NDM-1泛耐药菌流行病学及分子特征研究

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分类号密级公开ＵＤＣ保密期限硕士学位论文－题目ＮＤＭ１泛耐药菌流行病学及分子特征研究作者姓名王盛书指导教师王勇副研究员培养单位军事医学科学院疾病预防控制所专业名称流行病与卫生统计学论文提交日期２０１７年５月３１日人民解放军军事医学科学院学位授予单位中国答辩委员会主席柴光军主任医师中国人民解放军军事医学科学院制 军事医学科学院研究生学位论文独创性声明秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风,本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果,除了文中特别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得军事医学科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签字:王戚书签字日期∷冫°夕月日刂年⒋军事医学科学院保护知识产权声明本学位论文作者完全了解军事医学科学院对研究生在学其间撰写的论文知识产权保护的相关规定。本人撰写的论文是在导师具体指导下,并得到相关研究经费支持下完成,其数据和研究成果归属于导师和作者本人,知识产权单位属军事医学科学院。本人保证毕业后,以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为军事医学科学院。军事医学科学院有权保留学位论文及其电子版,通过网站公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文、汇编以供查阅和借阅。(涉密和延期公开学位论文在解密后适用本声明)湫rtg签字:王弑书签字日期:刀氵年⊥月旦日擀绷签字:J矣廴签字日期:力⊥月土日`7年 目录缩略词表........................................................................................................................I中文摘要.......................................................................................................................IIAbstract.........................................................................................................................V前言................................................................................................................................1第一部分：我国携带NDM-1基因耐药菌流行现况分析.........................................31实验材料.............................................................................................................42分析方法.............................................................................................................43结果.....................................................................................................................44讨论...................................................................................................................185小结...................................................................................................................20第二部分：中国部分地区携带blaNDM-1耐药菌的流行情况及特性研究..............211实验材料...........................................................................................................222实验方法...........................................................................................................233结果...................................................................................................................284讨论...................................................................................................................345小结...................................................................................................................34第三部分：中国部分地区携带blaNDM-1耐药菌的分子遗传学研究......................361实验材料...........................................................................................................372实验方法...........................................................................................................373结果...................................................................................................................424讨论...................................................................................................................465小结....................................................................................................................47总结..............................................................................................................................48参考文献......................................................................................................................50附表1...........................................................................................................................57发表文章......................................................................................................................58个人简历......................................................................................................................64致谢..............................................................................................................................65 缩略词表英文缩写英文全称中文名称MBLMetallo-β-lactamases金属β-内酰胺酶NDM-1NewDelhimetallo-β-lactamase1新德里金属β-内酰胺酶1blaNDM-1NewDelhimetallo-β-lactamase1NDM-1基因CRECarbapenem-resistantEnterobacteriaceae碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌LBLuria-BertanibrothLB培养基/肉汤培养基PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应BHIBrianHeartInfusionBroth脑心浸液肉汤BHIABrianHeartInfusionAgar脑心浸液琼脂IMPImipenem亚胺培南MEMMeropenem美罗培南AMPAmpicillin氨苄西林CTZCeftazidime头孢他啶CTXCefotaxime头孢噻肟AMIAmikacin阿米卡星TETTetracycline四环素TIGTigecycline替加环素COLColistin黏菌素MICMinimalinhibitoryconcentration最小抑菌浓度IPM/IPMIImipenem/Imipenem+EDTA亚胺培南/亚胺培南+EDTATnTransposon转座子ISInsertionsequence插入序列IncIncompatibility不相容性群MLSTMultilocussequencetyping多位点序列分析rpmrevolutionsperminute每分转数EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸NCBItheNationalCenterforBiotechnology美国生物信息中心InformationODOpticalDensity光密度STSequencetype序列型PBSPhosphate-bufferedSaline磷酸盐缓冲液I NDM-1泛耐药菌流行病学及分子特征研究中文摘要人类与各种感染性疾病的斗争中，抗生素起到关键作用，但由抗菌素应用产生的抗生素耐药问题逐渐显现，尤其是近几十年来，由于抗生素使用不当等问题加速了细菌耐药问题的恶化，给临床治疗带来沉重负担。尤其2009年新德里金属β-内酰胺酶（NewDelhimetallo-β-lactamase-1,NDM-1）的出现和流行更新了人们对“超级细菌”的认识，引起了世界范围内广泛关注和恐慌，最初报道的产NDM-1的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌对除了多粘菌素和替加环素以外的所有抗生素耐药，截止2016年，NDM-1耐药菌已经在全球范围内形成总体散发，局部地区高流行的流行趋势，越来越多的研究表明以NDM-1耐药基因为代表的细菌耐药问题已经成为健康和食品安全领域的最大威胁之一，能对人类健康产生巨大隐患。目前，我国大量报道了关于产NDM-1阳性菌的流行、blaNDM-1耐药谱及传播机制和遗传学特征等研究。报道的NDM-1阳性菌大部分为临床个案报道，病例之间无流行病学研究和联系，对于NDM-1阳性菌在全国的流行病学特征尚不明确，携带NDM-1菌株的特性及其播散的机制仍不清楚，给NDM-1的整体治疗、防控带来巨大挑战。因此，需系统研究NDM-1阳性菌株在各地的分布情况、病人类型、医疗环境、危险因素以及流行病学溯源和NDM-1分子特征和变异情况。基于以上现况，本研究在CNKI和PubMed文献数据库检索了从2007年1月至2015年12月所有报道中国产NDM-1细菌研究的中英文文献，共检索中英文文献767篇，排除阴性结果文献、综述、NDM-1分子生物学基础研究、非人感染、中英文重复文献，共纳入研究文献50篇。对文献报道的NDM-1阳性菌株的流行病学特征，菌株来源、耐药谱及传播机制等方面信息进行汇总和分析，结果发现：截至2015年12月，我国共有25个省市、地区报道blaNDM-1阳性菌株，其中东南部沿海地区分布较多，广东地区报道的阳性病例为109例，占39.49%，明显多于其他地区(P<0.05)，NDM-1阳性菌主要分布在肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌(P<0.05)；感染NDM-1阳性菌的男性患者明显多于女性患者(P<0.01)，主要集中在2个年龄段：10岁以下和60~80岁之间(P<0.05)；NDM-1阳性菌主要分离于痰液标本，为40株，占41.24%(P<0.05)，NDM-1阳性菌感染的病例主要分布在ICU、儿科和呼吸科(P<0.05)，肺部疾病患者更容易分离出阳性菌(P<0.05)，blaNDM-1阳性菌对阿米卡星、替加环素的总体耐药率最低，分别为7.69%和2.33%。文献分析显示我国共有13个菌属276株细菌携带NDM-1基因，blaNDM-1编码在大小为55kb～360kb范围的质粒上，表明编码blaNDM-1的质粒不仅可以实现高效水II 平传播，还具有较强的跨种传播能力；结果分析显示NDM-1阳性菌对34种抗生素的耐药性，只有对阿米卡星和多粘菌素E的耐药率低于10%，甚至还对9种抗生素出现100%耐药情况，证实了NDM-1阳性菌具有强耐药性。说明产NDM-1阳性菌感染已经在全国范围流行和传播，需要进一步开展主动监测，深入研究其发生发展规律。为进一步系统比较产NDM-1阳性菌的流行病学及生物学特性，本次研究选取全国5个地区8个临床哨点医院收集多重耐药菌株样本，使用梅里埃VITEK2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行菌种鉴定和药敏测定，对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌标本使用普通PCR和实时定量PCR方法进行NDM-1阳性菌筛查，对筛选出的阳性菌株使用E-test法进行金属酶表型鉴定。在筛查的2367份样本中，一共鉴定出5份NDM-1阳性样本，阳性率为0.21%，通过菌种鉴定显示1株为肺炎克雷伯菌，其他4株均为不动杆菌属细菌，药敏结果显示：肺炎克雷伯菌只对多粘菌素和替加环素敏感，4株不动杆菌属细菌对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、多粘菌素和替加环素呈现敏感或中度耐药。E-test法检测5株NDM-1阳性菌金属酶表型验证试验均为阳性。通过上以上研究发现，虽然NDM-1耐药菌已经在我国部分医院中传播，但本次监测的哨点医院患者NDM-1耐药基因阳性率比文献报道的检出率较低。筛选的5株NDM-1阳性菌株有4株（80%）为不动杆菌属细菌和1株肺炎克雷伯菌与国内NDM-1阳性菌流行现况分析结果一致，显示我国NDM-1耐药基因主要在肠杆菌科细菌中不动杆菌属细菌中流行和传播。携带blaNDM-1不动杆菌属细菌不仅仅对多粘菌素和替加环素敏感。为了进一步研究NDM-1耐药基因所在质粒位置及周围序列结构特征，以期揭示耐药基因的分子特征。首先应用Southernblot法对blaNDM-1进行基因定位；通过PCRmapping进一步鉴定NDM-1所在质粒的结构；使用试剂盒提取质粒DNA并进行高通量测序。