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学校代码：10564学号：2014307320分类号：S855.3密级：硕士学位论文2014年～2015年我国部分地区H5亚型禽流感流行病学调查林一村第一指导教师：廖明教授第二指导教师：学院名称：兽医学院专业学位类别：兽医硕士领域：答辩委员会主席：中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南农业大学。学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅（除在保密期内的保密论文外）；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。本学位论文属于：□保密，在年解密后适用本授权书。□不保密。学位论文全文电子版提交后：□同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。(请在以上相应方框内打“√”)本人签名：日期：导师签名：日期： 摘要自1996年H5亚型高致病性AIV首次在我国大陆鸡群中分离到后，该亚型毒株开始在我国禽群中广泛蔓延，H5亚型AIV不仅给我国养禽业发展造成了严重的影响，而且能够发生基因重组，突破宿主屏障。1997年香港发生第一例人感染H5N1禽流感并导致死亡后，人们对H5亚型AIV的高度关注。为了了解我国2014年～2015年H5亚型禽流感的流行情况和流行毒株的致病性性，本研究从2014年11月至2015年10月通过对广东地区活禽交易市场的禽类和对来自不同省份的临床病料进行采样和病毒分离鉴定进行流行病学调查，并选取了代表毒株进行全基因测序分析和致病性研究。本研究收集了来自不同省份的临床送检病料共228份，分离出H5亚型AIV53株，分离率为23.2%。在广东活禽交易市场共采集3089份样品进行了病毒分离，共分离出H5亚型AIV99株，分离率为3.1%。根据宿主来源进行统计，临床病例中分离的H5亚型AIV中，水禽源毒株占67.9%，活禽交易市场中H5亚型毒株中，水禽源毒株占55.6%。说明水禽是H5亚型AIV的重要传染源。53株来自临床病料的毒株中H5N6亚型毒株共37株，占69.8%；29株来自活禽交易市场的毒株中H5N6亚型毒株共24株，占82.8%，说明2014～2015年期间，本研究样品采集地区主要流行的H5亚型AIV为H5N6亚型。对上述82株H5亚型AIV的HA基因作遗传进化树分析，发现从临床病料分离的53株H5亚型AIV中，12株位于2.3.2.1分支，占22.6%，41株位于2.3.4.4分支上，占77.4%；从活禽交易市场分离的29株H5亚型AIV中，1株位于2.3.2.1分支，占3.4%，28株位于2.3.4.4分支，占96.6%。说明本研究样品采集地区流行的H5亚型AIV主要为2.3.4.4分支毒株。本研究对82株H5亚型AIV的HA蛋白裂解位点和HA受体结合位点进行分析，发现所有毒株的HA蛋白裂解位点均存在多个连续碱性氨基酸，符合高致病性禽流感特征；另外其中11株发生了S137A、T192I双位点突变，占12.8%，其中10株为临床毒株，1株为活禽交易市场分离毒株，S137A、T192I双位点突变能增强AIV对唾液酸α2-6半乳糖（SAα2-6Gal）受体结合能力。为了了解现流行H5亚型AIV的致病性，本研究根据分离毒株的NA亚型和HA基因的特点，从临床送检病料分离的毒株中选取了4株作为代表毒株，对BALB/c小6鼠和SPF鸡的致病性进行了研究，将4株病毒分别用50μL10EID50剂量以鼻腔吸入5的方式感染BALB/c小鼠，用200μL10EID50剂量以点眼滴鼻的方式感染SPF鸡。结I 果显示：4株不同NA亚型的H5亚型AIV对小鼠和鸡呈现不同的致病性，但4株毒株均能对小鼠致病，且导致小鼠死亡；其中3株对鸡有强致病性，1株不能导致鸡死亡。结合毒株不同蛋白的氨基酸位点分析结果，发现发生S137A、T192I双位点突变的两株毒株对小鼠的致病性强于未发生突变的毒株，且在脑和鼻甲骨中定殖能力更强，未发现NA蛋白位点与致病性试验结果的相关性。说明H5亚型AIV的HA蛋白发生S137A、T192I双位点突变能增强毒株对哺乳动物的致病性，在活禽交易市场分离的H5亚型AIV中发现发生该突变的毒株，因此活禽市场中的AIV可能会感染人类，危害人类生命健康，值得引起人们关注；现流行H5亚型AIV对鸡主要呈现高致病力特征。关键词：H5亚型禽流感；流行病学调查；遗传进化分析；致病性II EpidemiologyInvestigationofH5SubtypeAvianInfluenzaVirusesIsolatedinPartsofChinaBetween2014and2015Linyicun(CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversityGuangzhou，510642，China)Abstract:Since1996,theH5subtypeofhighlypathogenicAIVwasisolatedfromchickeninChinesemainlandforthefirsttime.Afterthat,H5AIVbegantospreadwidelyinpoultryinourcountry.H5subtypeAIVcanbreakspeciesbarrierstoinfectothermammals,includinghumansthroughgeneticrecombination.,In1997thefirstcaseofhumaninfectionwiththeH5N1avianinfluenzaappearedinHongKongwhichcausedthedeath，peoplestartedtopayhighattentiontoH5AIV.InordertolearnabouttheprevalenceofH5subtypeAIVineasternpartofChinabetweenNov.2014andOct.2015,wecollected228samplesfromclinicalcasesindifferentprovincesand3089samplesfromlivebirdmarkets(LBMs)inGuangdong.53strainsofH5subtypeAIVhavebeenisolatedfrom228sampleswhichwereisolatedfromclinicalcases.Theisolatedrateis23.2%.Thereare69.8%strainscomingfromwaterfowl.99strainsofH5subtypeAIVhavebeenisolatedbyembryonatedeggsinLBMssamples.Theisolatedrateis3.2%.Thereare55.6%ofH5subtypeAIVscomingformwaterfowl,whichprovesthattheducksarethemainhostforH5subtypeAIVsinGuangdongLBMs.ItprovesthatthewaterfowlisthemostimportanthostforH5subtype.HAandNAgeneof29strainsofH5subtypeAIVfromLBMsand53strainsofH5subtypeAIVfromclinicalcaseswereidentifiedbygenesequencing.69.8%ofH5subtypeAIVfromclinicalcasesareH5N6and82.8%ofH5subtypeAIVfromLBMsareH5N6.ItprovesthatthemostpopularH5subtypeAVIintheareawherewecollectedsamplesisH5N6.TheHAgeneevolutionwasanalyzedbyMEGA5.2.Theresultshowedthat96.6%strainsofH5subtypeAIVfromLBMsand77.4%strainsofH5subtypeAIVfromclinicalcaseshadHAgeneinClade2.3.4.4.OtherstrainswereinClade2.3.2.1.ItprovesthatthestrainsofClade2.3.4.4arethemostpopularstrainsintheareawherewestudied.ThroughanalyzingtheHAproteinofthe82strainsofH5AIV，wefoundthatallofthestrainshadmultipleconsecutivebasicaminoacidincrackingsitesand11strainshadS137A,T192IdoublemutationwhichcouldenhancereceptorbindingcapacityofAIVonsialicacidalpha2-6galactose(SAalpha2-6Gal).OneofthesestrainswasseparatedfromthesamplesofIII LBMs.FourrepresentativestrainsofH5subtypeAIVwereselectedforpathogenicityexaminationtounderstandthepathogenicityofH5subtypeAIVondifferentanimals.SPFchickensand56BALB/cmicewereinoculatedintranasallywith10EID50and10EID50ofrepresentativestrainswhicharehighlypathogenicavianinfluenzavirus(HPAIV).Theresultsshowedthatallthestrainscouldinfectandkillthemice.ThestrainswhichhaveS137A,T192IdoublemutationinHAproteinhavehigherpathogenicityandwedidn’tfindtheevidencetoprovethattheNAsubtypecouldinfluencethepathogenicity.SomeoftheAIVswhichwereseparatedfromLBMsalsohaveS137A,T192IdoublemutationinHAprotein,sotheH5AIVhaveachancetoinfecthumanswhoareconnectedwithLBMs.Keywords:H5subtypeAIV;epidemiologyinvestigation;geneanalysis;pathogenicityIV 英文缩略表缩写英文名称中文名称AIAvianinfluenza禽流感AIVAvianinfluenzavirus禽流感病毒BpBasepair碱基对cDNAComplementaryDNA（与RNA）互补的DNAdday天EID5050%Embryoinfectivedose鸡胚半数感染量hHour小时HAHemagglutinin血凝素HA试验Hemagglutinationtest血球凝集试验HIHemagglueinationinhibitiontest血球凝集抑制试验LBMLivebirdmarket活禽市场MMatrixprotein基质蛋白minMinute分钟mLMilliliter毫升NANeuraminidase神经氨酸酶NCBINationalcenterforbiotechnology美国国家生物信息中心informationNPNucleoprotein核蛋白NSNonstructuralprotein1非结构蛋白PAPolymeraseA聚合酶APBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PB1PolymeraseB1聚合酶B1PB2PolymeraseB2聚合酶B2PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应sSecond秒SPFSpecificpathogenfree无特定病原TaqThermusaquaticus水生栖热菌V 目录1前言....................................................................................................................................11.1禽流感病毒概述.............................................................................................................11.2禽流感病原学特点.........................................................................................................11.2.1病毒形态及结构..........................................................................................................11.2.2基因组及蛋白功能......................................................................................................11.2.3禽流感病毒的抗原性..................................................................................................21.2.4禽流感的致病性..........................................................................................................31.3H5亚型禽流感的流行....................................................................................................31.4研究目的和意义..............................................................................................................42材料与方法........................................................................................................................42.1材料..................................................................................................................................42.1.1相关试剂......................................................................................................................42.1.2鸡胚及实验动物..........................................................................................................42.1.3引物..............................................................................................................................42.1.4主要仪器......