磁珠分选步骤.doc

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1、磁性标记和分选步骤：1.制备无菌Buffers,冰上放置。细胞染色缓冲液（cell-stainingbuffer）：含3%热灭活胎牛血清和0.1%叠氮化钠的PBS。1×BDIMag™buffer：按1:10稀释(10X)BDIMag™Buffer，用无菌蒸馏水或加有0.5%BSA，2mMEDTA和0.1%叠氮化钠的PBS稀释。2.无菌操作，从外周淋巴组织内制备单细胞悬浮液。然后用70μm的尼龙细胞过滤器滤除细胞簇和组织碎片。用cell-stainingbuffer制备细胞悬浮液。3.细胞计数：如果细胞浓度在10x106和20x106/ml之间进行第

2、3步，如果浓度低于10x106如，离心细胞，并用cell-stainingbuffer重悬细胞至终浓度20x106/ml。4.可选：在细胞悬液内添加BDMouseFcBlock纯化的抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体2.4G2（BDMouseFcBlockpurifiedanti-mouseCD16/CD32mAb2.4G2），每1x106个细胞添加0.25μg，然后冰浴15min.5.添加生物素标记的小鼠树突状细胞富集混合物（BioinylatedMouseDendriticCellEnrichmentCocktail），每1x106个细胞添加

3、5μl,冰浴15min.6.用10x过量体积的1XBDIMag™buffer洗涤标记细胞，300×g离心7分钟并小心吸去所有上清液。7.彻底涡旋BDIMag™StreptavidinParticlesPlus–DM后，每1x106个细胞添加5μl。8.混匀，然后6˚C-12˚C冷藏30min.9.用1XBDIMag™buffer将标签量提高到20到80x106/ml。10.把标记细胞转移到12x75mm的圆底试管，添加的最大体积不超过1.0ml。把这个positive-fraction管放到BDIMagnet™(水平位置)8min。对于较大体积，可

4、把细胞转移到17x100mm圆底试管，添加的最大的体积不超过3.0ml。把这个positive-fraction管放到BDIMagnet™(垂直位置)8min。11.当管在BDIMagnet™上时，用无菌巴斯德吸管轻轻的吸取上清至一个新的无菌管内。12.从BDIMagnet™取出positive-fraction管，添加1XBDIMag™buffer到与步骤8相同的体积。上下吹打10-15次，重悬positivefractionwell，并重置于BDIMagnet™上6-8min.对17x100mm管，重置于BDIMagnet™上8min。13.用

5、一个新的巴斯德吸管轻轻吸上清和步骤10中的enrichedfraction。混合。14.把含有结合enrichedfraction的管再置于BDIMagnet™6-8min。对17x100mm管，重置于BDIMagnet™上8min。15.轻轻吸出上清并置于一个新的无菌管内。两次enrichedfraction不含有boundantibodies和磁性粒子。细胞可用后续应用。16.留在原管内的正选细胞可用适当的缓冲液或培养基重悬以备后续应用，包括流式细胞系检测。17.未分离的细胞悬浮液样品和正选富集positiveandenrichedfracti

6、ons的样品，应用流式细胞仪评估细胞分离效率。