2010-2016年间我国北方部分地区支原体型奶牛乳房炎病原流行病学调查

《2010-2016年间我国北方部分地区支原体型奶牛乳房炎病原流行病学调查》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

５１．３学校代码２２３分：Ｓ８：１０类号学号：ＺＳ１５３０３９密级：公开＾龍灰農皇乂者专业学位硕士论文２０１０－２０１６年间我国北方部分地区支原体型奶牛乳房炎病原流行病学调查陈嘉研究生：杨颗粒教授指导教师：第二导师：于力研究员兽医硕士类别（领域）：全日制培养方式：培养学院：动物科技学院中国·大庆２０１７．０５ 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。尽我所知，论文中不包，除了文中特别加以标注和致谢的地方外一含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八农垦大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。研究生签名：日期：ｗｒ年ｙ月日／ｇ关于论文使用授权的说明一、本人完全了解黑龙江八农垦大学有关保留使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用一影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八农垦大。学可以用不同方式在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研宄生签名导师签名：￣玄月曰期：衲年亨月３日日期：年｝日１１） 摘要乳房炎是制约奶牛养殖业健康发展的重要疾病之一，多种致病菌均可诱发奶牛乳房炎，其中支原体型乳房炎近几年备受关注。本研究旨在通过对我国北方黑龙江省、辽宁省、宁夏回族自治区、内蒙古自治区、天津市规模化奶牛场支原体型乳房炎病原流行病学的调查，初步查明支原体型奶牛乳房炎的阳性率及其与奶牛年龄、胎次、地区和年度的关系，为临床防制支原体型奶牛乳房炎提供实验依据。首先，参照牛支原体GN1168株B0W4300590基因序列(GenBank登录号：CP019639.1)以及leachii支原体GN407株LPPA外膜蛋白编码基因序列(GenBank登录号：HQ699892.1)设计两对特异性引物(531U28/1371L25)和(17U26/556L22)，通过优化PCR退火温度等反应条件，建立了牛支原体和leachii支原体的两种PCR检测方法。特异性试验结果显示，这两种PCR方法可以特异性扩增牛支原体和leachii支原体，而与丝状支原体山羊亚种(Mmc)、绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体丝状亚种(Mmm)、山羊支原体山羊肺炎亚种4(Mccp)无交叉反应。敏感性试验结果显示，该方法检测出牛支原体的最低浓度为10CCU、5leachii支原体的最低浓度为10CCU。符合性试验结果显示，该方法对两种标准阳性支原体进行检测，所检测出的阳性结果与支原体分离培养方法所检测出的阳性结果一致，符合率达到100%。上述结果表明，本研究建立的牛支原体和leachii支原体PCR检测方法特异性强、敏感性高，结果准确可靠，可实现高通量快速检测牛支原体和leachii支原体的目的。其次，应用本研究建立的两种PCR方法对采集于5个地区28个规模化奶牛场的539份临床型乳房炎的乳汁样品进行检测，总体检测结果显示：共检测到41例支原体，阳性率为7.61%，其中包括2例leachii支原体，总阳性率为0.371%，39例牛支原体，总阳性率为7.24%。地区检测结果显示：黑龙江省12个牛场的275份样品中，leachii支原体阳性为2例，牛支原体阳性为19例；辽宁省及宁夏回族自治区的97份样品中未检测到牛支原体和leachii支原体；天津市54份样品中无leachii支原体阳性，牛支原体阳性为5例；内蒙古自治区113份样品中无leachii支原体阳性，有15例牛支原体阳性。年度检测结果显示：2010年的40份样品中leachii支原体阳性样品1份，阳性率为2.50%，牛支原体阳性样品4份，阳性率为12%；2011年的85份样品中leachii支原体阳性样品1份，阳性率为1.17%，牛支原体阳性样品11份，阳性率为12.9%；2016年的414份样品中没有检测到leachii支原体，牛支原体阳性样品24份，阳性率为5.23%。支原体型乳房炎与奶牛年龄、胎次相关性研究结果显示：118头2-3岁奶牛，5头阳性，阳性率为4.24%；180头3-5I 岁奶牛，12头阳性，阳性率为6.67%；241头5-7岁奶牛，24头阳性，阳性率为9.96%；118头1-2胎次奶牛，3头阳性，阳性率为2.54%；180头3-4胎次奶牛，12头阳性，阳性率为6.67%；241头5-6胎次奶牛，27头阳性，阳性率为11.20%。综上所述，本试验成功建立了牛支原体及leachii支原体的PCR检测方法。初步阐释支原体型奶牛乳房炎在我国北方部分地区散发、少发的特点，且该病与奶牛的年龄、胎次呈正相关。关键词：奶牛，乳房炎，支原体，聚合酶链式反应，流行病学II AbstractBovineMastitisisoneoftheimportantdiseaseswhichrestrictthestabledevelopmentofthedairyindustry.Avarietyofpathogenicbacteriumcaninducetheoccurrenceofbovinemastitis.Asoneofthepathogenicbacterium,Mycoplasmahasbeenpaidmuchattentioninrecentyears.DuringtheresearchofMycoplasmamastitispathogenicepidemiologyoflarge-scaledairyfarmslocatedinHeilongjiangprovince,Liaoningprovince,theNingxiaHuizuAutonomousRegion,theInnerMongoliaAutonomousRegion,TianjinCity,theauthorfoundoutthepositiverateofMycoplasmabovinemastitis,aswellastherelationshipbetweentherateandthecow'sages,parities,theinvestigationofareaandtime.ThepapercouldprovidetheexperimentbasisforclinicalpreventionofMycoplasmabovinemastitis.Firstly,theauthordesignedtwopairsofspecialprimers(531U28/1371L25)and(17U26/556L22),whichtooktheB0W4300590genesequenceofMycoplasmabovine(M.bovis)GN1168strain(GenBankand:CP019639.1)andtheoutermembraneproteincodinggenesofMycoplasmaleachii(M.Leachii)GN407strain(GenBankand:HQ699892.1)asreference.AndtheauthorultimatelyestablishedthetwoPCRdetectionmethodsoftheM.bovisandM.leachiibyoptimizingthereactionconditionssuchasPCRannealingtemperature.Accordingtotheresultsofspecifictest,theabove-mentionedtwoPCRmethodscouldachievetheamplificationofM.bovisandM.leachiispecifically,andhadnocrossreactionswithotherMycoplasma(suchasMycoplasmamycoidessubsp.Capricolum,Mycoplasmaovipneumoniae,Mycoplasma.mycoidessubsp.MycoidesSmallColonyType,Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae).SensitivitytestresultsshowedthattheminimumconcentrationoftheM.45bovisandM.leachiiwere10CCU(colorchangeunit)and10CCU,respectively.Compliancetestresultsshowedthat,bytestingtwostrainsofstandardpositiveMycoplasma,thepositiveresultswereconsistentwiththeresultswegotfromtheMycoplasmacultivationmethod.Andthecoincidenceratecameto100percent.TheseresultsconfirmedthatthePCRestablishedinthisstudyisafast,sensitive,specificandreliablemethodfordetectingM.bovisandM.leachii.Secondly,theauthorusedthetwoPCRmethodstotestthe539milksampleswithclinicalmastitisof28large-scaledairyfarmsin5regionsinChina.Theoverallresultsshowedthat41Mycoplasmaweretestedwiththepositiverateof7.61%and2M.Leachiiweretestedamongthetotalnumber,withthepositiverateof0.371%.Therestpartsofresultswere39M.bovis,withthepositiverateof7.24%.Theresultsofregionaltestrevealedthatamong275samplesfromHeilongjiangprovincein12cattleherds,2M.leachiiand19M.bovispositivesamplesweredetected.M.bovisandM.leachiiwerenotdetectedin97samplesfromLiaoningprovinceIII andtheNingxiaHuizuAutonomousRegion.5M.bovispositivesamplesweredetectedandM.leachiiwerenotdetectedin54samplesfromTianjinCity.15M.bovisandnoM.leachiiweredetectedin113samplesfromInnerMongoliaAutonomousRegion.Theannualtestresultsindicatedthataccordingtoinvestigatedthe40samplesin2010,theauthordetected1M.Leachiiwiththepositiverateof2.50%and4M.Boviswiththepositiverateof12%.Amongthe85samplesin2011,theauthordetected1M.Leachiiwiththepositiverateof1.17%and4M.boviswiththepositiverateof12.9%.Andamongthe414samplesin2016,therewerenoM.Leachiidetected,and24M.bovisweredetectedwiththepositiverateof12.9%.AccordingtotheresultsoftheresearchoftherelationshipbetweentheMycoplasmamastitisandthecow’sageandparities,theauthorgotsomeinformation.Firstly,amongthe118samplesfromthecattlewiththeageof2to3,5cowswerepositiveandtheratewas4.24%.Amongthe180samplesfromthecattlewiththeageof3to5,12cowswerepositiveandtheratewas6.67%.Andamongthe241samplesfromthecattlewiththeageof5to7,24cowswerepositiveandtheratewas9.96%.Secondly,whencametothevariousparities,withinthe118samplesfromthecattlewiththeparityof1to2,3cowswerethepositiveand2.54%wasthepositiverate.Withinthe180samplesfromthecattlewiththeparityof3to4,12cowswerethepositiveand6.67%wasthepositiverate.Andwithin241samplesfromthecattlewiththeparityof5to6,27cowswerethepositiveand11.20%wasthepositiverate.Inconclusion,thetestsuccessfullyestablishedthePCRdetectionmethodsofM.bovisandM.leachii.TheMycoplasmaBovineMastitishadalowanddiffusemorbidityinsomenorthernareasofourcountry.Itshowedanincreasingtendency,andhadpositivecorrelationwiththecow’sageandparity.Keywords:Dairycow,Mastitis,Mycoplasma,PCR,EpidemiologyIV 