................................................................................................................52.1.5生物学软件..................................................................................................................52.1.6参考毒株......................................................................................................................52.2病毒的获取.....................................................................................................................72.2.1样品的采集..................................................................................................................72.2.2病毒的分离..................................................................................................................72.2.3病毒的鉴定..................................................................................................................72.3代表株的全基因组的测序、遗传演化分析和动物致病性实验..................................72.3.1AIV代表毒株的挑选...................................................................................................72.3.2病毒RNA的抽提及反转录........................................................................................82.3.3各基因片段的PCR扩增............................................................................................82.3.4PCR产物的回收和纯化..............................................................................................92.3.5病毒鸡胚半数感染量（EID50）测定.........................................................................92.3.6病毒对BALB/c小鼠致病性实验..............................................................................9VI 2.3.7病毒对SPF鸡致病性实验.......................................................................................103结果..................................................................................................................................103.1流行病学调查结果.......................................................................................................103.1.1宿主来源统计............................................................................................................123.1.2NA亚型统计..............................................................................................................133.1.3HA分支统计..............................................................................................................143.1.4HA结合位点基因突变及HA蛋白裂解位点统计..................................................163.2代表毒株遗传序列分析...............................................................................................193.2.1HA序列分析..............................................................................................................193.2.2NA序列分析..............................................................................................................213.2.3PB2基因序列分析.....................................................................................................233.2.4PB1基因序列分析.....................................................................................................243.2.5PA基因序列分析.......................................................................................................253.2.6NP基因序列分析.......................................................................................................263.2.7M基因序列分析........................................................................................................273.2.8NS基因序列分析.......................................................................................................283.3鸡胚半数致死量测定...................................................................................................293.4H5亚型AIV对SPF级BALB/C小鼠致病性实验..................................................303.4.1小鼠体重变化及死亡情况.........................................................................................303.4.2病毒在小鼠体内复制情况........................................................................................343.5H5亚型AIV对SPF鸡致病性实验..........................................................................353.5.1SPF鸡感染后存活率..............................................................................................353.5.2SPF鸡感染后各组织脏器含毒量测定结果.............................................................363.5.3SPF鸡感染后咽/泄殖腔拭子检测结果....................................................................393.5.4血清抗体转阳情况测定结果.....................................................................................394讨论..................................................................................................................................404.1流行病学调查...............................................................................................................404.2代表毒株全基因分析...................................................................................................414.3H5亚型AIV对动物致病性.........................................................................................44VII 5全文结论..........................................................................................................................45致谢..............................................................................................................................46参考文献........................................................................................................................47附录A..................................................................................................................................50附录B..................................................................................................................................51VIII 1前言1.1禽流感病毒概述禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV）是禽流感的病原。禽流感是一种会导致禽类呼吸器官和全身感染的疾病。禽流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属，单股负链RNA病毒。禽流感病毒属于A型流感病毒。根据禽流感病毒表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的分型，可将禽流感分为不同亚型（郭元吉，1997）。至今，人们已发现18种HA亚型和11种NA亚型（Freidletal.,2015）。对于流感病毒的命名，根据世界卫生组织（WTO）1980年通过的针对流感病毒毒株的命名修正案，规定流感毒株的命名包含型（种）别、宿主、分离地区、毒株序号、分离年份、亚型六个要素，对于人类流感病毒省略宿主要素。例如：A/goose/Guangxi/345/2005(H5N1)表示该株病毒核蛋白为A型，宿主是鹅，源自广西，毒株编号为345，毒株分离年份为2005年，亚型为H5N1的禽流感毒株（扈容良等，2014）。1.2禽流感病原学特点1.2.1病毒形态及结构禽流感病毒颗粒直径80～120nm之间，呈长丝状或球形，刚分离的毒株呈长丝状，可长达几微米。禽流感病毒经鸡胚或细胞多次传代后，病毒颗粒多呈球形。病毒颗粒分为外、中、内三层，外层是由来源于宿主细胞的双层类脂囊膜，类脂囊膜表面大约有500多个糖蛋白纤突，其中包括HA、NA和M2蛋白。中层为球形蛋白壳，由基质蛋白（M1）构成。内层是核壳体，由核蛋白（NP）、RNA聚合酶（PA、PB1、PB2）和病毒RNA形成螺旋堆成结构，包裹在球形蛋白壳中（扈容良等，2014）。1.2.2基因组及蛋白功能禽流感病毒基因组核酸全长约为13.6kb，由8个独立的单股负链RNA片段，这8个片段由长到短分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，每个片段可以编码1～2种蛋白，（见表1.1）主要包括基质蛋白（M1、M2）、血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、聚合酶蛋白（PA、PB1、PB2）等结构蛋白以及非结构蛋白（NS1、NS2等）（司振书等，2012）。1 表1.1禽流感病毒核酸编码蛋白及蛋白功能简表RNA长度基因编码蛋白蛋白功能(nt)RNA多聚酶活性蛋白复合物组成蛋白之一，功能12341PB2为识别、结合宿主细胞帽状RNA，具有有核酸内切酶活性。RNA多聚酶活性蛋白复合物组成蛋白之一，功能22341PB1为延伸新产生的病毒RNA。RNA多聚酶活性蛋白复合物组成蛋白之一，主要32233PA参与RNA复制，与PB1、PB2组成RNP血凝素，识别靶细胞上唾液酸受体并与其结合，41742～1778HA参与囊膜融合，诱导产生保护性中和抗体。51565NP核蛋白，构成核衣壳的主要成分。神经氨酸酶，水解细胞表面受体特异性糖蛋白末61362NA端的N-乙酰基神经氨酸，释放成熟病毒粒子。构成病毒的基质膜，装配病毒，保护病毒颗粒核M1心部分。71027病毒的表面抗原，能在HA合成时调控高尔基体M2的pH值，酸化病毒粒子的内部环境。NS1非结构蛋白。8890NS2非结构蛋白。1.2.3禽流感病毒的抗原性禽流感病毒的抗原性主要由表面蛋白HA和NA决定（葛菲菲等，2015）。禽流感病毒抗原性复杂，而且会不断发生变化。抗原性变化的方式主要有抗原漂移和抗原变异两种。抗原漂移指的是编码HA和NA的病毒基因发生基因重组或交换，产生不同的HA和NA的组合，不同亚型的HA和NA可以组合出不同亚型的禽流感病毒（吕让等，2015），因此流感病毒基因型具有多样性。抗原变异指的编码HA和NA的病毒基因发生点突变（马勇等，2015）。