猪瘟病毒荧光定量pcr检测方法的建立

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1、动物医学进展。2009，30(5)：36—40ProgressinVeterinaryMedicine猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立王云龙。，刘建营。，韩洁。，陈小科。，李玉林。(1．河南郑州职业技术学院，河南郑州450121；2．广东省畜牧技术推广站，广东广州510500；3．河南省生物工程技术研究中心，河南郑州450001)摘要：通过RT-PCR方法克隆了猪瘟病毒(CSFV)5端非编码区(UTR)的一段靶序列，构建重组质粒作为标准阳性模板。同时根据GenBank中的靶序列设计了用于FQ_PCR的一对引物和一条IraqMan探针。通过条件优化，以定量的1O倍系列稀释

2、的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线，建立了CSFV检测的荧光定量PCR方法。结果表明，该方法检测灵敏度可达1．0×10。拷贝／L，线性范围为1O。～1O。，达1O个数量级；对起始浓度为1．0×10。、1．0×10。、1．0×10拷贝／L的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为l9．73、22．95和26．24；变异系数分别为0．61、1．77和1．18，均小于5，说明此方法具有良好的准确性和重现性。对阳性组织病料的检测表明，该方法的检测灵敏度高出常规PCR，与套式PCR具有相近的灵敏度。关键词：猪瘟病毒；荧光定量PCR；TaqMan探针中图分类号：$852．6

3、51文献标识码：A文章编号：1007—5038(2009)05—0036—05猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)广泛应用，它可以准确的计算出组织中病毒的含量，是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)推测动物是处于发病阶段还是亚临床感染阶段。因成员[1]，其基因组为单股正链RNA，长约12．5kb，此，我们将FQ-PCR技术用于猪瘟病毒的定量检测，含一个大的开放阅读框(ORF)，两侧为高度保守的通过特异性、敏感性和重复性验证，并与常规PCR、5和3非编码区[2]。由CSFV引起的猪瘟在临床上套式PCR(nPCR

4、)方法进行比较，建立了猪瘟病毒主要表现为高热稽留、出血梗死和死亡率高等特征。的定量检测方法，为猪瘟病毒的早期诊断提供有力虽然我国应用猪瘟兔化弱毒疫苗较好地控制了该病工具，同时也为猪瘟病毒的流行病学、致病机理和分的发生，但近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生子生物学等相关领域的研究提供参考和依据。了很大的变化，以温和型、非典型猪瘟和母猪持续性1材料与方法感染引起的流产、死胎及新生仔猪发病、死亡为1．1主要仪器与试剂主【3]I，造成了严重的经济损失。因此，目前急需一ABIPrism7500荧光定量PCR仪，ABI2700种快速、特异、敏感的诊断方法用于该病的诊断和防普通PCR仪

5、。核酸蛋白分析仪，凝胶成像分析系治。统，高速离心机。RNA提取试剂盒，一步RT-PCR国内外对CSFV的常用诊断方法有病毒分离、试剂盒，荧光定量PCR试剂盒，DNA凝胶回收试剂间接免疫荧光抗体(IFA)[6]、酶联免疫吸附试验盒，质粒小量提取试剂盒，BamHI、H／ndⅢ、(ELISA)[7]、血清学方法、反转录一聚合酶链反应Premix等均购自宝生物工程(大连)有限公司。(RT—RCR)等[8]。但这些方法都存在某些不足之TaqManPCR八联管购自ABI公司。处，病毒分离耗时长，IFA检测灵敏度不是很高；1．2病毒、质粒和菌种ELISA和血清学方法只能检测抗体，不适合早

6、期诊CSFV分离自河南省某猪场的1份患病仔猪组断；RT-PCR易污染等。近年来发展起来的荧光定织病料；pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有量PCR(FlourescentquantitativePCR，FQ-PCR)技限公司；宿主菌DH5a为河南省生物工程技术研究术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表中心保存。达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到收稿日期：2009-02—26作者简介：王云龙(1962一)，男．河南洛阳人，高级工程师，主要从事生物工程技术研究。王云龙等：猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立371．3标准阳性模板的制备94℃预变性2min

7、；然后以94℃30S、56℃30S；1．3．1引物设计与合成根据GenBank中CSFV72℃1min进行35个循环；72℃延伸10rain。反应5端非编码区序列，设计一对PCR引物：上游引物结束，取5LPCR产物用15g／L琼脂糖凝胶电泳P1：5一ACGGAGGGACTAGCCGTAGTp3；下游鉴定产物。引物P2：5一CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC3。1．3．3PCR产物的克隆及酶切鉴定PCR产物用扩增片段为238bp。引物由Invitrogen公司(上海)15g／L琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，用