实验13 地衣酚法测定RNA含量 - 华南师范大学生命科学学院新 ….doc

《实验13 地衣酚法测定RNA含量 - 华南师范大学生命科学学院新 ….doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验13地衣酚法测定RNA含量一、目的学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地衣酚法）的原理和操作技术。二、原理核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3，5—二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200微克/毫升范围内，光密度与RNA的浓度成正比关系，在反应液中如混有DNA或其他杂质。也能给出类似的颜色。因此测定RNA时可先测定DNA的含量，再计算RNA的含量。地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核糖，不同来源的

2、RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种RNA的含量存在误差。最好用被测样品相同来源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从曲线求得被测样品的RNA含量。三、材料、试剂和器具（一）试剂1、RNA标准溶液：取酵母RNA配成200微克/毫升的标准溶液（如不溶，可滴加氢氧化铵溶液，调至pH=7.0）2、样品溶液：RNA浓度在20~100微克/毫升范围内。（自己提取）3、地衣酚试剂，先配制0.1%三氯化铁浓盐酸溶液（A、R）。使用前再用上述溶液为溶剂配成0.1%的地衣酚溶液。（临用时配制）（二）器具

3、1、试管及管架2、水浴锅3、移液管（1，2，5ml）4、可见光分光光度计四、操作步骤（一）RNA标准曲线的制作取8支试管，编号，按下表加入试剂管号试剂01234567RNA标准液00.20.40.81.01.21.62.0蒸馏水21..81.61.21.00.80.40地衣酚试剂22222222加毕，摇匀，置沸水浴中加热15分钟，冷却，测0.D670nm值。以0.D670nm值为纵坐标，RNA含量（微克/毫升）为横坐标作图绘制标准曲线。（二）样品的测定取0.2~0.5毫升样品液于试管中，加蒸馏水稀释至2毫升，后加2毫升地

4、衣酚试剂摇匀，于沸水中煮15分钟，冷却，测0.D670nm。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度的RNA的含量，按下式计算样品中RNA的百分含量。RNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数RNA产率（%）=含量/毫升×总体积×100新鲜肝重（g）×106五、注意事项样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。六、实验报告附上绘制标准曲线图，并计算RNA的含量及产率。七、思考题1、采用该法测定RNA的含量有何优点及缺点？2、地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些？如何能减少它们的影

5、响？