山奈酚对人肝癌细胞Huh7生长及凋亡的影响-论文.pdf

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1、·192·广东医学2014年1月第35卷第2期GuangdongMedicalJournalJan．2014，Vo1．35，No．2山奈酚对人肝癌细胞Huh7生长及凋亡的影响冰王铮华，梁统，李涛，周克元广东医学院广东省医学诊断分子重点实验室，检验医学研究所(广东东莞523808)【摘要】目的探讨山奈酚在体外实验条件下对人肝癌细胞Huh7生长及凋亡的影响方法采用CCK一8法检测25～125txmol／L浓度山奈酚对肝癌Huh7细胞24、48、72h存活率的影响，Hochest33258染色检测山奈酚对细胞形态变化的影响，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Caspase一3活性检测试剂盒法检

2、测细胞Caspase一3的活性。结果25～125~mol／L浓度山奈酚能有效抑制肝癌细胞Huh7的增殖，并具有明显的剂量一时效关系；山奈酚诱导肝癌Huh7细胞凋亡及提高肝癌Huh7细胞Caspase一3的活性。结论山奈酚对肝癌Huh7细胞生长有明显的抑制作用，该抑制作用可能与山奈酚提高了细胞Caspase一3的活性、诱导细胞的凋亡有关。【关键词】肝癌；细胞凋亡；细胞增殖；山奈酚山奈酚(Kaempfero1)又名黄芪甙元、山奈黄素，属胞悬液，分瓶传代培养，2～3d传代1次，取对数生长黄酮醇类化合物，主要来源于姜科植物山奈的根茎，具期细胞用于实验。有抗炎、抗氧化、抗癌等多种生物活性及

3、药理作用。1．2．2CCK一8法检测细胞增殖抑制将对数生长期近年发现山奈酚对卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肺癌～等Huh7细胞消化，接种于96孔板中，每孔接种约2×10多种肿瘤有抑制作用，而山奈酚对人肝癌是否有抑制个细胞，待细胞长到60％～70％汇合时，分别更换培作用尚未见报道。2010年9月至2011年11月，本研养基。实验分组为0．1％DMSO溶剂对照组，药物组分究探讨山奈酚对人肝癌细胞Huh7增殖及凋亡的影响，为25、50、75、100及125~mol／L5个浓度组，每组5个为山奈酚的研究开发提供实验依据。复孔。药物作用时间24、48、72h后吸出孔内的液体，1材料与方法每孑L加入

4、新鲜的培养基100txL及CCK一8液体101．1材料人肝癌细胞株Huh7，目录号为TCHu182，L，置37℃、5％CO培养箱内培养，在酶标仪上检测购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中各组细胞不同时间段(吸光度)值，检测波长为450心。山奈酚(纯度98％，南京替斯艾么中药研究所)，rim，参照波长650nm。细胞增殖抑制率(％)=(1一试顺铂(山东柏源化学有限公司)，DMEM液体培养基验组值／溶剂对照组4值)×100％。(HyClonecorporation)，胎牛血清(Gibco／Invitrogencor—1．2．3Hochest33258染色观察细胞形态消化对数p

5、oration)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术生长期的Huh7细胞，稀释计数，种入6孑L板，每孑L约研究所)，AnnexinV—FITC细胞凋亡检测试剂盒(凯8x10个细胞，6孔板内放置盖玻片1片／孔。待细胞基生物公司)，Hochest33258染色液(碧云天生物技术生长汇合至50％～60％时，DMSO对照组、阳性对照组研究所)，Caspase一3活性检测试剂盒(凯基生物公和药物组分别更换为含0．1％DMSO、顺铂8~mol／L、司)。Syrengy2多功能酶标仪(BioTekinstruments)，山奈酚125p~mol／L的培养基，药物作用24、48和72h54

6、17R型高速台式离心机(德国Eppendorf公司)，后，弃掉含药物的培养基。加入固定液500I／孔固定FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司)，二氧化碳10min，弃掉固定液，用PBS冲洗2次，每次冲洗3min。孵箱(NUAIRE公司)。加Hochest33258染色液500L／孑L，染色5min，弃掉1．2方法染色液，用PBS冲洗2次，3min／次。滴1滴抗荧光淬1．2．1细胞培养Huh7细胞培养于含有10％胎牛血灭液至载玻片上，将盖玻片盖至载玻片上，避免有气泡清、100U／mL青霉素和100p~g／mL链霉素的DMEM完产生。荧光显微镜镜下观察是否有凋亡小体形成。全培

7、养基中，37℃、5％CO饱和湿度培养箱孵育，显微1．2．4流式细胞仪检测细胞凋亡实验分为阴性对镜下观察细胞生长情况。当细胞生长汇合至80％～照组、PI单染对照组、AnnexinV—FITC单染组、0．1％90％时，弃掉培养液，PBS冲洗2次，可用0．25％的胰DMSO对照组、药物组，待细胞生长汇合至60％～70％酶(含0．02％的EDTA)消化2min，镜下观察胞质回时，阴性对照组、PI单染对照组和AnnexinV—FITC单缩、细胞间隙增大后，立即加入培养液终止消化，吸管染组只