北疆部分地区规模化养猪场仔猪腹泻的流行病学调查

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密级：公开分类号：１０７５９２０１６２１１３０１０单位代码：学号：石河子大学磺士考依铪式⑩北疆部分地区规模化养猪场仔猪腹泻的流行病学调查学位申请人张华雷指导教师张莉（副教授）张鲁安（研究员）申请学位类别专业硕士专业名称兽医研究领域兽医技术服务所在学院动物科技学院中国？新疆？石河子２０１８年６月 分类号：密级：公开学号：20162113010单位代码：10759石河子大学硕士学位论文北疆部分地区规模化养猪场仔猪腹泻的流行病学调查学位申请人张华雷指导教师张莉（副教授）张鲁安（研究员）申请学位类别专业硕士专业名称兽医研究领域兽医技术服务所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月 Epidemiologicalinvestigationonpigletdiarrheainlarge-scalepigfarmsinsomeareasofnorthernXinjiangADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByZhangHua-lei(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:AssociateProf.ZhangliJune,2018 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研宄成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意？研究生签名：ｆｊｌ时间：年６月（曰ｆ使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务？有权将学位论文的标题和摘要汇编出版？保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：赛ｆ曹时间：辦年“Ｖ曰导师签名：减时间：城年／月５曰 摘要仔猪腹泻是生猪产业发展中经常发生而又难以彻底解决的问题，每年因仔猪腹泻对养殖场造成的经济损失非常巨大。引起仔猪腹泻的病因复杂，病原种类多样，主要有传染性和非传染性因素，其中传染性因素中以病毒和细菌感染较为常见。2016-2017年北疆部分地区规模化养殖场中陆续有仔猪腹泻现象的发生，主要症状为水样稀便、消瘦以及脱水，使用抗生素治疗和疫苗防控效果均不理想，给养殖户造成了严重的经济损失。为了查明导致北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的主要原因，本研究选择石河子、克拉玛依、伊犁和博乐地区7个近两年常发生仔猪腹泻的规模化养殖场为研究对象，首先进行现场流行病学调查，查明可能的传染来源、传播途径和发病诱因，观察其主要临床症状及病理变化，同时对猪群的免疫抗体水平进行监测；采集腹泻仔猪的小肠及其内容物等病样共计111份，采用RT-PCR方法检测PEDV、PoRV和TGEV这三种主要导致病毒性腹泻的病原，与商品化疫苗株和流行株进行同源性分析；同时采用常规微生物学方法及16SrRNA的序列分析，对细菌性病原（大肠杆菌）进行分离、鉴定、药物敏感性以及对小白鼠的感染试验。最终明确引起北疆地区养殖场仔猪腹泻的主要病原及其特性，为北疆地区仔猪腹泻的临床治疗及防控提供科学依据。结果如下：（1）仔猪腹泻的现场流行病学调查结果试验区养殖场的仔猪腹泻主要发生在冬春两季，传播速度快，传播途径包括同窝之间的水平传播和母子之间的垂直传播两种方式；发病日龄以2月龄左右的哺乳仔猪为主，其中7日龄以内的仔猪所占比例最高，发病率及死亡率可达80%-90%；发病仔猪以水样腹泻为主并伴有呕吐、脱水、消瘦等症状；病理剖检可见肠壁菲薄、呈半透明状、肠内充满稀黄色液体并有部分出现臌气、胃部充满未消化的乳凝块；病理切片观察可见肠绒毛断裂、粗短、脱落，肝脏肿胀，肝小叶不明显，脾脏可见淋巴细胞空泡变性，淋巴结有嗜酸性粒细胞浸润；同时猪场内猪舍环境差、通风不良、圈舍湿度大是导致仔猪腹泻发病率高的主要诱因，另外，发病猪场内猪群伪狂犬、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征的的免疫抗体水平不稳定也是导致仔猪腹泻发病率高的诱因之一。（2）仔猪病毒性腹泻主要病原的RT-PCR检测及序列分析结果7个规模化猪场的111份病样中，PEDV的阳性率占67.5%（75/111），PoRV的阳性率占10.8%（19/111），没有检测到TGEV；同源性分析及系统进化关系显示，7株代表株PEDVORF3基因序列与3株疫苗株JX188454.1AJ1102、GU372744.1Cv777和JX002703.1ZJ08的同源性较高，均在94%-99%之间，其中与疫苗株JX188454.1AJ1102的进化关系较近，与疫苗株GU372744.1Cv777和疫苗株JX002703.1ZJ08的关系较远；7株代表株PEDVS基因序列与参考株的同源性为94-99%，其中与疫苗株JN599150.1CV777(S)的遗传距离较大，亲缘关系较远，而与流行毒株KY496315.1CHhubei2016和MG334003.1YnP2的距离差异稍小，亲缘关系较近；7株代表株PoRVVP-6基因序列与2株参考株的同源性为92-98%，与参考株L29186.14S（猪源）的同源性为92%左右，处于一个较大的进化分支中，亲缘关系较远，与参考株JN034041.12010/WH-a（野猪源）的同源性为96%左右，处于一个较小的进化分支中，亲缘关系较近。（3）致仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究从111份病样中分离出89株大肠杆菌，其生理生化特性均符合大肠杆菌的生物学特性；分离株在麦康凯培养基上呈光滑的红色单个菌落，伊红美蓝培养基上为泛有绿光带有金属光泽的黑色菌落；10株代表株的PCR扩增及序列分析结果表明，与MG270576.1同源性均在95%-99%之间，系统进化关系表明当地流行株与大肠杆菌参考株在同一个大的分支上；不同来源分离株的药物敏感性有所不同，但对阿莫西林、复方新诺明、四环素、卡那霉素等药物耐受率均超过50%；代表菌株的动物I 感染试验结果显示，腹腔注射小白鼠后在18h死亡数大于50%，在36h小白鼠全部死亡。综上，北疆地区部分规模化养殖场导致仔猪腹泻的主要病原为流行性腹泻病毒继发大肠杆菌感染，主要发病诱因包括环境、温度、季节、猪群的免疫抗体水平等；根据PEDV流行毒株的序列分析结果，结合商品化疫苗的毒株种类，优先选择与流行毒株亲缘关系略近的JX188454.1AJ1102疫苗株进行免疫；针对大肠杆菌导致的腹泻，选择耐药性较低的抗生素，例如头孢喹肟、阿奇霉素、洛夫沙星类等药物进行防治；同时，需注意仔猪保暖、母猪临产时的消毒，加强通风及减少各种应激因素等。现场回访结果表明，本研究建立的集免疫防控（根据流行毒株筛选疫苗）、药物防治（根据药敏试验筛选药物）及消除各种发病诱因三位一体的综合防控措施，基本控制了试验区猪场仔猪腹泻的大面积暴发，降低了猪场的经济损失。