目录摘要....................................................................IAbstract.................................................................III1引言....................................................................11.1奶牛乳房炎概述.............................................................................................................11.1.1乳房炎分类................................................................................................................11.1.2奶牛乳房炎致病因素................................................................................................11.2奶牛乳房炎主要致病菌.................................................................................................21.2.1大肠杆菌.....................................................................................................................21.2.2金黄色葡萄球菌........................................................................................................31.2.3链球菌........................................................................................................................31.2.4真菌............................................................................................................................41.2.5支原体........................................................................................................................41.3支原体概述.....................................................................................................................41.3.1形态及结构................................................................................................................51.3.2生长特性和培养特性................................................................................................51.3.3生化特性....................................................................................................................61.3.4抵抗力及致病性........................................................................................................61.3.5支原体的诊断方法....................................................................................................61.4牛支原体..........................................................................................................................71.4.1牛支原体概述............................................................................................................71.4.2牛支原体致病性........................................................................................................71.4.3牛支原体流行情况....................................................................................................71.5Leachii支原体.................................................................................................................71.5.1Leachii支原体概述....................................................................................................81.5.2Leachii支原体致病性................................................................................................81.5.3Leachii支原体流行情况............................................................................................81.6目的与意义.....................................................................................................................92材料与方法...........................................................112.1牛支原体及Leachii支原体PCR检测方法的建立....................................................11V 2.1.1主要试剂与仪器设备..............................................................................................112.1.2乳汁样品..................................................................................................................112.1.3标准对照菌株..........................................................................................................112.1.4引物设计..................................................................................................................112.1.5基因组提取..............................................................................................................122.1.6PCR及其条件的优化............................................................................................122.1.7特异性试验..............................................................................................................132.1.8敏感性试验..............................................................................................................132.1.9符合性试验..............................................................................................................132.2支原体型奶牛乳房炎病原流行病学调查...................................................................132.2.1主要试剂与仪器设备..............................................................................................132.2.2支原体培养基的配制..............................................................................................132.2.3样品地区的选择......................................................................................................142.2.4样品的采集..............................................................................................................142.2.5奶牛数据信息的统计..............................................................................................152.2.6样品的分离培养......................................................................................................152.2.7样品的检测..............................................................................................................163结果与分析..........................