猪瘟病毒荧光定量RT-PCR和RT-LAMP快速检测方法的建立-论文.pdf

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1、动物医学进展，2014，35(3)：1—5ProgressinVeterinaryMedicine猪瘟病毒荧光定量RT—PCR和RT—LAMP快速检测方法的建立唐景峰，周康平，韩振伟，王业富(武汉大学生命科学学院，湖北武汉430072)摘要：建立了应用TaqMan—LNA的荧光定量RT—PCR和反转录一环介导等温扩增(RT—LAMP)技术检测猪瘟病毒(CSFV)的两种方法。根据对NCBI中CSFVE2基因序列进行分析，设计了CSFVE2基因的引物和探针，并以E2基因为模板构建了重组质粒。通过梯度稀释阳性标准品进行试验表明荧光定量RT—PCR和R

2、T—LAMP检测下限分别为10拷贝／uL和10拷贝／gL；特异性试验表明，两种方法对于其他5种病毒不能检出，具有良好的特异性。临床样本检测同样表明两种方法都具有良好的特异性和灵敏度。说明所建立的TaqMan—LNA荧光定量RT—PCR和RT—LAMP可应用于CSFV的检测。关键词：猪瘟病毒；荧光定量RT—PCR；环介导等温扩增技术中图分类号：$852．651文献标识码：A文章编号：1007—5038(2014)03—0001—05猪瘟(Classicalswinefever，CSF)为世界动物dong／1105／2009株H1N1AIV、CH一

3、1a株PRRSV、卫生组织(OfficeInternationalDesEpizooties，OIE)石门株CSFV由武汉大学王业富实验室保存。规定的必须报告的动物传染病，也是我国规定的一1．1．2主要试剂与主要仪器Trizol试剂、逆转录类动物传染病，世界范围内大约有50个国家及地区酶，购自宝生物工程(大连)有限公司公司；Taq酶、暴发或报道过猪瘟，严重危害世界养猪业的发展口]。dNTP购自武汉三益公司；BstDNA聚合酶，购自E2为CSFV4种结构蛋白(即C、E、E1及Gene公司；ABI7500荧光定量PCR仪，购自LifeE2)之一，为

4、囊膜上的主要结构糖蛋白，是病毒主要TechnoLogies公司。保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体。研究表明1．2方法E2分子含A、B、c、D4个抗原结构域，A区又分为31．2．1引物和探针的设计和合成在NCBI上获个亚区，其中，A1、B、C在功能上具有中和性，其他取在中国流行的CSFVE2序列，经由Mega4．0进结构域则无此作用；编码E2蛋白的基因具高突变行比对，利用BeaconDesigner7．0设计软件，设计率，对于该基因的研究具有重要的意义_2]。CSFVE2荧光定量PCR特异性引物和探针，其中荧光定量PCR(real—timePC

5、R)和环介导等温扩增CSFVE2基因代表序列为FJ598612(Shimen—ZJ(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术均株)，利用PrimerExpLoerV4设计CSFVE2是近年来常用的一种检测病毒的方法，其中LAMP法LAMP特异性引物(表1)，主要针对经典石门株等自2000年发明来，由于其快速和极高的灵敏度，使其在进行检测，其中E2基因代表序列为HQ380241(CS—检测方面得到快速的发展及应用_4。]。本试验针对CS—FV—PY一2009)。引物由上海生工生物工程技术服务FV建立

6、了荧光定量RT-PCR和RT-LAMP两种检测有限公司合成，探针委托江苏硕世生物科技有限公方法，并证明了两种方法都具有良好的特异性和灵敏司合成。度，能有效的应用于猪瘟病毒的检测。1．2．2猪瘟病毒RNA提取参照Trizol试剂操1材料与方法作说明书提取病毒总RNA，并于一80℃冻存备用。1．1材料1．2．3标准品的制备以CSFVRNA为模板，以1．1．1病毒株O／NY00株O—FMDV、A／Guang—Random6primer为引物逆转录合成病毒cDNA。收稿日期：2013—09—14基金项目：质检公益性行业科研专项(201110036—03

7、)作者简介：唐景峰(1982一)，男，湖北人，博士研究生，主要从事临床诊断和病毒机理研究。*通讯作者2动物医学进展2Ol4年第35卷第3期(总第249期)再以CSFV的cDNA为模板，以real—time—F／real1．2．4荧光定量RT—PCR和RTIAMP反应体系time—R及LAMP—F3／IAMP—B3为引物进行PCR及优化用以上制备的cRNA标准品对Taq-Man扩增。扩增条件为：94C5rain；94。C30S，58℃15模式的荧光定量RT—PCR反应条件根据武汉三益S，72℃30S，共35个循环；72℃10min。PCR一扩增一

8、一的Taq酶～说呈～明：书进行优化，确定其最佳引物和探针_工m晏=产物用20g／i的琼脂糖凝胶进行电泳。将切胶纯的浓度、反应温度及条件。用以上cRNA