关键词：仔猪腹泻；轮状病毒；流行性腹泻；大肠杆菌；流行病学II AbstractPigletdiarrheaisacommonandingrainedprobleminthedevelopmentofpigindustry.Everyyear,theeconomiclosscausedbypigletdiarrheaisveryhuge.Thecausativeagentsofpigletdiarrheaarecomplexduetovariouspathogenswhicharemainlycomposedofinfectiousandnon-infectiousfactors.Inparticular,thevirusandbacterialinfectionaremorecommon.From2016to2017,pigletdiarrheaoccurredinsomelarge-scalefarmsinnorthernXinjiang,themainsymptomsofwhichwerediarrhea,emaciationanddehydration,andtheefficacyofantibiotictreatmentandvaccinecontrolwerenotsatisfactory,whichcausedfarmers’seriouseconomiclosses.InordertofindoutthemaincausesofpigletdiarrheainsomeareasofnorthernXinjiang,sevenlarge-scalefarmsinShihezi,Karamay,YiliandBorlewereselectedastheresearchobjects,inwhichthepigletdiarrheafrequentlyoccurred.First,thefieldepidemiologicalinvestigationwascarriedouttofindoutthepossiblesourceoftransmission,routeoftransmissionandpredisposingfactors,toobservethemainclinicalsymptomsandpathologicalchanges,andmonitorthelevelofimmuneantibodyinpigs.Atotalof111samplesofsmallintestineanditscontentswerecollectedfrompigletswithdiarrhea.PEDV,PoRVandTGEVweredetectedbyRT-PCRmethod,whicharethemaincausativeagentsoftheviraldiarrheaandhomologyanalysiswascarriedoutwithcommercialvaccinestrainsandepidemicstrains.Atthesametime,routinemicrobiologicalmethodsand16srRNAsequenceanalysiswereusedtoisolateandidentifybacterialpathogens(Escherichiacoli).Drugsensitivityandinfectiontestonmicewerealsoconducted.Finally,themainpathogensandcharacteristicsofpigletdiarrheainnorthernXinjiangareaweredetermined,whichprovidedscientificbasisforclinicaltreatment,preventionandcontrolofpigletdiarrheainNorthernXinjiangarea.Theresultsareasfollows:(1)FieldepidemiologicalinvestigationofpigletdiarrheaThepigletdiarrheaoccurredmainlyinwinterandspringintheexperimentalareawithafasttransmissionspeed.Thetransmissionrouteincludedhorizontaltransmissionbetweenthesamenestandverticaltransmissionbetweenmothersandtheiroffsprings.Thehighestmorbidityandmortalityfellin7-day-oldpigletswere,andthemorbidityandmortalitywereupto80%-90%in2-month–oldgroup.Theillpigletsmainlyshowedwaterydiarrheaalongwithvomiting,dehydration,wastingandothersymptoms.Pathologicalexaminationshowedthattheintestinalwallwasthinandsmi-translucent,theintestinewasfilledwiththinyellowfluid,andpartofthestomachwasfullwithundigestedmilkclots.Histopathologicalexaminationdisplayedthatintestinalvilliwerebroken,thick,shortandwereshedding,liverswell,hepaticlobulewasnotclear.Vacuolardegenerationoflymphocytesandinfiltrationofeosinophilsinlymphnodeswereobservedinspleen.Atthesametime,thepoorenvironment,poorventilationandhighhumidityofpigpensinthepigfarmwerethemainfactorsleadingtothehighmorbidityofpigletdiarrhea.Theunstablelevelsofimmuneantibodiesofpseudorabies,swinefeverandporcinereproductiveandrespiratorysyndromeinpigfarmsarealsooneofthecausesofhighmorbidityofthedisease.(2)RT-PCRdetectionandsequenceanalysisofthemainpathogensofviraldiarrheaofpigletsAmongthe111samplesof7large-scalepigfarms,thepositiverateofPEDVwas67.5%(75/111),andthepositiverateofPoRVwas10.8%(19/111),andnoTGEVwasdetected.HomologyanalysisandphylogeneticrelationshipshowedthatPEDVORF3genesequenceof7representativestrainsand3vaccinestrainsJX188454.1AJ1102、GU372744.1Cv777andJX002703.1ZJ08arehighlyhomologouswith94%-99%homology,ofwhichtheviralstrainsisevolutionarilyclosertovaccinestrainJX188454.1AJ1102,andisrelativelyfarfromthevaccinestrainGU372744.1Cv777andJX002703.1ZJ08.ThehomologybetweenPEDVSgenesequencesof7representativestrainsandPEDVreferencestrainswas94-99%,Thegeneticdistancebetweenthe7PEDVs(S)andthevaccinestrainJN599150.1CV777(S)isrelativelyfar,whichindicatedadistantgeneticrelationship.However,thesituationwasoppositeintheaspectofthegeneticdistancewiththeepidemicstrainKY496315.1CHHubei2016andMG334003.1YnP2.III Thehomologyof7PoRVVP-6genesequencesand2referencestrainswas92-98%,andthehomologywithreferencestrainL29186.14S(swinesource)wasabout92%,fallinginabigevolutionarybranchandsuggestingarelativelyfarrelationship.Thehomologybetween7PoRVVP-6genesequencesandreferencestrainJN034041.12010/WH-a(wildswinesource)was96%,fallinginasmallevolutionarybranchandindicatingacloserrelationship.