2 1.2.4禽流感的致病性根据禽流感病毒致病性的高低，将禽流感病毒分为高致病性禽流感病毒（HighlyPathogenicAvianInfluenzavirus，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LowPathogenicAvianInfluenzavirus，LPAIV）。目前发现的HPAIV都是H5或H7亚型，（Neumannetal.,2010）但并非所有H5或H7亚型AIV都具有高致病性。HPAI能使家禽出现腺胃肌胃角膜出血、采食量下降、鸡冠发绀、产蛋率下降、精神萎靡、呼吸困难以及发病率和死亡率都较高等临床症状（辛朝安，2003）。根据世界动物卫生组织（OfficeInternationalDesEpizooties，OIE）的陆生动物卫生法典的规定，对六周龄的鸡进行静脉接种感染禽流感病毒，鸡静脉接种致病指数（IVPI）高于1.2或取8只4至8周龄的鸡，静脉接种0.2mL1:10稀释的病毒尿囊液，禽流感病毒死亡率达到75%以上的禽流感为高致病性禽流感。此外，不符合以上两条标准，但HA0裂解位点的存在多个连续碱性氨基酸的H5和H7亚型禽流感也应被视为高致病性禽流感（OIE，2015）。其他非高致病性禽流感病毒定性为低致病性禽流感。高致病性禽流感其流行特征为潜伏期短，传播快，发病急，死亡快发病率和死亡率可达100%潜伏期为21天。因此OIE将HPAI定位A类烈性传染病。1.3H5亚型禽流感的流行1878年，意大利首次出现高致病性禽流感。1959年人类首次分离到了H5N1亚型AIV（Lupianietal.,2009）。此后H5亚型禽流感在全世界多个国家的鸟类、鸡、火鸡等群体中陆续发现报道，对养殖业造成了巨大的损失。我国首次分离到高致病性H5亚型禽流感在1996年，在广东省一个农场的鹅中分离到第一株高致病性H5亚型禽流感病毒。1997年，香港活禽市场的禽群中发生了高致病性H5N1禽流感（Subbaraoetal.,1998），2005年我国青海湖发生高致病性H5N1禽流感，导致野鸟大面积死亡，使人们注意到H5N1流感病毒通过候鸟的传播途径（Chenetal.,2005）。2015年8月，我国广东省清远市一个鸡场爆发了H5N6亚型高致病性禽流感。因此，我国每年对禽流感的流行病学监测对于疫情防控尤为重要。根据国内外的研究和流行病学监测结果，近年来国内流行的H5亚型禽流感病毒有H5N1、H5N2、H5N6、H5N8等多种亚型，HA基因分支主要包括2.3.4.4分支、2.3.2.1分支和7.2分支等三个基因群(Yuanetal.2016,Wuetal.2014,Guetal.2013,Wangetal.2014)。3 1.4研究目的和意义为了了解我国2014-2015年H5亚型禽流感的流行情况和当前流行毒株对动物的致病性，本研究对2014年～2015年禽流感流行病学调查中分离到的H5亚型AIV进行了分析研究，了解当前流行的H5亚型AIV毒株基因特征和在不同禽群中的分布情况，并且通过动物试验验了解毒株在禽和哺乳动物中的复制感染规律，为该病的综合防控提供科学数据。2材料与方法2.1材料2.1.1相关试剂DEPC水、PBS溶液等由国产分析纯试剂配制等；总RNA抽提试剂盒为上海飞捷生物技术有限公司产品；琼脂糖凝胶回收试剂盒为Magen公司产品；莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV）反转录酶及其Buffer、dNTP、RNA酶抑制剂、ExTaq聚合酶及其Buffer、DL1000Marker、DL2000Marker为TaKaRa公司产品；随机引物、反转录引物、PCR扩增引物为广州艾基生物有限公司产品。2.1.2鸡胚及实验动物病毒分离和纯化所用9-11日龄的SPF鸡胚购于华南农大生物药品有限公司；13～15g重SPF级Balb/c购于广东省实验动物中心；4周龄SPF鸡购于济南斯帕法斯家禽有限公司。2.1.3引物参照全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID)数据库中H5亚型禽流感病毒各个基因片段的序列，使用Oligo7软件设计，PB1、PB2和PA基因均分别用两对引物进行扩增，分别为PB11和PB12，PB21和PB22，PA1和PA2，其它5个基因均用一对引物扩增；由于N6亚型与N1、N2、N8亚型的NA基因差异较大，根据N6亚型的NA基因设计了一对N6引物。另外根据H5亚型禽流感的HA基因的保守区域设计一对HA的鉴定引物。设计的引物由广州艾基生物技术有限公司合成，采用PAGE方式纯化。’’反转录引物为：Uin12：5-AGCAAAGCAGG-3；病毒基因扩增引物序列(见表2.1)。4 表2.1病毒DNA的扩增引物引物名称上游引物下游引物鉴定-HA5TGGCAGGGAATGGTAGATGTAGGGAACTCGCCACTGTTGPB11AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTGAAGAGGATTGGAGYCCRTCCCACCAPB12ATGATGATGGGCATGTTCAACATGAGTAGAAACAAGGCATTTTTTCAPB21AGCRAAAGCAGGTCAAWTATATTCAACTGCYTTTATCATGCAMTCYTCPB22GCAACRGCTATYYTRAGGAAAGCAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAPA1AGCRAAAGCAGGTACTGATYCAAAAATCCARCTYGARTCWGTCAATTCAGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGPA2TAAGCAGGTGCTGGCAGAAH5AGCRAAAGCAGGGGTHAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAANPAGCRAAAGCAGGGTAGATAATCAAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTNA通用AGCAAAAGCAGGAGTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTN6AGCAAAAGCAGGGTGAAAATGAGTAGAAACAAGGGTGTTTTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACMAGCAAAAGCAGGTAGATRTTKAATCNSATTAGCAAAAGCAGGGTGGAGTAGAAACAAGGGTGTT2.1.4主要仪器ZENTRIFUGENROTOFIX32离心机为美国Hettich公司的产品；L8-M冷冻离心机、Allegra64型高速冷冻离心机为美国Beckman公司的产品；PTC-200型PCR仪为美国MJReSearch公司的产品；TgradientPCR仪为德国WhatmanBiometra公司的产品；InGeniusBioImaging凝胶成像及分析系统为英国GYNDENE公司的产品。2.1.5生物学软件序列编辑、转换、开放阅读框查找、引物设计、序列比较软件DNAstarLasegene（version7.1，DNAStar公司，USA），引物设计软件Oligo7(MolecµLarBiologyInsights公司，USA)，系统发生分析软件MEGA（version5.2，BiodesignInstituteofCenterforEvolutionaryFunctionalGenomics，USA）。2.1.6参考毒株本研究选取的参考毒株来自NCBIGenBank数据库，共16株（见表2.2）；选取参考疫苗株Re-6、Re-8、D7、D8株的HA基因序列来自华南农业大学禽病实验室数据库。5 表2.2本研究中源自GenBankH5亚型AIV参考毒株毒株名称8个基因片段GenBank收录号A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)KP286098.1KP286099.1KP286100.1KP286101.1KP286102.1KP286104.1KP286105.1KP286105.1A/chicken/Wuhan/HAQL07/2014(H5N1)KU143565.1KU143522.1KU143479.1KU143436.1KU143393.1KU143339.1KU143310.1KU143257.1A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)KP732579.1KP732599.1KP732619.1KP732639.1KP732659.1KP732678.1KP732699.1KP732719.1A/duck/EasternChina/S1109/2014(H5N8)KP732586.1KP732606.1KP732626.1KP732646.1KP732666.1KP732686.1KP732706.1KP732726.1A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)KU143567.1KU143524.1KU143480.1KU143438.1KU143395.1KU143341.1KU143308.1KU143259.1A/duck/Zhejiang/1220092/2014(H5N1)KU042655.1KU042684.1KU042713.1KU042742.1KU042771.1KU042800.1KU042829.1KU042858.1A/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)KJ476677.1KJ476675.1KJ476663.1KJ476665.1KJ476667.1KJ476669.KJ476671.1KJ476673.1A/environment/Guangdong/QY197/2014(H5N6)KT370066.1KT370060.1KT370077.1KT370081.1KT370087.1KT370094.1KT370101.1KT370108.1A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)KT370110.1KT370103.1KT370096.1KT370089.1KT370083.1KT370073.1KT370068.1KT370058.1A/goose/Yangzhou/0420/2014(H5N8)KT221086.1KT221085.1KT221084.1KT221083.1KT221081.1KT221082.1KT221080.1KT221079.1A/goose/Zhejiang/925037/2014(H5N8)KU042885.1KU042856.1KU042827.1KU042798.1KU042769.1KU042740.1KU042711.1KU042682.1A/NorthernKU201636.1KU201635.1KU201634.1KU201633.1pintail/Oregon/AH0003967/2015(H5N2)KU201632.1KU201631.1KU201630.1KU201629.1A/snowgoose/Missouri/150112461/2015(H5N2)KU201612.1KU201611.1KU201610.1KU201609.1KU201608.1KU201607.1KU201606.1KU201605.1A/turtledove/Wuhan/HKBJ07/2015(H5N6)KU143569.1KU143527.1KU143484.1KU143440.1KU143408.1KU143358.1KU143312.1KU143273.1A/wildduck/Jilin/HF/2011(H5N1)JX534577.1JX534576.1JX534575.1JX534574.1JX534573.1JX534572.1JX534571.1JX534570.1A/woodduck/Oregon/AH0007244/2015(H5N2)KU201644.1KU201643.1KU201642.1KU201641.1KU201640.1KU201639.1KU201638.1KU201637.1注：表中每株毒株的GenBank收录号依次对应PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因6 2.2病毒的获取2.2.1样品的采集2014年11月至2015年10月期间，按一定顺序每两周选择一间广东地区的活禽交易市场进行采样。根据市场中实际售卖鸡、鸭、鹅、鸽子档口的数量比例，计算需要采样的不同类型档口数量，一般情况下随机采集售卖鸡的档口8间，售卖鸭的档口1间，售卖鹅或鸽子的档口1间。每一间档口随机挑选10只家禽采集喉头、泄殖腔棉签拭子，将同一只家禽上采集的喉头和泄殖腔拭子放入同一个装有1mL保存液（含20%甘油及青霉素-链霉素各5000单位的灭菌PBS）规格为2mL的EP管中，作为一份样品；另外，每次采样选取2～3处潮湿的的卫生死角采集环境拭子，环境拭子采集后放入装有保存液的2mLEP管中每个环境拭子亦作为一份样品。采集的样品放入放置冰盒的采样箱中运输。本研究来源于活禽交易市场中的样品主要由林一村、丰舟、郑译、周琪、宋慧、曾昭勇、吴斯宇、刘杨、张旭等人共同采集。从基层兽医站、临床送检疑似禽流感病例中共获家禽脏器病料。2.2.2病毒的分离将装有喉头、泄殖腔棉拭子的样品震荡后，10000r/min离心3min，取上清接种；临床病料称重研磨后，按1g/mL加入PBS，冻融三次，10000r/min离心3min，取上清接种。每个样品接种3枚9～11日龄SPF鸡胚。每隔12h照胚，将死亡鸡胚放入4℃保存，48h后通过HA实验判断尿囊液是否存在病毒，收取含有病毒的尿囊液。本研究中的AIV分离主要由郭彩银、谢淑敏完成。2.2.3病毒的鉴定通过HA/HI试验鉴定AIV的HA亚型，对用HA/HI试验仍无法鉴定亚型的AIV，抽提病毒RNA后，以针对H5亚型AIV的HA基因的特异性引物鉴定-HA5，通过RT-PCR的方法进行鉴定。对市场中分离的H5亚型AIV的毒株进行HA、NA基因测序。若活禽市场中同一时间同一间档口采集的样品中分离出多株H5亚型AIV，只对其中一株H5亚型AIV进行HA、NA基因进行测序。本研究中HA/HI试验主要由郭彩银、谢淑敏完成；病毒RNA抽提、RT-PCR主要由林一村、任行星完成。2.3代表株的全基因组的测序、遗传演化分析和动物致病性实验2.3.1AIV代表毒株的挑选对临床送检病料中分离的H5亚型AIV的HA、NA基因进行分析之后，根据NA7 亚型以及HA基因特点（分支及HA结合受体位点突变情况）选取4株代表毒株进行全基因测序、遗传演化分析和动物致病性实验。2.3.2病毒RNA的抽提及反转录参照飞捷总RNA极速抽提试剂盒说明书，具体操作步骤如下(所有离心均为10000r/min)：在1.5ml的EP管中加入150µL的病毒鸡胚尿囊液和500µL的RA2试剂，震荡混匀后室温作用1min；将处理好的样品全部吸入内套管（已插外套管）中，离心1min；取出外套管，吸去外套管中的液体后放回内套管，加入500µL洗液，离心1min；重复上步再洗一次；取出内套管吸去外套管中的液体后放回内套管，不加洗液再离心2min；最后将内套管移入一个新的1.5mL的EP管中，在内套管的膜中央加入26µL的洗脱液静置1min后离心获取总RNA。反转录体系包括以下组分：5×MLVBuffer8µLdNTP2µL引物2µL反转酶M-MLV1µLRNA酶抑制剂1µL提取的RNA26µL将各个成分依次加入1.5mL的EP管内并混匀，然后置于42℃水浴2h，反转所得的cDNA置于-20℃或者直接用于目的片段的PCR扩增。2.3.3各基因片段的PCR扩增在PCR管中配制50μL体系的PCR混合液同时设立阴性对照，反应体系如下：去离子水36.5µL10×Buffer5µLdNTPs5µL上游引物(20pmol)1µL下游引物(20pmol)1µLcDNA2µLExTaq™Polymerase0.5µL将以上各组分混匀后，在PCR扩增仪中运行以下程序为：预变性95℃，5min；变8 性94℃，1min；退火温度54℃，1min；延伸72℃，1min50s；33个循环；终延伸72℃，10min；4℃，保存。