................................................................................................173.1牛支原体及Leachii支原体PCR检测方法的建立....................................................173.1.1引物的选择与设计..................................................................................................173.1.2PCR退火温度的优化...............................................................................................173.1.3特异性试验结果......................................................................................................183.1.4敏感性试验结果......................................................................................................193.1.5符合性试验结果......................................................................................................203.2支原体型奶牛乳房炎病原流行病学调查结果...........................................................203.2.1乳汁样品中牛支原体和leachii支原体的PCR检测结果....................................203.2.2乳汁样品中牛支原体和leachii支原体分离培养结果.........................................223.2.3PCR阳性样品的序列分析结果...............................................................................244讨论......................................................................................................................................254.1PCR检测方法的建立及初步应用................................................................................25VI 4.2病原流行病学调查结果分析.......................................................................................254.3应用前景及研究展望...................................................................................................265结论......................................................................................................................................27参考文献.................................................................29致谢.................................................................33作者简介.................................................................35VII 1.引言改革开放以来，我国人民的生活质量逐步上升，牛奶变成了我们摄入的营养物质中必不可少的蛋白质来源，所以奶牛的健康尤为重要，乳房炎是影响奶牛健康的重要因素之一，该病不但降低了奶牛的生产性能，也降低了乳品质，每年给我国乃至世界奶业的发展造成巨大的经济损失。1.1奶牛乳房炎概述奶牛乳房炎是指奶牛在各种疾病因素的作用下，引起奶牛乳腺发生炎症的过程，因此[1-4]又称为乳腺炎。奶牛乳房炎的诱因包括病原微生物、环境卫生、饲养管理及奶牛的遗[5-6]传等方面，它不但会降低奶牛的泌乳量，与此同时还会影响到牛奶的品质，特别是对于奶牛的隐性乳房炎而言，约占其致病因素的73%。据报道，美国奶业中因乳房炎造成的[7]损失每年高达20多亿美元，在英国的奶牛养殖业中，乳房炎所导致的奶牛淘汰率为[8]3%，我国相对于养殖业发达的国家，损失更为严重，每年每头牛约1000-3000元的损[9-11]失。我国对于奶牛乳房炎的研究与发达国家相比较起步较晚，在近几年的不断研究中[12]取得了一些进展，但远未达到彻底解决实际问题的目标。1.1.1乳房炎分类在1978年，美国奶牛乳房炎委员会按照奶牛的乳房和所挤出的乳汁是否出现肉眼可以观察到的变化，将奶牛的乳房炎分为两种，一种是临床型乳房炎(Clinicalmastitis)，另一种为隐性乳房炎(Hiddenmastitis)。临床型乳房炎在奶牛患病前期会导致奶牛产奶量减少，随着病程的加重，奶牛的乳区逐渐肿胀变得硬化、化脓，最后甚至会导致乳房的萎缩，失去泌乳能力。在全球范围内，每年大约有10%左右的病牛因为临床型奶牛乳房炎而被淘汰[13]。隐性乳房炎是指奶牛的乳房和其产出的乳汁几乎不出现可观察到的变化，因临床症状[14]不明显不容易被饲养者发觉，需要采用特殊的方法才能够检测出奶牛是否感染乳房炎，[15][16]并且在防制中存在病原抗药性增强、药物残留等问题。奶牛群体中大多数都存在隐性[17][18]乳房炎，在我国其发病率为60%-70%左右。1.1.2奶牛乳房炎致病因素诱发奶牛乳房炎的过程复杂，诱因包括病原微生物、环境卫生、管理因素及奶牛的遗传因素等方面，地域性的差异也是诱因之一。饲养因素包括：养殖者对奶牛乳房炎的关注程度、奶牛养殖的营养、饲料以及环境卫1 生。关注程度表现在养殖者对其采用的榨奶方式、圈舍的规划等众多因素。部分牛场很少定时检测奶牛隐性乳房炎，等其转为临床型奶牛乳房炎才意识到问题的严重性。同时不洁净的榨奶设备也容易引起奶牛乳房炎。对于支原体而言，较差的生活环境为其提供了良好的生存机会，增加了奶牛由支原体感染乳房炎的几率。饲料配方不合理也会导致奶牛营养不良，降低机体免疫力，从而更易诱发乳房炎。适合奶牛生长的温度约为8~20℃，过高、过低、过湿都会引起机体的应激，而诱发乳房炎。奶牛自身的因素大致为：在奶牛的体型中，拥有悬垂乳房的奶牛比乳房大小适中、结实的奶牛容易接触地面的细菌，而引起乳房的损伤。乳房的乳头损伤后，会影响乳头括约肌的闭合，给致病菌提供进入乳房的机会，从而导致乳房炎的发生；奶牛的年龄，牛奶中的体细胞以及乳房炎的发病率随着奶牛年龄的增加而上升，奶牛每度过一个泌乳期，乳导管就会随之扩大，乳头括约肌逐渐的变得松弛，使得乳头孔不断变大，致病菌就会有更多的机会能进入乳房，从而引起奶牛乳腺组织的损伤；在奶牛泌乳初期，乳房水肿、机体抵抗力下降，后期和干奶期，随着分泌的乳素逐渐减少，乳房的抵抗力降低，通过致病菌的入侵引起乳房的感染；基于人们对奶牛产奶量的要求，长期的选育也会导致疾病易感性的增加，尤其是奶牛乳房炎。病原微生物因素主要涵盖以下几类：细菌类主要包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、[19]乳房链球菌等；病毒主要包括口蹄疫病毒、疱疹病毒等；真菌主要包括毛孢子菌属、曲[20]霉菌属；支原体至少有十种以上，其中报道最多的是牛支原体，随着我国养牛规模的不断扩大，支原体型奶牛乳房炎呈上升趋势，且不断发现新型致病支原体。1.2奶牛乳房炎主要致病菌1.2.1大肠杆菌大肠杆菌为革兰氏阴性短杆菌，主要由菌体、鞭毛和荚膜三个部分构成，0.5-3微米大小，有鞭毛，无芽孢，好氧且兼性厌氧，适宜生长的温度为37℃，适宜PH为中性偏碱。可以水解葡萄糖、甘露醇和阿拉伯胶等。奶牛乳房炎中的革兰氏阴性菌，以大肠杆菌为主，最近报道其他学者成功的分离巴氏[21-22]杆菌、沙门氏菌等。有些学者提出某些特定的大肠杆菌较易在奶牛乳腺内存活，部分[23-24]学者认为所能引起乳房炎的大肠杆菌基本是一致的。革兰氏阴性病原菌对于乳房炎的致病力研究，近几年有了一定的进展。细菌可以通过利用牛奶中的乳糖等营养物质进行快速的生长繁殖，增殖越快，释放的越多，炎症反应越2 [25]快，越容易出现临床症状。影响乳腺内细菌繁殖的主要因素是奶牛所处的泌乳阶段和乳汁中的白细胞数以及抗生素使用情况。识别病原启动免疫反应依赖于乳腺内感染病原菌的[26]数量，研究表明在初产奶牛中增加大肠杆菌的攻毒剂量能够引起免疫反应更迅速，而且[27]乳腺上皮细胞的细胞因子水平与攻毒大肠杆菌浓度呈明显正相关，从而证实了初始细菌数量与免疫反应的关系。持续性感染是所有乳房炎中的难题，严重的会引起奶牛的死亡，大肠杆菌持续性感染会使体细胞数不断上升，使乳房炎反复发作，难以根治。1.2.2金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属，革兰氏染色呈阳性，根据菌落色素沉积为金黄色与其他葡萄球菌相区分。该菌可以在干燥的血液、乳汁样品、浓汁中存活2到3个月，其抵抗力较其他无芽孢的细菌强，大部分可以分解糖类来为自身提供营养物质，且部分致病菌株能够还原硝酸盐。金黄色葡萄球菌容易产生耐药性，治疗难度较大，可形成顽固的乳房炎，[28]如不及时治疗可造成奶牛的淘汰和死亡。金黄色葡萄球菌具有11个血清型，不同国家和地区多流行荚膜多糖5型、8型和336型，荚膜多糖5型和8型是乳房炎中常见的血清型，也是较难治疗的血清型，金黄色葡萄球菌通过乳头管侵入上皮细胞并大量繁殖，之后释放溶血素等多种毒素来破坏细胞，在酶的作用下致使炎症扩大，被感染乳区里的金黄色葡萄球菌会持续定殖。在此过程中粘附素FnBPs和ClfA起到了重要的作用，粘附素对宿主细胞外基质成分具有极强的亲和力，能[29]够特异性识别配体。此外，金黄色葡萄球菌还在生存进化中产生了多种抗吞噬因子，例[30]如荚膜多糖、葡萄球菌A蛋白等。1.2.3链球菌链球菌属革兰氏阳性菌，广泛存在于大自然中，与乳房炎有关的主要是无乳链球菌(Streptococcus.agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)。该菌感染可能具有菌株特异性，少数导致临床型乳房炎，多引起隐性乳房炎，属于传染性致病菌，具有较强的传染性、较长的潜伏期等特点。无乳链球菌多见于乳腺，主要作用于乳房及乳头，吸附并破坏乳腺管壁，引起慢性感染，该菌可通过规范挤奶卫生和乳头消毒避免；停乳链球菌，主要在干奶期感染乳房，在感染乳区、扁桃体及生殖道可以分离得到，症状多数为局部乳房病变、食欲不振和发热等，对青霉素等敏感，用药后大多数乳房炎病情可以得到控制；乳房链球菌是干奶期感染的最3 常见病原，是临床型奶牛乳房炎的重要诱因之一，使用抗生素在干奶期进行治疗，感染率[31]可大幅度下降。1.2.4真菌真菌是最常见的一种真核生物，区别于植物、动物和细菌，与植物细胞壁不同的是，真菌的细胞壁不是纤维素而是几丁质、甲壳素、壳多糖等。真菌根据其形态可分成酵母菌、霉菌、担子菌三大类，这三类真菌均能够引起动物发病。条件性致病菌主要有隐球菌属、毛孢子菌属；其中隐球菌属常引起较为严重的临床型乳房炎，毛孢子菌属不易侵入组织，[32]但能够在在粘膜层生长并引发炎症反应。真菌性乳房炎主要是继发于急性或慢性乳房炎，多由医源性感染所引起，真菌对于抗生素不敏感，部分抗生素会使其易感性增强。部分学者认为，在多次大量使用抗生素等药[33]物后，乳房内的菌群的动态平衡被打破，导致大量致病的真菌生长，从而诱发乳房炎。据报道，真菌所引起的乳房炎多属于环境致病菌，常散发，很少大范围流行，各地发病情[34-36]况均不相同。1.2.5支原体支原体型乳房炎是乳房炎中近几年较为常见的一种类型，目前可以引起奶牛乳房炎的至少有12种，常见的是牛支原体、牛生殖道支原体等，以及2009年发生的leachii支原体，其中牛支原体是支原型奶牛乳房炎重要的病原体，具有较强的传染性，可通过挤奶、呼吸和配种等多个途径进行传播，leachii支原体作为新发病原同样备受关注。支原体型乳房炎与群体数量的大小密切相关，发病率在近几年不断攀升，这其中与奶牛养殖规模的盲目扩大有着密不可分的关系；此外，大量的引种会大大增加支原体感染的机会，并且没有及时接受免疫也会给奶牛带来感染支原体的几率。在大多数情况下，支原体引起的乳房炎临床症状表现为，通常只感染一侧乳区，且不易被发现，支原体可以通过血液传播，也可通过污染的牛奶传播给犊牛，还可以通过空气、卧床垫料、饮水、饲料等水平传播。目前研究表明，支原体生命力顽强，可以在潮湿的环境中存活数月之久，一旦满足支原体的致病条件，会在很短的时间内大范围流行，常规的抗生素对支原体乳房炎的治疗是无效的，最终导致奶牛的淘汰。