米根霉L-乳酸高产菌株的选育及发酵条件优化.pdf

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1、Y870488米根霉L一乳酸高产菌株的选育及发酵条件优化ScreeningofRhizopusoryzaeoverproducingL．1acticacidandoptimizationoffermentationconditions作者姓名学位类型学科、专业研究方向导师及职称挝莲堂压亟±壅亡昌加工缝贮蘧王狸生丝厦廛皇盆童工程一潘面至．．数援2006年6月米根霉L一乳酸高产菌株的选育及发酵条件优化摘要本文采用紫外线(uV)与亚硝基胍(NTG)对米根霉As3．3461进行复合诱变，根据大通量快速筛选思想和代谢控制育种理论初步建立起两种筛选方法：琼脂块一变色乎板法和丙烯醇YPD平板法，获得

2、乳酸产量提高的正突变株分别为4株与8株。由后种方法获得的变异菌株HBF-12为最优突变株，该菌株产乳酸与乙醇分别为88．49／L与4．49／L，分别比亲株提高了30％与降低了74％。确定丙烯醇YPD平板法为高效初筛模型。通过单因素试验和正交试验，优化菌株HBF—12摇瓶发酵条件。确定最佳发酵培养基组成：1209／L葡萄糖，49／L(NH。)。SO。，0．49／LMgS04"7Hz0，0．19／LZnSO。-7Hz0，0．39／LKH。P吼，609／LCaC03。最佳培养条件：装液量20％，摇床转速200r／min，好氧发酵，温度32。C。在此条件下，突变株HBF一12的L一乳酸产量达到

3、96．219／L，斜面转接六代后该菌株的摇瓶生产能力比较稳定。最优条件下用7L发酵罐进行放大实验，发酵曲线显示：与亲株相比，突变株HBF一12的乙醇产量与乙醇脱氢酶(ADH)活力分别下降了73．6％与74％，乳酸产量与乳酸脱氢酶(LDH)活力分别提高了39．6％与16．2％。针对突变株HBF-12是乙醇脱氢酶减弱型突变株，研究了米根霉中乙醇脱氢酶的基本酶学性质：最适反应温度为25‘C；最适pH值7．5；热稳定性范围35。C以下；酸碱稳定性范围pH6．5-7．5；zn”对酶活存在明显的激活作用，Mg“对酶活有轻微抑制作用。得到该酶以乙醛为底物的米氏常数为1．750X10mol／L，NAD

4、H为底物的米氏常数为2．049x10、1mol／L。关键词：米根霉育种L一乳酸发酵条件优化乙醇脱氢酶ScreeningofRhizopusoryzaeoverproducingL-lacticacidandoptimizationoffermentationconditionsAbstractRhizopusoryzaeAs3．3461wasmutagenizedwithultravioletradiation(UV)andN-methyl-N'-nitro-N—nitrosoguanidinerNTG)together,andtwokindsofselectingmethodswer

5、eusedaccordingtolargestthroughputscreenandmetaboliccontrollingscreentheorythatwereagar-indicatorplateandYeast—Peptone—Dextrose(YPD)platecontainingallylalcoh01．Asaresult，fourandeightmutantstrainsoverproducingL．1acticacidwereobtainedrespectivelybyusingabovetwomethods．Compared、Ⅳithothermutants。the1

6、2“1mutantstrain(namedasHBF一121obtainedfromthe1attermethodshowsthehighestL．1acticacidyield88．49／Lwhichincreases30％thanthatoftheparentstrain．butethanolyieldiSonly4．49／Lwhichdecereases74％．Thee珩cientscreenmodelofYPDplatecontmningallyIalcoholwasfounded．Byunifactorandorthogonaldesignofexperiment，thefe

7、rmentationconditionsofthemutantHBF．12wereoptimizedwithflask．Theresultsshowedthattheoptimumfe：rmentationmediumareglucose1209／L，(NH4)2S0449／L，MgS04’7H200．49／L，ZnS04。7H200．1g／L，KH2P040．39／L，CAC03609／L，andtheoptimumculturecondit