表达绿色荧光蛋白的重组人偏肺病毒的构建及其致病性的研究.pdf

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1、分类号S828学校代码10129UDC615学号08201056表达绿色荧光蛋白的重组人偏肺病毒的构建及其致病性的研究ConstructionofrecombinanthumanmetapneumovirusexpressinggreenfluorescentproteinandstudyofitsPathogenicity申请人：李晓艳学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：兽医药理学与毒理学指导教师：哈斯苏荣教授步志高研究员论文提交日期：二〇一一年五月摘要人偏肺病毒(Humanmetapneumovirus,HMPV)属于副粘病毒科偏肺病毒属，是偏肺病毒属中唯

2、一能感染人类的单股负链不分节段RNA病毒。现有流行病学资料显示，HMPV呈全球流行，为儿科较为常见的呼吸道病原。临床症状与肺病毒属的呼吸道合胞病毒(RSV)感染相似，出现严重的咳嗽，气管炎和肺炎，经常伴有高热，肌痛和呕吐，并导致免疫功能不全者死亡。HMPV主要有A、B两型，分别以加拿大分离株CAN97-83(NL/1/00)及CAN98-75(NL/1/99)为代表，每型内又可分为两个不同的亚型。本研究采用反向遗传学技术，在HMPVNL/1/99(B型)代表株基因组内插入表达增强绿色荧光的外源基因，成功救获了重组病毒rHMPVNL/1/99-EGFP。通过荧光共聚焦、

3、电镜观察及生长动力学研究，证实最终拯救出具有感染性的rHMPVNL/1/99-EGFP重组病毒颗粒且救获病毒保持野生型HMPV的特点。采用改良噬斑形成试验测定病毒滴度，根据Reed-Muench的方法比较分析结果表明，重组病毒rHMPVNL/1/99-EGFP与野生型HMPVNL/1/99的生长动力学曲线及最高生长滴度基本一致。rHMPVNL/1/99-EGFP在Vero-E6细胞连续传代10次仍保持绿色荧光蛋白的稳定表达及其所有生物学特性保持不变。在此基础上，比较研究了rHMPVNL/1/99-EGFP（B型）及rHMPVNL/1/00-EGFP(A型)对小鼠和各细

4、胞的致病性，采用改良噬斑形成试验测定病毒滴度，结果表明，rHMPVNL/1/00-EGFP的感染性及致病力均比rHMPVNL/1/99-EGFP强。本研究填补了国内相同研究领域的空白，首先，重组病毒对外源基因的稳定表达使HMPV具有作为疫苗载体应用的可能性。其次，以EGFP蛋白作为病毒示踪物对实验条件要求不高，便于检测，使得在rHMPVNL/1/99-EGFP基础上进行病毒致病机制和基因功能研究变得更为便利。第三，对两株重组HMPV致病性的研究为病毒基因组的改造，从而为HMPV减毒活疫苗的研制奠定基础。关键词：反向遗传技术；重组人偏肺病毒；绿色荧光蛋白Construc

5、tionofrecombinanthumanmetapneumovirusexpressinggreenfluorescentproteinandstudyofitsPathogenicityAbstractHumanmetapneumoirus(HMPV)isanon-segmented,single-strandednegativeRNAandclassifiedasthefirstmammalianmemberofthefamilyParamyxoviridae,subfamilyPneumovirinae,genusMetapneumovirus.Itisco

6、mmonpediatricrespiratorypathogen,showedaglobalepidemic.ClinicalsymptomsassociatedwithHMPVinfectionaresimilartothosecausedbyrespiratorysyncytialvirus(RSV),appearseriouscough,bronchitisandpneumonia,oftenaccompaniedbyhighfever,musclepain,vomiting,anddeathofimmunedysfunction.HMPVisolatescan

7、beclassifieditotwomajorgroupsAandB,RepresentedbyCanadianisolatesCAN97-83(NL/1/00)andCAN98-75(NL/1/99),eachtypecanbedividedintotwodifferentsubtype.Inthisstudy,weinsertedanenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)geneintothefull-lengthgenomecDNAcloneofHMPVNL/1/99（B）strain,thenthereco