基于转录组测序技术研究道地药材当归同源基因.pdf

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1、·4lO·中国中医药科技2014年7月第21卷第4期July2014Vo1．21No．4基于转录组测序技术研究道地药材当归同源基因王金权杨杰练成丁维俊李炜弘王米渠(平凉医学高等专科学校·平凉744000成都中医药大学·成都610075)摘要目的：通过转录组测序技术全方位、深层次挖掘甘肃岷县当归的基因组资源，并进行当归同源基因分析，为当归栽培、品种鉴定、加工、配伍及保健品开发提供理论支撑。方法：岷县现场采集当归样品，并经专家鉴定为当归品种(angelicasinensis(oliv．)diels)。采用RNAplantP

2、lus方法提取岷归头、岷归尾的总RNA，质量鉴定合格后构建测序文库。测序文库检测合格后在IUumminaHiSeq2000测序仪上完成双端测序。采用相关生物信息学分析软件，实现研究目标。结果：①通过转录组测序技术，获取了63585个当归表达序列标签(EST)，构建了当归的基因组。②在UniProt(date：2012．09)数据库中注释的30432个当归基因，分布于939种物种；其中序列分布频率较高的前5种物种为葡萄、蓖麻、毛果杨、大豆、苜蓿属。结论：当归基因组研究处于起步阶段，亟待深入研究。已注释基因主要分布于目前研

3、究较深入的5种重要经济植物，成为当归制剂与保健品开发的分子生物学基础。关键词转录组测序技术当归同源基因道地药材当归为“血中之圣药”，是使用频率最高的中药之一，1．3序列组装有“十方九归”、“药王”之誉。我国第一部本草学著作《神农1．3．1原始序列组装(primaryunigenesassembly)将样本本草经》中，列其为既能祛邪又可补虚之品】。《景岳全书测序数据读本，应用CLCGenomicsWorkbench(version：5．5)·本草正》：“当归，其味甘而重，故专能补血；其气轻而辛，的scaffoldingc

4、ontig算法进行从头合成拼接，采用参数：word—故又能行血。补中有动，行中有补，诚血中之气药，亦血中之size=45，minimumcontiglength≥200。此阶段拼接得出的圣药也”。当归药效成分丰富，具补血、养血、活血等功效。序列称之为primaryunigenes。其主要成份Z一藁苯内酯、阿魏酸及香豆素葡萄糖苷等为活1．3．2最终序列组装(Finalunigenesassembly)应用血化瘀的物质基础，表现为抗血小板聚集和抗凝活性；CAP3EST拼接软件对得到的primaryunigenes进行混合拼

5、而当归多糖可抗凝血及止血，起双向调节作用J，也兼具补接，得到一个finalunigenes集合。采用cap3软件的策略为：血养血功能“。但是，当归药效成分形成的生物学基础仍对primaryunigenes进行两次拼接，第一个使用宽松拼接参缺乏研究。转录组测序技术作为开放性研究平台，尤其适用数进行初始拼接，第二次使用严格拼接参数进行拼接。于当归等基因组研究薄弱物种，可构建当归的基因组研究资1．4Uniprot数据库功能注释将得到的finalunigenes序列源，可从直系同源基因的角度发现与当归有密切关系的物与UniPr

6、ot(date：2012．09)库进行blastx比对(将核酸序列翻种，为当归研发提供理论支撑。译为蛋白，再进行比对)，UniProt数据库是目前对蛋白功能1材料与方法结构注释最为详细且准确的蛋白数据库，大概包括1．1样品收集与鉴定2012年10月中旬于甘肃岷县清水22000000个蛋白，这里采用trEMBL+swissprot。最后得到比乡收集代表性当归样品(angelicasinensis(oliv．)diels)，并由对结果，筛选条件：E—value<1e～。平凉医专药用植物学教授现场完成当归鉴定。立即取当归2结

7、果头、当归尾各0．5g，共10个，分别编号、锡箔纸包装，并投入2．1转录组测序产出、序列组装由IⅡuminaHiSeq2000液氮中保存，干冰运输至实验室。高通量测序获得62539584个读序。由这些短读序组装出1．2转录组测序从甘肃岷县当归头、当归尾中提取总11076个eontig，平均长度为556bp。因后续注释分析都基于RNA，经ND一1000分光光度计及AgilentBioanalyzer2100电unigene，由CLCGenomicsWorkbench(version：5．5)的scafol—泳检测RNA提

8、取质量。当归头、当归尾总RNA混合后，用dingcontig算法进行从头合成拼接得出的序列为primaryRNeasyMicrokit按其操作流程纯化20g总RNA，所得产物unigenes，再由CAP3EST拼接软件对得到的primaryunigenes用于测序文库构建；测序文库经Qubit⑩2．0Fluorometer和进行混