征求意见稿-鸭肝炎病毒1型和3型双重RT-PCR检测方法.docx

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1、ICS点击此处添加中国标准文献分类号     DB34安徽省地方标准DB34/XXXXX—XXXX     鸭肝炎病毒1型和3型双重RT-PCR检测方法DuplexRT-PCRassayfordetectionofduckhepatitisvirustype1andtype3点击此处添加与国际标准一致性程度的标识     XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施     安徽省质量技术监督局   发布DB34/XXXXX—XXXX前言本标准依据GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本标准由安徽省农业标

2、准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安徽省动物疫病预防与控制中心等本标准主要起草人：潘孝成、占松鹤等6DB34/XXXXX—XXXX鸭肝炎病毒1型和3型双重RT-PCR检测方法1范围本标准规定了鸭肝炎病毒1型（DHV-1）和鸭肝炎病毒3型（DHV-3）双重RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于鸭病变肝组织、接种疑似病料的鸭胚尿囊液或细胞培养物中DHV-1型和/或DHV-3型核酸的检测。2缩略语下列缩略语适用于本文件。DHV：鸭肝炎炎病毒(duckhepatitisvirus）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（rev

3、ersetranscription-polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus）PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffe

4、rsolution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（trisacetate-EDTAbuffer）EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）3主要仪器3.1PCR扩增仪。3.2台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。3.3电泳仪。3.4凝胶成像系统。3.5冰箱（-20℃；-80℃）。3.6微波炉。3.7分析天平（准确度0.01g以上）。6DB34/XXXXX—XXXX3.8水浴锅。3.9微量移液器（2.5µL；10µL；200µL；1000µL）。4试剂和材料4.1RNA抽提试剂：Trizol或其他商品化RNA提取试剂。4.2氯仿、异丙

5、醇、无水乙醇。4.3M-MLV反转录酶。4.4RNA酶抑制剂。4.5DEPC处理的灭菌水。4.6TaqDNA聚合酶。4.7dNTP。4.8DNA分子质量标准（DNAMarker）。4.9RT-PCR反应试剂。4.10EB（10µg/µL）或核酸染料。4.11磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），见附录A中的A.1。4.1250×TAE电泳缓冲液，见附录A中的A.2。4.131%琼脂糖凝胶，见附录A中的A.3。4.14引物：DHV-1扩增上游引物，5’-GGTGATTCTAACCAGTTGGGG-3’，下游引物，5’-TTCAATTTCC

6、AGATTGAGTTCAAA-3’；DHV-3扩增上游引物，5’-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3’，下游引物，5’-ACGAACCAGCCATTGACG-3’，引物浓度均为10pmol/µL。4.15阳性对照样品：DHV-1和DHV-3鸭胚接种尿囊液毒；阴性对照样品：正常鸭胚尿囊液。5样品的采集及处理5.1采样工具15mL离心管、1.5mL离心管、剪刀、镊子和研钵，经121（±2）℃，15min高压灭菌并烘干。5.2采样方法5.2.1鸭病变肝组织6DB34/XXXXX—XXXX采取病死或剖杀鸭的肝组织1g左右，按1:5倍体积加入PB

7、S，研磨冻融3次，装入15mL灭菌离心管中，8000g离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。5.2.2鸭胚尿囊液和细胞培养物鸭胚尿囊液、细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。6RT-PCR检测6.1RNA提取6.1.1用Trizol或其他商品化RNA提取试剂提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的RNA。6.1.2200μL的样品和800μLTrizol置于一个1.5mL离心管，反复颠倒混匀，室温静置5min。6.1.312000g4℃离心5min，吸取上清液移入新的离心管中，加入200μL氯仿，用手剧烈

8、振荡15s，室温静置5min。6.1.412000g4℃离心15min，吸取上清