资源描述：
《红尾皇冠鱼无乳链球菌病LAMP检测方法的建立与应用.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第29卷第6期大连海洋大学学报Vol.29No.62014年12月JOURNALOFDALIANOCEANUNIVERSITYDec.2014DOI:10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.06.004文章编号:2095-1388(2014)06-0561-05红尾皇冠鱼无乳链球菌病LAMP检测方法的建立与应用姚学良,徐晓丽,李贺密,包海岩,任涵玮,郑艳坤(天津市水产技术推广站,天津300221)摘要:以cfb基因保守序列的6个区域设计4条特异性引物,利用链置换DNA聚合酶(BstDNApolymer鄄ase)在恒温(65益)下保温40min,建立了无乳链球菌Strept
2、ococcusagalactiae的LAMP技术。建立的12LAMP方法能够特异性地检测无乳链球菌,检测灵敏度为3郾7伊10~3郾7伊10cfu/mL,反应前加入显色剂钙黄绿素避免二次污染。现场应用中采用FTA卡采集红尾皇冠鱼Aequidensrivulatus病鱼肝脏组织病原菌,操作简便、快捷。研究表明,针对无乳链球菌cfb基因建立的LAMP检测方法具有较高的特异性及稳定性,尤其是具有快速、简便、成本低等优点,可用于无乳链球菌的野外现场快速检测。关键词:红尾皇冠鱼;无乳链球菌;cfb基因;环介导等温扩增技术(LAMP)中图分类号:S941郾42摇摇摇摇文献标志码:A910摇摇红尾皇冠鱼Ae
3、quidensrivulatus又名绿面皇冠,扩增效率可达10~10个数量级,基于该原理的隶属于慈鲷科,原产于南美洲,为当地的食用鱼。LAMP技术已在水产动物细菌、病毒、寄生虫病原[5-8]1999年作为观赏鱼被引入中国香港,2000年在中的快速检测中被广泛研究与应用。与常规的基国大陆繁殖成功。红尾皇冠鱼饲养要求不高,深受因诊断技术相比,该技术因其检测时间短、对设备广大观赏鱼爱好者的喜爱,但随着其养殖的规模的要求低、结果判断简便等,在现场操作方面具有化、集约化发展,红尾皇冠鱼病害问题凸显。中国更大的优势。学者一直致力于食用鱼的病害诊断与防治,对观赏1摇材料与方法鱼病害的诊断和防治基本沿用食用
4、鱼的方法,有关观赏鱼疾病诊断与防治的研究目前鲜有报道。1郾1摇材料无乳链球菌Streptococcusagalactiae是在慈鲷科观赏鱼中流行的一种细菌病,目前该菌的诊断主要1郾1郾1摇菌株摇无乳链球菌标准株购自中国普通微[1]通过对病原菌的分离培养和血清学方法检测,生物菌种保藏管理中心;无乳链球菌、美人鱼发光该方法费时且缺乏准确性。PCR和RealtimePCR杆菌Photobacteriumdamselae、柱状黄杆菌Fla鄄[2-3]的应用提高了微生物检测的准确性,但复杂的vobacteriumcloumnare、哈维氏弧菌Vibrioharveyi、操作技术使其在生产实践中一直未得
5、到广泛应用。嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila、诺卡氏菌No鄄因此,操作简单、快速的野外现场检测方法亟待研cardiaasteroides、爱德华氏菌Edwardsiellatarda、发。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisother鄄维氏气单胞菌Aeromonasveronii、鳗利斯顿氏菌Lis鄄[4]malmplification,LAMP)是由Notomi等于2000tonellaanguillarum、创伤弧菌Vibriovulnificus参考年首次建立的体外链置换核酸扩增方法,近年来被株为天津市水产技术推广站保藏。广泛研究与应用。它利用靶序列上6
6、个关联区域设1郾1郾2摇主要试剂摇BstDNAploymerase购自New计的4条特异引物和1种高活性链置换DNA聚合EnglandBiolab公司,DL2000DNAMarker购自大酶(BstDNApolymerase),在恒温下对目的片段的连宝生物工程有限公司,钙黄绿素购自Sigma公摇收稿日期:2014-10-16摇基金项目:天津市科技支撑计划项目(12ZCZDNC00900)摇作者简介:姚学良(1982—),女,硕士研究生。E-mail:tjyaoxueliang@126郾com摇通信作者:徐晓丽(1983—),女,博士。E-mail:xiaolixu1983@gmail郾com
7、562大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第29卷司,FTA卡购自GE公司。(6)LAMP在无乳链球菌病检测中的应用。为评价无乳链球菌LAMP检测方法的有效性,分别对1郾2摇方法攻毒红尾皇冠鱼、健康无病的红尾皇冠鱼进行1郾2郾1摇LAMP引物设计摇依据GenBank报道的无LAMP检测。取红尾皇冠鱼的肝脏约0郾1g,置于乳链球菌的cfb基因保守序列(登录号:采样管中,用研磨棒快速将样品研磨至浆状;用吸X7