(3)Isolation,IdentificationandBiologicalcharacteristicsofdiarrhea-causingEscherichiacoliofpiglets89StrainsofEscherichiacoliwereisolatedfrom111samples,andtheirphysiologicalandbiochemicalcharacteristicsallaccordwiththebiologicalcharacteristicsofEscherichiacoli.TheisolatedstrainformedsmoothredsinglecolonyonMacConkeyagarandblackcolonywithgreenlightandmetalliclusteroneosin-methylenebluemedium.ThePCRamplificationandsequenceanalysisof10representativestrainsshowedthatthehomologywithMG270576.1wasbetween95%-99%.PhylogeneticrelationshipshowedthatthelocalepidemicstrainsbelongedtothesamelargebranchwiththereferencestrainofEscherichiacoli.Thedrugsensitivityofisolatesfromdifferentsourceswasdifferent,butthedrugtoleranceratesofamoxicillin,compoundsulfamethoxazole,tetracycline,kanamycinandotherdrugswereallover50%.Theresultsoftheanimalinfectiontestofrepresentativestrainsshowedthatthenumberofdeathswithin18hwasover50%aftermiceintraperitonealinjection,andallmicediedwithin36h.Tosumup,thepigletdiarrheainsomelarge-scalefarmsinnorthernXinjiangwascausedbyprimaryinfectionofepidemicdiarrheavirusandsecondaryinfectionofEscherichiacoli.accompaniedbyinducementsincludingenvironment,temperature,season,immuneantibodylevelofpigsandsoon.AccordingtotheresultsofsequenceanalysisofPEDVepidemicstrains,andthetypesofcommercialvaccinestrains,prioritywasgiventovaccinestrainJX188454.1AJ1102whichhadacloserelationshipwiththeepidemicstrains.ForthediarrheacausedbyEscherichiacoli,chooseantibioticswithlowdrugresistance,suchascefequinoxime,azithromycin,lofloxacinandotherdrugsforpreventionandtreatment;Simultaneously,weshouldpaymoreattentiontokeepingthepigletswarm,sterilizingenvironmentduringlaborofsows,strengtheningventilationandreducingallkindsofstressfactors.Theresultsoffieldfollow-upsshowedthatthecomprehensivepreventionandcontrolmeasuresincludingimmunepreventionandcontrol(screeningvaccinebasedonepidemicstrain),drugpreventionandcontrol(screeningdrugsbasedondrugsensitivitytest)andeliminatingallkindsofpathogenicfactorswereestablishedinthisstudy,whichbasicallycontrolledthelargeareaoutbreakofpigletsdiarrheainthepigfarmsoftheexperimentalareaand.reducedtheeconomiclossesofthepigfarms.Keywords:PigletDiarrhea;Rotavirus;Epidemicdiarrhea;E.coli;EpidemiologyIV 目录摘要...................................................................................................................................................................IAbstract.............................................................................................................................................................III目录..................................................................................................................................................................V符号说明........................................................................................................................................................VIII前言..................................................................................................................................................................1第一章文献综述..............................................................................................................................................21病毒性腹泻的研究进展.......................