层析分离法课件.ppt

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1、层析分离法特点：（1）纯化倍数高（2）操作规模小，放大困难（3） 终产品纯化（4）适用于价格昂贵的产品色谱法(chromatography)——以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法。色层分离法基本原理色层分离法基本原理分子筛层析示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：>>层析的发展史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938T

2、aylorUray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson

3、创立了毛细管电泳法。分类按溶质分子与固定相相互作用机理吸附层析：离子交换色谱疏水作用层析金属螯合色谱共价作用色谱分配层析凝胶过滤亲和层析类型机理优点缺点适用范围吸附色谱化学、物理吸附操作简便易受离子干扰各种生物大分子的分离、脱色、和去热源凝胶过滤分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起变性各种凝胶介质昂贵，处理量有限制分子量有明显差别的可溶性生物大分子分配色谱溶质在固定相和流动相中分配系数的差异分辨力高，重复性较好，能分离微量物质影响因子多，上样量太小用于各种生物大分子的分析鉴定亲和色谱亲和色谱生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大各种生物大

4、分子聚焦色谱等电点和离子交换作用分辨力高进口试制昂贵蛋白质和酶按实验技术分类低压（小于0.5Mpa)中压(0.5-5Mpa)高压(5-40Mpa)电泳(溶质在电场中移动）根据固定相形状分类柱层析、纸层析、薄层层析根据流动相分类气相层析、液相层析、超临界流体层析⑴分析色谱（10mg）⑵半制备色谱(10-50mg)⑶制备色谱(0.1-1g)⑷工业生产规模色谱(>20g/d)按制备规格基本概念分配系数；解离常数；分离因素；阻滞因子；溶出体积；分辨率；溶量因子基本概念（1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值（2）解离常数：有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与溶质在固相中的浓度比值

5、（3）分离因素：某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数(4)阻滞因子：分配层析溶质移动速度（距离）与流动相移动速度（距离）比值(5) 洗脱（容积）溶出体积：在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相体积(6) 分辨率：两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比(7)溶量因子：固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比色谱体系中样品运行特点不同组分的差速迁移(differentialmigration):混合物各组分在两相分配系数不同，分配系数大的迁移速度慢，使同时进入色谱柱的各组分得以分离。同种组分的分子分布离散(sepreading)：入口处组分分布在一狭窄区带内，随着分子在柱内迁移，分布

6、区带不断展宽，同组分分子迁移速度出现差异，主要是因为流体分子运动的速率差异造成，不是平衡分布不同引起。层析介质要求：（1）不溶于流动相（2）化学稳定（3）机械强度（4）大的表面积（5）粒度均匀种类：无机（氧化铝，硅胶，活性碳）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺）氧化铝：多孔，微孔表面具有吸附性能比表面积大分子简单，空间形态复杂（8种以上）吸附量与含水量关系很大制备：氢氧化铝加热脱水吸附基团：铝离子种类：碱性；酸性；中性应用：有机溶剂中分离天然成分硅胶硅胶：多聚硅酸分子间脱水形成（1）化学组成SiO2.XH20（2）无定形结构（3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面分

7、类特细孔硅胶(0.8nm以下)细孔硅胶（1.5—2.0nm)中孔硅胶(4.0一5.0nm)粗孔硅胶(10.nm以上)应用：优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物琼脂糖由海洋生物琼脂提取得到的主要成分①中性不带电②水溶性线状多糖③高亲水性，含大量羟基④能制成多孔性凝胶，分离大分子制备：（1）去除带电琼胶成分（2）将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化等方法制得珠状介质。（3）采用交联剂增加介质的机械强度商品种类Sepharose2B分离范围:70,000-40×106,Sepharose4B分