stat3短发夹rna表达载体的构建及对siha细胞增殖和凋亡的作用

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1、STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用：吴维光,于月成,陈亚琼,曹秀琴【摘要】目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA（shRNA）真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用。方法:根据siRNA设计原则,结合pSilencer2.1U6neo质粒特点,针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入pSilencer2.1U6neo质粒,脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞。RTPCR和TT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡。结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体,转染人宫颈癌SiHa细

2、胞。细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降,细胞凋亡增加。结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达,抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力,诱导细胞凋亡。【关键词】SiHa细胞;STAT3;RNA干扰;增殖;凋亡信号转导子及转录活化子（signaltransducersandactivatorsoftranscription,STATs）是细胞因子和生长因子受体信号的下游效应物,在细胞核内与特异性的DNA启动子结合,调节相关基因的表达［1］。在哺乳动物7个STAT家族成员中,STAT3是近年来研究异常活跃的转录因子。STA

3、T3已被确认为是癌基因［2］,在包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤组织中高表达［3］,与肿瘤增殖分化、细胞凋亡、新血管生成和免疫逃逸密切相关［4］。阻断STAT3信号转导通路可抑制胰腺癌细胞增殖功能［5］。本研究中利用RNA干扰（RNAinterference,RNAi）技术,以pSlinlencer2.1U6neo载体中的U6为启动子,STAT3为靶基因,构建STAT3siRNA表达载体,转染人宫颈鳞癌SiHa细胞,抑制STAT3基因表达,观察SiHa细胞增殖和凋亡的变化。1材料和方法1.1材料人宫颈癌细胞株SiHa细胞购自武汉典型生物保藏中心,胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公

4、司,RPMI1640培养液（Gibco）、质粒pSilencer2.1U6neo（Ambion）、DH5α为清华天为时代公司产品,质粒小提取试剂盒购自北京博克泰克公司,凝胶回收试剂盒和质粒大提取试剂盒购自Qiagen公司,Lipofectimane2000脂质体转染试剂盒、FITCannexinV凋亡试剂盒和cDNA逆转录试剂盒购自Invitrogen公司,各种工具酶购自TaKaRa公司,STAT3单克隆抗体（mAb）购自Santacruz公司,MTT试剂购自Sigma公司,PCR引物和短发夹RNA（ShorthairpinRNA,shRNA）表达载体插入片段的寡核苷酸链由北

5、京奥科生物公司合成,STAT3shRNA表达载体测序由大连亚法生物技术公司完成。1.2方法1.2.1STAT3特异性shRNA转录模板的设计及合成根据GenBank中STAT3人全长cDNA序列（No.003150）,参考相关文献选取特异性的序列为干扰作用的靶点［6］,加入9bp的环结构,U6启动子终止序列,并引入两个酶切位点,以确保退火后可以插入质粒pSilencer2.1U6neo中且读框正确。采用国际通用的与所有基因均无同源性序列的nontargetsiRNA作为阴性对照。人工合成一对互补并编码短发状siRNA的寡核苷酸链序列如下:STAT3正义5′GATCCATCC

6、AGAGTCACTGGAAGTTTCAAGAGAAGTTCCAGTGACTCTGGATTTTTTTGTCGACA3′,反义5′AGCTTGTCGACAAAAAAATCCAGAGTCACTGGAACTTCTCTTGAAAGTTCCAGTGACTCTGGATG3′。阴性对照正义5′GATCCTTCTCCGAACGTCTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGTCGACA3′,反义5′AGCTTGTCGACAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAG3′。1.2.2

7、重组质粒的构建和瞬时转染将上述的DNA片段退火,用T4连接酶连接于经双酶切（HindIII,BamHI）的质粒pSilencer2.1U6neo中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,涂于氨苄抗性（终浓度为50mg/L）的LB培养基上,次日随机挑取菌落,接种于LB培养液中,振荡过夜,碱裂解法快速抽提质粒,紫外分光光度法定量。SiHa细胞在含100mg/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液中,37℃、50mL/LCO2条件下培养。取对数生长期细胞接种于6孔板