2.3.4PCR产物的回收和纯化将PCR扩增产物在1%的琼脂凝胶中电泳后切下目的片段的DNA条带后，按照Megen试剂盒说明书进行目的核酸的回收：切下含有目的片段的凝胶，称重，按照100μL/mg凝胶的比例加入XP缓冲液，55℃水浴融化凝胶。将融化后的凝胶液转入微量收集管中，10000r/min离心1min，弃上清，再次加入300μLXP缓冲液到微量收集管中，10000r/min离心1min，弃上清，加入700μLWashBuffer，10000r/min离心1min，弃去上清液，再加入500μLWashBuffer，12000r/min离心1min，弃去上清液，12000r/min离心2min，将离心柱放入新的离心管中，加30μL灭菌去离子水，12000r/min离心2min。取2μL回收产物进行琼脂糖凝胶电泳或者直接检测浓度，检测回收效果，剩余样品用于连接或-20℃保存备用。2.3.5病毒鸡胚半数感染量（EID50）测定-5-10将纯化好的AIV按照10倍稀释法稀释10～10成6个稀释度，每个稀释度各接5枚9～11日龄非免疫胚，0.2mL/枚，37℃培养，弃去12h内死亡鸡胚，12h后死亡鸡胚放入4℃中保存，48h后测定所有感染鸡胚的尿囊液血凝活性，来判断该鸡胚是否被感染。通过Reed-Muench法计算病毒EID50滴度。距离比值=（高于50%感染数-50%）/（高于50%感染数-低于50%感染数）LogEID50=高于50%的稀释度的对数+距离比值×稀释因子2.3.6病毒对BALB/c小鼠致病性实验将体重为13g~15g重的SPF级BALB/c雌性小鼠随机分成5组，分别编号，其中一组作为阴性空白对照组，其他4组为实验组，每组8只小鼠，每组中有5只编号用于体重称量，另外3只用于4d剖杀取肺脏和脑组织，用来测定肺脏、鼻甲骨、脑中的病毒含量。攻毒前对每组中需要称重的小鼠进行编号、称量初始体重、记录，实验组中每只小鼠分别用干冰麻醉后以滴鼻方式接种4株不同的H5亚型AIV，每只接种剂量为650μL10EID50，对照组以同样方法麻醉后接种50μL等量的PBS缓冲液。攻毒后14天每天对编号的小鼠进行体重称量、记录，将体重低于初始体重75%的小鼠记作死亡，观察记录各组小鼠状态和死亡情况。采集的每个肺脏和脑组织用于小鼠肺脏、脑中病毒含量滴度测定。测定滴度前将脏9 器组织进行称重，研磨，充分研磨后按照1mL/g量加入相应量PBS缓冲液，混匀后转-１-7入离心管，4℃，8000r/min离心，10min。肺脏按照10倍倍比稀释成2×10～2×10稀释度进行接胚，每枚0.1mL，每个稀释度接3枚9~11日龄SPF鸡胚，37℃孵化48h；-1-6脑和鼻甲骨按照2×10～2×10稀释度进行稀释接胚，每枚0.1mL，37℃孵化，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性，以此来判断各病毒感染的小鼠肺脏和脑中是否存在感染，并利用Reed-Muench法计算病毒EID50滴度。2.3.7病毒对SPF鸡致病性实验54个病毒的攻毒剂量均为10EID50/200μL，每组14只4周龄SPF鸡（感染组7只，同居组7只），空白对照组9只，采取脚标编号记录。经点眼、滴鼻方法每只攻毒200μL，每组攻7只SPF鸡，对照组不攻毒，并将攻毒当天计做0d，攻毒后1d各组放入同居组，每组7只，随后连续观察14d，并随时记录各组鸡的临床症状和鸡的死亡情况。饲养期间分别于感染后2d、4d、6d、8d、10d采集各组鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子，分装到不同离心管中，用来测定攻毒后鸡的排毒情况。将采集的咽喉拭子和泄殖腔拭子用含有青霉素与链霉素各5000单位的PBS缓冲液震荡，各接3枚9～11日龄的非免疫胚，37℃孵化，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性，来判断是否存在感染。在攻毒后3d随机剖杀攻毒组和对照组鸡3只，4d随机剖杀同居组和对照组鸡各2只，分别取心、肝、脾、肺、肾、脑6个组织脏器，用于测定不同病毒感染SPF鸡后各个组织脏器中病毒复制能力及组织嗜性。在测定各组织脏器病毒滴度时，先将留取的各个不同组织进行称重、研磨，充分研磨后按照1mL/g加入相应量PBS缓冲液，混匀后-1-7转入离心管，4℃，4000r/min，离心10min，吸取上清液，10倍倍比稀释成10～107个稀释度进行接胚，各稀释度接3枚，每枚0.2mL，37℃孵化，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性，以此用来判断是否存在感染，并利用Reed-Muench法计算各被测样品中病毒滴度，以此作为判断各病毒组织嗜性及不同脏器中病毒复制能力的标准。3结果3.1流行病学调查结果本研究从基层兽医站、临床送检疑似AI病例中共获家禽脏器病料228份，其中来源于鸡的93份，来源于水禽143份。用鸡胚接种分离病毒，共分离出113株AIV，分离率为49.6%，其中H5亚型AIV53株，分离率为23.2%，占临床病料分离AIV总数的46.9%。临床病料来自于福建、广东、山东、河南、浙江、天津、河北、广西、湖南、10 江西、海南等省份（见图3.1）。图3.1临床病料来源区域示意图注：图中红色的区域为临床样品来源的省份。本地图仅表示包含我国各省份陆地区域，不包括我国海域。本研究从2014年11月至2015年10月对广东地区活禽交易市场（广州、东莞、湛江、茂名、汕尾、潮州、中山等市，见图3.2）中的家禽随机采集喉头、泄殖腔棉签拭子，共3089份样品。通过鸡胚接种分离出AIV共623株，AIV分离率为20.16%。通过HA/HI实验鉴定分离的毒株，发现H5亚型AIV共99株，分离率为3.1%，占活禽交易市场样品AIV分离株总数的15.4%。11 图3.2活禽交易市场采样地点图示注：红色部分为本研究采样的活禽交易市场所在的行政区域。3.1.1宿主来源统计对所有H5亚型AIV的宿主来源进行统计。临床病料分离的毒株中，来源于鸡的共17株，占32.1%，来源于水禽的共36株，占67.9%。活禽交易市场分离的毒株中，来源于鸡的AIV共35株，占H5分离株总数的35.4%；来源于水禽的AIV共55株，占H5分离株总数的55.6%；来源于鸽的AIV共4株，占H5分离株总数的4%；来源于环境的AIV共5株，占H5分离株总数的5%（见图3.3）。12 32.1%临床病料水禽临床病料鸡67.9%a5.0%4.0%活禽交易市场水禽活禽交易市场鸡35.4%活禽交易市场鸽55.6%活禽交易市场环境b图3.3活禽市场及临床病料中分离H5亚型AIV毒株宿主来源统计图注：a为临床病料H5AIV宿主来源分布图，b为活禽市场H5AIV宿主来源统计分布图。3.1.2NA亚型统计对临床病料中分离的53株H5亚型AIV和活禽交易市场中分离的29株H5亚型AIV的HA、NA基因进行测序，根据NA亚型进行统计，结果如下：从临床病料分离的53株H5亚型AIV中，其中H5N6亚型AIV共37株，占临床病料分离的H5亚型AIV分离株总数的69.8%；H5N1亚型AIV有8株，占临床病料分离的H5亚型AIV分离株总数的15.1%；H5N2亚型AIV共5株，占临床病料分离的H5亚型AIV分离株总数的9.4%；H5N8亚型共2株，占临床病料分离的H5亚型AIV分离株总数的3.8%；从活禽交易市场分离的29株H5亚型AIV中，H5N6亚型AIV共24株，占活禽交易市场H5亚型AIV分离株总数的82.8%；H5N2亚型共4株，占活禽交易市场H5亚型AIV分离株总数的13.8%；H5N1亚型共1株，占活禽交易市场H5亚型AIV分离株总数的3.4%（见图3.4）。13 临床病料分离毒株H5N6H5N1H5N2H5N84%10%15%71%a活禽交易市场分离毒株H5N6H5N10%3%14%83%b图3.4不同NA亚型H5亚型AIV统计注：a为临床病料H5AIV的NA亚型统计图，b为活禽市场H5AIV的NA亚型统计图。3.1.3HA分支统计对上述82株H5亚型AIV的HA基因作遗传进化树进行分析，69株AIV的HA基因位于2.3.4.4分支上，占84.1%；其余13株AIV的HA基因位于2.3.2.1分支，占15.9%。其中从临床病料分离的53株AIV中，12株AIV的HA基因位于2.3.2.1分支，占临床病料H5亚型分离株总数的22.6%，41株AIV的HA基因位于2.3.4.4分支，占临床病料H5亚型分离株总数的77.4%；从活禽交易市场分离的29株H5亚型AIV中，1株AIV的HA基因位于2.3.2.1分支，占活禽市场H5亚型AIV分离株总数的3.4%，其余28株14 AIV的HA基因均位于2.3.4.4分支，占活禽市场H5亚型AIV分离株总数的96.6%(见图3.5)。图3.5H5毒株分支遗传进化树分析注：红色部分为实验室分离株15 将69株2.3.4.4分支的H5亚型AIV的HA基因与Re-8、D8两株疫苗株的HA基因进行相似性分析，与Re-8疫苗株HA基因相似性在94.4%～98.5%之间；与D8疫苗株的HA基因相似性在96.9%～98.7%之间（见图3.6）。将13株2.3.2.1分支的H5亚型AIV的HA基因与Re-6、D7两株疫苗株的HA基因进行相似性分析，与Re-6疫苗株HA基因相似性在96.5%～98.1%之间；与D7疫苗株的HA基因相似性在92.2%～92.9%之间（见图3.7）。3.1.4HA结合位点基因突变及HA蛋白裂解位点统计有研究表明HA基因编码的氨基酸序列发生S137A、T192I双位点突变或者E190D、K193S、G225D三位点突变或者Q226L、G228S双位点突变均能增强流感毒株对唾液酸α2-6半乳糖（SAα2-6Gal）受体结合能力(Yangetal.2007)（以上位点均以H3亚型流感编码的氨基酸序列为标准，在H5亚型流感中分别对应149、204、202、205、237、238、240位点）。本研究对82株H5亚型AIV的HA受体结合位点进行分析，发现所有毒株均未发生E190D、K193S、G225D三位点突变或者Q226L、G228S双位点突变，但有11株发生了S137A、T192I双位点突变，占12.8%，其中10株为临床毒株，1株为活禽交易市场分离毒株。本研究还对GISAID流感数据库中2010年～2013年中国境内分离到的禽源H5亚型流感病毒HA蛋白的氨基酸序列进行统计，发现2010年有4.5%毒株发生S137A、T192I双位点突变，2011年有35%的毒株发生S137A、T192I双位点突变，2012年没有发生均未发现S137A、T192I双位点突变，2013年有6%的毒株发生S137A、T192I双位点突变。另外，所有毒株都未发现发生E190D、K193S、G225D三位点突变或者Q226L、G228S双位点突变。本研究中进行测序的82株H5亚型AIV的HA蛋白裂解位点均存在多个连续碱性氨基酸，符合高致病性禽流感特征。16 图3.62.3.4.4分支H5亚型AIV与疫苗株相似性分析17 图3.72.3.2.1分支H5亚型AIV与疫苗株HA基因相似性分析18 3.2代表毒株遗传序列分析本研究根据NA亚型、HA基因特点，从临床病料分离毒株中选择了4株H5亚型AIV代表株（见表3.1），对代表毒株进行了全基因测序和序列分析。表3.1进H5亚型AIV代表株NA亚型HA分支HA蛋白发生简称毒株名称S137AT192I突变A/goose/Hebei/512/2015(H5N8)N82.3.2.1是15512A/chicken/Tianjin/514/2015(H5N1)N12.3.2.1是15514A/chicken/Tianjin/516/2015(H5N2)N22.3.4.4否15516A/goose/Guangdong/600/2015(H5N6)N62.3.4.4否156003.2.1HA序列分析4株H5亚型AIV的HA基因均有完整ORF框，包含1704个核苷酸，可推导编码568个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有28个和44个核苷酸。对4株H5亚型AIV进行N端糖基化位点预测分析发现：4株AIV在26位，27位，39位，181位，209位，302位，499位，558位均存在糖基化位点；在170位与509位糖基化位点均出现缺失（见表3.2）。表3.2HA基因编码氨基酸潜在糖基化位点分析潜在糖基化位点毒株262739181209302499558NNSNSTNVTNNTNPTNSSNGTNGS15512++++++++15514++++++++15516++++++++15600++++++++对4株H5亚型AIV进行HA受体结合位点分析发现：4株AIV的HA基因编码的氨基酸序列第149位均突变为A，202位均为E，237-240位均为GQSG；1551219 和15514株204位突变为I；205～208位15512株和15514株突变为ALYK，15516和15600株突变为NLYK,（见表3.3）。裂解位点分析发现：4株AIV的HA裂解位点均为RRRKR↓G，符合高致病性禽流感病毒的典型分子特征：裂解位点由多个连续的碱性氨基酸构成。表3.3HA受体结合位点及裂解位点表HA受体结合位点毒株裂解位点149202204205-208237-240SETKLYQGQSG15512RRRKR↓GA+IALYK+15514RRRKR↓GA+IALYK+15516RRRKR↓GA++NLYK+15600RRRKR↓GA++NLYK+将4株H5亚型AIV实验株的HA基因核酸序列进行遗传进化分析。发现15512和15514的HA基因位于2.3.2.1分支中的WZ-like分支上，与参考毒株A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)亲缘性相近；15516的HA基因位于2.3.4.4分支中的在EC-Like分支上，与参考毒株A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)亲缘性相近；15600的HA基因位于2.3.4.4分支中的GD-Like分支上，与参考毒株A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)亲缘性相近（见图3.8）。20 A/snowgoose/Missouri/15-011246-1/2015(H5N2)A/woodduck/Oregon/AH0007244/2015(H5N2)A/Northernpintail/Oregon/AH0003967/2015(H5N2)EC-LikeA/baikalteal/Korea/Donglim3/2014(H5N8)A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)15516A/turtledove/Wuhan/HKBJ07/2015(H5N6)15600A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)GD-LikeA/environment/Guangdong/QY197/2014(H5N6)2.3.4.4A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)A/wild/duck/Shandong/628/2011(H5N1)A/duck/Guangdong/s14044/2014(H5N8)A/goose/Yangzhou/0420/2014(H5N8)A/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)ZJ-LikeA/duck/Eastern/China/S1109/2014(H5N8)A/goose/Zhejiang/925037/2014(H5N8)A/goose/Eastern/China/1112/2011(H5N2)A/quail/Jiangsu/k0104/2010(H5N5)A/duck/Eastern/China/031/2009(H5N5)A/duck/Guangdong/23/2004(H5N1)A/Guangxi/1/2009(H5N1)A/duck/Hunan/8/2008(H5N1)A/Hubei/1/2010(H5N1)A/wildduck/Jilin/HF/2011(H5N1)2.3.21551215514WZ-LikeA/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)A/duck/Zhejiang/1220092/2014(H5N1)A/chicken/Wuhan/HAQL07/2014(H5N1)0.01图3.8HA基因遗传进化树3.2.2NA序列分析对4株H5亚型AIV的NA基因进行核酸和氨基酸序列分析及糖基化位点预测后发现：15512的NA基因为N8亚型，ORF长度为1413个核苷酸，编码471个氨基酸。