................................................................................................21.1流行性腹泻.................................................................................................................................21.2传染性胃肠炎............................................................................................................................51.3轮状病毒....................................................................................................................................92大肠杆菌性腹泻的研究进展.............................................................................................................112.1病原学.......................................................................................................................................112.2国内外现状..............................................................................................................................112.3发病机理...................................................................................................................................122.4临床症状和病理变化..............................................................................................................122.5防控措施...................................................................................................................................13第二章试验研究............................................................................................................................................14试验一：仔猪腹泻的现场流行病学调查.....................................................................................................141调查的内容和方法.............................................................................................................................141.1调查范围..................................................................................................................................141.2流行特性..................................................................................................................................151.3临床表现..................................................................................................................................161.3剖解观察及病样采集..............................................................................................................161.4病理组织学观察......................................................................................................................161.5仔猪饲养管理..........................................................................................................................161.6猪群抗体水平检测..................................................................................................................161.7病原检测...................................................................................................................................162调查结果..............................................................................................................................................162.1规模化猪场猪群的情况调查..................................................................................................162.1规模化猪场猪群的情况调查..................................................................................................172.2临床症状...................................................................................................................................172.3病理剖检的观察及分析..........................................................................................................182.4病变组织的观察......................................................................................................................192.5仔猪的饲养管理......................................................................................................................202.6规模化猪场抗体水平检测及分析..........................................................................................212.7病原检测...................................................................................................................................213讨论与分析..........................................................................................................................................214小结......................................................................................................................................................22试验二：仔猪病毒性腹泻的PCR检测及序列的分析.................................................................................231材料......................................................................................................................................................241.1样品...........................................................................................................................................241.2实验仪器...................................................................................................................................24V 1.3主要试剂...................................................................................................................................242方法......................................................................................................................................................252.1病毒总RNA的提取................................................................................................................252.2反转录.......................................................................................................................................252.3引物设计与合成......................................................................................................................262.4PCR反应扩增...........................................................................................................................262.5PCR扩增产物观察及回收......................................................................................................272.6连接T载体..............................................................................................................................282.7感受态细胞的转化..................................................................................................................282.8菌液PCR验证.........................................................................................................................292.9序列测定与比对分析..............................................................................................................293结果与分析..........................................................................................................................................293.1PCR检测结果...........................................................................................................................293.2PCR结果统计...........................................................................................................................293.3PEDVORF3基因序列测定与对比分析.................................................................................303.4PEDVS基因序列测定与对比分析.........................................................................................313.5PoRVVP-6基因序列测定与对比分析..................................................................................324讨论与分析..