新一代高通量技术在龋病相关的口腔菌群宏基因组学研究中的应用.pdf

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1、中华口腔医学研究杂志（电子版）2011年8月第5卷第4期ChinJStomatolRes（ElectronicEdition）,August2011,Vol．5,No．4341·述评·新一代高通量技术在龋病相关的口腔菌群宏基因组学研究中的应用凌均棨杨芳滕飞龋病是人类最普遍的感染性疾病，针对龋病的病因学研究、风险评估乃至预防策略是目前研究的重点问题。本研究小组采用新一代高通量技术包括454FLXTitanium测序、SolexaGAⅡ测序及Geochip3.0功能基因芯片，就唾液菌群中的细菌谱系和功能基

2、因组成进行深入解析，阐释成人唾液微生物群落的生态特性，通过对龋活跃人群和健康人群的比较分析，发现两者在基因和群落结构上具有鉴别特征，从而探讨唾液菌群对于龋病易感活跃度的检测和早期防控的意义，为研究龋病的发生发展机制并展开相应的疾病预防和治疗策略提供新的思路。一、人类共生菌群基因组计划和龋病病因学说龋病四联因素学说认为细菌、环境、宿主、时间均是龋病发生的必要条件，细菌是其中一项重要环节［1-2］。关于龋病的病因学说存在经典的“特异性菌斑假说”和“非特异性菌斑假说”。［3-4］“非特异性菌斑菌斑假说”认为

3、，龋病源于菌斑群落所有成员共同作用的结果；“特异性菌斑假说”则认为仅有少数细菌在龋病发病中起作用［4-5］，主张针对少数特定的“致龋菌”进行有效控制来监控龋病。变形链球菌（Streptococcus）因具有产酸性及胞外合成葡聚糖的功能，被认定为“致龋菌”［5］［6］发现致。国内外对变形链球菌结构和功能的研究愈益深入时，Kleinberg龋特性并非完全依赖于变形链球菌的存在，同时还有大量其它口腔细菌被认为与龋病的发生密切相关［7］。因此，上述两种假说均存在争议。［1，8-9］2000年以来，越来越多研究

4、者趋向于认同新兴“生态菌斑假说”，即将菌斑作为一个整体来看待其所表现出的生物学行为。“生态菌斑假说”认为，具备所谓“致龋性”的细菌绝非仅限于变形链球菌，而是种类丰富的一群细菌，这些细菌原本就存在于口腔正常菌群，众多微生物保持彼此密切接触，通过复杂的相互作用使整体维持脱矿与再矿化持平；当微环境发生改变，生物膜内菌群或者基因成分发生偏倚向脱矿一方倾斜，不断的恶性循环使脱矿持续进行进而导致龋坏。该学说从整个口腔群落生态角度阐释了龋病发生与发展的微观原理，为研究龋病病因提供了新的切入点。口腔菌群作为人体共生菌

5、群非常重要的栖息位点，其群落结构复杂多样。2007年，美国国立卫生研究院（NIH）正式启动人类共生菌群基因组计划（HumanMicrobiomeProject，HMP），认为寄生于人体的大量共生菌群可作为人体的第二基因组，是后天禀赋的主要承载者，与人体的健康息息相关；只有在全面认识人体共生菌群的基础上，才能深度揭示其对人体健康或疾病状态的影响，从而构建微生物群落存在及变化情况与特定的疾病之间的联系［10］。由于技DOI：10.3877／cma.j.issn.1674-1366.2011.04.001作

6、者单位：510055广州，中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院·口腔医学研究所通信作者：凌均棨，电子邮箱：lingjq＠mail.sysu.edu.cn342中华口腔医学研究杂志（电子版）2011年8月第5卷第4期ChinJStomatolRes（ElectronicEdition）,August2011,Vol．5,No．4术条件限制，对于口腔菌群群落成员构成缺乏全面的了解，进而在不够深入的认识层面上所进行的龋病病因学研究存在一定的局限性。二、非依赖培养口腔菌群研究技术的发展自1924年J.K.Cl

7、arke首次分离出变形链球菌以来，对口腔微生物的认识主要依赖于传统的分离培养方法，基于该水平的研究大约鉴定了250余种口腔细菌［11-12］，但该方法对难于培养或生长速度较为缓慢的细菌则表现为假阴性结果。据报道环境中可培养的细菌所占比例不超过1％［13-14］，故通过培养方法来认识口腔细菌并致力于圈定致龋菌的研究具有较大的局限性。随着分子生物学技术的飞速发展，不依赖于培养的分子检测手段陆续涌现，包括16SrRNA克隆测序、DNA杂交芯片、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、末端限制性片段长度多态性（T-RF

8、LP）等技术手段，主要依赖于小核糖体RNA（smallsubunit16SribosomalRNA）在微生物群体中的广泛存在及其可作为种系发育的生物进化标志［15］［11］采用16SrRNA克。2005年，Aas等学者隆测序的方法第一次获得较为全面的健康人口腔菌群分布图谱，从5个健康人口腔内9个位点取样，提取基因组DNA进行16SrRNA扩增并转化入感受态大肠杆菌，然后随机挑取单克隆测序进行菌种鉴定。该研究结果表明，健康人群的口腔菌群约含有141个优势菌