1.3支原体概述支原体(Mycoplasma)又叫做霉形体，无细胞壁，结构单一，唯一可见的细胞器是核糖体，只有三层结构的细胞膜，多数呈球形，支原体大小为0.2～0.3um，可以通过细菌滤器，4 所以经常性的污染细胞，广泛分布于大自然中。支原体基因组的大小一般为500～2200kbp，多为双链DNA，散布于没有形成的核区或拟核内，以二分裂或芽生方式繁殖，由于其基因组小，缺乏编码氨基酸及能量代谢途径所需的许多重要的基因，因此不能自身合成氨基酸、脂类、和某些必须的营养因子等，因此支原体在体外培养时对培养基营养条件的需求[37]比细菌等大多数微生物苛刻。支原体的研究是从动物传染病-牛传染性胸膜肺炎开始的，于1898年由Nocard等首次分离得到，命名为胸膜肺炎微生物(Pleuropneumniaorganism，PPLO)，1967年命名为支原体，在1974年成立了国际支原体学组织，作为一门新的学科，形成了支原体学。随着对支原体培养基及其培养技术的不断研究，一些与人类和动物疾病相关的支原体被分离出[38]来，1991年Montagnier从艾滋病患者的淋巴细胞中分离到了梨型支原体(Mpi)，目前分离到的支原体大约有200余种。近年来，支原体的研究主要包括：支原体的系统发生与分类；粘附因子及其它表面蛋白功能研究；支原体与病毒之间的相互作用；支原体感染的治疗、控制；支原体感染与临[39]床疾病的关系等。在1995年生殖支原体G37株的基因组测序完成，此后Radcliff等人[40,41]完成了肺炎支原体(Mp)的基因组测序工程。随着近年来基因组学的发展及致病性支原体基因组测序的完成，给支原体研究奠定了良好的基础。1.3.1形态及结构支原体因缺乏细胞壁，所以呈现多形性，多以椭圆状、球状和丝状等，同属中的个体差异较大,由蛋白质膜、类脂和胆固醇等组成三层结构，中间层中的胆固醇含量较多，约为35%，能与胆固醇作用的物质均可破坏支原体膜系统，从而导致支原体死亡。支原体革兰氏染色呈阴性，吉姆萨染色呈淡紫色。1.3.2生长特性和培养特性支原体能够在人工配制的固体和液体培养基生长，但需要的营养成分较多且特殊，需要马血清、水解乳蛋白、葡萄糖等营养物质，适宜生长的温度为37℃，最适pH值7.8-8.0，大多数支原体的生长过程中还需要5%-6%的二氧化碳。支原体的人工培养周期较长，一般需要3天甚至更久的时间才能在液体培养基中看到轻微的浑浊以及培养基颜色的改变。在含有琼脂糖的固体培养基中，支原体菌落形态呈半球形，因其具有向下生长的特性，导致中心部分较厚，周围呈透明的颗粒样区域，所以在显微镜下观察为典型的“煎蛋样”形态。5 1.3.3生化特性部分支原体可以分解脂肪酸和大部分氨基酸，目前根据支原体是否能分解糖类将其分成两大类：一类可以对糖进行分解，包括葡萄糖等糖类，分解过程中能够产酸但是不产生气体；另一类不可以分解糖，通过分解氨基酸或脂肪酸，达到满足自身生长需求等目的。前者分解糖类后可以产酸，降低pH值，后者分解氨基酸产氨，升高pH值，人们根据这一性质，在支原体培养基中加入适量的酚红，来观察支原体的生长情况。1.3.4抵抗力及致病性支原体不耐热，45℃以上，20min，大多数支原体就会丧失活性，大部分能够破坏细胞膜的物质都可使其裂解死亡，如重金属、石碳酸、去污剂、皂素等，此外部分能够干扰蛋白质合成的抗生素，如红霉素和四环素等，支原体对其具有较低的耐药性，对青霉素、醋酸铊和亚硒酸盐等能抑制细胞壁合成的物质有较强的抵抗力。支原体能够粘附在细胞表面受体上，在宿主细胞表面吸收营养物质，引起细胞损伤，在新陈代谢的过程中会产生部分有毒的物质，如神经毒素和氨等，引起宿主细胞膜溶解损伤。1.3.5支原体的诊断方法1.3.5.1分离培养无菌采集乳汁样品、关节液、组织等，接种在培养基中，3天后平板内会出现部分针尖大小的菌落，5-7天后，在普通光学显微镜下可以观察到圆形、边缘整齐、具有典型“油煎蛋”形态的菌落，该培养结果即为阳性。如将病料接入支原体液体培养基中，等待7天或更久，才可以发现培养基轻度浑浊，并伴有颜色微黄的特性，该结果即为阳性。1.3.5.2免疫学诊断免疫学中通过检测支原体的抗原及其相应的抗体，对支原体做出早期的诊断。检测支原体的抗原对诊断支原体早期感染具有良好效果，目前已有用双抗夹心酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验和免疫印迹试验等检测支原体抗原的报道；测定抗体的方法中，包括特异性血清学检测和非特异性血清学检测。特异性血清学检测方法中，最常用的是补体结合试验；非特异性血清学方法有冷凝集试验，对支原体肺炎具有辅助诊断价值。1.3.5.3PCR诊断技术聚合酶链式反应的简称为PCR，是一种特异性扩增DNA片段的分子生物学技术，其6 最大的优势就是能将微量的DNA进行大幅扩增，达到检测的目的，能够准确的将引物与模板相结合，严格遵守碱基互补配对原则，具有特异性强、灵敏度高、误差小等特点，在实验室诊断鉴定中广泛使用。本研究在牛支原体和leachii支原体的两个支原体的特异性基因区段设计特异性引物，以建立这两种病原的PCR检测方法。1.4牛支原体1.4.1牛支原体概述牛支原体(Mycoplasmabovis)能够引起犊牛肺炎、关节炎和成年牛的乳房炎，多以呼[42][43]吸系统的疾病为主。1961年牛支原体首次在美国患有乳房炎的病牛中分离获得，此后牛支原体被广泛的关注，很多国家都发生过由牛支原体引起的相关疫情，各个养殖业大[44-46]国都受到了巨大的经济损失，牛支原体感染后也可明显增加其他病原的继发感染。1.4.2牛支原体致病性牛支原体引起的乳房炎主要通过接触在牛群中传播，且该类乳房炎通常不会伴发乳汁[47]中体细胞数升高的现象，Fox等报道牛支原体引起的乳房炎主要通过支原体污染物进[48]行传播。Gonzalez和Wilson认为大批量引种是牧场新发牛支原体性乳房炎的原因之一[49]。牛支原体可以从呼吸道粘膜、生殖道粘膜等乳腺外组织侵入到乳腺组织内，因此，呼[50]吸道感染牛支原体后容易继发牛支原体性乳房炎。研究报道氨基糖甙类和喹诺酮类抗生[51]素对支原体有一定的治疗作用，但由于抗生素的作用靶点多是抑制细菌细胞壁的合成，[52-53]因此，使用抗生素治疗不力常常会加剧其在牛群中的蔓延。牛支原体每年都会给养牛业造成严重的经济损失，因此开发牛支原体的新型疫苗及快速高效的诊断手段，对于牛支原体的流行病学的研究具有重要意义。1.4.3牛支原体流行情况[54]在我国，1983年黎济申首次分离到牛支原体，彭清洁于2011年再次从患乳腺炎牛[55-56]乳中牛分离到牛支原体，也有报道显示我国部分地区发生的肺炎疫情与牛支原体有关[57]。根据我国目前的牛支原体流行病学调查结果显示，牛支原在牛群中的抗体阳性率高达[58]85%，随着养牛业的不断发展和国内大量的引种，牛支原体的危害成为我国养牛业中一[59]个重要问题。此外牛支原体能够感染鸡，牛支原体很少会直接感染人。7 1.5Leachii支原体1.5.1Leachii支原体概述[60]Leachii支原体是牛7型支原体(Mycoplasmasp.Bovinegroup7，MBG7)新的命名，为支原体科支原体属成员，属于丝状支原体族，该族中的支原体均是反刍动物的致病菌，丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma,mycoidessubsp.Mycoides,Mmm)和山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumoniae,Mccp)是最重要的，是牛传染性胸膜肺炎(ContagiousBovinePleuroPneumonia，CBPP)和羊传染性胸膜肺炎(ContagiousCaprinePleuroPneumonia，CCPP)的病原体，是国际兽医局(OfficeInternationaldes[39]Epizooties，OIE)要求必须上报的动物传染病。目前的研究表明leachii支原体可以引起[61-67]奶牛的乳房炎、犊牛的关节炎以及犊牛肺炎。Leachii支原体最初是由Simmons于1963年在澳大利亚患多发性关节炎犊牛的关节液[62]内分离获得，典型代表菌株为PG50。之后，该病原菌陆续从患乳房炎的母牛、患关节[63-68]炎和肺炎的犊牛以及流产胎儿的体内获得分离。目前全世界大约有60个leachii支原体分离株，其中1株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队分离[69,70]，此分离株核苷酸序列分析结果显示，16SrRNA基因和LppA基因核苷酸序列均与[39]最初分离于澳大利亚的leachii支原体PG50具有最高的同源性，分别为99.9%和99.6%。1.5.2Leachii支原体致病性国内外研究表明，leachii支原体在患多发性关节炎犊牛的关节组织中分离获得，可以推断出leachii支原体是引起此病的病因之一。SimmonsGC等人研究发现，把leachii支原[63]体分离培养物注射到关节内后能够引起犊牛的关节炎。ConnoleMD等将leachii支原体[65]注入乳头管内也能够引起奶牛的乳房炎，但是乳房炎程度较轻，因此以上两个实验可以证实leachii支原体可以引起犊牛的关节炎和奶牛的轻度乳房炎。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队在2009年在分离获得leachii支原体后，也成功的复制[70]了犊牛关节炎的致病性试验。leachii支原体引起的犊牛多发性关节炎和奶牛乳房炎，其临床症状与其他一些致病菌所导致的病症相似，所以在临床上一旦爆发相关疫情就很难及时确诊以及实施后续的防治措施。1.5.3Leachii支原体流行情况根据目前的研究表明，leachii支原体的传播途径以及源头并没有肯定的答案。[58,59]Alexander认为，被饲喂leachii支原体污染乳汁的犊牛也可以诱发关节炎。根据目前的调查结果来看，同一时间引进的精液所配种的大多数母牛妊娠后所产下的犊牛100%患8 有关节炎，而其他途径购买的精液就不会有此情况，母牛产下的犊牛均为健康犊牛，因此本实验室推断leachii支原体的传播途径之一就是精液传播。此后针对该牛场进行了后续的调查，检测结果发现用带有leachii支原体污染的精液配种的母牛发生了乳房炎，所以推测，leachii支原体垂直传播途径之一为精液传播，水平传播途径之一为直接接触传播。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病团队已证明leachii支原体引起的犊牛多发性关节炎仅通过精液和血液传播，而精液传播是最主要的传播途径，呼吸道消化道等水平途径不能传播该病(常继涛等未发表资料)。因此，建立PCR方法检查精液是否污染，是目前控制该病的最有效途径。研究表明leachii支原体所引起的疾病多数因其传播途径的限制而呈局限性爆发流行，少有地域性、季节性发病。因此该病原可能具有独特的传播途径，1.6目的与意义通过对我国北方部分地区规模化奶牛养殖场临床型乳房炎乳样的采集，应用本研究所建立的牛支原体及leachii支原体PCR检测方法对样品进行检测，计算奶牛支原体型乳房炎的感染率，分析牛支原体及leachii支原体与奶牛个体因素、饲养管理、环境卫生的相互作用关系，阐明我国北方部分地区支原体型乳房炎的流行情况及支原体型乳房炎与奶牛年龄、胎次的关系，为下一步牛支原体和leachii支原体引起的乳房炎的致病机理和防控技术研究奠定基础。9 10 2材料与方法2.1牛支原体及Leachii支原体PCR检测方法的建立2.1.1主要试剂与仪器设备主要试剂：裂解液、MIX预混酶、去离子水、DNAMaker为天根生化有限责任公司产品，电泳液、AxyPrep基因组小量试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司。仪器设备：电泳仪EPS-300购自上海天能有限责任公司，电子天平FA1604N、低速离心机TDZ5-WS、电泳仪DYY-11B、小型高速离心机购自北京六一，梯度PCR仪(购自美国伯乐，水浴锅，超纯水仪UVFELGA购自普瑞德公司，紫外凝胶成像仪TANCN-3500购自美国伯乐。2.1.2乳汁样品来自我国北方部分省市主要规模化奶牛养殖场，包括黑龙江省、辽宁省、宁夏回族自治区以及内蒙古自治区，总共28个牛场，共计539份乳样，主要包括临床型乳房炎和疑似支原体感染奶牛乳汁及乳房炎久治不愈奶牛乳汁，冷冻保存运输。2.1.3标准对照菌株Leachii支原体GN407株，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新[68]团队分离于患关节炎犊牛的关节液，保存于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队；牛支原体(Mycoplasmabovis,M.bovis)、丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.Ca0pricolum,Mmc)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)、丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma,mycoidessubsp.Mycoides,Mmm)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)的灭活样品，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所支原体研究创新团队馈赠。