短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建.pdf

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1、生技术通讯⋯174LETrTI’ERSINBIOTECHHNOLOGYvol．·2z60N一ro．·2Mar．,20ul15)doi：10．3969~．issn．1009—0002．2015．02．004研究报告短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建孙晓雅，韩庆旺，宋晓艳，何文俊，郝好杰，韩为东，母义明解放军总医院a．内分泌科；b．基础医学所分子生物室；北京100853[摘要]目的：构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体，在HepG2细胞中鉴定该载体对NLRP3

2、的抑制效果。方法：设计针对NLRP3基因的shRNA序列，将其插入慢病毒表达载体pWPT—U6一shRNA—CMV—GFP中，将载体与包装质粒psPAX2、pMD2．G共转染293T细胞，进行病毒包装；得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液，分别转染293T细胞后进行滴度测定；用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系HepG2，获得稳定沉默NLRP3的细胞株；利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果：构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体；稀释法测定干扰病毒滴度为2x10TU

3、／mL；实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后，细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论：构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体，获得NLRP3基因稳定干扰的HepG2细胞株。[关键词]NLRP3；短发卡RNA；慢病毒载体；HepG2细胞[中图分类号]Q78[文献标识码]A[文章编号]1009—0002(2015)02—0174—04ConstructionofRecombinantHepG2CellswithshRNALentiviralVectorTargetingNLRP3SUNXiao

4、—Ya“，HANQing—Wanga，SONGXiao—Yan，HEWen—Jun，HAOHao—fie，HANWei—Dong，MUYi—Minga．DepartmentofEndocrinology；b．DepartmentofMolecularBiology，InstituteofBasicMedicine；ChinesePLAGeneralHospital，Beijing100853，ChinaCo—correspondingauthers，MUYi—Ming，E—maihmuyiming@301h0spi

5、tal_con．cn；HANWei—Dong，E-maihhanwd0001@163．con【AbstractJObjective：ToconstructarecombinantlentiviralvectorofshorthairpinRNA(shRNA)targetingNLRP3gene，andtoidentifyitsinhibitoryeffectinHepG2cells．nethods：TheNLRP3shRNAsequencewasdesignedandinsertedintothelentivira

6、lvectorpWPT—U6一shRNA—CMV—GFP．Thelentiviralvectorwasfurtherpackagedwithaccessoryplasmidsintolentivirusin293Tcells．Thevirussolutionwasconcentratedandseriallydilutedinto9levels。andtransfectedinto293Tcellsrespectivelyforthetiterdetermination．Theresultedlentivirusw

7、asinfect—edHepG2celltostablysuppressNLRP3expression．andtheinhibitioneffectwasdetectedbyquantitativereal—timePCR(qRT-PCR)andWesternblotting．Results：AlentiviralvectorcarryingNLRP3shRNAwasconstructed．Thevirustiterwas2x10TU／mLdetectedbydilutionmethod．TheNLRP3expre

8、ssioninHepG2cellswasdown—regulatedsignificantly，confirmingbytheqRT—PCRandWesternblotting．Conclusion：TheconstructedlentiviralvectortargetinghumanNLRP3genecanstablysuppressNLRP3expre