山奈酚对大鼠肝癌细胞cbrh7919的增殖抑制及诱导凋亡作用

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1、山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖抑制及诱导凋亡作用作者：周瑶，杜标炎，谭宇蕙，吴映雅，刘喜娟，刘晶晶，易华，李药菊【摘要】【目的】观察山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响。【方法】选用CBRH7919肝癌细胞株，传代培养24h后，加入不同浓度山奈酚处理，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率，4′6二脒基2苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡形态，彗星电泳技术和流式细胞术检测药物对细胞DNA的作用。【结果】山奈酚体外能抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖，以625、125、25、50、100μmo

2、l/L浓度的山奈酚处理细胞72h，对CBRH7919细胞的增殖抑制率显著升高，呈明显的剂量效应关系。用50、100μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞24、48、72、96h，对细胞的增殖抑制作用显著增强，呈明显的时间效应关系，即药物作用时间越长，抑制作用越强。DAPI染色显示不同浓度山奈酚组的细胞均有明显的细胞凋亡特征。彗星电泳显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72h后，细胞后面均呈现长度不等的拖尾，平均光密度值较空白对照组显著降低(P<001)，彗星尾距较空白对照组显著增加(P<001)，且两者改变与药物浓度相关。流式细

3、胞仪检测结果显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞7210h出现亚二倍体凋亡峰，细胞周期被阻滞于S期，不同浓度山奈酚组凋亡率较空白对照组均明显增高。【结论】山奈酚可能通过抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖及诱导其凋亡而产生抗肿瘤作用。【关键词】山奈酚/药理学;肝肿瘤/中药疗法;肿瘤细胞/病理学;细胞凋亡;细胞培养　山奈酚主要来源于姜科植物山奈的根茎，属于黄酮醇类，黄酮类化合物是一类存在于多种植物中的多酚化合物，具有多种潜在的药用价值，其中抗肿瘤作用是一个研究热点[1-2]。有研究报道山奈酚通过不同作用机制能抑制大肠癌细胞[3]、大鼠前列腺

4、癌细胞[4]、人乳腺癌细胞[5]、髓母细胞瘤细胞[6]、大鼠嗜碱性白血病细胞[7]、人宫颈癌Hela细胞[8]等的生长或诱导其凋亡，并在人肝肿瘤细胞株HepG2细胞中能调节孕烷X受体(PXR)介导的细胞色素P4503A4的转录表达，从而影响某些与其同时使用的临床药物的代谢[9]。本研究观察了山奈酚在体外对大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响，现报道如下。　　1材料与方法　　11实验药物山奈酚购自Sigma公司(批号：54608195，纯度>96%)。10　　12试剂与仪器大鼠肝癌细胞株(CBRH7919)购于中山大学细胞库。

5、细胞培养用RPMI1640粉和胰蛋白酶均为Gibco公司产品，青、链霉素合剂为杭州吉诺生物医药技术有限公司出品，新生牛血清为奥地利PAA公司产品，四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品，琼脂糖为Biowest公司产品。仪器有IX71F22FL/PH型荧光倒置显微镜及图像采集系统(日本Olympus公司)和BioRad680型全自动酶标仪(日本BioRad公司)。　　13细胞培养用完全培养基(含RPMI1640培养基、体积分数10%新生牛血清、100U/mL青霉素、01mg/mL链霉素)接种在培养瓶中，置体积分数

6、5%CO2、37℃培养至融合率80%～90%时传代进行实验，接种细胞浓度为1×105/mL。　　144′6二脒基2苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡形态细胞培养24h后，加不同浓度山奈酚处理，设0、25、50、100μmol/L共4个浓度组，作用72h后，DAPI染色，倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。　　15MTT法检测细胞存活率以2×104个/mL的密度将细胞接种于96孔板，每孔内有100μL细胞悬液，后将山奈酚用乙醇溶解、培养基稀释为625、125、25、50、100μmol/L共5个浓度组，加药至每孔培养液总体积200μL。每组设6个复孔

7、，培养箱中培养7210h，MTT法检测药物作用的量效关系。设50、100μmol/L2个浓度组，培养24、48、72、96h，MTT法检测药物作用的时效关系。　　16彗星电泳检测细胞DNA损伤情况细胞培养24h后，加不同浓度山奈酚处理，设0、30、60、120μmol/L共4个浓度组，作用72h后，分别收集各组的细胞，按文献[10-11]方法采用彗星电泳分析DNA损伤的情况。DAPI染色，荧光倒置显微镜40倍物镜下观察照相，每组随机选取20个细胞测量平均光密度(D)值和彗星尾距(l)相对值。　　17流式细胞仪分析凋亡和细胞周期细胞培养24h后，加不同浓度山

8、奈酚处理，设0、30、60、120μm