2.1.4引物设计2.1.4.1牛支原体引物设计参照牛支原体GN1168株B0W4300590基因序列(GenBank登录号：CP019639.1)，根据文献中所给出的一对已测出牛支原体的相关基因设计一对牛支原体特异性引物，利用Oligo6.24软件设计引物，由公司进行合成。上游引物(531U28)：5'-CAACAAAGCTGTTGATGGTGTGTCATTT-3'下游引物(1371L25)：5'-TGCATAACGGCAAATTTTGATCTCG-3'11 2.1.4.2Leachii支原体引物设计以leachii支原体GN407株LPPA外膜蛋白编码基因序列(GenBank登录号：HQ699892.1)为模板，将该基因的跨膜区和信号肽部分截去，利用Oligo6.24软件设计一对特异性引物，由公司进行合成。上游引物(17U26)：5'-ATCCTAATAACCCAGAAACTAAACCG-3'下游引物(556L22)：5'-GATCTTGACTATATAACAACAT-3'2.1.5基因组提取2.1.5.1乳汁样品的预处理取乳汁样品750μl分装于2ml离心管，加入150μl裂解液，漩涡震荡器震荡1分钟，使其充分的均匀混合，放入-20℃冰箱中反复冻融3次，最后一次融化后采用12000×g，离心10min左右，取中间清澈液体350μl，以备下一步DNA的提取。2.1.5.2试剂盒提取DNA取已预处理样品或标准菌株纯培养物350μl，加入150μlC-L液和0.9μlRNaseA后，按照康宁生命科学(吴江)有限公司的AxyPrep基因组小量试剂盒进行DNA的提取。2.1.6PCR及其条件的优化2.1.6.1PCR反应体系的选择以支原体标准菌株的DNA为模板放入PCR仪中进行扩增。反应的总体系为25μl，其中去离子水5.5μl，MIX预混酶12.5μl，上、下游引物(10pM/μl)各1μl，支原体DNA模板5μl。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃30s，52℃30s，72℃2min，30个循环，最后72℃延伸10min。2.1.6.2PCR退火温度的优化在引物设计所给定的退火温度的基础上进行优化，设置7个不同梯度的温度：45℃、46.1℃、48.5℃、52℃、56.3℃、59.9℃、61.9℃，进行PCR扩增，通过琼脂糖核酸凝胶电泳的条带亮度及清晰度进行比较，选择最佳温度作为牛支原体和leachii支原体PCR的最适退火温度。2.1.6.3PCR产物回收和序列测定PCR产物回收：将切下的含有目的DNA片段的凝胶按照AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒操作说明进行DNA的回收纯化。阳性样品的序列测定：样品胶回收结束后，进行琼脂糖凝胶核酸电泳，检查是否有清12 晰的条带，分析其片段大小与目的片段是否一致，以检验是否胶回收成功，将初步鉴定为阳性样品的纯化产物送到哈尔滨博仕生物科技有限公司进行序列测定，收到公司返回的测序结果后在NCBI官网中使用BLAST进行基因对比分析。2.1.7特异性试验分别提取leachii支原体、牛支原体、丝状支原体山羊亚种(Mmc-Y-goat)、绵羊肺炎支原体(Mo-Y-98)、丝状支原体丝状亚种(Mmm)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)的DNA，以提取的DNA为模板，按优化的条件进行PCR。2.1.8敏感性试验8牛支原体和leachii支原体纯培养物的滴度均为10CCU/ml，对原培养物进行10倍倍比稀释，之后对原培养物以及稀释后的培养物进行DNA的提取，按照优化的条件进行PCR。2.1.9符合性试验为验证本试验所建立的牛支原体和leachii支原体的两种PCR检测方法的准确性和特异性，将牛支原体和leachii支原体分别接种于支原体液体培养基和固体培养基中，同时本研究所建立的PCR检测方法对这两种支原体进行检测。将标准支原体分离培养方法检测出的阳性样品与本研究所建立的PCR检测方法的阳性样品进行对比，计算符合率。2.2支原体型奶牛乳房炎病原流行病学调查2.2.1主要试剂与仪器设备主要试剂：PPLO肉汤，水解乳蛋白，葡萄糖，酵母浸液，醋酸铊，青霉素，酚红，丙酮酸钠，马血清，琼脂糖，去离子水，BMT乳房炎诊断液。仪器设备：乳房炎检测盘、电热恒温水槽DK-8D、4℃冰箱海尔BCD-206TASJ、-20℃冰箱海尔BCD-208K/A、培养箱9162MBE、电子天平FA1604N、CO2培养箱MCO-15AC、酸度计、分光光度计、空气恒温振荡器HZQ-C、生化培养箱LRH-250、20微米滤器，15ml离心管、50ml离心管、50ml注射器、超纯水仪UVFELGA购自普瑞德公司。2.2.2支原体培养基的配制液体培养基的配制见：表2-113 表2-1支原体培养基的配制Tab.2-1Mycoplasmaculturemediumprepartion成分添加量终浓度溶液1：基础肉汤(21gPPLO肉汤、697mlPPLO，2.1%5g水解乳蛋白加入到697ml水中)水解乳蛋白，0.5%溶液2：50%葡萄糖溶液20ml葡萄糖，1%溶液3：5%酵母浸液100ml酵母浸出物，0.5%溶液4：100mg/ml青霉素1ml青霉素，0.01%溶液5：1%酚红溶液2ml酚红，0.002%溶液6：50%丙酮酸钠溶液8ml丙酮酸钠，0.4%马血清150ml15%固体培养的配制：在表2-1的液体培养基的基础上添加约1.4%的琼脂糖，高压灭菌后冷却至70℃左右，添加液体培养基中其他成分，制备成含1%的琼脂糖固体培养基，倒平板，待温度冷却后置于4℃保存备用。2.2.3样品地区的选择我国奶牛养殖主要集中在我国北方大部分地区和南方部分地区，其中，内蒙古自治区的奶牛存栏量为全国最高，约200万头左右，占全国奶牛存栏量总量的16%左右；其次为河北约181万头，占全国总量13.2%；宁夏奶牛存栏56.7万头，也排在前列。2015年全国牛奶总产量约为3800万吨，其中内蒙古自治区、黑龙江省、河北省、河南省和山东省的牛奶产量均超过200万吨，约占全国牛奶总产量的60%。根据数据统计结果和本实验室的现有资源，样品地区的采集选为以下两个自治区、两个省和一个直辖市：内蒙古自治区2个规模化奶牛养殖场、宁夏回族自治区3个规模化奶牛养殖场、黑龙江省12个规模化奶牛养殖场、辽宁省5个规模化奶牛养殖场、天津市6个规模化奶牛养殖场。共计对28个规模化奶牛养殖场进行了样品的采集，共计收集了539份的临床型奶牛乳房炎的乳汁样品。2.2.4样品的采集2.2.4.1采样前的准备采购密封膜、碘酊、酒精、离心管(需要进行高压灭菌消毒，以保证无污染)，BMT乳14 房炎检测液，一次性手套，一次性防护服等。2.2.4.2采样操作根据奶牛耳号对离心管进行对应标号；挤奶前首先对奶牛的各个乳区用温水进行清洁，然后用75%的酒精进行消毒；奶牛挤奶前的头三把奶是不需要收集的，分别从四个乳区各挤5ml乳汁样品于离心管中，贴上标签，做好样品的记录；采集的过程中尽量避免离心管口接触到乳头等地方，避免不必要的污染，保证乳汁样品的无菌操作，挤奶时要做到稳、准、快。2.2.4.3乳汁样品的运输和保存：将采集好的乳汁样品迅速放在冰盒中，冰盒上贴上标签记录好采集的时间地点等主要信息，然后将冰盒放入泡沫箱中以免运输中倾洒和损坏，回到实验室后应立即放入-4℃冰箱中以备近期实验用，如果不需近期做实验需要把乳汁样品放在-20℃冰箱中保存备用，长期保存时要注意把乳汁样品的详细信息贴在装乳汁样品的盒子上，放入-70℃冰箱保存。2.2.5奶牛数据信息的统计在2010、2011年的本实验室所收集的乳汁样品的基础上，在2016年继续增加采样地区范围，根据我国北方奶牛业发展情况及文献报道有关支原体发病情况，又增加黑龙江省、辽宁省、天津市、宁夏回族自治区、内蒙古自治区等，基本上将我国北方的主要奶牛养殖地区涵盖，样品具有一定代表性。奶牛的年龄按照2-3岁为一组，3-5岁为二组，5-7岁为三组分类统计；胎次按照1-2胎为一组，3-4胎为二组，5-6胎为三组分类统计；而对于品种，所采奶牛90%为荷斯坦品种，结果分析不具有代表性。此外遵照每个牛场管理层的建议，对所有牛场基本信息不做任何泄露，仅供最后的数据分析。2.2.6样品的分离培养按照2.2.2所述支原体培养基配制方法进行培养基的配置，根据样品数量准备相应的液体及固体培养基，后将已采集的乳汁样品使用0.22微米的滤膜过滤，装在已灭菌的5mlEP管内，按牛号对其进行标号，从每个5mlEP管中取30μl乳汁样品，连枪头及乳汁样品同时打入装有液体培养基的试管内，再从每个5mlEP管内取100μl乳汁样品，按照平板划线的方式均匀的画在固体培养基上(以上步骤均按照要求在超净台中进行)，之后将液体培养基和固体培养基全部放入37℃培养箱中，在培养箱内加入适量无菌去离子水以保证培养箱内湿度，为支原体生长创造良好环境，以备后续观察。15 2.2.7样品的检测将采集自我国北方部分地区的牛乳汁样品，共计539份，按照上述方法进行预处理，后对539份乳汁样品使用试剂盒提取其DNA，将按照试剂盒所提取出的DNA，应用已设计好的牛支原体及leachii支原体的两对引物进行特异性PCR扩增，后经琼脂糖核酸凝胶电泳观察其条带的大小及其亮度，最后记录阳性样品的结果。16 3结果与分析3.1牛支原体及Leachii支原体PCR检测方法的建立3.1.1引物的选择与设计参照牛支原体GN1168株B0W4300590基因序列(GenBank登录号：CP019639.1)，设计牛支原体特异性PCR引物，因此段基因序列曾在其他实验中作为引物使用，所扩增出的片段为1912bp，具有较强的准确度，可以特异性的扩增出牛支原体。但是，扩增片段偏长，所以本试验在该基因序列的基础上设计牛支原体特异性PCR引物，其最终的目的片段大小为840bp。参照leachii支原体GN407株LPPA外膜蛋白编码基因序列(GenBank登录号：HQ699892.1)为模板，设计leachii支原体特异性PCR引物，因其lppA基因编码的LPPA蛋白具有粘附特性和免疫原性，不同支原体间lppA基因变异度较大，并且引物覆盖区域与GN407、GN408以及PG50株的同源性均为100%，与Mmm等支原体存在着明显的差异，因此，本研究以lppA基因为模板设计引物，该基因的目的片段大小为539bp。3.1.2PCR退火温度的优化在PCR过程中，如果引物已经确定，那么影响PCR方法的特异性及扩增效率的最主要因素就为退火温度。因此，将退火温度分别设定为45℃、46.1℃、48.5℃、52℃、56.3℃、59.9℃、61.9℃，进行梯度PCR扩增，以选择最优退火温度，按照所设计的牛支原体和leachii支原体的特异性引物，经过梯度PCR后的琼脂糖凝胶电泳显示，52℃时牛支原体和leachii支原体的PCR扩增的特异性以及扩增效率最好，因此PCR扩增的最佳退火温度为52℃(图3-1)。123456782000bp1.DL2000Marker；2：45℃;3：46.1℃；4：48.5℃；5：52℃；6：56.3℃；7：59.9℃；8：61.9℃lane1：DL2000Marker；lane2：45℃；lane3：46.1℃；lane4：48.5℃；lane5：52℃；lane6：56.3℃；lane7：59.9℃；lane8：61.9℃；图3-1PCR退火温度优化核酸电泳Fig.3-1NucleicacidelectrophoresisofPCRannealingtemperatureoptimization17 3.1.3特异性试验结果3.1.3.1牛支原体特异性试验结果按照2.1.5的方法分别提取牛支原体、leachii支原体、Mmc、Mo、MmmSC、Mccp的DNA，已提取的DNA为模板，按照牛支原体特异性引物：上游引物(531U28)，下游引物(1371L25)，对牛支原体、leachii支原体、Mmc、Mo、MmmSC、Mccp等6种支原体按优化后的条件进行PCR。PCR所扩增出的产物使用1%的琼脂糖核酸凝胶电泳检测，结果显示,其可以特异性的扩增出牛支原体，且条带清晰明亮，分子量约为840bp，与预期相符；不能扩增出leachii支原体、Mmc、Mo、MmmSC、Mccp等支原体，均没有条带出现图(3-2)。结果表明：针对牛支原体B0W4300590基因设计的PCR检测方法具有较强的特异性，能实现对牛支原体的特异性扩增，没有交叉反应。123456782000bp840bp图3-2PCR特异性试验核酸电泳Fig.3-2NucleicacidelectrophoresisofPCRspecificity1:DL2000marker;2：leachii支原体;3：水；4：牛支原体；5：丝状支原体山羊亚种(Mmc)；6：绵羊肺炎支原体(Mo)；7：丝状支原体丝状亚种小菌落型(Mmm)；8：山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)lane1：DL2000Marker；lane2：Mycoplasmaleachii；lane3：water；lane4：Mycoplasmabovis；lane5：Mycoplasmamycoidessubsp.Capricolum；lane6：Mycoplasmaovipneumoniae；lane7：Mycoplasma.mycoidessubsp.mycoidesSmallColonyType；lane8：Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae3.1.3.2Leachii支原体特异性试验结果按照2.1.5的方法分别提取牛支原体、leachii支原体、Mmc、Mo、MmmSC、Mccp的DNA，已提取的DNA为模板，按照leachii支原体特异性引物：上游引物(17U26)，下游引物(556L22)，对leachii支原体、牛支原体、Mmc、Mo、MmmSC、Mccp等6种支原体按优化后的条件进行PCR。