关于人-鼠嵌合抗体制备的可行性

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1、..关于人-鼠嵌合抗体制备的可行性一、概述人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自鼠单克隆抗体，而恒定区那么来自人的抗体。它是通过从杂交瘤细胞别离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞表达产生。嵌合抗体既保存了亲本抗体特异性结合抗原的能力，又大大减少了鼠源性在人体的免疫原性，其半衰期明显延长，且在介导CDC及ADCC方面亦明显增强。二、市场分析附表是中国SFDA批准上市和进入临床的治疗型单抗药物-.jz*..抗体名称厂家靶抗原抗体类型适应症研发阶段Muromonab-CD3强生

2、CD-3鼠源抗移植排斥批准上市Rituximab罗氏CD-20嵌合B细胞非霍奇金淋巴瘤批准上市Trastuzumab罗氏HER-2人源化乳腺癌批准上市Basiliximab诺华CD-25嵌合抗移植排斥批准上市Trastuzumab基因泰克HER-2人源化乳腺癌批准上市OKT3生物制品研究所CD-3鼠源抗移植排斥批准上市抗人IL-8单克隆抗体乳膏宏远逸士生物公司IL-8鼠源银屑病批准上市重组人源化抗人表皮因子受体单克隆抗体注射液百泰生物药业公司人表皮因子受体人源化上皮源性肿瘤批准上市碘［131I］美妥昔单抗注

3、射华神集团，第四军医大学鼠源肝癌批准上市碘［131I］人鼠嵌合型肿瘤细胞核单克隆抗体注射液美恩生物技术公司嵌合抗肿瘤批准上市重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体－抗体融合蛋白国健药业公司肿瘤坏死因子人源化银屑病和强直性脊柱炎批准上市鼠抗人T淋巴细胞CD3外表抗原单克隆抗体天康生物制品公司CD-3鼠源抗移植排斥临床研究注射用抗肾病综合症出血热病毒单克隆抗体〔I型〕生物制品所，第四军医大学鼠源出血热临床Ⅲ期抗人肝癌单抗Hepama 1中科院细胞所鼠源肝癌临床研究抗乙型脑炎单抗生物制品所，第四军医大学鼠源乙型脑炎临床研究注

4、射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白美恩生物公司嵌合肿瘤临床研究-.jz*..目前国上市的单抗药物有11个，其中5个是国外进口产品，我国上市的自行开发的治疗性单抗药物的有6个，处于临床研究阶段的有5个(表6)。其中，生物制品研究所抗肾移植单抗OKT3〔注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体〕，也是最早批准上市的国自行研制的抗体，具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官的排斥反响；由百泰生物药业与古巴合作开发的I类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体〞〔商品名：泰欣生〕于2005年

5、4月11日获得国家I类新药证书。这是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物，它的问世标志着我国在癌症靶向治疗和人源化抗体药物领域取得重大突破，该药主要用于治疗头颈部、食管、肺部、乳腺、结直肠等部位的上皮源性肿瘤；由第四军医大学、华神集团股份联合研制的碘［131Ｉ］美妥昔单抗注射液〔商品名：利卡汀〕，于2005年4月20日获得国家I类新药证书。这是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。一、应用嵌合抗体目前主要用于药物治疗方面，与鼠抗相比，嵌合抗体既保存了鼠源可变的高亲和

6、性，又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反响的发生几率，改善了临床治疗效果，与其它小分子基因工程抗体相比，嵌合抗体作为完成的抗体分子，在体半寿期更长，并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。 二、技术路线从杂交瘤细胞中提取总RNA反转录合成cDNA扩增轻链、重链的V区基因插入含信号肽及人Ig重链、轻链C区基因的真核表达载体转染Sp2/0细胞克隆、测序分析制备腹水生产抗体检测抗体特异性与人源性酶切鉴定、测序分析三、材料与仪器-.jz*..1．材料大肠杆菌DH5α，大肠杆菌感受态细胞，T-A克隆

7、载体T-EasyVector，含信号肽及重链、轻链恒定区基因的质粒pAc-κ-CH3，分泌单抗的杂交瘤细胞，真核表达载体pcDNA3.1，小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0。2．主要试剂氨苄西林钠，限制性切酶，T4DNA连接酶，TaqDNA酶，TrizolRNA提取试剂盒，反转录PCR试剂盒，琼脂糖，嗅化乙锭(EB)，dNTPs，DNAMarker，DNA凝胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒，胎牛血清，无血清培养液，二甲亚砜(DMSO)，转染试剂盒LipofectamineTM2000，MTX，抗原，羊抗人IgGFc片段-

8、HRP酶标抗体。3．主要仪器低温高速台式离心机，恒温摇床，恒温水浴箱，水平式电泳仪，PCR扩增仪，紫外分光光度计，紫外透射仪，CO2培养箱，倒置显微镜，干净工作台，酶标仪。一、关键技术与方法1．可变区基因克隆1.1　RNA提取及反转录取对数生长期的杂交瘤细胞株约107个细胞，按照TrizolRNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA，再进展RT-PCR扩增，回收纯化扩增产物备用。1.2　扩增轻链、重链的V区基因根