通过Southernblot法对5株NDM-1阳性菌进行基因定位发现：4株NDM-1阳性菌blaNDM-1均编码于质粒上，1株NDM-1阳性菌blaNDM-1丢失。其中3株NDM-1阳性菌blaNDM-1分别编码在大小约30-6kb的质粒，分别为Pm131-NDM-1、PNDM-BJ02、PAbNDM-1，1株NDM-1阳性菌blaNDM-1编码在大小约240-280kb质粒上。按照4个质粒扩增19对引物鉴定质粒结构，通过PCRmapping鉴定2个NDM-1阳性菌携带NDM-1耐药基因的质粒为pNDM-BJ01。4株细菌编码NDM的质粒测序结果显示：所有NDM-1阳性菌质粒均含有经典的Tn125转座子结构，但Tn125下游结构均发生丢失，NJ-18号和305-118号细菌质粒在Tn125上游有插入序列IS26和IS5，该插入序列可能介导NDM-1III 耐药基因进行跨种传播，而305-118号细菌NDM耐药基因亚型为NDM-5。综上所述，本研究结果显示：（1）我国blaNDM-1呈现整体散发局部流行的流行现状，具备独特流行病学特点，不动杆菌属细菌是blaNDM-1的主要优势菌，需要进一步开展主动监测，深入研究其发生发展规律；（2）产NDM-1阳性菌株在我国部分医院呈散发状态，病例之间无流行病学关联，阳性检出率低于文献报道平均水平；（3）blaNDM-1基因可能会在基础体质和免疫力较差人群或人群所在地点暴发流行，菌株主要集中在不动杆菌属细菌，还应重点关注肺炎克雷伯菌。（4）blaNDM-1位于质粒上，其全长30kb左右，1株NDM-1耐药菌质粒全长约240-280kb，质粒结构显示均含有Tn125转座子结构，且其下游结构部分缺失，部分Tn125结构上游含有插入序列IS26和IS5，Tn125转座子和插入序列共同介导耐药基因的水平转移。关键词：NDM-1；流行病学特征；NDM-1阳性菌分子特性；blaNDM-1质粒；IV NDM-1泛耐药菌流行病学及分子特征研究EpidemiologyandMolecularcharacterizationofNDM-1ProducingPanResistanceBacteriainChinaAbstractAntibioticsplayakeyroleonthestruggleagainstinfectiousdiseasesinhumanhistorycomebylotsofproblemsresultfromantibioticsapplicationatthesametime.Especiallyinrecentdecades,rapiddevelopmentofbacterialresistanceattributetoantibioticsabusehasbroughtseverechallengestoclinicalanti-infectiontreatment.TheemergenceandepidemicofNewDelhimetalbetalactamase(NewDelhimetallo--lactamase-1,NDM-1)updatedhumanontheunderstandingof"superbacteria",conductedglobalattentionandpanicin2009.FirstreportedNDM-1-producingKlebsiellapneumoniaeandEscherichiacoliwereresistanttoalmostallantibioticsbesidesColistinandtigecycline.Until2016,NDM-1-producingbacteriahavebeenformedinthedistributionofoverallsporadicandlocalepidemicintheworldwidewhatincreasinglystudiesshowthatbacterialresistanceproblemrepresentedbyNDM-1resistancegenehasbecomeoneofthebiggestthreatstoglobalhealth,foodsecurity,canproducegreathiddendangerstohumanhealth.MostresearchesfocusedonclinicalcasesbutalmostnoepidemiologicalandrelatedstudyonNDM-1positivebacteria,suchastheepidemicandresistancespectrumofNDM-1-positivebacteria,thetransmissionmechanismandthegeneticcharacteristicsofblaNDM-1.TheepidemiologicalcharacteristicsofNDM-1-positivebacteria,themechanismoftransmissionanditsspreadisstillnotclearinChina,whichisagreatthreattopreventionandcontrolofblaNDM-1.Therefore,itisnecessarytostudythedistribution,thetypeofpatients,themedicalenvironment,theriskfactors,themolecularstructureandvariationofNDM-1-producingstrains.Basedontheabovesituation,wehavecollectedliteraturesaboutNDM-1-producingbacteriaamongCNKIandPubMedfromJanuary2007toDecember2015.Atotalof767articleswereretrievedinChineseandEnglishliteraturewhichusedkeywordincludingNDM-1andChinafromCNKIandPubMed,andonly50articlesaboutNDM-1-positivebacteriawereselectedinthestudyV excludingthenegativeresults,reviews,basicresearchesonNDM-1molecularbiology,non-humaninfectionandduplicateliteratures.Epidemiologicalcharacteristics,strainsource,resistancespectrum,genestructureandvariationofNDM-1-positivestrainswereanalyzed.TheresultsshowedthatthestrainsproducingblaNDM-1whichreportedinthesearticleswereisolatedfrom25provincesandregionsofChinafromDecember2015.ThesoutheasterncoastalareasweremostlydistributedregionsrepresentedbyGuangdongprovincewhichreported109positivecasesandaccountedfor39.49%andweresignificantlymorethantheotherareas(P<0.05);thatNDM-1-positivebacteriamainlyconsistedinKlebsiellapneumoniaeandEnterobactercloacae(P<0.05);thatthenumberofthemalepatientsinfectedwithNDM-1-positivebacteriawassignificantlymorethanthefemalepatients(P<0.01);thatthenumberofthepatientsunder10yearsoldandamongthe60-80yearsoldwasexplicitlymost(P<0.05);thatthepositivebacteriacarryingblaNDM-1weremainlyisolatedfromsputumsamplesaccountingfor41.24%(P<0.05)anddepartmentssuchasICU,Pediatricandrespiratorymedicinerespectively(P<0.05);thatNDM-1-positivebacteriawereisolatedmorefrequentfromthepatientswithlungdiseasesthanotherdiseases(P<0.05)andthattheOverallresistancerateofNDM-1-positivebacteriatowardAmikacinandTigecyclinewasthelowestamong34kindsofantibioticsaccountingfor7.69%and2.33%respectively.Thereare13bacterialgeneracontaining276strainscarryingtheNDM-1geneencodedinplasmidwiththesizeof55-360kb,whichshowsthatplasmidencodingblaNDM-1canachieveefficientcommunicationnotonlyinhorizontalpropagationbutalsoininterspeciestransmission.TheresultsofdrugresistancerateofNDM-1positivebacteriato34kindsofantibioticsshowedtheresistancerateofAmikacinandpolymyxinEwerelessthan10%andeven100%resistantto9kindsofantibiotics,whichconfirmedthatNDM-1-positivebacteriahavestrongresistance.AlltheseresultsshowedthattheinfectionofNDM-1-positivebacteriahasbeenspreadandtransmissionacrossChina,soactivesurveillanceandmorestudiesshouldbedevelopedinordertofindhowithappensandepidemicinthefuture．InordertofurthercomparetheepidemiologicalandbiologicalcharacteristicsofNDM-1-producingbacteria,8clinicalsentinelsurveillancehospitalslocatedin5areaswereselectedforcollectingmultidrugresistantbacteriathatwouldbeidentifiedandtestedantibioticssensitivitybyVITEK2COMPACT.Then,selectedbacteriaresistanttoCarbapenemswerescreenedforNDM-1-positivebacteriabyPCRandVI real-timequantitativePCR.PhenotypiccharacterizationofthemetalenzymewasconfirmedbyusingE-testmethod.5NDM-1positivesampleswereidentifiedamong2367samplesaccountingfortheaveragepositiverateof0.21%,whichcontain1Klebsiellapneumoniaand4Acinetobacterbacteriastrains.Thedrugresistenceresultsof5NDM-1-positivebacteriashowedthattheNDM-1-positiveKlebsiellapneumoniaewassensitivetotigecyclineandpolymyxin;thatthe4NDM-1-positiveAcinetobacterbacteriawerecompleteorintermediatesensitivetogentamicin,tobramycin,Amikacin,levofloxacin,polymyxinandtigecycline.TheresultsofE-testshowedthat5NDM-1positivestrainswerepositivefortheverificationofthephenotype.ResultsofthisstudyshowedthatNDM-1resistantbacteriahavebeenspreadamongsomehospitalsinChinaandthepositiverateofNDM-1resistancegeneinhospitalisfarlowerthanthoseresultswhichreportedinotherarticles.5NDM-1positivestrainsincluding4Acinetobacterbacteria(80%)strainsand1Klebsiellapneumoniaestrain,whichfitsthefirstpartofthedomesticNDM-1positivebacteriaepidemicstatusverywell.ItshowedthatNDM-1resistancegenesweremainlyspreadamongEnterobacteriaceaewhichrepresentedbyAcinetobacterinChina.ItisAcinetobactercarryingtheblaNDM-1notonlysensitivetocolistinandtigecyclinethatfitstheresultsofthefirstpartresultverywell.InordertorevealthemechanismofNDM-1resistancegenebydeeplystudyingthelocationandsequencestructureofresistancegene,theblaNDM-1waslocatedbySouthernblotandthestructureofplasmidcarryingNDM-1wasfurtheridentifiedbyPCRmapping.ThentheplasmidcarryingNDM-1wasextractedbythekitandthehigh-throughputsequencingwasperformed.Southernblotwasusedtolocatethe5NDM-1positivebacteria,whichshowedthattheblaNDM-1of4NDM-1positivestrainswereencodedontheplasmid-3blaNDM-1inbacterianamedPm131-NDM-1,PNDM-BJ02andPAbNDM-1withthesizeofabout30-6kband1blaNDM-1positivebacteriacarriedtheplasmidwiththesizeofabout240-280kb.BecauseofthefewdifferenceinstructureamongPm131-NDM-1、PNDM-BJ02、PAbNDM-1andPNDM-BJ01,19primersweredesignedforidentifythestructureof4plasmidsbyPCRmapping.ThePCRmappingresultsshowedthattheplasmidscarryingNDM-1resistancegenein2NDM-1positivestrainswereidentifiedaspNDM-BJ01.SequencingresultsofplasmidencodingblaNDMof4bacteriashowedthatallVII