NA蛋白茎部无氨基酸缺失，氨基酸序列潜在糖基化位点为54为NET,67位NTS，84位NNTE，144位NGT，293位NWT，398位NWS。15514的NA基因为N1亚型，ORF长度为1350个核苷酸，编码450个氨基酸。NA蛋白茎部49～68位缺失20个氨基酸，氨基酸序列预测糖基化位点为126位NGT和215位NGS。15516的NA基因为N2亚型，ORF长度为1414个核苷酸，编码471个氨基酸。NA蛋白颈部无氨基酸缺失，预测糖基化位点为61位NIT，69位NNT，70位NIT，21 86位NWT，146位NGT，200位NAT，234位NGT，400位NSS。15600的NA基因为N6亚型，ORF长度为1380个核苷酸，编码460个氨基酸，NA蛋白茎部59～70位缺失22个氨基酸，预测糖基化位点为51位NET，54位NPT，59位NIT，135位NGT，190位NAS，391位NWS。在Mitnaul（1996）的研究中发现，AIV的NA蛋白缺失氨基端胞浆尾会改变病毒颗粒形状，并且影响NA蛋白的表达量和稳定性，还会影响病毒的毒力。NA蛋白的氨基端胞浆尾包含6个序列为MNPNQK的氨基酸残基。对本研究中的4株分离株的氨基酸序分析后发现在该部分都没有发生变异。对4株AIV实验株的NA基因核酸序列进行遗传进化分析。发现15512的NA基因位于ZJ-Like分支上，与参考毒株A/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)亲缘性相近；15514的NA基因位于WZ-like分支上，与参考毒株A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)亲缘性相近；15516的NA基因位于EC-Like分支上，与参考A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)亲缘性相近；15600的NA基因位于GD-Like分支上，与参考毒株A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)亲缘性相近（见图3.9）。69A/chicken/Wuhan/HAQL07/2014(H5N1)82A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)9515514WZ-Like100A/duck/Zhejiang/1220092/2014(H5N1)94A/wildduck/Jilin/HF/2011(H5N1)A/goose/Yangzhou/0420/2014(H5N8)A/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)100A/goose/Zhejiang/925037/2014(H5N8)ZJ-Like74A/duck/EasternChina/S1109/2014(H5N8)95711551210015516A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)100A/snowgoose/Missouri/15-011246-1/2015(H5N2)EC-LikeA/Northernpintail/Oregon/AH0003967/2015(H5N2)10059A/woodduck/Oregon/AH0007244/2015(H5N2)1560052A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)100A/turtledove/Wuhan/HKBJ07/2015(H5N6)GD-Like74A/environment/Guangdong/QY197/2014(H5N6)55A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)0.1图3.9NA遗传进化树22 3.2.3PB2基因序列分析对本研究中4株H5亚型AIV的PB2基因序列的序列分析发现：4株分离株的PB2基因全长都为2341个核苷酸，包含完整ORF为2280个核苷酸，推导编码759，个氨基酸，5’端非编码区有27个核苷酸，3’端非编码区有34个核苷酸。4株H5亚型AIV的PB2基因编码氨基酸的第627位都为E，第701位上均为的D。15512、15514、15516三株AIV的PB2基因编码氨基酸的第588位为A，15600编码的588位氨基酸为V（见表3.4）。将4株AIV实验株的PB2基因核酸序列进行遗传进化分析。发现15512的PB2基因位于ZJ-Like分支上，与参考毒株A/duck/Eastern/China/S1109/2014(H5N8)亲缘性相近；15514的PB2基因位于WZ-like分支上，与参考毒株A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)亲缘性相近；15516的PB2基因与EC-Like分支毒株A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)的PB2基因有一定遗传距离；15600与GD-Like分支毒株A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)的PB2基因有一定遗传距离，不在GD-Like分支上（见图3.10）。A/duck/EasternChina/S1109/2014(H5N8)15512A/goose/Zhejiang/925037/2014(H5N8)ZJ-LikeA/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)A/goose/Yangzhou/0420/2014(H5N8)A/duck/Zhejiang/1220092/2014(H5N1)15514WZ-LikeA/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)A/chicken/Wuhan/HAQL07/2014(H5N1)15600A/snowgoose/Missouri/15-011246-1/2015(H5N2)A/woodduck/Oregon/AH0007244/2015(H5N2)A/Northernpintail/Oregon/AH0003967/201(H5N2)15516A/wildduck/Jilin/HF/2011(H5N1)A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)EC-LikeA/turtledove/Wuhan/HKBJ07/2015(H5N6)A/environment/Guangdong/QY197/2014(H5N6)GD-LikeA/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)0.1图3.10PB2遗传进化树23 3.2.4PB1基因序列分析对本研究4株H5亚型AIV的PB1基因序列分析发现，PB1基因长度均为2341bp个核苷酸，包含完整ORF框，长度为2274个核苷酸，推导编码757个氨基酸，5’端非编码区包含24个核苷酸，3’端非编码区含有43个核苷酸。4株AIV的PB1基因编码氨基酸第13位均为P，第678位均为S（见表3.4）。将4株AIV实验株的PB1基因核酸序列进行遗传进化分析。发现15512的PB1基因位于ZJ-Like分支上，与参考毒株A/duck/Eastern/China/S1109/2014(H5N8)亲缘性相近；15514的PB1基因位于WZ-like分支上，与参考毒株A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)亲缘性相近；15516的PB1基因在EC-Like分支上，与参考毒株A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)亲缘性相近；15600与GD-Like分支上，与参考毒株A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)亲缘性相近（见图3.11）。A/environment/Guangdong/QY197/2014(H5N6)A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)15600GD-LikeA/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)A/turtledove/Wuhan/HKBJ07/2015(H5N6)A/duck/Zhejiang/1220092/2014(H5N1)A/wild/duck/Jilin/HF/2011(H5N1)A/duck/EasternChina/S1109/2014(H5N8)A/chicken/Wuhan/HAQL07/2014(H5N1)15514WZ-LikeA/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)A/goose/Zhejiang/925037/2014(H5N8)15516EC-LikeA/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)A/goose/Yangzhou/0420/2014(H5N8)A/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)ZJ-Like15512A/snowgoose/Missouri/15-011246-1/2015(H5N2)A/Northernpintail/Oregon/AH0003967/2015(H5N2)A/woodduck/Oregon/AH0007244/2015(H5N2)0.01图3.11PB1基因遗传进化树24 3.2.5PA基因序列分析对本研究中4株H5亚型AIV的PA基因序列的序列分析发现：4株分离株的PA基因全长为2233个核苷酸，包含有一个长度为2151个核苷酸完整ORF，5’端非编码区包含58个核苷酸，3’端非编码区包含24个核苷酸。本研究中的这4株H5亚型AIV分离株PA基因编码的氨基酸序列第97位均为T，224位均位S，在383位点处均为D，615位氨基酸均K，均未发生突变（见表3.4）。将4株AIV实验株的PA基因核酸序列进行遗传进化分析。发现15512的PA基因位于ZJ-Like分支上，与参考毒株A/duck/Eastern/China/S1109/2014(H5N8)亲缘性相近；15514的PA基因位于WZ-like分支上，与参考毒株A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)亲缘性相近；15516的PA基因在EC-Like分支上，与参考毒株A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)亲缘性相近；15600的PA基因位于GD-Like分支上，与参考A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)亲缘性相近（见图3.12）。A/duck/EasternChina/S1109/2014(H5N8)15512ZJ-LikeA/goose/Yangzhou/0420/2014(H5N8)A/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)A/goose/Zhejiang/925037/2014(H5N8)A/snow/goose/Missouri/15-011246-1/2015(H5N2)A/Northern/pintail/Oregon/AH0003967/2015(H5N2)A/woodduck/Oregon/AH0007244/2015(H5N2)A/duck/Zhejiang/1220092/2014(H5N1)15600A/turtledove/Wuhan/HKBJ07/2015(H5N6)A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)GD-LikeA/environment/Guangdong/QY197/2014(H5N6)A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)15516EC-LikeA/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)A/wildduck/Jilin/HF/2011(H5N1)15514A/chicken/Wuhan/HAQL07/2014(H5N1)WZ-LikeA/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)0.01图3.12PA基因遗传进化树25 3.2.6NP基因序列分析对本研究中4株H5亚型AIV的NP基因序列的序列分析发现：4株分离株的NP基因全长为1565个核苷酸，包含有一个长度为1497个核苷酸的完整ORF，推导编码498个氨基酸，其5’端非编码区包含58个核苷酸，3’端非编码区包含24个核苷酸。4株H5亚型AIV基因编码的氨基酸序列第184位均为K，第319位均为N（见表3.4）。将4株AIV实验株的NP基因核酸序列进行遗传进化分析。发现15512的NP基因位于ZJ-Like分支上，与参考毒株A/duck/Eastern/China/S1109/2014(H5N8)亲缘性相近；15514的NP基因位于WZ-like分支上，与参考毒株A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)亲缘性相近；15516的NP基因位于EC-Like分支上，与参考毒株A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)亲缘性相近；15600的NP基因位于GD-Like分支上，与参考毒株A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)亲缘性相近（见图3.13）。A/environment/Guangdong/QY197/2014(H5N6）A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)GD-LikeA/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)15600A/turtledove/Wuhan/HKBJ07/2015(H5N6)A/duck/Zhejiang/1220092/2014(H5N1)A/wildduck/Jilin/HF/2011(H5N1)A/chicken/Wuhan/HAQL07/2014(H5N1)WZ-LikeA/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)15514A/goose/Zhejiang/925037/2014(H5N8)15516EC-LikeA/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)A/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)A/goose/Yangzhou/0420/2014(H5N8)ZJ-Like15512A/duck/EasternChina/S1109/2014(H5N8)A/snow/goose/Missouri/15-011246-1/2015(H5N2)A/Northern/pintail/Oregon/AH0003967/2015(H5N2)A/woodduck/Oregon/AH0007244/2015(H5N2)0.01图3.13NP基因遗传进化树26 3.2.7M基因序列分析对本研究中4株H5亚型AIV的M基因序列的序列分析发现：4株分离株的M基因全长为1027个核苷酸，包含两个ORF，M1从26位到784位，长度为759个核苷酸的完整ORF，编码252个氨基酸，是连续的片段；M2分为不连续的两部分，第一部分从26位51位，第二部分从740位1007位，与M1重叠了71个核苷酸，共编码97个氨基酸。