PCR所扩增出的产物使用1%的琼脂糖核酸凝胶电泳检测，结果显示，针对leachii支原体可以扩增出特异性条带，条带清晰明亮，分子量约为539bp，与预期相符；而针对牛支原体、Mmc、Mo、MmmSC、Mccp等其他支原均无条带出现(图3-3)。结果表明，针对leachii支原体lppA基因设计的PCR检测引物具有较强的特异性，能实现对leachii支原体18 的特异性扩增，而与其他支原体无交叉反应，特别是与MmmSC也无交叉反应。123456782000bp539bp图3-3PCR特异性试验核酸电泳Fig.3-3NucleicacidelectrophoresisofPCRspecificity1:DL2000marker;2：leachii支原体;3：水；4：牛支原体；5：丝状支原体山羊亚种(Mmc)；6：绵羊肺炎支原体(Mo)；7：丝状支原体丝状亚种小菌落型(Mmm)；8：山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)lane1：DL2000Marker；lane2：Mycoplasmaleachii；lane3：water；lane4：Mycoplasmabovis；lane5：Mycoplasmamycoidessubsp.Capricolum；lane6：Mycoplasmaovipneumoniae；lane7：Mycoplasma.mycoidessubsp.mycoidesSmallColonyType；lane8：Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae3.1.4敏感性试验结果3.1.4.1牛支原体敏感性试验结果针对leachii支原体GN407株以及牛支原体、Mmc、Mo、Mmm、Mccp的灭活样品原培养物进行10倍倍比稀释，之后对原培养物以及稀释后的培养物进行DNA的提取，用牛支原体特异性引物：上游引物(531U28)，下游引物(1371L25)，按优化后的条件进行PCR。PCR所扩增出的产物使用1%的琼脂糖核酸凝胶电泳进行检测，结果显示：10000倍4稀释物(含10CCU牛支原体)的PCR扩增产物仍然产生扩增条带，并且与目的条带相吻合4(见图3-4)，结果表明：牛支原体PCR检测方法的灵敏度为10CCU。图3-4PCR敏感性核酸电泳Fig.3-4NucleicacidelectrophoresisofPCRsensibility3.1.4.2Leachii支原体敏感性试验结果针对leachii支原体GN407株以及牛支原体、丝状支原体山羊亚种(Mmc)、绵羊肺炎19 支原体(Mo)、丝状支原体丝状亚种(Mmm)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)的灭活样品原培养物进行倍比稀释，按照10倍倍比稀释，之后对原培养物以及稀释后的培养物进行DNA的提取，按照leachii支原体特异性引物：上游引物(17U26)，下游引物(556L22)，按优化后的条件进行PCR。PCR所扩增出的产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：1000倍稀释物(含510CCULeachii支原体)的PCR扩增产物仍然产生扩增条带，并且与目的条带相吻合(见图53-5)，结果表明：leachii支原体PCR检测方法的灵敏度为10CCU。图3-5PCR敏感性核酸电泳Fig.3-5NucleicacidelectrophoresisofPCRsensibility3.1.5符合性试验结果结果显示，采用标准支原体分离培养出的阳性样品与本研究所建立的PCR检测方法所检测出的阳性样品结果一致，符合率达到100%。3.2支原体型奶牛乳房炎病原流行病学调查结果3.2.1乳汁样品中牛支原体和leachii支原体的PCR检测结果根据本实验室的现有资源，所采集的样品来自：内蒙古自治区2个规模化奶牛养殖场、宁夏回族自治区3个规模化奶牛养殖场、辽宁省5个规模化奶牛养殖场、黑龙江省12个规模化奶牛养殖场、天津市6个规模化奶牛养殖场。共有28个奶牛养殖场，总计539份临床型奶牛乳房炎乳汁样品。对临床型奶牛乳房炎所采集的样品，按照2.1.5.1的试验方法进行预处理后用试剂盒提取所有样品的DNA，使用本试验设计的牛支原体和leachii支原体特异性引物对对所有样品进行支原体PCR检测，检测结果见表3-1。结果显示：黑龙江省12个牛场中2例leachii支原体阳性，19例牛支原体隐性；辽宁省及宁夏回族自治区未检测到这两种支原体；天津市无leachii支原体阳性，有5例牛支原20 体阳性；内蒙古同样无leachii支原体阳性，有15例牛支原体阳性。结果表明：支原体型奶牛乳房炎并不具有普遍感染的特性，具有区域性，且呈少发或散发分布。表3-1我国北方地区支原体检测情况Table.3-1DetectionofMycoplasmainNorthChina我国北方部分地区Leachii支原体牛支原体黑龙江省12个牛场2/27519/275辽宁省5个牛场0/740/74宁夏回族自治区3个场0/230/23天津市6个牛场0/545/54内蒙古自治区2个牛场0/11315/1133.2.1.12010、2011、2016年牛支原体及leachii支原体的分布情况Leachii支原体及牛支原体发病情况如下：在2010年至2016年期间，我国北方28个规模化奶牛养殖场中539份临床型奶牛乳房炎的样品中，已检测到2例leachii支原体、39份牛支原体。其中leachii支原体总体阳性率为0.371%，牛支原体的总体阳性率为7.24%。2010年所采集的40份临床型奶牛乳房炎样品：leachii支原体阳性样品1份，阳性率为2.50%，牛支原体阳性样品4份，感染率为12%。2011年所采集的85份临床型奶牛乳房炎样品：leachii支原体阳性样品1份，阳性率为1.17%，牛支原体阳性样品11份，感染率为12.9%。2016年所采集的414份临床型乳房炎的样品：没有检测到leachii支原体；检测到牛支原体24份，阳性率为5.23%(图3-6)。302520leachii支原体15牛支原体10502010年2011年2016年图3-6：2010、2011、2016年支原体阳性样品柱形统计图Fig.3-6Mycoplasmapositivesamplecolumnchartsin2010,2011,2016.3.2.1.2支原体乳房炎与奶牛年龄的关系本试验将所有检测奶牛按照年龄划分成三组：其中2-3岁为一组，有118头奶牛，521 头奶牛为支原体阳性，阳性率为4.24%；3-5岁为一组，有180头奶牛，12头奶牛为支原体阳性，阳性率为6.67%；剩余的5-7岁为一组，共有241头奶牛，24头奶牛为支原体阳性，阳性率为9.96%。利用统计数据分析，进行卡方检验，显示组间差异显著(P＜0.01)。结果表明，根据本试验所划分的三组，支原体型乳房炎的感染率伴随着奶牛年龄的增加也随之上升。随着奶牛年龄的增大，身体健康程度不断降低，免疫功能逐渐下降，奶牛的乳房在长期挤奶的过程中受到不断的挤压，乳房的机械性损伤越发严重，乳头孔不断扩大，这会使支原体等病原微生物更易进入乳房，因而导致奶牛感染乳房炎的几率随着奶牛年龄的增加而升高(表3-2)。表3-2：支原体乳房炎与奶牛年龄的关系Table.3-2Relationshipofmycoplasmamastitiswiththedairycattleage.项目一组(2-3岁)二组(3-5岁)三组(5-7岁)检测头数118180241感染头数51224感染率4.24%6.67%9.96%3.2.1.3支原体乳房炎与奶牛胎次的关系本试验将所有已检测奶牛按照胎次划分成三组，其中1、2胎次为一组，有118头奶牛，3头奶牛为支原体阳性；3、4胎次为第二组，有180头奶牛，12头奶牛为支原体阳性；5、6胎次为第三组，共有241头奶牛，27头奶牛为支原体阳性。结果显示：第一组阳性率最低，为2.54%；第二组阳性率较第一组而言显著上升，其阳性率达到6.67%；第三组阳性率最高，为11.20%，约是第一组的5倍、第二组的2倍。(见表3-3)。结果表明：第1胎奶牛的乳房损伤较小，负担轻，阳性率最低，3胎以上随着乳房的不断损伤，其感染乳房炎的几率不断上升，6胎时，阳性率最高达到12.10%，这表明，支原体型乳房炎的感染率随着奶牛胎次的增加呈上升的趋势。表3-3：支原体乳房炎与奶牛胎次的关系Table.3-1Relationshipofmycoplasmamastitiswiththedairycattleparity.项目一组二组三组1胎2胎3胎4胎5胎6胎检测头数44748793117124感染头数12571115感染率2.27%2.71%5.75%7.53%9.40%12.10%3.2.2乳汁样品中牛支原体和leachii支原体分离培养结果3.2.2.1支原体液体培养结果按照2.2.2所述支原体液体培养基配制方法进行对支原体液体培养基的配置，之后按22 照2.2.6的内容对样品进行接种，首先将539份牛乳汁样品用0.22微米滤膜过滤，而后将过滤后的乳汁样品吸取30ul，连带枪头一同置于试管中，置于5%二氧化碳、37℃培养箱中培养，3-5天后，观察液体培养基的颜色变化情况。结果显示：按照上述方法进行分离培养的539份牛乳汁样品中出现41份液体培养基颜色改变的样品。在前2天，液体培养基颜色几乎没有变化，在第3天时液体培养基开始出现颜色的轻微的变化，液体培养基颜色没有最开始颜色深，5天后液体培养基颜色开始出现明显变化，液体培养基颜色逐渐变黄，但不浑浊，7天后，液体培养基呈轻微浑浊，颜色呈深黄色，与此同时所接种的阴性对照组颜色一直无变化，仍为最初液体培养基的颜色。结果表明：539份牛乳汁样品中出现的41份阳性样品均为支原体，因阴性对照成立所以排除实验室污染支原体的可能，最终阳性率为7.61%，与PCR检测结果一致，符合率100%，从而证实了PCR检测方法的准确性。3.2.2.2支原体固体培养结果按照2.2.2所述支原体液体培养基配制方法进行对支原体液体培养基的配置，在液体培养基的基础上加入琼脂糖，倒入灭菌的平皿中，待凝固后，制备成固体支原体培养基，之后按照2.2.6的内容对样品进行接种，首先将539份牛乳汁样品用0.22微米滤膜过滤，而后将过滤后的乳汁样品吸取100μl，按照平板划线法在平皿上缓慢均匀的将过滤后的乳汁样品接种到平皿中，置于5%二氧化碳、37℃培养箱中培养，观察3-5天，观察固体培养基的上是否出现菌落。结果显示：按照上述方法进行分离培养的539份牛乳汁样品中出现41份有菌落的平皿，前2天观察固体培养基均没有明显的变化，第3天部分平皿中出现较小的菌落形态，第5天时共出现了41份阳性乳汁样品，由于支原体生长缓慢，所以再观察两天，在第7天时，阳性乳汁样品的结果没有变化，与第5天的结果相一致，41份阳性乳汁样品在显微镜下，可观察到典型的油煎蛋样菌落，而在这7天中阴性对照始终没有出现任何菌落的迹象，所以对照成立。结果表明：分离培养的539份牛乳汁样品中出现的41份阳性牛乳汁样品，从生长特性和显微镜下的形态大小均可以判断为支原体，且排除支原体污染的可能性，牛乳汁样品的阳性率为7.61%，与PCR检测结果及液体培养的结果相一致，符合率达到100%，阳性样品都是来自41头相同奶牛的乳汁样品，不仅证实了PCR方式的准确性，还最终确定了本次试验所采集的乳汁样品中，共有41头奶牛为支原体阳性奶牛，阳性率为7.61%。23 3.2.3PCR阳性样品的序列分析结果将PCR阳性样品的产物按照胶回收步骤进行回收纯化，送哈尔滨博仕生物科技有限公司进行序列测定，结果如下：将公司返回的基因序列经过BLAST对比后发现，所有牛支原体PCR阳性样品均与牛支原体HB0801-P115株(GenBank编号为CP007591.1)同源性最高，为99%；所有leachii支原体PCR阳性样品均与leachii支原体GN407和GN408(GenBank编号分别为HQ699892.1和HQ699893.1)的同源性最高，为99.6%(图3-7)。结果表明，牛支原体和leachii支原体PCR检测方法与序列分析结果是一致的，具有良好的特异性。图3-7：牛支原体基因BLAST对比分析Fig.3-7ComparativeanalysisofMycoplasmabovineGenomebytheBLAST24 4讨论4.1PCR检测方法的建立及初步应用本研究所建立的PCR检测方法扩增的牛支原体B0W4300590基因序列，具有较强的特异性，在已有研究的基础上，本研究设计的引物，其扩增片段变短，约为840bp，增加了PCR方法的准确性和可重复性；leachii支原体所扩增的目标基因为特异性lppA基因，同源性比对结果显示，leachii支原体的lppA基因与Mmm的lppA基因同源性最高，因此PCR引物选定在leachii支原体lppA基因保守而与Mmm的lppA基因存在差异的区域，这样可完全避免与Mmm的交叉反应。