plasmidcontainingclassicalTn125transposonstructure,butdownstreamstructuresofTn125werelost.TheplasmidsofNJ-18and305-118haveainsertionsequenceIS26andIS5repectivelyintheupstreamofTn125,whichmaymediatedthecross-speciestransmissionofNDM-1.TheNDMbacterialresistancegeneof305-118issubtypeNDM-5.Insummary,wesuggestedthat1.TheepidemiologicalsituationofblaNDM-1inChinacharacterizedbyuniqueepidemiologicalfeaturesshowedtheoverallsporadicandlocallyepidemic.AcinetobacterspeciesisthemainreservoirofblaNDM-1,whichneedforfurtheractivesurveillanceandintensivestudyofitsoccurrenceanddevelopmentregularity.2.NDM-1-positivestrainshavebeensporadicinsomehospitalsinChinaandtherewasnoepidemiologicalcorrelationamongthecases.ThepositiverateofNDM-1werelowerthanthatreportedintheliterature;3.ItmaycauseoutbreaksbyblaNDM-1amongthepopulationwiththepoorbasicconstitutionandthelowerimmunity.AcinetobacterspeciesbesidesKlebsiellapneumoniaeshouldbemainlyfocusedon.4.blaNDM-1waslocatedontheplasmidwiththelengthofabout30kb.oneplasmidcarryingNDM-1isabout240-280kb.PlasmidcontainingTn125structurewiththedownstreamstructurelossandsomeupstreamstructureofTn125containinsertionsequenceIS26andIS5.Tn125transposonandinsertionsequencemediatedresistancehorizontalgenetransfer.Keywords:NDM-1,epidemiologicalandmolecularcharacteristic,NDM-1-positivebacteria,plasmidVIII 前言1立题背景及国内外研究现状2014年4月30日，WHO首次发布关注全球抗菌素耐药问题报告，其中抗生素的耐药问题尤为突出，抗生素耐药问题已经成为世界各地普遍发生的公共卫生重要威胁。多重耐药菌引起的医院获得性感染导致中国每年约8万人死亡，泰国每年约3万人死亡，而欧洲和美国分别是2.3万和2.5万人。为了更好预防和控制碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌的传播，WHO已经向指南开发小组（GuidelinesDevelopmentGroup,GDG）提交防治指南，旨在规范卫生保健机构最佳实践和流程方案，该指南最早将于2017年2月审议通过，以进一步防控CRE传播。美国CDC发病率与死亡率周报（MorbidityandMortalityWeeklyReport，MMWR）关于美国耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）感染监测报告显示：由于高发病率和死亡率，碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌（CRE）是美国紧迫的公共卫生威胁，可迅速导致大面积的流行和暴发。从上世纪40年代开始，抗菌药物的应用使感染性疾病死亡率大幅下降，也使感染性疾病并发症发病率显著下降。然而，由于对抗菌药物的广泛使用、错误使用和过量使用，人类和动物抗菌素耐药问题也更加凸显。随着世界贸易水平和旅游业等全球一体化的快速发展，出现各类耐药细菌问题，碳青霉烯酶是细菌耐药领域的重要分支和原因，而首次发现的“超级细菌”NDM-1耐药基因再次引起人们对抗菌素耐药问题的关注和研究。2008年初，英国加的夫大学的医学微生[1]物学教授TimothyR.Walsh等在瑞典一名患尿道感染的印度裔患者身上分离到一种全新的可表达金属β-内酰胺酶(Metallo-β-lactamase，MBL)的肺炎克雷伯杆菌和大肠杆菌，由于该名患者是在印度首都新德里接受治疗时被该MBL感染，因此，研究者将其命名为新德里金属β-内酰胺酶(NewDelhimetallo-β-lactamase)，即NDM-1，同时以blaNDM-1命名编码NDM-1的基因。随后全球范围的研究者对NDM-1进行了广泛的研究和报道证实该耐药基因编码于质粒上并可以在菌株之间广泛传播，目前已呈现出全球流行的特征。2拟解决的科学问题目前，国内blaNDM-1的流行病学特征研究仍不明确，该耐药基因在我国的分布特征也未全面总结；我国报道的NDM-1阳性菌是否与国外报道菌株有关联，进化和变异如何等问题仍然不清楚，该耐药基因对公共卫生领域的负担及对人民群众的健康威胁等疑问还未报道。本研究欲解答下面3个问题：2.1以产blaNDM-1为代表的碳青霉烯类耐药基因在我国的流行病学特点。从1 NDM-1阳性菌三间分布到临床流行病学资料分析，系统的总结出我国NDM-1阳性菌的流行分布现况，为细菌耐药防控提供数据支持。2.2通过收集临床标本筛选和鉴定出NDM-1阳性菌，初步揭示产NDM-1的菌株的分子特性。2.3分析blaNDM-1分子遗传背景，揭示NDM-1耐药基因分子遗传学特性。3在推进科学研究和军事医学发展等方面的理论意义与实用价值（1）首次系统开展2009年至2015年产NDM-1阳性菌的流行病学研究，通过汇总和分析NDM-1阳性菌在我国医疗机构流行现况，结合NDM-1耐药菌在医院感染中发生的危险因素、变异规律，不仅宏观了解NDM-1阳性菌在我国的分布及流行病学特征，而且为NDM-1耐药菌的医院感染监测和控制方案提供科学依据。（2）首次将宏观层面的NDM-1临床流行病学特征研究与微观层面的分子生物学的角度综合、客观准确地分析NDM-1阳性菌的表型和分子特征以及传播扩散特点，为控制NDM-1阳性菌传播与流行以及防控策略的研究奠定基础。4研究思路通过文献回顾方法筛选2009年至2015年我国NDM-1阳性菌暴发或个案报道的文献，分析和揭示我国2009年至2015年携带blaNDM-1基因的菌株的流行病学特征；选取国内部分地区有代表性城市及医院，广泛收集细菌标本，筛检样本中blaNDM-1基因的阳性标本，揭示NDM-1阳性菌的菌种分布，丰富携带blaNDM-1耐药菌在我国的流行现况及规律；研究NDM-1阳性菌的细菌分子生物学特性；选取有代表性的菌株，结合分子生物学特性、临床流行病学资料和有关NDM-1研究的最新进展，揭示blaNDM-1基因的流行病学及分子特征。2 第一部分：我国携带NDM-1基因耐药菌流行现况分析引言2010年8月和2015年11月，《柳叶刀传染病》(TheLancetInfectiousDiseases)[1][2]分别发表了有关NDM-1和MCR-1耐药基因的研究论文，文章报道了携带blaNDM-1基因的细菌对除替加环素和多粘菌素以外，临床所有的抗菌药物均表现出高度耐药，而且在印度、巴基斯坦和英国出现了180余例阳性标本，短期内全球各国研究者相继报道该耐药基因在本国的流行情况，全球五大洲均有报道，NDM-1呈全球分布多点暴发的流行趋势，与NDM-1同属一个耐药家族的KPC、IMP等基因也成为研究重点；多粘菌素被誉为对抗细菌“最后一道防线”，文章报道的多粘菌素耐药基因MCR-1或已经通过食物链传播到中国健康人的肠道细菌中，全球研究者陆续报道了该耐药基因的流行情况。耐药基因带来的细菌耐药问题已经成为全球范围公共卫生问题，而新的耐药基因也在外部环境选择压力下不断进化。2007年冬天，一位印度裔瑞典籍男子到印度旅游时因臀部脓肿在印度旁遮普住院治疗，然后转院至新德里住院治疗，2008年1月该男子被遣送回瑞典厄勒布鲁一家医院治疗，入院第二天，从该男子尿液标本中分离出一株肺炎克雷伯菌，该细菌对多种抗生素，甚至是碳青霉烯类抗生素耐药，在其他任何环境均未分离出有如此耐药特性的菌株，同年3月在该病人粪便标本中分离出了对碳青霉烯类抗生素耐药的大肠杆菌。表型检测结果显示该病人体内分离的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌有MBL，但是PCR分析未能筛选出已知的特定MBL。克隆和测序研究提示该耐药基因是一种新的MBL，与VIM耐药基因的序列相同部分为32%，这种新型MBL按照它的起源地被命名为新德里金属-β-内酰胺酶-1（NewDelhi-Metallo-1，NDM-1）。新发现的耐药基因从同一患病不同菌属细菌分离出来，提示它可能是可转移的，经分子生物学实验研究证实，blaNDM-1基因分别位于在肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中180kb和140kb质粒上。由于其前所未有的强耐药性和易传播性，blaNDM-1迅速成为全球细菌耐药相关领域关注和研究的焦点[3]之一。目前，文献报道的NDM-1阳性菌主要分布于肠杆菌科细菌，多数为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，携带blaNDM-1的阳性菌大多数还同时携带多种其他类型耐[4,5][4]药基因。NDM-1耐药基因多编码于细菌质粒上，由于细菌往往含有多个质粒，而质粒中存在多种耐药基因，，都造成blaNDM-1阳性菌全球范围内广泛传播。除了非洲中部、南美洲西部个别国家没有报道，其他国家和地区呈NDM-1耐药3 [6]基因散发状况、暴发等全球流行蔓延的趋势。2010年中国首次报道3株携带blaNDM-1阳性菌，其中，宁夏省两个新生儿患者粪便标本分离出2株屎肠球菌；福建的一个晚期癌症病人分离出1株鲍曼不动杆菌，随后中国报道NDM-1阳性菌的个案及暴发案例越来越多，与文献报道的全球86.3%（132/153）NDM-1阳性病例感染通过到印度半岛或巴尔干地区旅游或接受医疗治疗而感染不同，根据病例资料显示，绝大部分中国患者无印度和巴基斯坦等地区的医疗旅行史。虽然中国产NDM-1阳性菌株报道越来越多，但该耐药基因在中国临床特点和流行病学情况仍不清楚。基于以上研究背景，本研究主要阐述以下两方面：产blaNDM-1菌株在我国临床机构流行现况如何？有何特点？本部分通过对报道我国临床NDM-1阳性菌株的文献进行汇总和分析，对我国NDM-1耐药基因的流行病学特征进行分析。1实验材料1.1文献来源以NDM-1为关键词检索2007至2015年的文献，其中在PubMed中检索出595篇，中国知网检出172篇文章，共检索767篇中英文献。1.2纳入标准报道中国境内（含港澳台地区）临床医院携带blaNDM-1耐药菌个案及暴发疫情文献，共纳入研究文献50篇（中文25篇，英文25篇）。。1.3排除标准排除综述性文献、中英文重复文献、非人感染文献、阴性结果文献，NDM-1病原学和机制等基础研究文献，其他非报道blaNDM-1耐药菌个案及暴发疫情文献。2分析方法汇总文献中NDM-1耐药基因的起源与进化，临床流行病学特点，阳性菌株来源、耐药谱及传播机制等方面信息，描述NDM-1耐药基因在我国临床传播的三间分布及临床流行病学特点，揭示该耐药基因临床感染特点、耐药谱及传播规律。使用SPSS18.0统计软件对汇总信息统计分析。3结果3.1NDM-1耐药基因病原学特征NDM-1是一种单体金属酶，分子量约为27.5kDa，全长共有269个氨基酸，与其他已知的MBLs结构相似性很低，与VIM氨基酸序列最为相似，其相似性也不过32.4%。blaNDM-1常编码于质粒上，报道最多的阳性质粒为IncA/C，IncFII、4 PNDMBJ01、PNDMBJ02和IncL/M等。与其他碳青霉烯酶相比，该耐药基因具有更强的耐药性，对头孢菌素抗生素几乎为100%耐药。目前已报道的NDM型别有14种，分别被命名为NDM-1至NDM-14；其中，blaNDM-2从鲍曼不动杆菌[9][10-13][4]中分离，blaNDM-3至blaNDM-7均首次分离于大肠杆菌，blaNDM-14和[14]blaNDM-15为我国首次发现并命名，3.2碳青霉烯酶的流行现况碳青霉烯酶已经在肠杆菌科细菌中全球性传播，被报道的三种主要的碳青霉烯酶属于三种β-内酰胺酶，分别为：KPC、NDM和OXA-48。KPC的主要来源[15]于肺炎克雷伯菌，分布于美国、以色列、希腊和意大利；NDM主要来源于肺炎克雷伯菌和大肠杆菌，分布于印度半岛；OXA-48主要来源于肺炎克雷伯菌和[16]大肠杆菌，主要分布于北非和土耳其。产KPC阳性菌主要分离于医院菌株，而NDM和OXA-48主要分离于医院和社区医院的病例标本。虽然在十年前鲜有报道，但是近年来产碳青霉烯类肠杆菌正在被广泛报道、关注和研究。而且不同种类的碳青霉烯酶已经快速出现并全球传播3.2.1NDM-1等碳青霉烯酶的传播及流行要素1）储藏宿主。碳青霉烯酶会出现在特定地理环境区域，如人口密度大，卫生条件差，高选择压力与过度使用和滥用抗生素等危险因素。2）遗传学特征。某些遗传结构容易提高该耐药基因的可塑性和流动性。特定整合或转座子的结构和质粒有利于水平基因转移，有一些质粒复制的宿主范围广，因此可以提高种间传播，比如不动杆菌属，比如我国很大部分报道的NDM-1[4]阳性菌分离于不动杆菌属，该耐药基因在不动杆菌属中具有稳定的遗传性。3）耐药基因库形成后的人口流动水平。如果一个酶的出现发生在一个地理区域具备高度人口流动性，该酶全球流行和传播的可能性较大。而全球一体化不断推进的当今世界，全球各地区几乎均具备高度人口流动性特点。3.2.2NDM-1在碳青霉烯酶中的分类及流行特点NDM-1属于B类金属β-内酰胺酶（MBLs）。20世纪90年代初MBLs在铜[18]绿假单胞菌和肠杆菌科中首次分离，MBLs广泛存在于环境和条件致病菌内。最常见的B类MBL家族基因是VIM、IMP和NDM和GIM-1，KHM-1也偶有报道。NDM-1是2009年在印度新德里住院期间被感染该基因阳性的菌株，首次在一位瑞典病人体内的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中分离出NDM-1。产VIM肠杆菌科细菌在欧洲和地中海地区普遍存在，IMP广泛分布于亚洲。5 [17]除B类碳青霉烯酶之外，还有A类和D类酶。其中A类碳青霉烯酶首次在阴沟肠杆菌中被发现(NmcA;non-metallo-carbapenemaseofclassA)，A类碳青霉烯酶还包括：SME、IMI、GES、KPC，KPC酶（Klebsiellapneumoniaecarbapenemases）是目前临床上最重要的A类碳青霉烯酶，全球公认的KPC酶五大高流行区域为：美国东北部、[15]波多黎各、希腊、中国浙江省和以色列5个国家和地区。D类碳青霉烯酶也叫[19]OXAs，OXA亚型众多，目前已知亚型已大于400多种，它们的碳青霉烯酶活性较低，这其中，只有一部分的D类β-内酰胺酶具有碳青霉烯酶，常分离于肠道细菌。大多数的D类β-内酰胺酶分离于不动杆菌，但OXA-48及其它的亚型[20]常存在于肠杆菌科细菌。OXA-48常分布于土耳其、欧洲和北非地区。KPC和NDM常分布于革兰阴性菌，然而OXA-48常分布于肠道细菌。3.3NDM-1相关研究的文献回顾通过中国知网搜索关键词：NDM-1，发表年限为2010年1月至2016年12月，共检索209篇，其中2011年检出最多43篇，2016年检出最少，为14篇，其中期刊论文124篇，硕博士毕业论文和会议文献均为31篇，其他文献23篇。通过PubMed搜索篇名含NDM-1，发表年限为2010年1月至2016年12月，共检索427篇，其中2012年检出最多，为77篇，2010年检出最少，为24篇（见表1.1，图1.1、1.2）。