4株H5分离株中M1基因编码的氨基酸序列第15位均为I，第30位均为D，第121位均为T，第167位均为T，第215位均为A。M2基因编码氨基酸第26位都为L，第30位都为A，第31位15600为S，其余三株为N（见表3.5）。将4株AIV实验株的M基因核酸序列进行遗传进化分析。发现15512的M基因位于ZJ-Like分支上，与参考毒株A/duck/Eastern/China/S1109/2014(H5N8)亲缘性相近；15514的M基因位于WZ-like分支上，与参考A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)亲缘性相近；15516的M基因位于EC-Like分支上，与参考毒株A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)亲缘性相近；15600的M基因与GD-Like分支，与参考毒株A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)的M基因有一定遗传进化距离（见图3.14）。15512A/duck/EasternChina/S1109/2014(H5N8)A/goose/Zhejiang/925037/2014(H5N8)ZJ-LikeA/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)A/goose/Yangzhou/0420/2014(H5N8)15516A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)A/woodduck/Oregon/AH0007244/2015(H5N2)EC-LikeA/Northern/pintail/Oregon/AH0003967/2015(H5N2)A/snow/goose/Missouri/15-011246-1/2015(H5N2)15514A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)WZ-LikeA/duck/Zhejiang/1220092/2014(H5N1)A/chicken/Wuhan/HAQL07/2014(H5N1)A/wildduck/Jilin/HF/2011(H5N1)A/turtledove/Wuhan/HKBJ07/2015(H5N6)A/environment/Guangdong/QY197/2014(H5N6)A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)GD-LikeA/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)15600M图3.14M基因遗传进化树27 3.2.8NS基因序列分析对本研究中4株H5亚型AIV的NS基因序列的序列分析发现:4株分离株NS基因长度为890个核苷酸，其中包含2个ORF框，NS1和NS2。15512株NS1基因ORF长度为693个核苷酸，15514和15600株NS1基因ORF长度为678个核苷酸15516株NS1基因ORF长度为612个核苷酸。4株分离株的NS2基因ORF均由第130位和503～838位两段组成，长度为366个核苷酸构。本研究4株H5亚型AIV中15600和15514株NS1基因编码的氨基酸序列第92位为E，15512和15516株的NS1基因编码的氨基酸序列第92位为D（见表3.5）。将4株AIV实验株的NS基因核酸序列进行遗传进化分析。发现15512的NS基因位于ZJ-Like分支上，与参考毒株A/duck/Eastern/China/S1109/2014(H5N8)亲缘性相近；15514的NS基因位于WZ-like分支上，与参考毒株A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)亲缘性相近；15516的NS基因位于EC-Like分支上，与参考毒株A/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)亲缘性相近；15600的NS基因位于GD-Like分支上，与参考毒株A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)亲缘性相近（见图3.15）。15514A/duck/Wenzhou/HAYXLG10/2015(H5N1)WZ-LikeA/chicken/Wuhan/HAQL07/2014(H5N1)A/duck/Zhejiang/1220092/2014(H5N1)A/wildduck/Jilin/HF/2011(H5N1)15600A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)A/turtledove/Wuhan/HKBJ07/2015(H5N6)GD-LikeA/environment/Guangdong/QY197/2014(H5N6)A/environment/Guangdong/QY208/2014(H5N6)A/Northern/pintail/Oregon/AH0003967/2015(H5N2)A/snow/goose/Missouri/15-011246-1/2015(H5N2)A/woodduck/Oregon/AH0007244/2015(H5N2)15516EC-LikeA/duck/EasternChina/S0131/2014(H5N2)A/goose/Zhejiang/925037/2014(H5N8)A/duck/Zhejiang/W24/2013(H5N8)A/goose/Yangzhou/0420/2014(H5N8)ZJ-LikeA/duck/EasternChina/S1109/2014(H5N8)155120.01图3.15NS基因遗传进化树28 表3.4PB2、PB1、PA、M基因编码氨基酸位点分析氨基酸PB2PB1PAM位点588627701136789722438361518431915512AEDPSTSDKKN15514AEDPSTSDKKN15516AEDPSTSDKKN15600VEDPSTSDKKN表3.5M1、M2、NS1基因编码氨基酸位点分析氨基酸位M1M2NS1点1530121167125263031429215512IDTTALANSD15514IDTTALANSE15516IDTTALANSD15600IDTTALASSE3.3鸡胚半数致死量测定将纯化好的分离株15512、15514、15516、15600尿囊液按照10倍稀释法用PBS-5-10稀释成10～106个稀释度，每个稀释度各接5枚11日龄非免疫胚，0.2mL/枚，37℃培养，弃去12h内死亡鸡胚，12h后死亡的鸡胚放入4℃保存，48h后测定所有鸡胚的尿囊液血凝活性，来判断该鸡胚是否被感染。通过Reed-Muench法计算病毒EID50滴度。实验中所有感染病毒的鸡胚都在36～48h死亡，各分离株EID50测定结果见表3.6。表3.6鸡胚半数致死量稀释度毒株EID50/200μL-5-6-7-8-9-101010101010108.5155125/55/55/55/50/50/5108.17155145/55/55/53/50/50/5107.63155165/55/55/51/50/50/5108.68156005/55/55/54/52/50/51029 3.4H5亚型AIV对SPF级BALB/c小鼠致病性实验3.4.1小鼠体重变化及死亡情况15512小鼠2d出现体重下降，6d开始死亡3只小鼠，7d死亡2只小鼠，共死亡5只，死亡率达100%；15514组小鼠2d出现体重下降，6d出现死亡2只，7d死亡3只，共死亡5只，死亡率达100%；15516组小鼠1d开始体重下降，5d稍微回升后6d继续下降，6d死亡1只小鼠，8d死亡2只小鼠，10d体重开始回升，10d死亡1只小鼠，最终体重低于空白对照组，共死亡4只小鼠，死亡率达到80%。15600组小鼠体重下降情况不如其他三个攻毒组明显，3d体重增速减缓，5d体重下降后9d体重开始回升，10d死亡1只小鼠，最终体重高于15516组，但比空白对照组低，共死亡1只小鼠，死亡率达20%（见表3.7，图3.16）。饲养中观察发现，攻毒组小鼠体重下降期间都出现了精神不振，食欲下降，毛发蓬松等症状。30 表3.7各组小鼠体重变化及死亡情况记录表空白组0d1d2d3d4d5d6d7d8d9d10d11d12d13d14d75%体重（g）1号体重（g）14.415.115.816.417.518.018.518.919.219.019.719.619.519.919.910.82号体重（g）12.713.514.014.615.916.517.518.418.819.119.719.819.519.620.39.53号体重（g）11.913.113.914.415.316.217.117.818.719.219.820.020.120.520.48.94号体重（g）12.213.213.814.615.216.317.017.818.518.318.818.918.918.919.09.25号体重（g）12.913.514.014.615.616.217.017.018.017.818.318.017.918.017.99.7体重均值（g）12.813.714.314.915.916.617.418.018.618.719.319.319.219.419.5累计死亡数（只）0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0存活率1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0a15512组0d1d2d3d4d5d6d7d8d9d10d11d12d13d14d75%体重（g）1号体重（g）13.312.110.810.710.510.2死亡10.02号体重（g）13.114.114.813.212.711.810.7死亡9.83号体重（g）14.214.815.013.412.211.3死亡10.74号体重（g）14.515.215.913.812.511.5死亡10.95号体重（g）14.115.115.813.813.112.811.1死亡10.6体重均值（g）13.814.314.513.012.211.510.9累计死亡数（只）0.00.00.00.00.00.03.05.0存活率1.01.01.01.01.01.00.40.0b31 15514组0d1d2d3d4d5d6d7d8d9d10d11d12d13d14d75%体重（g）1号体重（g）13.714.813.912.711.710.910.4死亡10.32号体重（g）14.115.115.013.311.911.210.7死亡10.63号体重（g）13.314.513.212.111.310.310.2死亡10.04号体重（g）13.614.713.812.211.110.4死亡10.25号体重（g）14.215.314.713.012.011.1死亡10.7体重均值（g）13.814.914.112.711.610.810.410.3累计死亡数（只）0.00.00.00.00.00.02.05.0存活率1.01.01.01.01.01.00.60.0c15516组0d1d2d3d4d5d6d7d8d9d10d11d12d13d14d75%体重（g）1号体重（g）13.614.212.312.313.514.313.011.1死亡10.22号体重（g）14.014.513.513.915.616.715.413.912.411.4死亡10.53号体重（g）12.513.212.011.912.413.311.810.5死亡9.44号体重（g）13.914.412.812.112.213.812.711.510.711.011.311.712.513.313.710.45号体重（g）13.814.212.411.711.110.8死亡10.4体重均值（g）13.614.112.612.413.013.813.211.811.611.211.311.712.513.313.7累计死亡数（只）0.00.00.00.00.00.01.01.03.00.04.00.00.00.00.0存活率1.01.01.01.01.01.00.80.80.40.40.20.20.20.20.2d32 15600组0d1d2d3d4d5d6d7d8d9d10d11d12d13d14d75%体重（g）1号体重（g）14.215.315.816.116.014.913.813.012.411.813.213.914.915.216.010.72号体重（g）13.314.615.115.816.416.515.914.814.514.412.612.212.712.813.710.03号体重（g）12.713.814.514.815.416.216.315.415.617.117.717.817.917.818.19.54号体重（g）13.714.015.215.415.816.416.315.914.313.1死亡10.35号体重（g）14.315.015.615.816.116.416.616.717.118.118.518.518.618.619.210.7体重均值（g）13.614.515.215.615.916.115.815.214.814.915.515.616.016.116.810.2累计死亡数（只）0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.01.00.00.00.00.0存活率1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.00.80.80.80.80.8e注：a表为空白对照组，b表为15512攻毒组，c表为15514攻毒组，d表为15516攻毒组，e组为15600攻毒组33 200空白对照组1551215015514%1551610015600体重500051015攻毒后天数a15015512（H5N8）15514(H5N1)15516(H5N2)100%15600(H5N6)空白对照存活率500051015攻毒后天数b图3.16小鼠体重变化及死亡情况折线图注：图a为小鼠体重变化折线图，图b为小鼠死亡情况折线图3.4.2病毒在小鼠体内复制情况由图3.17所示，4株病毒在小鼠肺脏中都能繁殖，且滴度比较高，范围在4～5EID50/100μL；15512、15514、15516都在小鼠脑和鼻甲骨中繁殖，其中15512和15514在脑中病毒滴度在3.5～4.5EID50/100μL之间，在鼻甲骨中病毒滴度在2～4.5EID50/100μL之间，而15516在脑和鼻甲骨中病毒滴度分别为0.92EID50/100μL和0.81EID50/100μL；，15600则不能在小鼠的脑和鼻甲骨中繁殖。34 图3.17小鼠脏器病毒滴度3.5H5亚型AIV对SPF鸡致病性实验3.5.1SPF鸡感染后存活率5以200μL10EID50剂量对SPF鸡以点眼滴鼻的方式攻毒，连续观察14d记录各组鸡出现的临床症状及死亡情况（见图3.18和图3.19）15512攻毒组第2天死亡5只鸡，鸡死亡迅速，死亡前无明显症状，之后再无鸡死亡；同居组除第4天剖杀3只鸡外无鸡死亡。15514攻毒组第2天死亡4只鸡，第3天死亡1只鸡，鸡死亡迅速，死亡前无明显症状，之后再无鸡死亡；同居组第4天死亡一只鸡，鸡死亡迅速，死亡前无明显症状，另外剖杀2只鸡，之后再无鸡死亡。15516攻毒组第3天死亡3只鸡，鸡死亡迅速，死亡前无明显症状，之后再无鸡死亡；同居组除第4天剖杀3只鸡无鸡死亡；15516攻毒组和同居组存活的鸡在第5天到第10天进食和饮水减少。15600攻毒组除第3天剖杀3只鸡，无鸡死亡；同居组除第4天剖杀3只鸡，无鸡死亡。对照组除第3天剖杀3只鸡，无鸡死亡。