试验结果也证明，本研究建立的两种PCR检测方法可以特异性扩增牛支原体和leachii支原体，与Mmc、Mo、Mmm以及Mccp等其他支原体无交叉反应，尤其是leachii支原体与Mmm无交叉反应，表明该方法具有较强的特异性。此外，在检测过程中同时采用16SRNA特异性引物对样品进行扩增，再结合序列分析，经常会发现临床样品中含有其他支原体，而这些样品的牛支原体和leachii支原体特异性PCR均为阴性，这也侧面证实了本研究建立的PCR方法具有高度的特异性，不能扩增出其他无关支原体，其中leachii支原体PCR检测方法在我国尚属首次建立。应用该两种方法对本研究所采集的我国北方地区主要规模化奶牛养殖场临床型奶牛乳房炎的乳样进行检测，539份临床型奶牛乳房炎病牛的牛乳汁样品中出现41例支原体阳性，将539份牛乳汁样品进行了支原体的液体培养和固体培养基的分离培养，与PCR结果相比较，最终阳性样品的符合率为100%。并且PCR检测结果中的阳性样品进行胶回收测序与支原体分离培养后重新提取DNA胶回收测序结果一致，最终本试验所采集的539份样品中，41份样品为支原体，其中包括2份leachii支原体和39份牛支原体，支原体型奶牛乳房炎的总体阳性率为7.61%(41/539)。所以本研究所建立的牛支原体及leachii支原体PCR检测方法是真实可靠、准确高效的，可以用于大量临床样品的检测。4.2病原流行病学调查结果分析针对41个支原体阳性样品，分别采用了直接提取样品DNA后PCR检测、样品支原体分离培养、支原体分离培养物提取DNA进行PCR检测的三种方法。通过将阳性样品PCR检测胶回收测序结果与阳性样品培养物PCR检测胶回收测序结果相比较，结果完全一致。因此证实了本研究所建立的牛支原体及leachii支原体PCR检测方法是正确可行的，也通过分离培养的方法对所有样品进行检测以保证没有漏检、错检的情况。所以本研究检测出的41份支原体均真实有效，为奶牛支原体型乳房炎提供了可靠的数据支持。25 根据2010、2011、2016年三年的检测结果可知，牛支原体所引起的支原体型乳房炎呈上升趋势，主要分布在黑龙江省以及内蒙古自治区，其中内蒙古自治区2个牛场中检测出15例牛支原体，其他地区如天津市呈现散发的特点，而辽宁省及宁夏回族自治区则没有检测出牛支原体。leachii支原体感染奶牛并引起乳房炎在2010、2011年两年中只检测到2例，2016年没有检测到leachii支原体。根据本试验所划分的三组数据结果表明：支原体型乳房炎的感染率随着奶牛年龄的增加也随之上升。随着奶牛年龄的增加，免疫功能逐渐下降，在长期的挤奶过程中，乳头、乳管的机械性损伤增多、体细胞数上升及乳头括约肌机能衰退，致使支原体等病原微生物更易进入乳房，因而导致乳房炎的感染率随着奶牛年龄的增加而升高；此外，根据本试验的数据表明：奶牛的胎次也是影响支原体型奶牛乳房炎的重要因素之一，奶牛在第1胎中产奶量低，乳房负担轻，抵抗力强，感染率最低，从3胎开始感染率具有上升趋势，6胎感染率最高为12.10%，约是第一胎感染率的5倍，随着被检测奶牛胎次的增加，奶牛抵抗力逐渐下降，由于多次生产造成乳房功能的衰退，给奶牛的乳房带来了一些不可修复的损伤，由此可见，支原体型乳房炎随着奶牛胎次的增加呈上升的趋势。与此同时，在本研究所调查的28个牛场中，支原体型奶牛乳房炎的发生与牛场的卫生环境、饲养管理水平、不合理的引种等因素都密不可分。因此，干燥、清洁、温度适宜、设计合理的牛舍需引起养殖者的重视，还要在合理管理、妥善分群、减少应激等方面更加规范，这样才能减少此类疾病的发生及发展。4.3应用前景及研究展望本研究建立的牛支原体及leachii支原体PCR检测方法，特异性强、敏感性高，可实现临床上高通量快速检测牛支原体和leachii支原体的目的。另外这两种PCR方法可以检测牛乳汁样品和其它样品，扩展了该两种支原体的样品检测范围，尤其是leachii支原体PCR检测方法的建立，在我国尚属首次。应用本研究建立的方法对我国北方地区黑龙江省、辽宁省、宁夏回族自治区、内蒙古自治区和天津市规模化奶牛场中的临床型及疑似支原体感染的乳房炎进行了病原流行病学的调查，初步查明支原体型奶牛乳房炎的阳性率及其与奶牛年龄、胎次、地区和年度的关系，为这些地区防制本病提供了可靠的实验依据，为下一步开展全国范围内牛支原体及leachii支原体病原流行病学的调查奠定了坚实的基础。26 5结论5.1建立了牛支原体及leachii支原体PCR检测方法。5.2初步阐释了支原体型奶牛乳房炎在我国北方部分地区的流行情况，且证实支原体型奶牛乳房炎与奶牛的年龄、胎次呈正相关。27 28 参考文献[1]郑丹.奶牛乳房炎的发病原因及综合防治措施[J].农技服务,2015(1):137-138.[2]曹志，何生虎.奶牛乳房炎防治技术研究进展[J].农业科学研究,2011,32(1):76-82.[3]叶倩，王礼伟，屈勇刚，等.奶牛乳房炎防治的研究进展[J].现代畜牧兽医,2014(1):56-61.[4]曹志，何生虎.奶牛乳房炎防治技术研究进展[J].农业科学研究,2011,32(1):76-82.[5]赵兴绪.兽医产科学(第3版)[M].北京：农业出版社，2002:458-459.[6]李勇，葛秀国，窦忠英.奶牛隐性乳房炎研究进展[J].中国牛业科学,2003,29(3):38-41.[7]乌兰巴特尔，郝永清，海岩，等.奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分子流行病学调查[J].中国兽药杂志,2007,41(2):21-23.[8]胡瑞萍，刘磊，边艳青，等.无乳链球菌检测及其奶牛乳腺炎防治的研究进展[J].中国兽药杂志,2008,42(6):54-57.[9]GilbertFB,FromageauA,LamoureuxJ,etal.EvaluationofTandemRepeatsforMLVATypingofStreptococcusuberisIsolatedBovineMastitis[J].BMCVetRes,2006，2:33.[10]谢家仪，董光军，刘振英.扫描电镜的微生物样品制备方法[J].电子显微学报，2005,24(4)：440-440.[11]杨宗英，李万盛.中西医结合治疗奶牛乳房炎[J].畜禽业，2008,2(226):89.[12]贺成龙，屈立凤，徐章琼,等.奶牛乳房炎的综合防治措施[J].畜牧兽医杂志，200827(1:122-123).[13]MalinowskiE,GajewskiZ.Mastitisandfertilitydisordersincows[J].PolJVetSci,2010,13(3):555-560.[14]马君，张蓓，李含锋,等.奶牛乳房炎的综合防治措施[J].畜牧兽医杂志，2008,27(1):122-123.[15]张善瑞，王长法，高远东等.检测奶牛乳房炎主要病原菌的多重PCR方法的建立与应用[J].中国兽医学报，200828(5):573-575.[16]贾荣玲，王立景，马长新.南阳市奶牛梨形虫病流行病学调查[J].中国草食动物，2008(01):46-48.[17]MiddletonJR,LubyCD,AdamsDS.Efficacyofvaccinationagainststaphylococcalmastitis:areviewandnewdata[J].VetMicrobiol,2009,134(1-2):192-198.[18]马保臣，柴同杰，李建基，等.奶牛急性乳腺炎病原菌的分离与鉴定[C].2004:22-24.[19]RobersonJR,WarnickLD,MooreG.MildtoModerateClinicalMastitis:EffcacyofIntramammaryAmoxicillin,FrequentMilk-Out,aCombinedIntramammaryAmoxicillin,andFrequentMilk-OutTreatmentVersusNoTreatment[J].JDairySci,2004,(87):583-592.[20]HumS,MastitisPolyarthrisandAbortionCausebyMycoplasnaSpeciesBovineGroupinDairyCattle[J].2000,78(11):744-750.[21]ShpigelNY,ElazarS,RosenshineI.MammarypathogenicEscherichiacoli[J].Currentopinioninmicrobiology,2008,11(1):60-65.[22]DoganB,KlaessigS,RishniwM,etal.AdherentandinvasiveEscherichiacoliareassociatedwithpersistentbovinemastitis[J].Veterinarymicrobiology,2006,116(4):270-282.[23]SuojalaL,PohjanvirtaT,SimojokiH,etal.Phylogeny,virulencefactorsandantimicrobialsusceptibility29 ofEscherichiacoliisolatedinclinicalbovinemastitis[J].Veterinarymicrobiology,2011,147(3):383-388.[24]BurvenichC,VanMerrisV,MehrzadJ,etal.SeverityofE.colimastitisismianlydeterminedbycowfactors[J].Veterinaryresearch,2003,24(5):521-564.[25]MehrzadJ,JanssenD,DuchateauL,etal.IncreaseinEscherichiacoliinoculumsdoseacceleratesCD8+T-celltraffickingintheprimiparousbovinemammarygland[J].Journalofdairyscience,2008,91(1):193-201.[26]VangroenwegheF,RainardP,PaapeM,etal.IncreaseofEscherichiacoliinoculumsdosesinducesfasterinnateimmuneresponseinprimiparouscows[J].Journalofdairyscience,2004,87(12):4132-4144.[27]GunterJ,LiuS,EschK,etal.StimulatedexpressionofTNF-αandIL-8,butnotofIingualantimicrobialpeptidereflectstheconcentrationofpathogenscontactingbovinemammaryepithelialcells[J].Veterinaryimmunologyandimmunopathology,2010,135(1):15-157.[28]杨勇.奶牛乳房炎病因分析和治疗[J].安徽农业通报，2009,15(6):21-23.[29]LulzimShkreta，BrianG.Talbot，MoussaS.DiarraandPierreLacasse.ImmuneresponsestoaDNA/proteinvaccinationstrategyagainstStaphylococcusaureusinducedmastitisindairycows[J].Vaccine,2004,23:114–126.[30]FosterTJ.ImmuneEvasionbyStaphylococci[J].NatRevMicrobiol,2005,3(12):948-958[31]王传蓉.奶牛乳房炎的病原体[J].中国畜牧兽医文摘,2013(12):132-133.[32]赵立香，吴艳玲.奶牛乳房炎的病因调查[J].吉林农业科技学院学报，2005,14(3):14-16.。[33]马保臣，李建基，王春璈.奶牛急性乳腺炎病原菌的分离与鉴定[J].中国兽医杂志,2004,40(11):22-24.[34]叶秀娟，杜爱芳，胡松华.金华地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国草食动物,2004,6:30-32.[35]陈坤永，陈坤永，翁良树.深圳地区奶牛临床型乳房炎病原菌分离鉴定与药敏试验[J].中国兽医科技，1999,29(9):36-38.[36]朱贤龙，谢芝勋，刘甲波，等.广西奶牛隐性乳房炎的检测及病原分离、鉴定和药敏试验报告[J].广西农业科学，2004,35(6):488-490.[37]吴移谋，叶元康.支原体学-第2版[M].人民卫生出版社,2008.[38]LemaitreM,HeninY,DestouesseF,FerrieuxC,MontagnierL,BlanchardA.Roleofmycoplasmainfectioninthecytopathiceffectinducedbyhumanimmunodeficiencyvirustype1ininfectedcelllines.InfectImmun1992Mar;60(3):742-8.[39]刘海军.Leachii支原体的分离鉴定[D].大庆：黑龙江八一农垦大学，2010:1-44[40]RadcliffFJ,HazellSL,KolesnikowT,DoidgeC,LeeA.Catalase,anovelantigenforHelicobacterpylorivaccination.InfectImmun1997Nov;65(11):4668-74.