表1.12010-2016年NDM-1相关研究的文献发表情况文献量（篇）年份合计（篇）/构成比中国知网(篇)/构成比PubMed（篇）/构成比201017/8.13%24/5.62%41/6.45%201143/20.57%72/16.86%115/18.08%201236/17.22%77/18.03%113/17.77%201331/14.88%63/14.75%94/14.78%201426/12.44%71/16.63%97/15.25%201542/20.10%72/16.86%114/17.92%201614/6.70%48/11.24%62/9.75%合计209/100.00%427/100.00%636/100.00%6 图1.12010-2016年NDM-1相关研究的文献发表情况2010-2016年NDM-1相关研究发表类型硕博士毕业论文其他15%11%会议15%期刊59%图1.22010-2016年NDM-1相关研究文献发表类型3.4携带blaNDM-1阳性菌地区与种类分布特征共有50篇文献报道的276株不同种类细菌携带blaNDM-1纳入研究范围，共报道274株（99.28%）革兰氏阴性菌，2株革兰氏阳性菌（屎肠球菌）。涵盖13个细菌菌属，不动杆菌属占112株，占所有阳性细菌的40.58%，显著高于其他菌属（P<0.05）；其它依次为克雷伯氏菌属76株（27.54%、P<0.05）、埃希菌属28株（10.14%）、肠杆菌属28株（10.14%）、枸橼酸杆菌属11株（3.99%）、普罗威登斯菌属10株（3.62%），其余假单胞菌属、肠球菌和肠产气杆菌属等均不到10株。细菌类别方面，除了72株未鉴定出菌种的不动杆菌属细菌外，以肺炎克雷伯菌报道最多（70株，占25.36%）（P<0.05），其次为阴沟肠杆菌28株（占10.14%）。2007-2013年全国共有25个省、市和地区报道携带blaNDM-1基因的阳性菌，其中广东109株（39.49%）,明显高于其他省（市）（P<0.05）；其余依次7 是海南（10.87%）、浙江（9.42%）、山东（7.97%）、河南（5.80%）等。（见表1.2、图1.3-5）。[4,5,21-71]图1.32007-2015年276株携带blaNDM-1细菌地区分布情况[4,5,21-71]图1.42007-2015年276株携带blaNDM-1细菌菌属分布情况[4,5,21-71]图1.52007-2015年276株携带blaNDM-1细菌地区分布情况8 [4,5,21-71]表1.22007-2015年276株携带blaNDM-1细菌地区分布情况菌株数量（株）携带blaNDM-1菌株宁湖海浙河甘安新云辽陕吉山湖广福香台河上重广北江江合夏南南江北肃徽疆南宁西林东北东建港湾南海庆西京西苏计16鲍曼不动杆菌261111133皮特不动杆菌35洛菲不动杆菌21112溶血不动杆菌111约氏不动杆菌111吉拉迪亲铜菌72未确定不动杆菌属216916大肠杆菌213261128阴沟肠杆菌841633121产碱杆菌11产气肠杆菌112大肠埃希菌22331110雷氏普罗维登斯菌91170肺炎克雷伯菌1056212625422139 [4,5,21-71]续表1.22007-2015年276株携带blaNDM-1细菌地区分布情况菌株数量（株）携带blaNDM-1菌株宁湖海浙河甘安新云辽陕吉山湖广福香台河上重广北江江合夏南南江北肃徽疆南宁西林东北东建港湾南海庆西京西苏计5产酸克雷伯菌11121臭鼻克雷伯菌14琼氏克雷伯菌21111弗氏枸橼酸杆菌3621植生拉乌尔菌11嗜麦芽寡养单胞菌18ACB711醋酸钙不动杆菌11解鸟氨酸拉乌尔菌12恶臭假单胞菌21铜绿假单胞菌122屎肠球菌+21302648111171223109621116332835276合计0.3构成比（%）0.7210.879.421.452.900.360.360.360.362.540.367.971.0939.492.170.723.995.801.091.090.722.901.091.811006注：ACB：醋酸钙不动杆菌-鲍曼不动杆菌复合体；“+”表示屎肠球菌为革兰氏阳性菌10 3.5菌株和感染来源通过对文献报道NDM-1阳性菌株的临床流行病学资料分析发现：NDM-1耐药基因在临床病例特征、临床分离标本、临床科室及疾病种类存在明显差异。其中，报道的文献中携带blaNDM-1男性病例为45人，明显多于女性病例20人（P<0.05），其中感染NDM-1阳性菌病例的年龄分布集中在10岁以下和60岁至80岁年龄段，分别为13人（19.70%）、36人（54.55%），多于其他年龄段病例（P<0.05）；从临床痰液标本分离出NDM-1阳性菌40株（41.24%），明显多于其它临床标本（尿、血、分泌物、肛拭子和便标本）（P<0.05）；ICU、儿科和呼吸科病患携带NDM-1耐药基因明显高于其他临床科室（P<0.05）；患肺部疾病病例分离出NDM-1阳性菌32株，占39.02%，明显高于其他疾病（P<0.05），其次是外伤、脑和肾等疾病（见表1.3、图1.6-8）。[54,60]文献报道2例携带blaNDM-1患者有国外（印度、巴基斯坦）旅游史，其[37][69]余均无国外旅游史。邵春红等和王晓娟等报道国内两起NDM-1阳性菌引起的暴发疫情，分别是山东某医院儿科和陕西西安某医院肺炎克雷伯菌携带blaNDM-1暴发疫情。其它多以个案报道为主。[4,5,21-71]图6.276株携带blaNDM-1细菌菌株和感染来源11 [4,5,21-71]表1.3276株携带blaNDM-1细菌来源情况类别阳性菌株数量构成比P值性别男4569.23%P<0.05女2030.77%－合计65100%－科室ICU2424.00%－儿科2323.00%－呼吸科2222.00%－内分泌科55.00%－烧伤科33.00%－其他2323.00%－合计100100%－标本来源痰4041.24%P<0.05尿2020.62%－血1616.49%－分泌物1313.40%－肛拭子66.19%－粪便22.06%－合计97100%－年龄（岁）0~101319.70%P<0.0510~34.55%－20~46.06%－30~23.03%－40~57.58%－50~46.06%－60~1624.24%P<0.0570~1015.15%－80~710.61%－90~23.03%－合计66100%－疾病种类肺部疾病3239.02%P<0.05外伤89.76%－脑部疾病78.54%－肾脏疾病67.32%－其他*2935.36%－合计82100%－注:“*”代表血液系统疾病、肝脏疾病、消化道疾病等其他疾病。12 [4,5,21-71]图1.7276株携带blaNDM-1阳性菌患者年龄分布[4,5,21-71]图1.8276株携带blaNDM-1阳性菌患者年龄分布3.6耐药谱对50篇文献blaNDM-1耐药及携带blaNDM-1阳性菌对6大类34种抗生素的耐药情况分析发现，报道的24种携带blaNDM-1耐药菌总体耐药率为78.64%；其中对β-内酰胺类抗生素耐药率高达95%，其中头孢呋辛、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑林、头孢曲松钠、头孢他啶、多利培南、氨苄西林、呋喃妥英的耐药率为100.00%，碳青霉烯类抗生素美罗培南和亚胺培南的耐药率均高于95%；对多粘菌素类抗生素、阿米卡星和替加环素的耐药率最低，分别为38.00%、32.64%、7.70%、2.30%，明显低于其他类抗生素（P<0.01）。（见表1.4-5）。13 [4,5,21-71]表1.4276株携带blaNDM-1细菌耐药情况对不同抗生素的耐药率（%）菌株TETAMKMEMDORPBIPMFOSLEVCIPCOLTGCCHLGENETPTMAMSAM吉拉迪亲铜菌-----------------鲍曼不动杆菌-18.2100.0--100.0-100.063.60.014.3-28.60.0--100.0不动杆菌属-0.0100.0--100.0--50.00.00.00.00.0---66.7产碱杆菌-----------------产气肠杆菌-100.0100.0-100.0100.0--100.0-0.0------产酸克雷伯菌0.066.7100.0100.0-100.0--66.70.00.050.050.066.7100.0-100.0臭鼻克雷伯菌-100.0---100.0--100.0--------醋酸钙不动杆菌-0.0100.0--100.0--0.00.00.0100.0-100.0-100.0-ACB-100.0100.0100.0-100.0--71.40.00.0-100.0100.0---大肠埃希菌-40.090.0100.028.6100.00.0100.071.450.020.0-100.0100.0100.0100.0100.0大肠杆菌-42.9100.0--100.0100.071.485.70.00.085.7100.0100.0100.0100.0-恶臭假单胞菌-----------------肺炎克雷伯菌50.037.595.2100.085.796.3100.042.976.20.09.575.069.2100.0100.0100.0100.0弗氏枸橼酸杆菌100.050.0---100.0100.0100.0100.00.00.050.0100.0100.0100.0--解鸟氨酸拉乌尔菌菌-0.0100.0--100.0-0.0-----100.0---雷氏普罗威登斯菌-100.0100.0--100.0-100.0100.0----50.0-100.0100.0洛菲不动杆菌-0.0100.0-0.0100.0-100.066.70.033.30.050.0---66.7琼氏不动杆菌100.00.0100.0--100.0100.00.033.30.00.0100.033.3100.00.0100.0100.0溶血不动杆菌-0.0100.0--100.0--100.00.00.0-100.0---100.0屎肠球菌-----------------嗜麦芽寡养单胞菌-----------------铜绿假单胞菌-----------------阴沟肠杆菌85.738.5100.0100.050.089.5100.044.461.50.00.066.7100.083.3100.0100.0100.0植生拉乌尔菌-100.0100.0--100.0--100.0-0.0-100.0100.0---16(76.32(32.672(97.311(1011(37.9108(97.16(88.8929(63.060(69.71(2.35(7.615(68.141(73.258(92.014(93.326(1027(9合计19)5)0)0)3)30)）4/)7)3)9)8)1)6)3)0)3.10)注：ACB：醋酸钙不动杆菌-鲍曼不动杆菌复合体；TET：四环素；AMK：阿米卡星；MEM：美罗培南；DOR：多利培南；PB：多粘菌素B；IPM：亚胺培南；FOS：磷霉素；LEV：左氧氟沙星；CIP：环丙沙星；COL：黏菌素；TGC：替加环素；CHL：氯霉素；GEN：庆大霉素；ETP：厄他培南；TM：妥布霉素；AM：氨苄西林；SAM：氨苄西林-舒巴坦14 [4,5,21-71]续表1.4276株携带blaNDM-1细菌耐药情况对不同抗生素的耐药率（%）菌株NITSXTTIMTZPCFZCXMSCFCTTCTXTXCAZFOXFEPATMMNOT/S合计吉拉迪亲铜菌----------------0（0.00）鲍曼不动杆菌100.0100.00.071.4100.0100.0100.066.7100.0-100.0-100.0-25.075.092（67.65）不动杆菌属---100.0-100.050.0-100.0100.0100.0100.0100.0-0.0-22（57.89）产碱杆菌----------------0（0.00）产气肠杆菌-100.0-100.0---100.0100.0100.0100.0--100.0--12（92.31）产酸克雷伯菌-50.0-100.0----100.0100.0100.0100.0100.0100.0-50.021（71.43）臭鼻克雷伯菌----100.0--100.0----100.0--100.07（100.0）醋酸钙不动杆菌-0.0-100.0100.0---100.0-100.0-100.0100.0--11（68.75）ACB--100.0100.0--100.0-100.0-100.0100.0100.0100.00.0-12（81.83）大肠埃希菌-60.0-100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0150（87.21）大肠杆菌100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.071.4--115（82.14）恶臭假单胞菌----------------0（0.00）肺炎克雷伯菌100.090.0-100.0100.0-100.0100.0100.0100.0100.0100.095.275.0-80.0289（79.18）弗氏枸橼酸杆菌-100.0-100.0------100.0--50.0-100.040（85.11）解鸟氨酸拉乌尔菌---100.0----100.0---100.0---6（75.00）雷氏普罗威登斯菌---100.0100.0---100.0100.0100.0-100.0100.0--20（95.24）洛菲不动杆菌-0.00.0100.0-100.050.0-100.0100.0100.0100.0100.0-0.0100.029（61.70）琼氏不动杆菌100.050.0-100.0100.0-100.0100.0100.0100.0100.0-100.00.00.0-30（62.50）溶血不动杆菌---100.0--100.0-100.0-100.0-100.0-0.0-10（71.43）屎肠球菌----------------0（0.00）嗜麦芽寡养单胞菌----------------0（0.00）铜绿假单胞菌----------------0（0.00）阴沟肠杆菌100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.087.5100.0100.0181（83.03）植生拉乌尔菌---100.0----100.0100.0100.0-100.0100.0--12（92.31）合计8(100)30(81.08)7(77.78)81(97.59)30(100.)9(100)24(92.31)26(96.30)63(100)26(100)98(100)28(100)96(98.97)57(82.61)14(51.85)21(87.5)1160（78.64）注：ACB：醋酸钙不动杆菌-鲍曼不动杆菌复合体；NIT：呋喃妥因；SXT：复方新诺明；TIM：替卡西林／卡拉维酸；TZP：派拉西林／他唑巴坦；CFZ：头孢唑林；CXM：头孢呋辛；SCF：头孢哌酮舒巴坦；CTT：头孢替坦；CTX：头孢噻肟；TX：头孢曲松钠；CAZ：头孢他啶；FOX：头孢西丁；FEP：头孢吡肟；ATM：氨曲南；MNO：盐酸米诺环素；T/S：甲氧苄啶／硫磺甲基异恶唑15 [4,5,21-71]表1.5276株携带blaNDM-1细菌耐药的抗生素分类抗生素种类抗生素名称β-内酰胺类美罗培南、多利培南、亚胺培南、厄他培南、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、替卡西林／卡拉维酸、派拉西林／他唑巴坦、头孢唑林、头孢呋辛、头孢哌酮舒巴坦、头孢替坦、头孢噻肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢西丁、头孢吡肟、氨曲南、氨基糖苷类阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、酰胺醇类氯霉素、四环素类四环素、替加环素、盐酸米诺环素、喹诺酮类左氧氟沙星、环丙沙星、其他抗生素及合成抗菌药多粘菌素B、磷霉素、黏菌素、呋喃妥因、复方新诺明、甲氧苄啶／硫磺甲基异恶唑3.7blaNDM-1编码质粒情况文献报道NDM-1耐药基因均编码于质粒上，但编码blaNDM-1质粒差异很大。文献报道河南地区携带blaNDM-1基因的质粒大小为55kb-360kb，blaNDM-1位于[67]ISAba125元件下游和bleMBL基因的上游。还有报道认为blaNDM-1会以基因盒[72][61]的形式编码于质粒甚至是染色体整合子上。SunY等报道了编码于47.3kb质粒上的blaNDM-1，还进行去除质粒blaNDM-1前后细菌耐药性的比较试验，结果[21]表明质粒消除后抗生素敏感性明显增强；傅鹰等通过Southernblotting杂交证实了13株菌株blaNDM-1基因均定位于大小为30-55kb的质粒上，ISAba125转座[39]酶在blaNDM-1基因跨种传播过程中起到重要作用。