........................................................................................................................................335小结......................................................................................................................................................34试验三致仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定及部分生物学特性研究...........................................................351材料......................................................................................................................................................361.1病料来源...................................................................................................................................361.2主要试剂...................................................................................................................................361.3主要仪器...................................................................................................................................361.4分离培养菌用培养基..............................................................................................................361.5细菌微量生化鉴定管及培养基..............................................................................................371.6药敏纸片及试验动物..............................................................................................................372方法......................................................................................................................................................372.1病料来源...................................................................................................................................372.2细菌的分离培养及纯化..........................................................................................................382.3分离株的形态学观察..............................................................................................................382.4分离株的生理生化鉴定..........................................................................................................382.5分离株的分子生物学鉴定......................................................................................................392.6分离株的药物敏感性试验......................................................................................................402.7分离株对小白鼠的致病性试验..............................................................................................413结果......................................................................................................................................................413.1病原菌分离培养特性..............................................................................................................413.2细菌形态观察结果..................................................................................................................423.3分离菌的生化特性..................................................................................................................423.4分子生物学鉴定......................................................................................................................433.5药敏试验结果..........................................................................................................................443.6分离株对小白鼠致病力试验结果..........................................................................................454讨论与分析..................................................................................................................................................465小结..............................................................................................................................................................47VI 