[41]FengSH,TsaiS,RodriguezJ,LoSC.Mycoplasmalinfectionspreventapoptosisandinducemalignanttransformationofinterleukin-3-dependent32Dhematopoieticcells.MolCellBiol1999Dec;19(12):7995-8002.[42]张瑞，崔朋，巴晓亮，等．牛支原体临床分离株牛体毒力和免疫原性比较［J］．动物医学进展，30 2013，34(6):126－132.[43]HaleHH,HelmboldtCF.BovinemastitiscausedbyMycoplasmaspecies[J].CornellVet,1962,52:582-591.[44]WangJF,FuSP,LiSN,etal.Short-chainfattyacidsinhibitgrowthhormoneandprolactingenetranscriptionviacAMP/PKA/CREBsignalingpathwayindairycowanteriorpituitarycells[J].InternationalJournalofMolecularSciences,2013,14(11):21474-21488.[45]NichlasRAJ,MilesRJ.Mycoplasmabovis:disease,diagnosis,andcontrol[J].ResearchinVeterinaryScience,2003,74:105-112.[46]KumarA,VermaAK,RahalA.Mycoplasmabovis,AMultiDiseaseProducingPathogenPathogen:AnOverview[J].AsianJournalofAnimalandVeterinaryAdcances,2011,6(6):537-546.[47]FoxLK,HancockDD,MickelsonA,BrittenA.Bulktankmilkanalysis:factorsassociatedwithappearanceofMycoplasmasp.inmilk[J].JVetMedBInfectDisVetPublicHealth,2003,50:235-240.[48]FoxLK,KirkJH,BrittenA.Mycoplasmamastitis:areviewoftransmissionandcontrol[J].JVetMedBInfectDisVetPublicHealth,2005,52:153-160.[49]GonzalezRN,WilsonDJ.Mycoplasmalmastitisindairyherds[J].VetClinNorthAmFoodAnimPract,2003,19:199-221.[50]MackieDP,FinlayD,BriceN,BallHJ.Mixedmycoplasmamastitisoutbreakinadairyherd[J].VetRec,2000,147:335-336.[51]AylingRD,BakerSE,PeekML,SimonAJ,NicholasRAJ.Comparisonofinvitroactivityofdanofloxacin,florfenicol,oxytetracycline,spectinomycinandtilmicosinagainstrecentfieldisolatesofMycoplasmabovis[J].VetRecord,2000,146:745-747.[52]BushnellRB.Mycoplasmamastitis[J].VetClinNorthAmLargeAnimPract,1984,6:301-312.[53]BoonyayatraS.DIAGNOSISOFMYCOPLASMAMASTITIS:VALIDATIONANDDEVELOPMENT[J].Dissertations&Theses-Gradworks,2010.[54]郭丹.国内分离到牛支原体[J].中国预防兽医学报，2006,21(8):651-653.[55]彭清洁，胡长敏，陈颖钰，等.牛支原体引起奶牛乳房炎的诊断[J].中国奶牛，2011,4:1-3.[56]辛九庆，李媛,等.国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体［Ｊ］.中国预防兽医学报，2008，30(9):661－664.[57]李大伟.牛支原体PCR诊断方法的建立及流行病学调查[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2011.[58]SsrabelleMadoff,BurenettQ.Pixley,etal.IsolationofMycoplasmabocisfromaPatientwithSystemieIllness[J].JournalofClinicalMicrobiology,1979,9(6):709-711.[59]HumS,KessellA,DjordjevicS,RheinbergerR,HornitzkyM,ForbesW,etal.Mastitis,polyarthritisandabortioncausedbyMycoplasmaspeciesbovinegroup7indairycattle.AustVetJ2000Nov78(11):744-50.[60]Manso-SilvanL,VileiEM,SachseK,DjordjevicSP,ThiaucourtF,FreyJ.MycoplasmaLeachiisp.nov.asanewspeciesdesignationforMycoplasmasp.bovinegroup7ofLeach,andreclassificationofMycoplasmamycoidessubsp.mycoidesLCasaserovarofMycoplasmamycoidessubsp.capri.IntJSystEvolMicrobiol2009Jun;59(6):1353-1358.31 [61]ThiaucourtF,BolskeG.Contagiouscaprinepleuropneumoniaandotherpulmonarymycoplasmosesofsheepandgoats.RevSciTech1996Dec;15(4):1397-414.[62]SimmonsGCJLAY.ArthritisincalvescausedbyMycoplasmasp.AustVetJ1963,(39):11-4.[63]CottewGS.MycoplasmasisolatedfromcattleinAustralia.AustVetJ1970Aug46(8):378-81.[64]HughesKL,EdwardsMJ,HartleyWJ,MurphyS.PolyarthritisincalvescausedbyMycoplasmasp.VetRec1966Feb19;78(8):276-81.[65]ConnoleMD,LawsL,HartRK.MastitisincattlecausedbyaMycoplasmasp.AustVetJ1967May;43(5):157-62.[66]ShielMJ,ColoePJ,WorotniukB,BurgessGW.Polyarthritisinacalfassociatedwithagroup7Mycoplasmainfection.AustVetJ1982Dec;59(6):192-193.[67]AlexanderPG,SleeKJ,McOristS,IrelandL,ColoePJ.MastitisincowsandpolyarthritisandpneumoniaincalvescausedbyMycoplasmaspeciesbovinegroup7.AustVetJ1985Apr62(4):135-136.[68]刘海军，常继涛，于力.我国发生Leachii支原体引起的犊牛多发性关节炎[J].中国预防兽医学报,2010,06:415-418.[69]ChangJT,LiuHJ,YuL.MycoplasmaLeachiisp.nov.incalves,China[J].EmergingInfectiousDiseases,2011,17(9):1772-1773.[70]常继涛,于力.Leachii支原体病的研究现状与展望[C].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会.201332 致谢时间如白驹过隙般转瞬即逝，转眼之间我的两年的研究生生活即将结束，仿佛一切如昨天般真实，自己还没有来得及细细的品味，却马上要挥手告别了。回忆这两年忙碌而又充实的时光，有苦涩、有苦难、有汗水，但更多的是收获、是成长。这一路走来有太多的人要感谢，是他们的教诲与帮助、支持与鼓励，才能让我走到今天，才能顺利的完成学业，成为一名合格的硕士研究生。2011年带着懵懂和青涩来到了我的母校黑龙江八一农垦大学，2015年带着对知识的渴望和对科研的好奇，再次选择自己的母校更进一步，转眼间已历经了六个年头，这六年我从一名刚入学的无知大学生成长为在各方面都有长足进步的硕士研究生，这都得益于我在学校中所受到的教育、得益于所有的老师对我的教导。在未来的日子里，我将秉承母校的优良传统，不忘初心，再次向更高的目标奋斗。在今天这个特殊的日子里，我要由衷的感谢每一位帮助过我的人。首先，我要感谢我的导师杨颗粒教授和武瑞教授在这两年来的教导，在学术上和生活中都给予了我莫大的帮助。科研中他是一位兢兢业业的学者，我每一次试验遇到阻碍时，他都能帮我顺利的渡过难关，为我指明前进的方向；生活中他更像是一名慈父般的导师，像是父亲一样的关怀着我，教导我如何为人处世，如何与人沟通，能够师承杨老师，我倍感荣幸。其次我要感谢武瑞教授为我提供的良好的科研平台与学术氛围，在实验开始设计的时候提供了莫大的帮助，在整个论文撰写过程中提供的巨大帮助、倾注的大量心力，没有武瑞教授无微不至的爱护与教诲，可能我今天不会如此顺利的毕业，在武瑞老师的身上我学习到了身为一名学者应有的正气以及对学术认真的态度和缜密的思维方式，他对我的帮助与鼓励将让我受用一生。在这里我还有要感谢中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的于力研究员，于老师为我提供了哈尔滨兽医研究所这个国内领先的实验平台，为我的实验提供了大量的样品，才能够保证我最终实验的顺利完成，在哈尔滨实验期间，于老师不断询问我的试验进展，不断与我探讨实验中出现的各个问题，此外我还要感谢常继涛老师，常老师如长兄般对我的呵护，让我在哈尔滨感受到了家的温暖，实验中所有的失败结果，常老师都会与我认真的讨论，针对我的实验帮我设计最适合我的试验方法，每次都是都如兄长般的跟我说，从没有一次用老师命令的口吻吩咐过我任何事情，并且常老师还教会了我如何设计实验，教会了我对科研应有的思路和态度，我觉得这会为我以后的博士之路带来莫大的帮助，没有常老师的帮助我的硕士之路会更加的崎岖坎坷。33 特别感谢王建发老师、贺显晶老师，无论从论文选题到试验设计，还是试验完成到论文撰写，及时的帮助与指导是我试验研究得以按期顺利完成的保障。感谢与我一同走过研究生生活的所有实验室的同门，在实验室学习生活的两年中，让我感受到了家的氛围。感谢曲艳鹏师兄、于德斌师兄、梁建斌师兄、李启涛师兄、孙志鹏师兄、张义爽师姐、徐丹丹师姐、任璐师姐、丛林师姐对我实验上的指导，感谢同届的刘东宇、张旭、许小楠、王乐对我试验上的协助，感谢单旭菲师妹对我试验的帮助，我要特别感谢哈尔滨兽医研究所的王芳老师、周国辉老师、王海伟老师、杨德成老师、姜志刚师兄、齐瑛琳师姐、刘蒙蒙师兄、孙超师姐、李琛师姐、袁天罡师兄、刘文铭师兄，还要感谢我的小伙伴王垚鑫、王静、杨宝琳、赵博以及王磊师弟，他们每一个人都为我的试验付出了太多的帮助，我很幸运能够认识他们，此外我要由衷的感谢我的室友王国庆、张旭、刘东宇对我的包容与鼓励，没有他们我这两年的硕士生活会是乏味无趣的，感谢我的研究生的同学们，因为有你们的陪伴我的研究生生涯才如此丰富多彩！最后，我要感谢我的父母的养育之恩，两年的研究生生活，父母无私的支持着我、鼓励着我，让我知道他们是我最坚强的后盾和最温暖的港湾，及时父母亲生病了也不会告诉我，生怕会耽误我的试验和学习，在这里我表示对他们深深的歉意，虽然学业上有所进步，却在生活中没有尽心尽力的关爱他们，没有我的父母就没有我，也就没有今天我所拥有的一切，近二十载的求学生涯，是他们在我孤立无援的时候为我撑起一片蓝天，是他们在我遇到困难时，为我排忧解难，每一次的挫折都是他们在背后默默的支持我、鼓励我，我才能坚持的走到今天，才能顺利的完成我的学业，希望在未来的日子里，我将继续努力，不忘他们的嘱托，努力前行，再接再厉！34 作者简介姓名：陈嘉性别：男民族：汉族出生年月：1992年4月籍贯：黑龙江省宁安市政治面貌：中共党员教育背景2011.09-2015.06黑龙江八一农垦大学动物科技学院农学学士学位动物医学专业2015.09-2017.06黑龙江八一农垦大学动物科技学院兽医硕士学位兽医硕士科研经历在学期间发表论文（1）陈嘉，常继涛，王建发，杨颗粒，武瑞，于力。《Leachii支原体PCR检测方法的建立与应用》发表于预防兽医学报。35