孙秋报道携带blaNDM-1基因的质粒大小约20kb，该质粒还携带多种其它耐药基因（blaCTx-M-14、qnrA、aac6-Ib-cr、rmtA、qnrS）。还有报道肺炎克雷伯菌同时携带NDM-1，KPC-2，VIM-2和IMP-4[73]耐药基因；而INCA/C、IncL/M等质粒可能导致碳青霉烯酶传播(见图1.9，表1.6)。16 表1.9276株阳性菌携带blaNDM-1质粒大小分布情况表1.6.276株阳性菌携带blaNDM-1质粒情况菌株质粒报道地区第一作者Escherichiacoli88803bpHongkongPakLeungHo65kbZhejiangXueqingZhang56489bpTaiwanChao-JuChen190kbBeijingGuangZhou17924bpBeijingLiuZhiyuan310.1kbHenanShangshangQin180kbHenanShangshangQin216.9kbHenanShangshangQin54.7kbHenanShangshangQinKlebsiellapneumoniae54.7kbHenanShangshangQin310.1kbHenanShangshangQin56072bpTaiwanChao-JuChen110786bpShanghaiHongpingQu70kbGuangxiLonghuaHu13,508bpShanxiWANGxiaojuan300，200，100，50kbHubeiZhongjuChen50kbBeijingGuangZhouAcinetobacterbaumannii30-50kbAnhui,Xinjiang,Liaoning,ChenYanJilin,Shanxi,Shandong,Hubei,Guangdong,HainanAcinetobacterlwoffii48.9kbBeijingZhangWei30-50kbZhejiangChenYanAcinetobacterjohnsonii54.7kbHenanShangshangQin30-50kbZhejiangChenYan17 续表6.276株阳性菌携带blaNDM-1质粒情况菌株质粒报道地区第一作者Enterobactercloacae54.7kbHenanShangshangQin398.4kbHenanShangshangQin216.9kbHenanShangshangQin50kbBeijingGuangZhou20kbChongqingSunQiuCitrobacterfreundii54.7kbHenanShangshangQin170kbHenanShangshangQinAcinetobactercalcoaceticus47.3kbFujianYangSunZhejiangR.ZhangACB50kbProvidenciarettgeri190kbBeijingGuangZhou50kbGuangdongXiaShuRaoultellaornithinolytica70kbBeijingGuangZhouRaoultellaplanticola53134bpShanghaiHongpingQuAcinetobacterHemolytic30-50kbHainan,AnhuiChenYan4讨论随着对NDM-1耐药基因关注和研究的不断深入，其神秘面纱被逐步揭开。该耐药基因具有强耐药性和易传播性，但由于不同医院临床检测问题能力水平不同、感染者临床表现不同和全球一体化带来广泛传播的客观现实等多种因素，本文汇总和分析的文献有一部分通过实验室回顾性筛检留存标本获得阳性菌株，另一部分通过个案报道或者暴发疫情报道检出阳性菌，提示NDM-1阳性患者临床症状差别较大；囿于blaNDM-1只能通过实验室检测、各临床医疗机构实验室检测能力和NDM-1阳性感染者临床症状的差异等因素，本研究归纳和分析的阳性菌株可能只是NDM-1实际流行情况的冰山一角，blaNDM-1实际分布范围可能更广，其引起的公共卫生问题可能更加复杂。本研究汇总报道NDM-1的文献涉及全国25（73.53%）个省、市（包含两个特别行政区），台湾和香港各报道了1例输入性病例，有2起NDM-1耐药基因暴发疫情。南方报道NDM-1阳性病例明显多于北方，东部沿海发达地区报道NDM-1阳性病例明显多于中西部地区。从NDM-1阳性菌株菌种分布情况来看，共有13个菌属276株细菌，首次报道亲铜属的吉拉迪亲铜菌和革兰阳性菌编码NDM-1耐药基因，证实了NDM-1耐药基因具备很[44]强的跨种传播能力。我国最早在2008年就已经存在NDM-1阳性菌,印度也证实该耐药[74]基因最早存在与2006年，都证明了NDM-1耐药基因早在2008年之前就存在。本研究汇总的我国NDM-1阳性文献的数据分析显示，NDM-1阳性患者中男性多于女性；10岁以下、60-80岁年龄段病例分布最多，重症监护室、呼吸内科和儿科（新生儿科）呈现NDM-1高度聚集状态；提示基础体质和免疫能力较差人群是NDM-1阳性菌感染的易感人群，NDM-1阳性菌最多分离于痰液标本和肺部疾病患者，2起NDM-1暴发疫情均18 由肺炎克雷伯菌引起，而该细菌正是呼吸道传播和感染的条件致病菌，提示NDM-1耐药基因经呼吸道传播能实现更严重的致病力和更大范围的播散。本研究分析了文献报道的NDM-1阳性菌对34种抗生素的敏感性发现：①blaNDM-1具有广泛而且较强的耐药性。有对阿米卡星和多粘菌素E的耐药率最低，为10%，对9类抗生素100%耐药，其中对头孢菌素类抗生素完全耐药。②与其他文献报道的除多粘菌素和[25,58,替加环素外对所有抗生素耐药有差别：并不是所有菌株都对多粘菌素和替加环素敏感71],同时同种菌株也会体现出不同的耐药谱。如感染blaNDM-1的阴沟肠杆菌，有的对替加环[27,31,39,46]素和多粘菌素敏感，有的只对喹诺酮类抗生素和氨基糖苷类敏感,16SrRNA甲基化酶呈阳性的携带blaNDM-1的肺炎克雷伯菌对包括阿米卡星在内的氨基糖苷类药物耐药率[75][46]较高，但临床也有报道经阿米卡星等抗炎治疗患者体内的NDM-1检测转为阴性。NDM-1耐药基因不仅在人体中广泛感染，还被证实大量存在于伴生动物和环境中。[74]固定栖息地鸟类和候鸟体内发现了blaNDM-1，伴随着候鸟的迁徙，blaNDM-1横向的基因转移成为可能，这也许是细菌耐药全球蔓延的非人为因素之一。同时伴生动物和野生动物[75]体中也检测出了产碳青霉烯酶的大肠杆菌，如产blaVIM-1的沙门氏菌属和不动杆菌属、携带blaOXA-23和blaNDM-1基因的伴生动物，提示伴生动物可能是超广谱β-内酰胺酶（ESBL）广泛蔓延的主要宿主。以上都证实动物尤其是候鸟作为病原或耐药基因的储存宿主对疾病传播起到的重要作用，NDM-1传播途径与禽流感等传染病传播途径的研究结果相类似，也说明NDM-1耐药基因在不同物种间横向传播的可能性，这有可能是我国NDM-1阳性患者均无境外旅游史的一种解释。另外，人为因素加速了blaNDM-1在全球范围内迅速蔓延。通过文献回顾结果：NDM-1研究热度近几年已经逐渐降低，国内和国外的中英文文献发表数量随时间呈现相吻合趋势，2011年发表文献达到一个高峰后趋于平稳，在2015年再次达到一个高峰后次年迅速下降。以NDM-1耐药基因为代表的耐药家族是被迫选择进化的产物，即是对不断严峻的细菌耐药问题的体现，也是对人类如何管理和使用抗生素的反馈，更是对如何应对病原微生物提出的挑战，因此不论是专业机构还是政府都应该积极响应WHO的呼吁和要求，持续加强关注和研究细菌耐药问题。随着对NDM-1耐药基因研究的不断深入，NDM-1病原学特征、生物学和流行病学特点都取得了可喜的进展，然而以NDM-1为代表碳青霉烯酶耐药问题还存在大量未解决的问题，人们对NDM-1耐药菌的认识也逐步改变：由发现之初对其高耐药率可能导致的高致病率恐慌，到从目前暂未造成严重的公共卫生问题和人群健康威胁，国内外也未出现大范围的无药可用传染病的暴发，与人们初期对NDM-1菌株的恐慌相反，因此，本研究通过对我国部分地区临床哨点医院细菌标本进行NDM-1耐药菌筛选和研究，以期找到相关的答案和原因。19 5小结研究结果显示：NDM-1在我国广泛分布和流行，各地报道的阳性病例之间无明显流行病学联系，实验室对临床留存标本回顾性筛选检出率与用于临床治疗为目的的阳性检出率大致相等，我国NDM-1主要在不动杆菌属中流行，在地区分布、细菌类别分布和人群分布存在显著性差异；我国NDM-1阳性菌耐药谱和传播规律与国外报道的相关结果既有共性又有差异；对NDM-1研究的热度和成果在2016年显著下降，但NDM-1在菌种之间、人群之间的传播及扩散机制需持续关注和研究。20 第二部分：我国部分地区携带blaNDM-1耐药菌的流行情况及特性研究引言自2010年NDM-1被发现并在全球各大洲流行以来，我国NDM-1阳性病例报道的逐年增多，截止2013年已经有25个省市（含港澳台地区）报道阳性病例，而且，在一些医院的医疗环境和外环境（污水）中也报道存在NDM-1阳性的菌株，候鸟及伴生动物均检[75,76]出NDM-1阳性菌，第一部分研究已证明我国NDM-1基因分布广泛且复杂，与国际上报道的NDM-1流行特点相比呈现出独特的流行规律和特征。2010年10月，以国家“艾滋病和病毒性肝炎等传染病重大专项”科技重大专项项目“传染病监测技术平台”为平台，对2009-2010年收集的细菌标本进行产NDM-1阳性细菌检测，结果显示，从32408株细菌标本中，共检出24株携带blaNDM-1阳性菌，阳性率为0.07%[77]（24/32408），分别为20株不动杆菌属细菌，2株产酸克雷伯杆菌和2株屎肠球菌。blaNDM-1在全球大部分地区均有报道，部分地区呈现流行现状，但全球对于NDM-1耐药基因的耐药特性研究与2009年首次报道的blaNDM-1耐药谱有多不同，并非所有NDM-1阳性菌只对替加环素和多粘菌素过敏；而该耐药基因感染的细菌除肠杆菌科细菌外，其他菌属细菌也检出NDM-1，甚至也有报道革兰阳性菌中检出blaNDM-1，可见不同地区不同环境NDM-1耐药菌的生化特性存在差异。[78]报道的我国的NDM-1患者大部分无印度、巴基斯坦等国家医疗旅行史，且报道病例多为个案报道，各地之间的特点和分离情况由于采用的方法不太统一，因此在其生物学特性、临床特点方面的可比性较差，同时，NDM-1阳性菌在我国临床检出率如何，是否如文献报道已经在全国范围扩散均不甚明确，我国临床医疗机构NDM-1耐药基因分布特点，耐药谱及生物学特性与国外报道的NDM-1阳性菌分子生物学特点有何不同；产NDM-1菌株之间的流行关系仍不清楚；该耐药基因是否已经引起严重的公共卫生负担无明确报道。因此，本部分研究欲回答以下两个问题：NDM-1阳性菌株在我国部分地区临床环境中流行现况如何？其表型和耐药性有何特征？因此，本部分在前期文献分析的基础上，利用军队病原监测平台，在全国范围内选择具有代表性的哨点医院采集泛耐药菌，筛查NDM-1阳性菌株的流行情况以期了解我国NDM-1阳性菌真实的情况。21 1实验材料1.1培养基LB液体培养基：称取胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，氯化钠(NaCl)10g搅拌溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌20分钟后，备用。LB固体培养基：称取胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，氯化钠(NaCl)10g，琼脂粉15g，搅拌溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌20分钟后，生物安全柜内倒板后备用（每板大约15ml）。脑心浸液培养基：称取脑心浸液培养基(BrainHeartInfusionBroth)38.5g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20分钟后，备用。BHIA培养基：，称取脑心浸液琼脂(BrainHeartinfusionAgar)52.0g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20分钟后，备用。麦康凯琼脂培养基：称取麦康凯琼脂培养基（MacConkeyAgar）54g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20分钟后，备用。1.2试剂与药品试剂名称试剂公司美罗培南(MEM)和亚胺培南(IPM)美国Amresco品牌2×TaqPCRMastermix和D2000DNAMarker北京博迈德生物科技有限公司MHA培养基、麦康凯琼脂培养基和巧克力琼脂平板北京陆桥生物科技有限公司E-TEST金属酶检测试纸条梅里埃公司BHI液体培养基和BHIA培养基美国BD公司注：氯化钠、常规琼脂糖、Tris-base、硼酸、氢氧化钠、Na2EDTA·2H2O、EB(溴化乙锭)和PBS和TritonX-100均在本单位供应处领取，相应试剂的品牌见附录表1；1.3缓冲液1×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液2MTris-醋酸，100mMEDTA配制方法：称量下列试剂Na2EDTA·2H2O：37.2g，Tris：242g于1L的烧杯中，向烧杯加入800mL的蒸馏水，充分搅拌溶解后，量取57.1mL醋酸加入后充分搅拌，加蒸馏水定容至1L，室温保存。此时为50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液，使用时按比例稀释即可。PBS（PhosphateBufferedSaline）缓冲液:配制方法：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。室温保存备用。TE缓冲液：22 配制50mL1MTris-HCL(PH8.0)溶液：称取6.06gTris，加ddH2O40ml溶解，滴加浓HCL约2.1ml调至PH为8.0，定容至50mL；配制50mLEDTA(PH8.0)溶液：称取EDTA-Na2.2H2O9.306g，加ddH2O35mL，剧烈搅拌，用约1gNaOH颗粒调至PH至8.0，定容至50mL；取10mMTris-HCL，1mMEDTA配制1×TE溶液1.4仪器设备仪器/设备名称所属公司VITEK2COMPACT全自动微生物鉴定及药敏分析仪VITEK公司PCR仪Eppendorf公司凝胶成像仪Bio-Rad公司浊度仪VITEK公司A2生物安全柜Thermos公司高压蒸汽灭菌锅SANYO公司高速台式离心机Eppendorf公司梯度PCR扩增仪Bio-Rad公司引物合成和DNA测序服务由北京六合华大基因公司和诺禾致源生物科技有限公司提供；2实验方法2.1样本采集2.1.1采样对象的选取收集对象为临床医院检验科留存的多重耐药菌备份及细菌标本的相关临床流行病学资料，多重耐药菌株分离于病患的不同标本，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，根据哨点医院留存方式，菌株主要有两种保藏方式：甘油法和纸片法。样本在-20℃环境下运送保存，要求尽快送检。2.1.2采样地区的选取根据实际工作情况和临床哨点分布，选取了以下5个地区8个城市。华北地区：北京市；济南市西南地区：成都市；重庆市；东北地区：葫芦岛市；华东地区：南京市西北地区：乌鲁木齐市；兰州市23 图注：图中被红色圈包围的地方即为选取的采样地区，该图片通过地图慧软件制作。图1.1采样地区分布图2.2样本处理2.2.1样品送达实验室后，立即进行处理。2.2.2使用无菌接种环蘸取少量已复苏的甘油菌液于5ml无菌LB液体培养基中/生物安全柜中将保藏菌株的纸片置于5ml无菌LB液体培养基。2.2.3恒温振荡箱摇床培养12h，37℃，200rpm。2.2.4使用无菌接种环挑取少量样本增菌液分三区划线LB固体培养基，置于37℃恒温培养箱中过夜培养24h。2.2.5使用无菌接种环挑取LB平板上单个菌落接种于无菌LB液体培养基，放于恒温振荡箱，200转/min，增菌8-10h。2.2.6吸取1ml增菌菌液保存于高压灭菌的甘油冻存管，每份样本保存两份甘油冻存管，存于-80℃超低温冰箱。2.2.7部分革兰氏阳性菌使用LB液体培养增菌效果不佳时，更换为脑心浸液培养基。2.3PCR法筛查blaNDM-1阳性样本2.3.1筛选blaNDM-1基因引物NDM-F：5'-GGTTTGGCGATCTGGTTTTC-3'NDM-R：5'-CGGAATGGCTCATCACGATC-3'24 [79]产物大小为621bp2.3.2用接种环蘸取已复苏的甘油冻存菌液于5mlLB液体培养基，置于37℃恒温振荡箱，200转/min，8h，吸取500uL上述菌液至1.5mL离心管中。