全文总结..........................................................................................................................................................48参考文献..........................................................................................................................................................49致谢................................................................................................................................................................55作者简介..........................................................................................................................................................56石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表...............................................................................................1VII 符号说明英文缩写英文全称中文名称PEDVPorcineepidemicdiarrhea猪流行性腹泻病毒TGEVPorcinetransmissiblegastroenteritis猪传染性胃肠炎病毒RVRotavirus轮状病毒E.coliEscherichiacoli大肠杆菌RNARibonucleicacid核糖核酸VPViralstructureprotein病毒结构蛋白ETECEnterotoxigenicE.coli产肠毒素大肠杆菌EPECEnteropathogenicE.coli肠致病性大肠杆菌EHECEnterohemonhagicE.coli肠出血性大肠杆菌LTECShiga-liketoxigenicEscherichiacoli类志贺毒素大肠埃细菌UPECUropthogenicE.coli尿道致病性大肠杆菌LTHeat-labileenterotoxin热敏肠毒素STHeat-stableenterotoxin耐热肠毒素K88K88fimbriae大肠杆菌K88菌毛/F4菌毛K99K99fimbriae大肠杆菌K99菌毛/F5菌毛hhour小时minminute分钟ssecond秒mgmilligram毫克ggram克Lliter升mlmilliliter毫升r/minRoundperminute转/分钟ELISAEnzymelinkedadsorptionexperiment酶联吸附实验CSFClassicalswinefever猪瘟PRPseudorabies伪狂犬PRRSPorcinereproductiveandrespiratory猪繁殖与呼吸综合征syndromeDNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸Bpbasepair碱基对PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应EBEthidiumbromide溴化乙锭GenBankgenebank核苷酸序列基因库LBLuria-BertanimediumLB培养基EMBeosin-methylenebluemedium伊红美蓝琼脂BHIBrainHeartInfusionBroth脑心浸出液培养基VIII 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查前言仔猪腹泻指0-60日龄的仔猪因各种原因引发以腹泻为主要特征的综合症，是养殖过程中最常见且难以根治的疾病。自2010年以来仔猪腹泻在中国大范围内暴发后，许多大规模、中大规模、小规模及个体散养户的猪场中均出现了不同程度的腹泻病例。如今，仔猪腹泻因其高发病率、高死亡率的特点仍旧是各种猪场不可轻视的疾病。本病主要危害未断奶的哺乳仔猪，特别是1周龄以内的仔猪，发病率和死亡率可达70%-99%，保育仔猪的发病率和死亡率随着日龄的升高而减少，约为30%-50%，架子猪和大猪的发生率低，且腹泻程度轻，通常不用治疗即可自行治愈。据报道，当前养殖场仔猪死亡率约占猪群总死亡数的60%-70%，由腹泻造成的仔猪死亡数占20%-40%，同时，猪场发生腹泻还会导致仔猪生长发育缓慢，饲料报酬低，生产性能下降。仔猪腹泻已对养殖场造成了严重的影响，阻碍了猪产业的健康发展，给猪场带来了巨大的经济损失。2016年9月至2017年11月，新疆北部部分地区陆续有仔猪腹泻的发生，严重的猪场仔猪发病率达到80-90%，死亡率高达70%，尤其是1-7日龄的仔猪死亡率高达80%以上，据不完全统计，先后死亡仔猪3000余头。发病仔猪多为突然发病，出现严重腹泻，排水样稀粪并含有少量未消化的乳凝块，脱水明显，对死亡仔猪进行剖解，可见小肠病变严重，肠壁菲薄，呈半透明状，能看见肠内黄色的稀水样粪便，并有臌气的现象，肠系膜淋巴结肿大，胃部剪开后内充满未消化的乳凝块，并有酸臭味。发病后传播迅速，数日内便波及全群，病程很短，多数为15-18h，有时为2-3天，病死率高，对北疆部分地区的养殖场造成了极为严重的经济损失。为了查明导致北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的主要原因，本研究选择石河子、克拉玛依、伊犁和博乐地区7个近两年常发生仔猪腹泻的规模化养殖场为研究对象，首先进行现场流行病学调查，查明可能的传染来源、传播途径和发病诱因，观察其主要临床症状及病理变化，同时对猪群的免疫抗体水平进行监测；采集腹泻仔猪的小肠及其内容物共计111份，采用PCR方法检测PEDV、PoRV和TGEV三种主要病原，与商品化疫苗株和地方流行株进行同源性分析；同时采用常规微生物学方法及16SrRNA的序列分析，对细菌性病原（大肠杆菌）进行分离、鉴定、药物敏感性以及对小白鼠的感染试验。最终明确引起北疆地区养殖场仔猪腹泻的主要病原及其特性，为北疆地区仔猪腹泻的临床治疗及防控提供科学依据。1 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查第一章文献综述仔猪腹泻现已成为危害养猪业健康发展的重要疾病，其病死率高，控制难度大，可水平和垂直传播，发病的原因复杂多样，包括传染性和非传染性因素，可分为病毒性、细菌性、寄生虫性、中毒性、营养性、应激性等，病毒性腹泻的原因包括：猪流行性腹泻病毒、轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒等，以前三种较为常见，危害较重；细菌性腹泻包括：大肠杆菌埃希氏菌、沙门氏菌、猪痢疾密螺旋体等，均可引起仔猪腹泻，以大肠杆菌为主要致病菌；寄生虫性腹泻包括:附红细胞体病、弓形体病、钩虫病、球虫病等引起的腹泻；中毒性腹泻包括：真菌毒素中毒、金属中毒、亚硝酸盐中毒等引起的腹泻；营养性腹泻包括：贫血、维生素缺乏等；应激性腹泻包括：断奶应激、疫苗应激、气候突变应激等[1]。导致仔猪腹泻的主要因素以病毒和细菌感染最常见。鉴于此，本文将以病毒性腹泻和大肠杆菌性腹泻为重点进行阐述。