组织培养技术.doc

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1、组织培养技术］、概念植力组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物离体的器官、组织或细胞等，在无菌和适宜的人工培养条件下，经脱分化和再分化过程，最后形成完整植株的技术。2、原理细胞全能性。3.常用培养基的配方培养基名称配方MS(1L)琼脂粉(8g)+蔗糖(30g)+大量元素(2OX)50ml+微量元素(1OOX)10ml+铁盐(1OOX)10ml+水定容(PH5.8-6.0)LB培养基(1L)胰蛋白B(log)+酵母提取物(5g)+NaCl(10g)+琼脂粉(10g)+水定容(pH5.8-6.

2、0)YEB培养基(1L)蛋白月东(5g)+牛肉浸膏(5g)+酵母粉(lg)+蔗(5g)+硫酸镁(0.49g)+琼脂粉(10g)(pH5.8-6.0)分化培养基(1L)琼脂粉(8g)+蔗糖(30g)+大量元素(20X)50ml+微量元素(100X)10ml+铁盐(100X)10ml+相应的激素+水定容(PH5.8-6.0)生根培养基(1L)琼脂粉(8g)+蔗糖(30g)+大量元素(20X)50ml+微量元素(100X)10ml+铁盐(100X)10ml+相应的激素+水定容(PH5.8-6.0)培养基配制好后，于121°C

3、,20Min高温高压湿热灭菌。灭菌完成后，于紫外杀菌后的无菌工作台内分装即可。4、外植体的灭菌和培养4.1外植体的灭菌不同类别的外植体，可能灭菌的方式有所区别。外植体灭菌常用方法如下：4.1.1乙醇乙醇由于乙醇具有脱水作用和一定的溶脂性，所以它能使蛋白质脱水、变性、沉淀及质膜破损、透性增加，使微生物致死，是--种常用的外植体表面杀菌剂。70%(W/V)的乙醇对细胞具有很强的穿透性和杀伤力，故用乙醇作杀菌剂，灭菌时间不宜过长，约30s即可杀死外植体表而的绝大部分微生物。因植物材料不同，一般控制在5-60s之间，种子的灭菌

4、可适当延长。延长灭菌吋间会增加外植体损伤的程度。4.1.2次氯酸盐次氯酸盐是一种强氧化剂，具有杀菌作用。常用的次氯酸盐有钠盐和钙盐。次氯酸钠通常为微黄色或无色的澄清液体，含有效氯约5%,应用广泛；次氯酸钙,俗名漂白粉，它在组培工作屮的应用不如钠盐广泛，其缺点是在空气屮易吸水潮解，降低灭菌效力。次氯酸盐在水屮形成次亚氯酸(Hclo),次亚氯酸分解后形成盐酸和新生态氧(Hclo^HcK[O]),[0]具有极强的氧化性，故具有杀菌作用。组培屮使用的次氯酸盐浓度以有效氯计算，通常在0.5%-2.5%之间，灭菌吋间在5-15mi

5、ne次氯酸钠最后分解成氯和氧气排入大气屮，灭菌处理后易于除去,不留残毒,故它具有杀菌力强、低毒、价廉、易得等优点，是组培工作者喜欢选用的杀菌剂之一O4.1.3升汞升汞(二氯化汞，HgClJ是重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg+可与带负电荷的蛋白质结合，使菌体蛋白变性，酶失活。HgCb杀菌效力极强，lO'HgCb溶液在37°C2h可完全杀死50亿个•ml"农杆菌。在室温下，0.1%HgCl2在lOmin内可有效地杀死附着在外植休表面的细菌及芽抱，是一种极有效的杀菌剂。Hgcb是剧毒药吕,使用过程屮必须极其小心谨慎，不要接触

6、皮肤，更不误入体内。另外，经升汞灭菌的外植体，需彻底除去残留的Hg+,以消除微量的残留升汞对外植体的伤害。4.1.4新洁尔灭新洁尔灭是一种广谱表而活性灭菌剂。它对绝大多数植物外植体伤害很小，效果很好。通常使用1:200的稀释液，刷洗、浸泡外植体30min,甚至可更长些吋间。4、1.5抗生素类杀菌剂抗生素是生物代谢的产物，一般是通过阻断微生物的正常代谢途径使微生物致死。常用的有链霉素、青霉素、庆大霉素、金霉素、四坏素和杀真菌剂(fungicide)、多菌灵等生化类物质。5、外植体接种于紫外杀菌后的操作台内，将无菌外植体

7、(叶片切成0.5cm2大小，茎段切成lcni大小)，用无菌银子轻轻夹持置于分化培养基上进行脱分化培养。密封好后放于适宜条件下培养。待分化出幼苗后，将幼苗切下移至生根培养基培养。6、实验仪器及试剂6.1仪器超净工作台、灭菌锅、光照培养箱、电子天平、p【I试纸、烧杯、量筒、试剂瓶、三角瓶、洗耳球、刻度吸管、洗瓶等。6.2试剂(所有试剂均为分析纯)硝酸钾、硝酸讓、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸猛、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钳酸钠、硫酸铜、氯化钻、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氮酸、盐酸硫胺素、盐酸毗哆素、肌醇、1mol/L盐酸

8、、1mol/L氢氧化钠等。