2.3.3离心机12000rpm，3min，4℃离心后，弃上清。2.3.4用移液器向EP管中加入的1mLPBS缓冲液，漩涡震荡混匀。2.3.5离心机12000rpm，3min，4℃离心后，弃上清。2.3.6用移液器向EP管中加入的1mlPBS缓冲液，漩涡震荡混匀。2.3.7将EP管放入沸水中煮沸10min，12000rpm，4℃离心3min后，吸取上清液作为PCR扩增模板。2.3.8PCR扩增体系和反应条件：30μL扩增体系：2×TaqPCRMastermix：15μL，引物：各1μL，模板：5μL，H2O：8μL；反应条件：95℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火复性30s，72℃延伸1min进行30个循环，最后72℃延伸7min，产物于4℃保存。2.3.9制备浓度为1.5%琼脂糖胶块，吸取5μLPCR产物加入胶块样孔中，180V，结束后拍照，对比阳性、阴性对照，以阳性对照条带作为标准筛选特异性条带。2.3.8将与阳性条带一致条带对应的PCR产物送公司测序。2.3.9将测序结果导入NCBI中BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对。根据测序结果判定是否为blaNDM-1基因阳性菌株。2.4实时定量PCR法筛查blaNDM-1阳性样本[80]本方法源于美国疾病控制与预防中心公布的筛选NDM-1和KPC耐药基因的方法2.4.1探针和引物信息（Nucleotidesequence,5’–3’）KPC-FPrimer：GGCCGCCGTGCAATACKPC-RPrimer：GCCGCCCAACTCCTTCAKPC-Probe(FAM)：FAM-TGATAACGCCGCCGCCAATTTGT-BHQNDM-FPrimer：GACCGCCCAGATCCTCAANDM-RPrimer：CGCGACCGGCAGGTTNDM-Probe(HEX)：HEX-TGGATCAAGCAGGAGAT-BHQ16SrRNA-F：TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA16SrRNA-R：TGCGGGACTTAACCCAACA16SrRNA-Probe(CY5)：CY5-CACGAGCTGACGACAR*CCATGCA-BHQ2.4.2用接种环蘸取已复苏的甘油冻存菌液于5mlLB液体培养基，置于37℃恒温振荡箱，200转/min，8h，吸取500uL上述菌液至1.5mL的EP管中。2.4.312000rpm，3min常温离心然后弃上清。2.4.4用移液器向EP管中加入的1mlPBS缓冲液，漩涡震荡混匀。25 2.4.5离心机12000rpm，3min，4℃离心后，弃上清。2.4.6用移液器向EP管中加入的1mlPBS缓冲液，漩涡震荡混匀。2.4.7离心机12000rpm，3min，4℃离心后，弃上清。2.4.8将EP管放入煮沸10min，4℃，12000rpm离心3min，取上清液作为PCR扩增模板。2.4.9PCR扩增体系和反应条件：避光环境下20μL扩增体系：2×QuantiFastProbePCRMasterMix：10μL；probe-primerMix：5uL；SterilereagentgradeH2O：3uL；Temple：2uL；(probe-primerMix：分别将NDM-1、KPC和16SrRNA引物与探针按照1：1：1混匀制备)；反应条件：首先将机器设置成检测以下信号：16sUniversal:CY5，KPC:FAM，NDM-1(HEX):VIC。Enzymeactivation95℃，3min；以95℃melt3s，60℃退火延伸30s进行40个PCR循环，将混合体系加入避光96孔板。2.4.10结果判读：当10-30个循环之间呈现阳性才有意义，如果在10个循环之前迅速扩增为阳性应将其稀释后重新测定，如果在30次循环后扩增则指示痕量污染。未添加模板的对照样本（水）不应扩增阳性产物（CT>40），但在31-40循环范围内产生微量16s结果是可以接受的。阳性和阴性判读结果如下所示：如果16S未扩增或者低于30个循环扩增，同时又没有模板对照则运行结果无。正面和负面的控制应产生以下描述的结果(见表1)。表2.1实时定量PCR检测NDM-1和KPC判读结果Report16S(CY5)ResultKPC(FAM)ResultNDM(HEX)ResultKPCNDMCt10-30Ct10-30UndetectedPositiveNegativeCt10-30UndetectedCt10-30NegativePositiveCt10-30Ct10-30Ct10-30PositivePositiveCt10-30UndetectedUndetectedNegativeNegativeCt10-30Ct<10(ineither)Dilutetemplate1:100,repeatCt<10orCt>40anythingConsultsupervisor2.4.11将判读结果为NDM-1阳性的对应PCR产物送测序。2.4.12将测序结果导入NCBI中BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对。根据测序结果判定是否为blaNDM-1基因阳性菌株。2.5blaNDM-1阳性菌的菌种鉴定和药敏测试由于blaNDM-1阳性菌筛选之前已进行单菌落挑选，可直接接种鉴定为NDM-1阳性菌的菌株置于麦康凯平板37℃培养24h。然后使用VITEK2COMPACT全自动微生物鉴定及药敏分析仪进行菌种鉴定。26 表2.2VITEK2COMPACT全自动微生物鉴定及药敏分析仪测试卡片使用情况细菌分类检测目的VITEK2测试卡片革兰氏阳性菌菌种鉴定GP测试卡片药敏测试AST-GP67药敏卡革兰氏阴性菌菌种鉴定GN测试卡片药敏测试AST-GN14，AST-GN09药敏卡2.5.1用接种环蘸取已复苏的甘油冻存菌液于5mLLB液体培养基，置于37℃恒温振荡箱，200转/min，8h，蘸取少量增菌液三区划线LB固体培养基，37℃恒温培养箱24h。2.5.2制备0.50-0.63麦氏浓度菌悬液：分别在试管中加入3mL浓度为0.45%的生理盐水，使用一次性咽拭子蘸取LB固体平板培养好的单菌落置于试管中混匀；通过浊度仪调试至0.50-0.63麦氏单位浓度，测菌种用。2.5.3使用专用移液枪吸取已配制好菌悬液243uL至加有3mL0.45%的生理盐水试管中，测药敏用。2.5.4使用VITEK2COMPACT全自动生化鉴定仪鉴定细菌菌种和药敏：开机完成自检；取出4℃保存的VITEK测试卡片常温放置30min；然后依次将菌种鉴定卡(GN/GP)和药敏鉴定卡(AST-GP67/AST-GN14)放入试管架中，依次将试管架放入充填仓和孵育仓。2.5.5结果读取。2.6E-test法验证阳性菌株金属酶表型筛选为NDM-1阳性菌应进一步进行金属酶表型阳性验证。本研究采取E-test法进行检测。E-test检测试纸条两端分别为亚胺培南(MIC：4-256μg/mL)和亚胺培南/EDTA(MIC：1-64μg/mL)。1）取-20°C保存的E-test金属酶检测条常温放置30min。2）挑取LB培养平板单个菌落，使用梅里埃的浊度仪，用0.85%的生理盐水稀释制备0.5麦氏单位的菌悬液5ml。3）将进口一次性无菌鼻拭子浸入菌悬液中，管壁上挤干后，在MHA琼脂平板均匀涂布。4）超净台放10min至平板上水分消失，用无菌镊子将E-test药敏试纸条放在MHA平板中央，一旦放定不再移动和挤压排出试纸条下气泡。5）将粘有E-test试纸条的MHA平板口朝下倒置，37°C培养16-18h。实验结果判读：读取E-test金属酶检测试纸条两端的MIC值，若IPI的MIC值比IP的MIC值降低3个以上时应对倍稀释度；或P/IPI≥8时，报告试验阳性，即该菌产金属[76]β-内酰胺酶阳性，如果出现怪影圆圈或畸变圈，也报告阳性。27 3结果3.1样本采集情况本研究共收集2367株细菌标本通过甘油法或纸片法保藏的院内感染的多重耐药菌和耐碳青酶烯菌株，涉及全国8个地区9家医院。其中甘油法保藏菌种1209株，纸片法保藏菌株1158株。（见表3）表2.3菌株来源地区分布采集医院医院所在地点样本数解放军309医院北京690解放军305医院北京270解放军313医院葫芦岛260成都军区总医院成都226西南医院重庆198南京军区总医院南京188新疆军区总医院乌鲁木齐180兰州军区总医院兰州180济南军区总医院济南175合计23673.2各地区样本阳性率及分离出的阳性菌株数使用梅里埃VITEKⅡcompact全自动细菌鉴定及药敏分析系统对2367株菌进行菌种鉴定和药敏分析，其中，革兰阴性菌1899株，占80.32%；革兰阳性菌468株，占19.68%。菌种分布以不动感菌属最多，共568株，占24.00%，其次为克雷伯菌属、葡萄球菌属和肠杆菌属。（见图2.1）28 收集菌种分布情况不动杆菌属29%24%克雷伯菌属肠杆菌属14%埃希菌属普罗维登斯菌属12%5%5%10%葡萄球菌属肠球菌属其他1%图2.1收集菌株菌种分布分别使用VITEK2药敏测试卡片GN14和GN09测试革兰阴性菌耐药情况；AST-GP67测试革兰阳性菌耐药情况，其中，1899株革兰阴性菌中有737株碳青酶烯类耐药菌，占38.81%；447株超广谱β内酰胺酶耐药菌(ESBL+)，占23.54%；其中即携带碳青酶烯酶又产超广谱β内酰胺酶202株；468株革兰阳性菌中有多重耐药菌265株，占56.62%；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)55株，占11.75%；其中MRSA均为多重耐药菌。（见表2.4，图2.2）表2.4收集菌株菌种鉴定结果菌株分类耐药菌株数量/构成比革兰氏阳性菌多重耐药菌(MDR)265(56.62%)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)55(11.75%)其他菌株203(43.38%)革兰氏阴性菌碳青霉烯酶耐药菌737(38.81%)超广谱β内酰胺酶耐药菌(ESBL)447(23.54%)其他菌株917(48.29%)注：其中MRSA均为多重耐药菌；ESBL+耐药菌有202株为碳青霉烯酶耐药菌。29 菌株耐药类型31%碳青酶烯类耐药菌58%11%多重耐药菌其他菌株图2.2收集菌株耐药情况分布3.3携带blaNDM-1阳性菌检出情况本研究依托军队病原监测网络，选择全国有代表性的8个地区的哨点医院共收集2367株菌株，其中东部地区选取济南军区总医院共收集175株细菌标本，编号为JN-1至JN-175；南部地区选取南京军区总医院共收集188株细菌标本，编号为NJ-1至NJ-188；西部地区选取第三军医大学附属西南医院和成都军区总医院共收集424株细菌标本，编号分别为XD-1至XD-198和CD-1至CD-226；西北部地区选取兰州军区总医院和新疆军区总医院共收集360株细菌标本，编号分别为LZ-1至LZ-180和XJ-1至XJ-180；北部地区选取305医院和309医院共收集960株细菌标本，分别为305-1至305-270和309-1至309-690；东北部地区选取313医院共收集260株细菌标本，编号为313-1至313-260。通过普通PCR和多重实时定量PCR对所有收集菌株筛选NDM-1目的基因，阳性PCR产物送测序验证，所有阳性菌株均通过普通PCR(图2.5)和多重实时定量PCR方法进行二次验证，其中共筛选5株产NDM-1阳性菌（见图2.3,2.4表2.5,2.6），均为革兰氏阴性菌，阳性率为0.21%。通过VITEK2菌种测试卡片GP和GN得出菌种鉴定结果分别为1株肺炎克雷伯菌，4株不动杆菌属细菌，分别是309-254号鲍曼不动杆菌；305-118号鲍曼不动杆菌；309-177号不动杆菌属菌；CD-34号醋酸钙不动杆菌；NJ-18号肺炎克雷伯菌。5株产NDM-1阳性菌E-test金属酶表型验证MBL结果均为阳性（见图2.6）。通过VITEK2药敏测试卡片GN14和GN09得出耐药结果：对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、氨曲南耐药率为100%。对庆大霉素、左氧氟沙星呈中度耐药。对替加环素和多粘菌素敏感（见表2.8）。30 图2.3部分NDM-1阳性菌株实时定量PCR结果图图2.4部分NDM-1阳性菌株实时定量PCR结果图表2.5图3阳性菌株实时定量PCR结果值wellFlourSampleCq值D06HEX309-17720.38E02HEX305-11823.05G12HEXNegctroN/AH12HEXPosctro24.2231 表2.6图4阳性菌株实时定量PCR结果值wellFlourSampleCqC07HEXCD-3423.68D06HEX309-25417.61D07HEXNJ-1822.84G12HEXNegctroN/AH12HEXPosctro25.11图2.5NDM-1阳性菌株PCR电泳图表2.7产NDM-1阳性菌株来源地区分布采集医院样本数NDM-1阳性标本数菌株编号菌株类型309-177Acinetobactersp解放军309医院6902309-254A.baumanii解放军305医院2701305-118A.baumanii解放军313医院2600成都军区总医院2261CD-34A.calcoaceticus西南医院1980南京军区总医院1881NJ-18KlebsiellaPneumoniae新疆军区总医院1800兰州军区总医院1800济南军区总医院1750合计2367532 图2.6产NDM-1阳性菌金属酶E-test表型验证阳性结果表2.8产NDM-1阳性菌耐药情况MIC309-177309-254305-118CD-34NJ-18AMPR(≥32)R(≥32)R(≥32)R(≥32)R(≥32)SAMR(≥32)R(≥32)R(≥32)R(≥32)R(≥32)CTXR(≥64)R(≥64)R(≥64)R(≥64)R(≥64)CTZR(≥64)R(≥64)R(≥64)R(≥64)R(≥64)IMPR(≥16)R(≥16)R(≥16)R(≥16)R(≥16)MERR(≥16)R(≥16)R(≥16)R(≥16)R(≥16)ATMR(≥64)R(≥64)R(≥64)R(≥64)R(≥64)GENS(≤1)S(2)S(2)I(4)R(≥16)AMIS(≤2)I(4)I(8)I(8)R(≥64)TOBS(≤1)S(2)S(2)I(4)R(≥16)CIPR(≥4)R(≥4)R(≥4)R(≥4)R(≥4)LVXS(1)S(2)S(2)I(4)R(≥8)TIGS(0.25)S(0.25)S(0.25)S(0.25)S(0.25)COLS(1)S(1)S(1)S(1)S(1)33 4讨论2009年NDM-1首次报道后，多国科学家对印度、巴基斯坦和英国等国家的细菌标本进行筛选，共筛出180株NDM-1耐药菌。分别在印度Chennai和Haryana筛出141株和[81]47株CRE菌株，从这些阳性菌株中共得70株携带blaNDM-1菌株；2010年Perry在巴基[82]斯坦一家部队医院筛选出37份（18.5%）NDM-1阳性菌。邹大阳2013年收集的3001[4]份样本中筛出阳性菌株329份，平均阳性率为11%。傅鹰等从12024株非重复性革兰氏[5]阴性菌中分离出13株blaNDM-1基因阳性菌株，阳性率为1.08%。推断我国整体NDM-1阳性菌株携带率低于印度、巴基斯坦等国家。NDM-1耐药菌在我国部分医院呈散发流行状况。NDM-1耐药基因已然成为超级细菌的新兴代言人，在全球范围内广泛传播与扩散，它是对β-内酰胺类抗生素耐药的重要机制，该耐药基因在全球范围已经广泛编码于革兰阴性杆菌，尤其是肠杆菌科细菌和不动杆菌属细菌，其次为弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌；[4,5]而我国主要分布于不动杆菌属细菌中，并未在肠杆菌科细菌中广泛流行，虽然blaNDM-1在印度被首次报道，其编码于质粒而导致的易传播性已经被证实，但是全球各地报道的大[83]部分NDM-1阳性病例无印度旅游史或未知感染途径，本次监测结果发现，我国医院患者NDM-1耐药基因阳性率整体较低，但NDM-1耐药菌已经在我国部分医院中传播扩散。本次收集菌株多为医院多重耐药菌，既有革兰氏阳性菌又有革兰氏阴性菌，NDM-1阳性菌检出率为0.21%，高于国家疾病预防控中心2010[77][4,5]年筛检的0.07%阳性率，低于其他文献的阳性检出率，分析其原因为①哨点医院收集的样本菌株为医院检验科留存菌株，大部分为临床治疗需采集的常见样本，多为多重耐药菌，无特异性。