欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:5915077
大小:24.50 KB
页数:1页
时间:2017-12-28
《rna提取方法及其比较》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、Trizol法1)将新鲜叶片约100mg放入液氮预冷过的1.5ml的Eppendorf管中,用带有200ul枪头的加样枪迅速将材料捣碎成粉末(捣碎过程中Eppendorf管部分浸在液氮中),然后加入1mlTrizol试剂。振荡,充分混匀后,冰浴静置15min。2)加入200ul预冷的氯仿,振荡混匀,冰浴静置5min。4℃,12000g离心15min。3)吸取上清,加入与上清液成0.6倍体积的高盐溶液(1.2mol/L氯化钠和0.8mol/L柠檬酸钠)轻轻颠倒混匀,再加入与高盐溶液等体积的异丙醇,轻轻颠倒混
2、匀,-20℃静置15min。4℃,12000g离心5min。4)弃去上清,加入1ml70%的乙醇洗涤沉淀。4℃,7500g离心5min。5)弃去上清,将沉淀干燥5min,加入40ulDEPC水溶解沉淀。CTAB-LiCl法:取0.2g新鲜组织或-70℃保存的样品,在液氮中充分研磨成粉末状,将磨好的粉末迅速转移至65℃预热的含有600μlCTAB提取液的离心管中,立即涡旋振荡30s,使其混匀;置65℃水浴中2~5min,期间涡旋振荡3~5次;稍微冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min后,4℃,120
3、00r/min离心15min;取上清液,加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min,4℃,12000r/min离心15min;将上清转移到一新的离心管中,加入1/3体积的8mol/LLiCl,使其终浓度为2mol/L,4℃过夜沉淀;4℃,12000r/min离心20min,弃上清;分别用70%乙醇,无水乙醇洗沉淀,室温晾干,加30~50μlDEPC-H2O溶解沉淀。CTAB-异丙醇法:步骤同CTAB-LiCl法,用等体积的异丙醇沉淀。CTAB-LiCl及CTAB-异丙醇法都能成功的提取拟南芥及烟草幼嫩种子的
4、总RNA,只有Trizol法没有提取成功。在Trizol法提取的RNA中,未检测到28SrRNA和18SrRNA,只检测到5SrRNA,说明Trizol法不适合提取拟南芥及烟草幼嫩种子的总RNA。在CTAB-LiCl及异丙醇法中,28SrRNA和18SrRNA条带清晰,28SrRNA的亮度基本为18SrRNA的2倍,表明提取的总RNA很少降解。CTAB-异丙醇法提取的5SrRNA条带较CTAB-LiCl法明显。CTAB-异丙醇法提取的RNA电泳检测时,在点样孔下方有明显的亮带,说明该方法提取的RNA有较多
5、的基因组DNA污染;CTAB-LiCl法所提取的总RNA基本无基因组DNA污染,但是对小分子RNA的沉淀效果不如CTAB-异丙醇。反转录是检测RNA质量的良好方法,因为多糖等杂质的污染将抑制RNA的反转录,同时RNA的降解也会影响mRNA反转录的cDNA长度,导致后续试验失败。
此文档下载收益归作者所有