细胞转染步骤.doc

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1、细胞转染及其筛选1.传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘向6cm盘中加入3ml培养基，“米”字形摇晃。当细胞生长到50%-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染2.配置转染体系：（6cm盘）2.4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基。混匀后室温静置10-15min孵育。3.将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。4.将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。5.12小时，换液后进行显微镜拍照观察。6.再过6h加入G418，进行筛选（始终在6cm盘中进行），使用G418浓度：600µg/mlG4

2、18的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。7.3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变，只到细胞呈单个细胞那种，当细胞死的过多时，可考虑药物浓度减半。筛选出稳定表达的cell。8.挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul，在96孔板中加入培养基150ul/孔，在加入细胞悬液10ul/孔，待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm盘增殖。2.伴随着细胞的生长，可能最后会变成细胞簇，故可以用黄枪头把细胞菌落挑出，放入24孔板里面。9.单克隆鉴定：

3、提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。10.先做RT-PCR筛选一部分，在做western继续筛选一部分。所需物品：1.转染试剂（AttracteneTransfectionRegent）；2.96孔板；3.24孔板；4.6孔板；5.6cm盘；6.G4187.1mlHEPES液