而文献报道肠道细菌多为NDM-1耐药基因的储存宿主，因此NDM-1阳性菌检出率较低；②收集菌株19.68%为革兰氏阳性菌，而NDM-1耐药基因多存在革兰氏阴性菌。本研究分离的5株NDM-1阳性菌株，其中4株不动杆菌属细菌和1株肺炎克雷伯菌。第一部分国内NDM-1阳性菌流行现况分析结果显示我国NDM-1耐药基因主要在肠杆菌科细菌中流行和传播，以不动杆菌属细菌和肺炎克雷伯菌为主要菌种，不同于全球范围内[84][4][5]NDM-1耐药菌最多分布于肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。邹大阳与傅鹰的研究中携带NDM-1耐药基因主要为不动杆菌属细菌，与本研究NDM-1阳性菌株分布情况相类似。推测不动杆菌属细菌是blaNDM-1的保存宿主，对NDM-1耐药基因的传播起到重要作用。5小结通过研究发现NDM-1耐药基因在临床医院中呈现低流行状态，本研究NDM-1阳性菌检出率为0.21%，高于国家疾病预防控中心2010年筛检的0.07%阳性率，但显著低于国内其他文献报道。本次共监测到5株NDM-1阳性菌株，其中1株肺炎克雷伯菌，4株不34 动杆菌属细菌。5株产NDM-1阳性菌E-test金属酶表型验证MBL结果均为阳性。耐药结果显示5株阳性菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、氨曲南耐药率为100%。对庆大霉素、左氧氟沙星呈中度耐药。对替加环素和多粘菌素敏感。我国NDM-1耐药基因的传播具有独特的耐药规律和传播特点，具有潜在的公共卫生危害，应加强监测预警。35 第三部分：我国部分地区携带blaNDM-1耐药菌的分子遗传学研究引言根据我国2014年CHINET中国细菌耐药性监测报告：不动杆菌属细菌（鲍曼不动杆菌占93.0%）对碳青霉烯类抗生素呈现高度耐药状态，其中对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别达到62.4％和66.7％。与2013年相比，鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌中泛耐药株[85]的检出率有所上升。我国临床分离的不动杆菌属细菌已经对大多数抗生素产生不同程度的耐药作用，而且以blaNDM-1为代表的诸多碳青霉烯酶主要分布在不动杆菌属细菌中,具有[4]稳定的遗传性，不动杆菌属细菌很有可能是我国耐药基因的重要储存宿主。肺炎克雷伯菌已经在世界各地传播，也是医院感染的重要原因，是各类耐药基因的常见宿主，比如[86]blaNDM-1和blaKPC，据WHO公布数据：在一些国家，因肺炎克雷伯菌携带碳青霉烯酶导致的耐药问题已经导致近半数病人被感染，而抗生素耐药性问题在占据世界人口数近1/4的东南亚地区十分严峻，具有强耐药性的碳青霉烯酶在一些国家和地区十分普遍，多重耐药和泛耐药的鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌是院内感染的重要病原菌。本研究筛选的NDM-1阳性菌株4株为不动杆菌属细菌，1株为肺炎克雷伯菌，且病例散发而且属于非输入性病例，检出率较低，病例之间无明显流行病学关联，说明我国NDM-1耐药基因具有独自的进化过程和特点，这与国外报道的NDM-1阳性菌菌种分布不[87]同，国外报道的NDM-1阳性菌主要为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，所以要对已分离的NDM-1阳性菌株进行深入研究。blaNDM-1本身的转移特点是引起不同地域、不同菌种和病例之间广泛传播的内在危险因素，而引起其广泛转移的外因复杂多样，除过量使用抗生素，错误使用抗生素和不合理使用抗生素造成的选择压力导致的细菌横向快速转移外，环境危险因素特别是患者治疗期[88]间所处的医疗环境也会加快耐药基因的转移，已有研究报道NDM-1不仅存在于患者体内，还存在于患者参与的所有医疗活动和外环境，包括患者所用的床、卫生间、医生的听[89]诊器、医生诊室的洗手池、下水管道等，都分离出阳性菌株，我国也有报道医院环境中监测到NDM-1阳性菌株，甚至在医院污水中也查到了阳性菌株，而近期国内报道的空气中检测到高耐药菌株更是说明耐药基因在内外因的共同压力选择下可以进行任何可能的转移和进化。基于此，本课题进一步对NDM-1耐药基因进行基因定位，并通过高通量二代测序技术分析本次分离到的blaNDM-1周围序列结构特征，与已经报道的质粒pNDM-BJ01结构差异进行比较，以期从分子生物学水平进一步揭示blaNDM-1的结构及基因环境特点。36 1实验材料1.1培养基BHI液体培养基：具体配置方法见上一章节。BHA琼脂培养基：具体配置方法见上一章节1.2实验耗材试剂名称试剂公司TM质粒试剂盒EZNABAC/PACDNAIsolationMaxiKit(OMEGA)广州飞扬生物工程有限公司S1核酸酶大连TaKaRa公司HindIII限制性核酸内切酶大连TaKaRa公司XbalI限制性核酸内切酶大连TaKaRa公司PCR反应试剂北京博迈德生物科技有限公司DNAMaker北京博迈德生物科技有限公司美罗培南（MEM）和亚胺培南（IPM）美国Amresco1.3缓冲液见第二章1.3缓冲液的配制方法1.4仪器设备Bio-Rad梯度PCR扩增仪；Bio-Rad公司的凝胶成像仪；Eppendorf公司的高速台式离心机；DensiCHEK-plus浊度仪；电泳仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴箱均为实验室公用国产仪器；引物合成和DNA测序服务由北京六合华大基因公司和北京诺禾致源生物有限公司提供。2实验方法2.1Southernblot对blaNDM-1进行基因定位[1,81]质粒作为NDM-1耐药基因最重要的储存库，对于blaNDM-1的播散具有重要意义，通过Southernblot对筛选的NDM-1阳性菌株blaNDM-1进行基因定位，以鉴定其编码位置并推断编码NDM-1质粒的大小。初步验证blaNDM-1是否定位于质粒，然后使用S1酶切含NDM-1阳性菌全基因组胶块得到质粒图谱，由此可简单得出携带blaNDM-1质粒情况。2.1.1Southernblot前期准备1）S1酶切电泳的胶块制备分别在离心管中加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；按照待测样本和Marker标记1.5mL离心管；使用无菌棉签蘸取少量CSB，刮取培养皿上适量的细菌菌落，在CSB混匀，用浊度仪调整OD值至4.0±0.1；吸取400µl细菌悬浊液至1.5ml无菌EP管37℃水浴5min；37 剩余的菌悬液冰浴待用置胶块制好；水浴5min后加入20uL规格为20mg/mL蛋白酶K，充分混匀；制备1%SeakemGold：称0.5克SeakemGold琼脂糖于47mLTE缓冲液加热融解，加入2.5mL20%SDS混匀置于56℃水浴箱备用；模具上标记好对应样品编号；向1.5mL离心管菌液加入400uL的1%SeakemGold（含1%SDS），充分混匀后加入模具，室温下放置10-15min至冷凝（此步骤模具中不可混入气泡）。2）胶块内DNA的S1酶切在1.5mLEP管上标记样品编号及Marker：H9812；按以下比例制备缓冲液：Marker：H9812试剂uL/胶块纯水160uL10×BSA20uL10×MBuffer20uL总体积200uL样本（ApaI）试剂uL/胶块纯水180uL10×LBuffer20uL总体积200uL在每个1.5mLEP管中分别加入200uL缓冲液；将切好的2-3mm宽胶块置于1.5mL管中，使胶块在侵泡于缓冲液下；将上述1.5mLEP管置于37℃水浴箱中10-15min；按照以下比例配制酶切缓冲液：MakerH9812（200uL）酶切缓冲液配制比例：纯水：155uL，10×MBuffer：20uL，10×BSA：20uL，XbalI：5uL。样本（ApaI）200uL酶切缓冲液配制比例：纯水：175uL，10×LBuffer：20uL，ApaI：5Ul；分别在EP管中加入200uL混合液（始终确保胶块位于液面之下），37℃水浴3h。缓冲体系制备：取10×Sl酶切缓冲液20uL并稀释至总体积为200uL；酶切体系制备：取10×Sl酶切缓冲液20uL，0.1uLSl酶，并稀释至总体积为200µL，37℃水浴15min后换成0.5×TBE待用。3）Marker选H9812(XbalI)，酶切和消化步骤参照上一步骤胶块DNA的酶切。4）PFGE电泳a.胶块准备b.细胞裂解在screw-capsule标记样品；制备细胞裂解液（CLB）：在细胞裂解液中加入浓度为0.1mg/mL蛋白酶K，颠倒混匀（冰上操作）；分别在管中加入5mL的蛋白酶K和CLB混合液；修整胶块至平齐；用小铲将胶块移入对应screw-capsule管（确保胶块完全在液面下）；38 将管子置于54℃水浴摇床2h，170转/min；将蒸馏水和TE缓冲液放入50℃水浴摇床预热。c.洗胶块用绿色的screened-capsule替换screw-capsule；分别在每管加15mL预热蒸馏水，始终保持胶块处于液面下，放入50℃水浴摇床10min弃蒸馏水，再使用蒸馏水洗一次胶块；弃纯水，向管中加入15mL，预热TE缓冲液，50℃水浴摇床，弃TE溶液。照此法反复清洗3次，每次清洗约10-15分钟；弃TE缓冲液，重新加入10mLTE缓冲液放置于4℃冰箱。d.胶块内DNA酶切e.加样调整梳子至梳子齿与胶槽底面接触，水平仪调整胶槽至水平；从水浴箱中取出胶块放至室温，吸出酶切混合液，分别加入200uL的0.5×TBE以终止酶切；将梳子平放于胶槽上，室温下风干约5分钟；配制1%SKG：称取1gSKG放入100mL0.5×TBE溶液中，微波炉加热溶解，再放入60℃水浴中平衡待用，凝胶温度降至60℃放入胶槽。f.电泳不触碰底部电极前提下，使用水平仪调整电泳槽至水平；加入2.2L5×TBE缓冲液，关盖子；开主机和冷却泵，调整冷却泵在-70（流速1L/min），使缓冲液在管道中循环；预热冷凝机20min，预设温度为14℃；把胶块放到电泳槽，排气泡后关上盖子；设置参数：片段大小为10-600kb，温度14℃，6V电压，脉冲转换时间2.16-54.17s，20h；结束电泳；运用BioNumericssoftware获取和处理图像。2.1.2blaNDM-1探针的制备和效率标记具体操作步骤详见Kit。2.1.3Southernblot2.1.3.1DNA脱嘌呤及变性处理将凝胶放到200mL0.25MHCL溶液中，缓慢震荡5-10min脱嘌呤；弃盐酸，加入变性液至完全浸泡胶块并水平震荡15min；换新变性液变性作用15min；弃变性液，将胶块完全浸入中和液，水平震荡15min；更新中和液再次中和15min。2.1.3.2毛细转移1）DNA毛细转移，具体见图3.12）毛细转移24h，用2×SSC清洗膜，置于湿滤纸上，在杂交仪中紫外交联1分钟，固定后将仍固定在湿滤纸备用。39 图3.1毛细转移示意图2.1.3.3Southern杂交拆除毛细转移装置，在尼龙膜标记胶孔顺序，放置于两张湿润滤纸中间后用紫外交联22min固定；将已固定好的尼龙膜浸入65℃DIGEasyHyb溶液中（10mL/100cm膜），排气泡，杂交仪50℃，60rpm预杂交30min；将探针70℃加热，变性10分钟；弃预杂交液，再加入含探针杂交液，使尼龙膜与杂交也充分接触，50℃，60rpm，12-16h。2.1.3.4显影检测2.2试剂盒提取质粒DNA（OMEGABAC/PA质粒提取试剂盒）2.2.1摇菌：使用LB液体培养基过夜摇菌6ml。2.2.2集菌：将摇好的菌液转移到2mlEP管，8000rpm/2min常温，吸净上清，再反复集菌2次（约6ml菌液）；2.2.3弃上清液，往EP管中加200uLT1/RNaseA，涡旋混匀（用移液枪吹散），加200ulT2Buffer，上下颠倒5-10次（忌剧烈摇晃），室温放置5min。2.2.3加200uLT3上下颠倒15-20次，冰浴10分钟。2.2.4常温离心14000rpm/10min，转移上清液至柱中，将柱放进新的2mLEP管，离心12000rpm/min。2.2.5弃柱子，将溶液转入新的2mLEP管，加0.1（约50ul）倍体积ETR（蓝色），上下颠倒7-10次，冰浴10min，加入ETR后变浑浊，但冰浴后会澄清。2.2.6水浴42℃，5min，上清浑浊。25℃离心14000rpm，3min，蓝色沉底分层。2.2.7转移上层水相至新的EP管内，加2uLlinearpolyarylamides和0.7倍（350ul）体积异丙醇，室温涡旋混匀15S。2.2.825℃离心14000rpm，15min沉淀DNA，弃上清。2.2.9加500ul冰的70%乙醇沉淀DNA，涡旋15S，12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥15min。2.2.10加50ulddH2O溶解沉淀测浓度，-20摄氏度保存。40 2.3PCRmapping鉴定质粒参考pNDM-BJ01的Tn125序列，将blaNDM-1上下游序列截取出来分析。同时参照pNDM-BJ0的Tn125设计引物，利用PCRmapping扩增blaNDM-1上下游序列。引物如下：表3.119对引物信息表序号引物信息大小1BJ01-130GACTGAACGGAAGCCATAGG3335bpBJ01-3464ATTCATAAAACCGCCCTCAT2BJ01-3008AAGCCTTACTTGGTGACGAG2968bpBJ01-5975ATGGGTGGTTCTGTTGGAGC3BJ01-5478CGTTGATCTGCGTCATAGTGA2858bpBJ01-8335CACCCTTTGGTAATGCTCGT4BJ01-8120GATATGCTTCTGATAACACCTTCGCTAG2743bpBJ01-10862GGTAATCTTGTCGGTATCCTTGACG5BJ01-10064GGCTGTTGCCTGCGGTTGGATG2393bpBJ01-12456CCTCGGTAAATGGTTGATTGACGTGGAA6BJ01-12123TTGCGTTGCCAGCGATAGACCG3115bpBJ01-15237ACAGACATGTGGAAGTGGATGTTGAGATT7BJ01-15019TGCGGCAATGGGTGCTGAGTTT1379bpBJ01-16397TTTGGCGAGTCTGGCGGGTAGG8BJ01-16256GATTCGGTGAGAAATGGCTAC2798bpBJ01-19053AATGTTCGATTATGTCCGTAGTG9BJ01-18812GCTAATTTAATTCCCTCTGC2823bpBJ01-21634CTTATCGCTACAATCTTCCTG10BJ01-21134CTAATGGGCTATCCGTTGCT3291bpBJ01-24424GGTACTGGTGGCGGTAAGAC11BJ01-24168TTACCATTATCGTTGTAGTCTTG2824bpBJ01-27015TTCACAAACATTCTGTAGCC12BJ01-26874AAACGAGCTGTAGAGGGAATG2840bpBJ01-29713CGCAAGACTATGTGCCAAGCT13BJ01-29609TGCCACCTGAAGTAGTCCCG2876bpBJ01-32484CGTGTAACTAATGATGTTTATAGCG14BJ01-32374GATTTCTGCTTGTCCGTCAT2702bpBJ01-35075ATCGTTGTTATTGGGCTGTT15BJ01-34921TGTCATTAGCGTTTACCTCCA2880bpBJ01-37800ATCCTCCTGCTACACCAACC16BJ01-37685TTTGCCGAGCTTCGTCTACT2667bpBJ01-40351AGATGCCTGGTCAAGACTGC17BJ01-39965GGGGCTTATTTGTCTTTGGA1432bpBJ01-41396AGGTCGTTACTGCACGTTGC18BJ01-41372TGTTGGCAACGTGCAGTAAC2794bpBJ01-44165AACGCTTCGTCCCATCCATT19BJ01-44144AAAATGGATGGGACGAAGCG3709bpBJ01-578GAACCGTATTGCCTGCCTGT41 2.4blaNDM-1质粒的高通量测序2.4.1使用OMEGA试剂盒提取细菌质粒DNA（同2.2步骤）2.4.2测序结果的拼接及比对由于4个细菌NDM耐药基因位于大质粒上，为避免重复序列，使用mate-pair建库并进行测序分析，该部分测序工作由我单位童贻刚老师课题组完成。