35 图3.18攻毒组鸡存活情况图3.19同居组鸡存活情况3.5.2SPF鸡感染后各组织脏器含毒量测定结果攻毒后第3天每个攻毒组和对照组各随机选取鸡3只剖杀，攻毒后第4天每个同居组各随机选取鸡3只剖杀，分别取心、肝、脾、肺、肾、脑6个脏器，研磨稀释后接10日龄非免疫鸡胚，测定15512、15514、15516、15600毒株在鸡体内不同组织脏器中的病毒滴度，结果如下：15512攻毒组死亡的三只鸡心、肝、脾、肺、肾、脑6个脏器中都检测到AIV，其中脑和肺中病毒滴度较其他脏器高，log10EID50/mLμL值大于6，其余脏器36 log10EID50/200μL值在3.92～4.58之间；而15512同居组中剖杀的三只鸡的6个组织脏器中并没有检测到病毒。15514攻毒组死亡的三只鸡心、肝、脾、肺、肾、脑6个脏器中都检测到AIV，其中脑和肺中病毒滴度较其他脏器高，log10EID50/200μL值分别为5.56和6.08，其余脏器log10EID50/200μL值在4.42～4.5之间；15514同居组鸡中死亡的一只被检测的6个组织中都检测到病毒，其中脑和肺的病毒滴度的log10EID50/200μL值都是6.75，高于攻毒组三只鸡的脑和肺的病毒滴度，其余脏器病毒滴度的log10EID50/200μL值在3.23～4.5之间，其它两只剖杀的鸡种未能分离病毒。15516攻毒组死亡的三只鸡心、肝、脾、肺、肾、脑6个脏器中都检测到AIV，其中脑和肺病毒滴度较其他脏器高，log10EID50/200μL值分别为5.67和6，其余脏器log10EID50/200μL值在3.23～4.5之间；15516同居组剖杀的三只鸡中，其中一只被检测的6个脏器中都分离出病毒，病毒滴度均低于攻毒组，其脏器病毒滴度log10EID50/200μL值在2～3.75之间。其余两只鸡的所有脏器中均未能分离出病毒。15600攻毒组剖杀的三只鸡只有一只鸡心、肝、脾、肺、肾、脑6个脏器中都检测到AIV，其中脑和肺病毒滴度较其他脏器高，log10EID50/200μL值分别为5.5和6.25，其余脏器log10EID50/200μL值在3.23～4.5之间；其余两只鸡在心、肝、脾、肺、肾、脑6个脏器中都未检测到AIV。15600同居组剖杀的三只鸡中都未能分离出病毒。对照组没有检测到病毒滴度（见表3.8）。37 表3.8鸡脏器滴度死亡/剖杀分组肝心脾肾脑肺时间攻毒组3/3(3.92±0.29)3/3(4.58±0.14)3/3(4.33±0.29)3/3(4±0.5)3/3(6.17±0.29)3/3(6.75±0)2d-s15512同居组0/30/30/30/30/30/34d-p攻毒组3/3(4.5±0)3/3(4.5±0.25)3/3(4.42±0.14)3/3(4.42±0.14)3/3(5.56±0.1)3/3(6.08±0.52)2d-s15514同居组1/3(3.23)1/3(3.25)1/3(4.5)1/3(4.5)1/3(6.75)1/3(6.75)4d-s/4d-p攻毒组3/3(3.25±0.9)3/3(4.18±0.55)3/3(4.17±0.38)3/3(4.42±0.14)3/3(5.67±0.14)3/3(6±0.25)3d-s15516同居组1/3(2)1/3(3)1/3(3.23)1/3(2.5)1/3(2.75)1/3(3.75)4d-p攻毒组1/3(1.5)1/3(4.25)1/3(2.5)1/3(4.25)1/3(5.5)1/3(6.25)3d-p15600同居组0/30/30/30/30/30/34d-p空白对照组0/30/30/30/30/30/33d-p注：1、括号中的值表示为脏器病毒滴度，平均值±标准差；2、p表示剖杀，s表示死亡，例如：2d-s表示第2天死亡。38 3.5.3SPF鸡感染后咽/泄殖腔拭子检测结果5以10EID50/200µL的剂量通过点眼滴鼻的方式对4周龄SPF鸡感染H5亚型AIV后连续观察14天，观察每组鸡的健康状况，并在攻毒后第2、4、6、8、10天采集各组鸡的喉头、泄殖腔拭子，稀释后接9～11日龄鸡胚，以此用来检测各组鸡的排毒情况（见表3.9）。结果显示：除15512攻毒组外，其余各攻毒组和同居组从第2天咽拭子均分离出病毒，到第10天除15516攻毒组、15516同居组、15514同居组外都分离不出AIV；除15514攻毒组外，其余各攻毒组和同居组从第2天开始泄殖腔拭子都分离出AIV，到第10天除15516攻毒组、15516同居组，15514同居组外都分离到AIV；15512同居组从第2天到第10天咽拭子中都分离不出AIV；空白对照组所有咽拭子和泄殖腔拭子都分离不出AIV。3.5.4血清抗体转阳情况测定结果攻毒14天后对存活的鸡采血取血清，以HI实验对血清抗体转阳情况进行检测，发现所有存活的鸡HI抗体都为阴性（见表3.9）。表3.9鸡拭子病毒分离情况血清咽拭子泄殖腔拭子分组转阳2d4d6d8d10d2d4d6d8d10d14d15600攻毒组1/70/41/43/40/43/70/42/41/40/40/415600同居组2/71/73/42/40/42/71/73/42/40/40/415516攻毒组4/70/41/41/41/46/71/42/42/41/40/415516同居组2/70/71/41/41/47/73/72/44/42/40/415514攻毒组1/20/10/11/10/10/21/11/10/10/10/115514同居组2/71/60/43/42/42/73/61/42/41/40/415512攻毒组0/30/30/30/30/32/31/31/33/30/30/315512同居组2/71/70/41/40/41/70/41/42/40/40/4空白对照组0/90/60/60/60/60/90/60/60/60/60/639 4讨论人们从20世纪70年代左右开始主动对禽流感病毒进行监测，但在那时人们对禽流感病毒检测重点是在养殖场、屠宰场和野禽（Slemonsetal.,1974），并未对对活禽市场内的禽流感病毒进行监测。1997年中国香港的活禽交易市场中爆发了高致病性的H5N1禽流感病毒，同年在香港总共报道了18例人感染高致病性H5N1，其中6例死亡。研究发现活禽市场在禽流感的储存和传播中起到关键作用，人们开始重视活禽交易市场内禽流感的流行情况。广东是我国禽类消费大省，不同种类的禽类在市场相互接触，被不同亚型的AIV感染后，AIV在禽体内混合后发生重组和变异（Guetal.,2011；Zhaoetal.,2012）。4.1流行病学调查在本研究收集的临床病料中，AIV分离率为49.6%，H5亚型AIV分离率为30.3%占临床病料分离AIV总数的61.1%，说明在2014～2015本研究采样的省份中，H5是主要流行的AIV亚型。本研究对广东活禽交易市场采集的样品进行了AIV分离鉴定，AIV分离率为20.16%。H5亚型AIV分离率为3.1%，占活禽交易市场样品AIV分离株总数的15.4%。对于H5亚型AIV宿主来源进行统计，临床病料分离的毒株中，来源于鸡的共17株，占32.1%，来源于水禽的共36株，占67.9%。活禽交易市场分离的毒株中，来源于鸡的共35株，占35.4%；来源于水禽的共55株，占55.6%；来源于鸽的共4株，占4%；来源于环境的共5株，占5%。由以上数据可以看出，临床病例和活禽交易市场中分离的病毒统计结果相互印证，水禽是H5亚型AIV的最主要的宿主。本研究对从活禽市场和临床样品分离的共82株H5亚型AIV的NA亚型进行统计，发现临床病料分离的53株中，其中H5N6亚型AIV占69.8%；H5N1亚型AIV占15.1%；H5N2亚型AIV占9.4%；H5N8亚型占3.8%；活禽交易市场分离的29株H5亚型AIV中，H5N6亚占82.8%；H5N2亚型有4株，占13.8%；H5N1亚型有1株，占3.4%。由以上数据可见，无论是在临床病例中还是在活禽交易市场中，H5N6亚型AIV占的比例都最高，说明本研究采样地区主要流行H5N6亚型AIV。本研究对82株H5亚型AIV的HA基因作遗传进化树，发现84.1%的毒株位于2.3.4.4分支，15.9%的毒株位于2.3.2.1分支。其中临床病料分离的53株AIV中，22.6%的毒株位于2.3.2.1分支，77.4%的毒株位于2.3.4.4分支。活禽交易市场分离的29株40 AIV中，3.4%的毒株位于2.3.2.1分支，96.6%的毒株位于2.3.4.4分支。无论是在临床病例中还是在活禽交易市场中，2.3.4.4分支的H5亚型AIV占的比例都最高，说明2014～2015年本研究采样地区主要流行的H5亚型AIV为2.3.4.4分支毒株。有研究表明HA基因编码的氨基酸序列发生S137A、T192I能增强流感毒株对唾液酸α2-6半乳糖受体结合能力(Yangetal.2007)。本研究对82株H5亚型AIV的HA受体结合位点进行分析，发现所有毒株均未发生E190D、K193S、G225D三位点突变或者Q226L、G228S双位点突变，但有11株发生了S137A、T192I双位点突变，占13.4%，其中10株为临床病料中分离的毒株，1株为活禽交易市场中分离的毒株。结合对GISAID流感数据库中2010年～2014年H5亚型AIV的HA受体结合位点突变统计结果，未能发现S137A、T192I双位点突变随时间变化呈规律性的变化。本研究中所有分离的H5亚型AIV的HA蛋白在裂解位点均存在多个连续碱性氨基酸，说明现流行的H5亚型AIV为HPAIV。通过DNASTAR软件中的MegAlign对本研究采集的2.3.4.4分支的H5亚型AIV的HA基因与Re-8、D8两株疫苗株的HA基因进行相似性分析，H5亚型AIV的HA基因与Re-8疫苗株HA基因相似性在94.4%～98.5%之间；与D8疫苗株的HA基因相似性在96.9%～98.7%之间。将本研究采集的2.3.2.1分支的H5亚型AIV的HA基因与Re-6、D7两株疫苗株的HA基因进行相似性分析，2.3.2.1分支的H5亚型AIV的HA基因与Re-6疫苗株HA基因相似性在96.5%～98.1%之间；与D7疫苗株的HA基因相似性在92.2%～92.9%之间。说明现有流行H5亚型AIV与D7疫苗株的HA基因相似性较低，D7疫苗株能否起到保护作用值得研究。4.2代表毒株全基因分析HA结合受体分析中15512、15514和15516、15600在205～208位存在差异，15512和15514为ALYK，15516和15600为NLYK；15512、15514的HA受体结合位点发生S137A、T192I双位点突变，增强了与SAα2-6Gal受体结合能力。推测这几个位点的突变可能是导致本研究中实验毒株对鸡和小鼠致病力差异的因素，对研究禽流感病毒致病性分子机理提供一定数据支持。4株代表株的HA蛋白裂解位点皆有多个连续碱性氨基酸，序列都为RRRKR↓G，符合高致病性禽流感特征。对病毒HA蛋白糖基化位点分析发现，4株H5亚型AIV具有多个潜在糖基化位点，糖基化位点的数目和位置都会影响到HA蛋白的裂解以及AIV与宿主的结合能力，进而影响到病毒对宿主41 的致病力（Gartenetal.,1999）。NA蛋白的茎部位于头部和非极性跨膜区之间，一般茎部长度为40个氨基酸(36-75位)左右，NA茎部有时会出现长度不同的氨基酸缺失（Castruccietal.,1993）。蛋白颈部有助于病毒形成四聚体，NA蛋白颈部缺失会对唾液酸残基的切除造成影响（Baigentetal.,2001）。本研究中15514的NA蛋白存在颈部缺失20个氨基酸，15600的NA蛋白存在颈部缺失22个氨基酸，15512与15516没有出现颈部缺失。有研究表明NA蛋白头部糖基化位点的存在有助于增强病毒致病性（Castruccietal.,1993；Hulseetal.,2004）。本研究中4株H5亚型AIV的NA蛋白中均存在多个糖基化位点。PB2蛋白在聚合酶复合体中起着重要作用，能够引发病毒的复制。在Hatta(2001）的研究中发现PB2基因是影响流感宿主范围和致病力的决定因素之一，在进一步的研究中发现PB2基因编码的氨基酸序列第627位氨基酸突变（E627K）影响禽流感致病力的因素，能增强AIV对哺乳动物的致病力。在Li（2005）的研究中发现PB2基因编码的氨基酸序列第701位氨基酸发生（D701N）也是影响AIV致病力的关键因素，对4株实验毒株的核酸分析比较后发现，4株AIV在PB2基因编码的氨基酸序列的地627位都为E。另外，有研究表明701位为D时对禽类有强致病力，当突变为N时则对哺乳动物具有强致病力（Lietal.,2005）。本研究中4株H5亚型AIV的PB2基因编码的氨基酸序列第701位上都为的D。在Chen（2015）的研究中发现，在H10N8、H7N9、H9N2禽流感病毒中，PB2基因编码的氨基酸第588位为V的病毒比588位为A的病毒对哺乳动物有更高的致病性。在本研究中PB2基因编码的氨基酸第588位为V的15600株对小鼠的致病力弱于588位为A的15512、15514、15516株，推测PB2蛋白的第588位氨基酸A突变为V对小鼠致病性的增强的作用可能不适用于H5亚型禽流感，也有可能是别的位点突变造成对小鼠致病力的差异。PB1蛋白是组成聚合酶复合体中的一个蛋白，在病毒的转录、复制过程中发挥着重要作用。在Hulse-Post（2007）的研究中发现PB1中发生L13P和S678N氨基酸突变是导致对小鼠致病力增强的关键。本研究发现4株H5亚型AIV的PB1基因编码氨基酸第13位均为P，第678位均为S。PA蛋白是组成聚合酶复合体中其中一个重要组成蛋白。在Song（2009）的研究中表明PA基因编码的氨基酸序列发生T97I的突变能够明显的提高流感病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性，由此增强对哺乳动物的适应性，而K615N的突变可能会导42 致对小鼠致病力增强。本研究中的这4株H5亚型AIV分离株PA基因编码的氨基酸第97位均为T，615位氨基酸均K，均未发生突变。Song（2011）的研究表明PA基因编码的氨基酸发生S224P和N383D突变，能增强H5N1亚型AIV对鸭的致病力，本研究中4株H5亚型AIV的PA基因编码的氨基酸序列在224位均位S，在383位处均为D。在Wasilenko（2008）的研究中发现，NP基因编码的氨基酸发生A184K突变可能影响禽流感病毒的繁殖与致病力。在Gabriel（2005）的研究中发现NP基因编码的氨基酸发生N319K突变可能对小鼠致病力增强。本研究4株H5亚型AIV基因编码的氨基酸序列第184位均为K，第319位均为N。M蛋白为AIV的基质蛋白，M1蛋白具有型特异性，能够以此划分流感病毒的A、B、C3个分型，而M2蛋白属于跨膜蛋白，是金刚烷胺作用的靶细胞。在Brown（2001）和Fan（2009）等人对M1基因与对小鼠致病性的研究中表明：M1基因编码的氨基酸序列第30位为D，第121位为T和第167位为T，都是对小鼠低致病性的特征；第15位为I和第215位为A两个位点则是对小鼠高致病性的特征。本研究4株H5亚型AIV中M1基因编码的氨基酸序列第15位均为I，第30位均为D，第121位均为T，第167位均为T，第215位均为A。在Intharathep（2008）的研究中表明，M2基因编码的氨基酸序列第26位为L，第30位为A，第31位为S时会产生对离子通道阻断剂(金刚烷胺和金刚乙胺)抗性，本研究中4株分离毒株M2基因编码氨基酸第26位都为L，第30位都为A，第31位15600为S，其余三株为N。由此推论15600毒株有对金刚烷胺类药物的抗性。NS蛋白是一种非结构蛋白，在病毒复制过程中主要负责调控AIV的复制周期。在Jiao（2008）的研究中NS1基因编码的氨基酸，第42位氨基酸发生S42P的突变是AIV对小鼠产生高致病力的一个关键因素。本研究中4株AIV的NS1基因编码的氨基酸序列第42位均为S。在Long（2008）的研究中发现NS1基因编码的氨基酸序列发生D92E突变能够增强H5N1亚型AIV对小鼠和鸡的致病性，研究的4株H5亚型AIV中，15600和15514株NS1基因编码的氨基酸序列第92位为E，15512和15516株的NS1基因编码的氨基酸序列第92位为D。综上，本研究的4株代表毒株除了在NS1蛋白上第92位氨基酸有差意外，其他影响AIV对动物致病性有影响的位点并无差异，结合动物致病性实验结果，4株毒株43 对小鼠和鸡的致病性存在差异，说明存在别的位点影响毒株对动物的致病性。对本研究中4株H5亚型AIV进行遗传演化分析发现，15512株除了HA基因外，其他片段与ZJ-Like分支同源性相近；15514株所有基因片段与WZ-Like分支同源性相近；15516株除了PB2基因外，其他片段与EC-Like分支毒株同源性相近；15600株除了PB2和M基因外，其余片段与GD-Like分支毒株同源性相近，说明15512、15516、15600三株毒株存在基因片段的重组现象，15512存在HA基因重组，15516出现PB2基因的重组，15600存在PB2和M基因的重组。