3结果3.1Southernblot基因定位Southernblot杂交实验显示，4株NDM-1阳性菌blaNDM-1基因均定位在质粒上，其中3株菌NDM-1质粒大小约为30-60Kb，1株所含的NDM-1质粒大小约240-280Kb之间，每一个菌株都只含有一个blaNDM-1质粒。菌株309-254号细菌的NDM-1基因发生缺失，该菌为鲍曼不动杆菌，其中阳性对照菌株是鲍曼不动杆菌，其质粒为携带blaNDM-1的pNDM-BJ01（由疾控所邹大阳助理研究员提供）（见图3.2）。图3.2NDM-1耐药基因定位Southernblot结果图3.2PCRmapping鉴定质粒按照4个质粒扩增19对引物鉴定质粒结构，经PCRmapping鉴定：309-177，305-118菌株携带NDM-1耐药基因的质粒为pNDM-BJ01。CD-34和NJ-18号菌株携带质粒需进一步鉴定和分析，其中第19对PCR引物未出现明显阳性条带，其中阳性对照为质粒为pNDM-BJ01的NDM-1阳性鲍曼不动杆菌（由疾控所邹大阳助理研究员提供），阴性对照为NDM-1阴性鲍曼不动杆菌，对照组为蒸馏水。（见图3.4、3.5）。42 图3.3PCRmapping电泳结果图图3.4PCRmapping电泳结果图43 3.3blaNDM-1耐药基因周边基因环境及注释通过测序分析证实：309-177号菌株（不动杆菌属细菌），其编码blaNDM-1的质粒为pNDM-BJ01(GenBank:JQ001791)，其质粒拥有完整的Tn125结构：ISAba125-blaNDM-1--ble-ΔtrpF-dsbC-cutA-ΔgroA-groEL-ISCR27-ISAba125；NJ-18，305-118和CD-34号菌株分别为肺炎克雷伯菌，鲍曼不动杆菌和醋酸钙不动杆菌，它们编码blaNDM-1阳性质粒Tn125结构下游序列均发生丢失，在NJ-18和305-108号菌株阳性质粒Tn125上游发现新的插入序列IS26和IS5；CD-34号菌株可能由于测序问题只发现blaNDM-1上下游不完整的转座子ISAba125和bleMBL结构片段，其他上下游结构发生丢失；305-118号菌株携带NDM耐药基因亚型为blaNDM-5（见图3.5）。将测序结果CONTIG文件带入ResFinder-2.1得到4株NDM阳性菌携带的其他耐药基因，除编码β-内酰胺酶外，还携带氨基糖苷类、氟喹诺酮类、利福平、磷霉素、利胆醇和磺胺类药物的耐药基因其中肺炎克雷伯菌（NJ-18）携带最多，为6类14种耐药基因，包括Beta-lactam类耐药基因5种，分别为blaNDM-1,blaSHV-11,blaLEN12,blaTEM-1B,blaOXA-1；鲍曼不动杆菌（305-118）共携带4类11种耐药基因除了携带blaNDM-5，还携带有D类β-内酰胺酶blaOXA-23；不动杆菌属细菌（309-177）携带4类7种耐药基因；醋酸钙不动杆菌（CD-34）携带2种耐药基因（见表3.2）。图3.5blaNDM-1基因周围结构相似性分析44 表3.2NDM阳性菌携带其他耐药基因情况NDM-1-positivebacteriacarryingresistancegenenumberstrainBeta-lactamAminoglycosideFluoroquinoloneRifampicinFosfomycinPhenicolSulphonamideNJ-18KlebsiellablaNDM-1，aac(6')Ib-cr，oqxB，fosAcatA1，sul2PneumoniaeblaSHV-11，strAaac(6')Ib-cr，catB3blaLEN12，oqxAblaTEM-1B，blaOXA-1305-118A.baumaniiblaNDM-5，strB，armA，aac(6')Ib-crsul1，blaOXA-23strA，sul2aadA24，aacA4，aph(3')-IcCD-34A.calcoaceticusblaNDM-1sul2309-177AcinetobacterspblaNDM-1，aacA4aac(6')Ib-crARR-3sul1，blaPER-1sul245 4讨论通过Southernblot杂交实验定位blaNDM-1显示4株耐药菌的blaNDM-1均定位于质粒上，1株携带blaNDM-1质粒大小约为240-280kb，3株细菌携带blaNDM-1质粒大小约为30-60kb。通过PCRmapping比较和鉴定质粒结构发现：307-177，305-118和NJ-18号菌株携带NDM-1阳性质粒类似于质粒pNDM-BJ01。其中，经测序分析确认309-177号NDM-1阳性菌编码NDM-1质粒为pNDM-BJ01，其他3株细菌标本质粒全序还在进一步检测中。质粒pNDM-BJ01在2010年首次在临床患者体内携带blaNDM-1的洛菲不动杆菌中分离并命名，[90]该老年女性患者因胰腺癌化疗合并尿路感染而分离出该细菌，而pNDM-BJ01已经成为NDM-1耐药基因广泛传播的重要宿主，尤其是携带blaNDM-1不动杆菌属细菌中的重要耐药[4]基因载体。基因的移位是指一段DNA序列从一种DNA转移到另一种DNA，它需要转座子（TN），[91]插入序列（IS）和公共区域转座子（ISCR）来完成，blaNDM-1等耐药基因的转移就基于此机制，而ISCR是一种与1类整合子捕获系统高度相关的转座子酶，采取滚动循环机制来调动DNA。我们认为不动杆菌属细菌携带blaNDM-1质粒的基因背景源于最早在2005年印度首次报道的NDM-1阳性Acinetobacter菌株，该不动杆菌属细菌携带blaNDM-1质粒中[92]存在完整的Tn125结构，而随后大量发表NDM-1阳性菌研究报道也证实了Tn125是blaNDM-1水平转移的重要介导载体，而该转座子中的部分插入序列可能会介导blaNDM-1的更广泛转移。NJ-18，CD-34，309-177和305-118号细菌的GC含量分别为56.5%，38.99%，45.95%和40.84%。309-177号细菌NDM-1阳性质粒是已报道的pNDM-BJ01，其质粒存在完整的Tn125结构，Tn125在NDM-1细菌种内起到重要作用，同时Tn125对于我国NDM-1在不动杆菌属细菌间传播起到至关重要的作用[4]；通过对基因环境分析发现NJ-18和305-108号菌株携带blaNDM-1质粒Tn125上游发现插入序列IS26和IS5，提示它们介导了bleISAba25NDM-1在不同种属细菌质粒间的转移。而插入序列IS26的出现可能潜在的进一[92]步激活blaNDM-1在菌种间传播。Tn125复合转座子区域插入IS26或IS5可能会对blaNDM-1[93]从不动杆菌属细菌跨种转移至肠杆菌科细菌扮演关键角色。通过遗传动员和IS-结构，blaNDM可以在各种质粒骨架之间传播主要是转座子和各种IS-结构动员的结果，而最经典[83]也最具有的代表性的转座子和IS-结构是Tn125和ISAba125。4株NDM耐药菌株除编码blaNDM-1外，还携带多种耐药基因，其中肺炎克雷伯菌（NJ-18）携带6类14种耐药基因，包括5种Beta-lactam类耐药基因，该菌株也表现出最强的耐药性，对除多粘菌素和替加环素以外的所有抗生素耐药；其他3株NDM-1阳性菌也携带有多种耐药基因，而且除CD-34外其他菌株均携带多种β-内酰胺酶。多种β-内酰胺酶共存于耐药菌是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的一种常态，推测多种β-内酰胺酶对细菌耐药方面存在相互促进或依存的关系，推测可能是由于耐药基因环境的相似性或耐药菌质粒的特46 异性，其原因和证据需进一步研究。309-254号NDM-1耐药菌标本在进行基因定位实验时发现blaNDM-1发生丢失，经重新复苏菌液和PCR筛选仍未检出NDM-1，经仔细核实已经排除筛选时因污染样本存在假阳性的可能性，初筛是通过普通PCR电泳图检测出阳性条带，经实时定量PCR验证实验均为NDM-1阳性，送测序结果证实NDM-1阳性。经结合文献和实际操作情况分析，我们认为该细菌发生NDM-1耐药基因丢失可能有以下原因：①在无抗选择压力下通过甘油法长期保存细菌并多次复苏增菌，可能导致NDM-1基因失去抗生素外部选择压力而丢失；②blaNDM-1只有在特定的基因环境和外部环境下才具备一定的遗传稳定性；③可能存在与blaNDM-1相拮抗的基因结构。5小结本研究4株耐药菌的blaNDM-1均定位于质粒上，1株携带blaNDM-1质粒大小约为240-280kb，3株细菌携带blaNDM-1质粒大小约为30-60kb。通过PCRmapping比较和鉴定质粒结构发现：307-177，305-118和NJ-18号菌株携带NDM-1阳性质粒类似于质粒pNDM-BJ01。其中，经测序分析确认309-177号NDM-1阳性菌编码NDM-1质粒为pNDM-BJ01，其质粒拥有完整的Tn125结构。其余NJ-18，305-118和CD-34号菌株中编码blaNDM-1阳性质粒Tn125结构下游序列均发生丢失，在NJ-18和305-108号菌株阳性质粒Tn125上游发现新的插入序列IS26和IS5；CD-34号菌株可能由于测序问题只发现blaNDM-1上下游不完整的转座子ISAba125和bleMBL结构片段，其他上下游结构发生丢失；本研究4株NDM-1阳性菌同时携带多种耐药基因，除编码β-内酰胺酶外，还携带氨基糖苷类、氟喹诺酮类、利福平、磷霉素、利胆醇和磺胺类药物的等耐药基因。未来4株NDM-1阳性菌株全基因组测序将进一步揭示携带blaNDM-1质粒的基因结构和传播特点。47 总结本研究主要完成3方面工作，首先是通过文献回顾和分析的方式对我国2009-2013年产NDM-1阳性菌的流行病学特征进行分析和总结；然后对哨点医院临床细菌标本进行NDM-1耐药基因筛选并对产NDM-1耐药菌菌株特性进行研究；最后揭示NDM-1耐药基因的分子遗传学特点，推测blaNDM-1在我国的流行特征和传播特点。通过NDM-1耐药菌专题流行病学调查和实验室研究我们主要得出以下结论：1）NDM-1耐药菌在我国部分医院呈现散发流行状态。2）NDM-1耐药菌在我国呈现出独特的分布、耐药、传播和进化特点。3）我国临床NDM-1耐药菌总体阳性检出率较低，主要分布于不动杆菌属细菌和肺炎克雷伯菌，未完全呈现超强耐药性。4）本研究筛选阳性blaNDM-1耐药基因均位于质粒上，其中NDM阳性质粒均含有不完整Tn125结构，部分Tn125结构上游出现IS26和IS5插入序列，Tn125转座子和插入序列共同介导耐药基因水平转移。5）NDM-1阳性菌株在我国暂未引起大规模流行和严重公共卫生负担，但仍存在潜在威胁，应继续加强防控和研究。本研究的主要创新性1）首次全面系统对我国产NDM-1耐药菌的流行病学特征进行分析和总结。2）通过对全国部分哨点医院NDM-1耐药菌筛查揭示我国NDM-1耐药菌临床流行现况。3）分析我国NDM-1基因的结构特点，并推断其流行和传播的规律。论文的不足之处及今后的研究思路由于临床非特异留存样本NDM-1耐药菌实际阳性检出率低、菌株收集筛选周期长和携带NDM-1测序质量等因素，结合以NDM-1为代表的碳青霉烯酶最近研究进展和本研究成果，未来有待于在以下几个方面做进一步的解释和探讨：1）补充以KPC、NDM-1和OXAs为代表的A、B和D类碳青霉烯酶在我国的流行病学研究和总结，以期对碳青霉烯酶在中国流行病学特征进一步了解，从而更深入阐示blaNDM-1的流行病学特征。2）进一步扩大筛选细菌标本数量以期得到更多的NDM-1阳性标本，从而进一步从宏观层面探索NDM-1耐药菌的临床流行病学关联及特征，揭示临床感染blaNDM-1的危险因素。3）完成3株未知NDM-1耐药菌质粒全序测序，并进行比较基因组学研究，以揭示NDM-1耐药基因环境特点和传播特点。4）进一步研究和探讨NDM-1耐药基因丢失的原因，以探索NDM-1耐药基因自身进48 化的必要条件，通过外部宏观环境和微观基因结构的研究，以阐明blaNDM-1遗传稳定性的影响因素和制约条件。5）肺炎克雷伯菌和不动杆菌属细菌中携带blaNDM-1质粒是否有关联，若有关联是否有分子生物学实验证据等待进一步分析。49 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附表试剂名称厂商蛋白胨与酵母提取物国药集团化学试剂有限公司异丙醇国药集团化学试剂有限公司Na2EDTA·2H2O国药集团化学试剂有限公司EB(溴化乙锭)国药集团化学试剂有限公司TritonX-100国药集团化学试剂有限公司无水乙醇国药集团化学试剂有限公司无水甲醇国药集团化学试剂有限公司正丁醇国药集团化学试剂有限公司十二烷基磺酸钠(SDS)国药集团化学试剂有限公司EDTA二钠盐国药集团化学试剂有限公司氯化钠国药集团化学试剂有限公司二水合磷酸二氢钠国药集团化学试剂有限公司硼酸国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司甘油国药集团化学试剂有限公司琼脂糖国药集团化学试剂有限公司Tris-base国药集团化学试剂有限公司过硫酸铵国药集团化学试剂有限公司TEMED国药集团化学试剂有限公司甘氨酸国药集团化学试剂有限公司血平板培养基北京陆桥技术股份有限公司麦康凯培养基北京陆桥技术股份有限公司E-Test金属酶试纸条梅里埃公司GP菌种鉴定卡片梅里埃公司GN菌种鉴定卡片梅里埃公司AST-GP67药敏卡片梅里埃公司AST-GN14药敏卡片梅里埃公司AST-GN09药敏卡片梅里埃公司57 发表文章以第一作者发表文章2篇，待发表3篇：1.王盛书,孙金柱,苏文莉,胡智,杨建鹏,王勇.我国携带NDM-1基因耐药菌流行现况分析.军事医学,2015,39(11):825-830.2.王盛书，孙金柱，陈伟，高志丹，苏文莉，杨建鹏，王勇.我国携带KPC基因耐药菌流行现况分析.军事医学,2016,40(6):491-496.3.王盛书，陈伟，张秀山，李青华，李亚楠，范国英，张文义，邹文，孙海龙，李申龙，王勇.军队流行性出血热流行现况分析.军事医学(待发表)4.DisseminationofNewDelhiMetallo-β-lactamase-1ProducingBacteriainChina:EpidemiologyAnalysis.(InPreparation)5.EpidemiologicalanalysisofKPC-positivebacteriainChina.(InPreparation)58 个人简历姓名王盛书性别男出生年月1986年12月14日民族汉出生地山西省阳泉市经历：2005年9月-2010年6月第三军医大学学士2010年6月-2014年8月总参谋部卫生防疫队医师2014年9月-2017年6月军事医学科学院疾病预防控制所硕士奖励情况：2009年第三军医大学个人三等功2013年原总参谋部卫生防疫队个人三等功59 致谢本研究及学位论文是在我的导师王勇研究员的亲切关怀和精心指导下完成的，感谢王勇老师在学术科研上对我的深刻启迪和悉心引导，感激您在日常生活中对我的关怀和帮助，感恩能够耳濡目染您在工作生活事业等多层面所展现出的崇高品质和进取精神，这些都使我在各方面受益匪浅，在此谨向王老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。感谢全军疾病监测中心李申龙主任，孙海龙书记以及科室李承毅老师，范国英老师，温亮老师，徐元勇老师，张文义老师，邹文老师，李青华老师，钱全老师，褚宸一老师及其他老师和工作人员在三年朝夕相处中的关心和帮助；感谢苏文莉老师在课题研究之初给予的无私帮助和耐心指导；感谢邹大阳师兄在课题实施整个过程中给予的帮助和技术指导；感谢刘威、王建、赵荣涛、尹志涛、杨朗、马秋霞、吴府丽、李亚楠、杨建鹏、陈伟、高志丹、敖大、董德荣、李利忠、胡晓丰、董念、张绍飞、王伟周、温中华、石清明、张曦等好朋友好同学给予我的支持和鼓励。感谢中央军委机关事务管理总局防疫队徐宝凤队长，尹红队长，肖红副队长，王善雨主任，韩红老师，李荣主任及各位领导及同事在我学习期间给予的支持，正是有了组织、领导和同事们的关心，才使我能够心无旁骛潜心学习和钻研，是我三年研究生学习期间的强大后盾和支持。感谢我的家人，感谢辛苦操劳一辈子的老父亲，特别感谢我的妻子任雪玲女士，我的女儿王熙泽和出生不久的儿子王熙晨，无论遇到什么困难你们永远是我奋斗征程上内心深处最强大的力量源泉和最温柔的心灵慰藉。感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家！最后，再次向曾经给予我关怀、鼓励和帮助的各位领导、老师、同学和朋友表达我最诚挚的感谢，衷心祝你们幸福安康！60