4.3H5亚型AIV对动物致病性6在对BALB/c小鼠的致病性试验中，以50μL10EID50的剂量对小鼠进行攻毒，15512和15514对小鼠都呈现高致病力，小鼠死亡率达100%，15516致病力低于15512和15514，小鼠死亡率为80%，15600对小鼠致病力最低，小鼠死亡率达20%，但也能导致小鼠体重下降，并造成一只小鼠死亡。从体重变化看，小鼠体重从1~3d开始出现体重下降或体重增速减缓，说明小鼠感染H5亚型AIV后1~3d开始发病。小鼠脏器中病毒滴度看，15512和15514实验组小鼠的脑、鼻甲骨和肺中AIV病毒滴度都高于15516和15600实验组，15600在小鼠的脑和鼻甲骨中不繁殖。说明4株实验毒株对小鼠致病力有差异，15512、15514对小鼠致病力强于15516，15516对小鼠致病力强于15600，但4株毒株都能在小鼠肺脏中繁殖，并且造成小鼠死亡，说明4株实验毒株都有感染小鼠的能力，且均能在小鼠肺脏中有效复制。有研究表明在BALB/c小鼠中,结肠和直肠中只存在SAα2-6Gal受体；气管、肾、胃中以SAα2-3Gal受体为主；食道、脾、鼻甲中以SAα2-6Gal受体为主；其余组织同时存在两种受体(刘兵2015)。推测由于15512株和15514株HA受体结合位点发生S137A、T192I双位点突变，增强了与SAα2-6Gal受体结合能力，因此对小鼠致病力强于15516株和15600株，且在鼻甲骨中病毒滴度高于15516株和15600株。人类呼吸道中主要的HA受体为SAα2-6Gal受体，本研究中的H5亚型AIV临床毒株发生了增强与SAα2-6Gal受体结合能力的基因突变，意味着AIV可能在养殖过程中传播给人类，导致人类感染AIV。在活禽交易市场中发现存在S137A、T192I双位点突变的毒株，在活禽交易市场中人与大量禽类密切接触情况下，增加了人感染AI的几率，而且本研究分离的H5亚型AIV的HA蛋白裂解位点均存在多个碱性氨基酸，很可能严重危害人的生命安全，值得引起人们的关注。44 5在对SPF鸡的致病性试验中，以200μL10EID50剂量对鸡攻毒，实验结果表明15512和15514对于SPF鸡致病力强于15516，造成攻毒组3d开始出现鸡死亡，最终每组各5只鸡死亡，死亡率均为4%；15516对于SPF鸡致病力弱于15512和15514株，强于15600株，造成攻毒组4d出现鸡死亡，最终共3只鸡死亡，死亡率达42.9%；15600毒株不造成鸡的死亡。虽然4株代表毒株在HA蛋白裂解位点都存在连续碱性氨基酸序列，符合高致病性禽流感特征，但是对鸡的致病力有差异。15600株在实验剂量下对鸡不致死，可能由于攻毒剂量较低导致，不能说明15600株为低致病性毒株。在水平传播能力上，除15514株能导致1只同居组的鸡死亡外，其余同居组的鸡皆不死亡。对咽喉拭子和泄殖腔拭子进行AIV分离实验，发现15516同居组第2天全部排毒，而其他三个同居组从第2天至第10天都只有部分鸡排毒，说明15516毒株水平传播能力强于其他组。本研究在攻毒组的鸡中各挑选三只剖杀，检测脏器中病毒滴度，发现除15600组的两只鸡外，其余的鸡在心、肝、脾、肺、肾、脑中均检测到AIV，肺中病毒滴度最高。结合本研究中动物致病性试验结果和代表毒株的全基因测序分析结果，除了HA结合受体位点S137A、T192I双位点突变与代表毒株致病性差异相关外，其他基因位点变化与代表株致病性差异未能发现相关。说明HA基因是决定H5亚型AIV对动物致病性的主要因素，未发现NA亚型与毒株致病性差异相关。5全文结论2014~2015年在以华南地区为主的部分省区H5亚型AI的流行特点是：H5N1、H5N2、H5N6、H5N8等多个血清亚型同时存在,流行毒株对鸡主要呈现高致病力特征；广东主要流行H5N6亚型毒株，以感染水禽为主，鸡也有感染，主要流行分支为2.3.4.4分支。本研究中代表毒株都能导致小鼠发病死亡，对鸡主要呈现高致病性；病毒主要在动物肺脏中定殖。HA蛋白发生S137A、T192I双位点突变能增强毒株对哺乳动物的致病性，在活禽交易市场分离的毒株中发现发生该突变的毒株，而且本研究分离的H5亚型AIV的HA蛋白氨基酸序列均具有HPAIV特征，在活禽交易市场中人与大量禽类密切接触情况下，增加AIV感染人的几率，可能严重危害人类的生命安全，值得引起人们的关注。45 致谢本论文是在导师廖明教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。廖老师严谨的科学态度，开阔的科研视野，渊博的学识、废寝忘食的工作热情和广阔的胸怀无一不使我钦佩，给我树立了一个榜样，使我受益匪浅，在此向导师廖明教授表示最衷心的感谢和最崇高的敬意！本论文也得到了贾伟新老师的指导，贾老师在论文的选题、实施、撰写都给予了全面细致的指导，同时也在生活上、精神上给予了无微不至的关心，并且对我的人生未来发展方向给予了重要的指导意见，在此对贾伟新老师表示最诚挚的感谢。特别感谢：人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室的徐成刚老师、张建民副教授在本论文设计、实验技术的指导和生活上的关心。感谢张桂红教授、任涛教授、亓文宝教授、罗开健副教授、曹伟胜副教授、樊惠英教授、焦培荣副研究员在专业知识上的教导！感谢冯赛祥博士、宋亚芬、肖陈诚、崔进、余远迪、代曼曼、梅堃、汪秀慧、邢凯祥、周琪、宋慧、曾昭勇、张灶月、李倩等师兄师姐在实验上和技术上的指导；感谢同门张旭、任行星、刘杨、吴斯宇、叶佳琪以及一同学习工作的丰舟、郑译、刘墅楷、胡平生、张宗尧等同学在实验上的帮助和对我生活上的关心！同样感谢在实验上给与帮助的师妹邢利、刘兆洁、符颖，师弟向程威、邢金超、李波，本科生水杨浩儿。感谢禽病教研室技术员瞿孝云、谢淑敏、郭彩银、张俊静、林丽芳、陈南猛等在实验过程中的支持和帮助！两年来，本人也得到了兽医学院辅导员陈晓梅副教授的关心和帮助，在此表示最诚挚的谢意！本论文由现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-42-G09）；国家国际科技合作专项（2013DFA31940）；农业部动物疫情监测与防治项目（农医发[2015]10号）；广东省科技计划项目（20140224、2013B020224004）；广东省农业厅专项[粤财农(2014)380号]；东莞市科技计划项目（2014108101041）；农业科研杰出人才及其创新团队-重大动物疫病防控，现代农业人才支撑计划项目(农财发（2012）160号)；2014年广东省特支计划杰出人才E15237资助，在此特别表示感谢！本论文全部在人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室、农业部兽用疫苗创制重点实验室、广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室、广东普通高校人兽共患预防与控制重点实验室完成，特此感谢！最后特别感谢我的父母和女友给予的鼓励、理解和支持！46 参考文献扈容良编.现代动物病毒学.第一版.北京:中国农业出版社,2014郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术.北京：中国三峡出版社,1997葛菲菲,刘健,杨德全,等.H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究[J].中国动物传染病学报,2015(05):10-14.刘兵.2015.SPF鸡与BALB/c小鼠体内流感病毒唾液酸受体组织分布的差异性分析.,52.:中国农业科学院吕让,毛雅元,杨国辉,等.禽流感新型疫苗研究进展[J].中国畜牧兽医,2015(06):1608-1612.马勇,徐晓龙,王秀荣,等.应对高致病性禽流感病毒H5N1抗原漂移的通用疫苗策略[J].动物医学进展,2015(05):111-115.司振书,王守山,胡冬民.禽流感病毒基因组及其编码蛋白的结构与功能[J].广东农业科学,2012(01):126-129.辛朝安编.禽病学.第二版.北京：中国农业出版社2003邢凯祥.2013~2014年广东地区H9N2亚型AIV分子流行病学调查及抗原性评估[硕士学位论文].华南农业大学，2015赵君和.2016年禽流感的流行特点及防控策略[J].中国畜牧兽医文摘,2016:2-3.BaigentSJ,MccauleyJW.Glycosylationofhaemagglutininandstalk-lengthofneuraminidasecombinetoregulatethegrowthofavianinfluenzavirusesintissueculture[J].VirusResearch,2001,79:177-185.BrownEG,LiuH,KitLC,etal..Patternofmutationinthegenomeofinfluenzaavirusonadaptationtoincreasedvirulenceinthemouselung:Identificationoffunctionalthemes[J].ProcNatlAcadSciUSA,2001,98:6883-6888.CastrucciMR,KawaokaY.Biologicimportanceofneuraminidasestalklengthininfluenzaavirus[J].JournalofVirology,1993,67:759-764.ChenH,HuangL,LiH,etal..Highpathogenicityofinfluenzaa(H10N8)virusinmice[J].AmericanJournalofTropicalMedicineandHygiene,2015,93:1360-1363.ChenH,SmithGJ,ZhangSY,etal..Avianflu:H5N1virusoutbreakinmigratorywaterfowl[J].Nature,2005,436:191-192.FanS,DengG,SongJ,etal..TwoaminoacidresiduesinthematrixproteinM1contributetothevirulencedifferenceofH5N1avianinfluenzavirusesinmice[J].Virology,2009,384:28-32.FreidlGS,BingerT,MullerMA,etal..SerologicalevidenceofinfluenzaavirusesinfrugivorousbatsfromAfrica[J].PLoSOne,2015,10:e127035.FreidlGS,MeijerA,deBruinE,etal..Influenzaattheanimal-humaninterface:AreviewoftheliteratureforvirologicalevidenceofhumaninfectionwithswineoravianinfluenzavirusesotherthanA(H5N1)[J].EuroSurveill,2014,19.GabrielG,DauberB,WolffT,etal..Theviralpolymerasemediatesadaptationofanavianinfluenza47 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附录B代表毒株PB2、PB1、PA、HA、NP、M1、M2基因编码的氨基酸序列比较：PB2基因编码的氨基酸序列15512ＭＥＩＫＥＬＲＤＬＭＳＱＳＲＴＲＥＩＬＴＫＴＴＶＤＨＭＡＩＩＫＫＹＴＳＧＲＱＥＫＮＰＡＬＲＭＫＷＭＭＡＭＫＹＰＩＴＡＤＫＲＩＭＥＭＩＰＥＲＮ[71]15514－Ｒ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－[71]15516－Ｒ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｉ－－－－－[71]15600－Ｒ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｋ－－－－－－－－－[71]15512ＥＱＧＱＴＬＷＳＫＴＮＤＡＧＳＤＲＶＭＶＳＰＬＡＶＴＷＷＮＲＮＧＰＴＴＳＴＶＨＹＰＫＶＹＫＴＹＦＥＫＶＥＲＬＫＨＧＴＦＧＰＶＨＦＲＮＱＶＫＩ[141]15514－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－[141]15516－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ａ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｉ－－[141]15600－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－[141]15512ＲＲＲＶＤＩＮＰＧＨＡＤＬＳＡＫＥＡＱＤＶＩＭＥＶＶＦＰＮＥＶＧＡＲＩＬＴＳＥＳＱＬＴＩＴＫＥＫＫＥＥＬＱＤＣＫＩＡＰＬＭＶＡＹＭＬＥＲＥＬ[211]15514－－－－－Ｔ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－[211]15516－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－[211]15600－－－－－Ｖ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｋ－－－－－－－Ｍ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－[211]15512ＶＲＫＴＲＦＬＰＶＡＧＧＴＳＳＶＹＩＥＶＬＨＬＴＱＧＴＣＷＥＱＭＹＴＰＧＧＥＶＲＮＤＤＶＤＱＳＬＩＩＡＡＲＮＩＶＲＲＡＴＶＳＡＤＰＬＡＳＬＬ[281]15514－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｋ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－[281]15516－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－[281]15600－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｉ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－[281]51 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M2基因编码的氨基酸序列：15512ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＴＥＷＥＣＲＣＳＤＳＳＤＰＬＶＶＡＡＮＩＩＧＩＬＨＬＩＬＷＩＬＤＲＬＦＦＫＣＩＹＲＣＬＫＨＧＬＫＩＧＰＰＴＥＧＶＰＥ[70]15514－－－－－－－－－Ｌ－Ｋ－Ｇ－－－Ｎ－－Ｇ－－－－－Ｇ－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ＲＦＲＹ－－－Ｇ－－Ｓ－－－Ｉ－－[70]15516－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｒ－－Ｙ－－－－－－Ｓ－－－－－－[70]15600－－－－－－－－－－－－Ｎ－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｓ－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｙ－－－Ｒ－－Ｙ－－－Ｒ－－Ｓ－－－－－－[70]15512ＳＭＲＥＥＹＲＱＥＱＱＮＡＶＤＶＤＤＳＨＦＶＮＩＥＬＥ[97]15514－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｇ－－－－－－－－[97]15516－－－－－－－－－－－Ｓ－－－－－－Ｇ－－－－－－－－[97]15600－－－－－－－－－－－－－－－－－－Ｄ－－－－－－－－[97]注：“－”表示与第一个序列统一位置上的氨基酸相同。62
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