1病毒性腹泻的研究进展1.1流行性腹泻猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的猪的一种高度接触性、传染性的肠道疾病，本病主要以水泄、呕吐和脱水为特征，可感染各年龄阶段的不同品种猪，对哺乳仔猪的危害最大，通常表现极高的发病率和死亡率[2]。1971年在英国首先发现能感染架子猪和育肥猪并使其发生急性腹泻的病毒，当时被称为“流行性病毒性腹泻（EVD）属于I型腹泻”[3]。后来在1977年的比利时和英国的一些种猪场内发现了可使各个年龄阶段的猪都暴发急性腹泻的病毒，后经查明是一种不同于传染性胃肠炎病毒的类冠状病毒，为了区别EDVI，命名为“2型EDV”，其形态很难与其他冠状病毒相区别，人工培养很难获得成功[4]。1978年英国分离到1株类冠状病毒CV777，通过猪致病性试验EDVI和2型EDV均有该病毒感染所致。1982年将该病统一命名为猪流行性腹泻，并沿用至今。在20世纪80年代我国发生所谓的传染性胃肠炎，后经上海牧医研究所和长春兽医大学等单位的研究证实，有很多即为流行性腹泻，由此表明我国在80年代就已经有PEDV存在。1.1.1病原学猪流行性腹泻（PED）的病原是猪流行性腹泻病毒（PEDV），1995年国际病毒分类委员会第六次会议将PEDV正式列为冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirius）的成员。病毒基因组为单股、正链RNA病毒，长约为28kb，包含5'帽子结构和3'ployA尾[5]。PEDV全基因组包括5'非编码区域（UTR），3'-UTR，有至少7个ORF，同时编码S结构蛋白、E结构蛋白、M结构蛋白、N结构蛋白和非结构蛋白复制酶1a、1b和ORF3，他们在基因组上依次以5'-复制酶（1a/1b）-S-ORF3-E-M-N-3'[6]。S蛋白是PEDV的纤突蛋白，是病毒粒子的重要膜蛋白之一，是主要的抗原蛋白，可诱导自然宿主体内产生抗体[7]，S蛋白还可用于确定PEDV之间的遗传相关性，并用于发2 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查展诊断化验和疫苗的研发。在PEDV中唯一的附属基因ORF3。ORF3是位于一个编码结构蛋白基因之间的附属基因，他编码一种辅助蛋白，其中数目和序列在不同的冠状病毒之中均不同，同时ORF3的产物被认为是一种离子通道，并影响病毒的产生和毒性[8]。此病毒的分离培养比较困难，我国于1982的长春兽医大学以吉林分离的毒株在胎猪肠组织原代单层细胞培养物中分离出PEDV；同年中国人民解放军农牧大学将本病毒接种与胎猪肠组织上皮细胞和胎猪小肠组织绒毛上皮细胞培养获得成功。目前还没有发现本病毒有不同的血清型。PEDV在蔗糖溶液中的浮密度为1.18g/cm3。对乙醚、氯仿和去污剂敏感，可以在4-50°C的环境中存活，当pH值在4-9的范围内可以将该病毒杀死。因此，各种酸性或碱性消毒剂都对PEDV有效。1.1.2国内外流行现状PEDV于1971年在英国首次发现，随后在欧洲的许多国家都有相关报道。20世纪80年代亚洲一些国家也出现了PEDV，日本就是首先暴发PEDV疫情的国家，随后在韩国、东南亚等相邻的国家中也相继出现了严重的疫情，使养殖场损失惨重[9]。上世纪末，PEDV在菲律宾、泰国、越南、日本、韩国、中国台湾和泰国等养猪国家呈现出地方流行性，危害越来越严重[10-12]。我国大陆也出现过大面积暴发PED的现象，导致国内十几个省市上百万头仔猪死于PEDV感染，尤其是一周龄内的仔猪，病死率可达80%-100%。2012年初李文涛等报道我国中部和南部共计12个省市的PEDV检出率高达61.1%，部分猪场的7日龄以下仔猪死亡率达到100%，既发病就死，通过序列分析，结果确定的病原为变异的PEDV感染所致[13]。随着PEDV毒株变异的出现，2013年5月，PED突然出现在美国，并迅速蔓延到整个美国地区，加拿大和墨西哥也有发生，一年期间内，仅在美国就有超过800万的新生仔猪死亡。随之下半年在韩国、日本和中国台湾爆发大规模的疫情，其中韩国最为严重，有超过40%的猪场受到影响。根据毒株的遗传进化分析显示的美国流行PEDV毒株与中国流行的毒株关系密切，尤其是2012年在中国安徽省分离的AH2012毒株。PEDV现已成为世界上具有毁灭性的病毒性传染病之一，给全球养猪行业造成了巨大的经济损失。1.1.3临床症状及病理变化PEDV常以突然爆发性形式感染生猪导致其腹泻的发生，此病毒能够感染所有年龄段的猪，但仔猪因其个体小、免疫力低更容易发病和死亡，大猪通常为隐性感染。腹泻猪常在进食或吃乳后发生呕吐，伴有食欲减退或厌食的症状，体温升高，精神沉郁，眼窝下陷，行走蹒跚，其粪便呈稀水样，为灰色或灰黄色，可顺着肛门流出，沾污臀部。日龄不同的病猪在临床症状上也有差异，日龄越小症状越明显，一周龄内仔猪常在腹泻后1-2天内因严重脱水和电解质失衡导致死亡[14]，死亡率可高达100%；而断奶猪、育肥猪常呈现萎靡、厌食和持续一周的腹泻，随后逐渐恢复正常，但少数恢复后发育不良、生长缓慢，死亡率很低为1%-3%[15]；成年大猪症状较轻，有些仅仅表现呕吐，严重的水样腹泻3-4d即可自愈。粪便中的PEDV在48h内能检测到，可在环境中持续存在4周。PEDV可能会影响生猪的生长性能，尤其对于母猪，可能没有明显腹泻现象的发生，3 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查但是它会经常表现出抑郁症状和厌食症，如果分娩母猪因此发生流产的情况，过后还会出现生殖障碍，包括乳泌素或延迟发情对猪场造成一定的经济损失。PEDV的主要病变在胃肠道，其特点是胃内充满了未完全消化的乳凝块，胃底粘膜充血、出血。肠壁菲薄，没有弹性，肠管内臌气呈半透明状，可以看见肠内稀黄色液体。肠系膜充血，淋巴结肿胀，PEDV感染仔猪的组织学特征包括：小肠绒毛变短、脱落和萎缩，肠绒毛会减少到原来长度的三分之二或更多，这根据感染或疾病的不同程度而改变[16]，同时可见小肠绒毛细胞的空泡形成，肠上皮变性明显。超微结构的变化主要发生在肠细胞的胞浆，可见细胞器减少，产生电子半透明区，微绒毛终末网消失，细胞变得扁平。1.1.4致病机理与鉴别诊断PEDV感染猪只大部分是通过直接或间接的粪-口鼻途径，小肠是此病毒的靶器官，病毒主要存在于肠绒毛上皮和肠系膜淋巴结，随粪便排出后，污染周围环境和车辆(运送猪、肥料、或食物)、衣帽、用具或野生动物和鸟类等散播感染健康猪只。其他受污染的污染源，如猪奶、饲料、食品、食品添加剂或食品添加剂，包括喷雾干燥的猪血浆，都可能是病毒的潜在来源[17]。猪只感染PEDV时，PEDV会在小肠的绒毛上皮细胞的细胞质中进行复制，破坏靶细胞，导致大量细胞坏死或凋亡。这些过程导致绒毛萎缩和空泡，以及酶活性显著降低。这一过程中断了小肠对营养和电解质的消化和吸收，从而导致了因吸收不良而发生的水样腹泻，严重时可导致仔猪因脱水而致命。在感染了PEDV后，疾病严重程度和死亡率高低与日龄的长短有着密切关系，日龄越短疾病越严重死亡率越高。虽然PEDV感染断奶仔猪与新生仔猪相比，后者更为严重的原因尚不清楚，但新生儿仔猪猪肠上皮细胞再生速度较慢可能是一个重要因素[18]。冠状病毒属的PEDV都是包膜病毒，它们对环境或化学刺激的抵抗力较低。因此，PEDV的稳定性确实是有限的，而且病毒无法抵抗来自粪便中存在的蛋白酶的损伤。因此，如果临床病例的中采集的腹泻病料没有得到适当保存（极端低温的条件），会使该病毒失去其传染性。最近的一项研究表明，断奶仔猪所需的成功感染病毒剂量是哺乳仔猪成功感染病毒剂量的1000倍，机理尚不明确。在PEDV暴发后的猪场，一段时间内可能不会再有PEDV感染猪只的使其发病，但是，如果由于卫生管理不善（例如，消毒不彻底和尸体处理不严格等）没有做到让猪群全进全出，或在病毒传播期间强行断奶，会导致轻度的断奶后腹泻，但死亡率非常低。如果母猪接种疫苗免疫失败、无乳或有乳腺炎等泌乳性能缺陷，新生仔猪无法获得足够的母源抗体的这种流行状态下，病毒可能会在猪场中重蹈覆辙，这是疫情暴发导致大量猪死亡的潜在风险[19]。这种流行的状况并不局限于亚洲国家，它们可能同样存在于欧洲国家。本病可以通过对患病动物的临床症状和病理变化可初步做出判断，但因其与TGE的病理特征相似性高，故很难对两病进行区分。通常借助实验室诊断技术来检测PED，常用的方法有RT-PCR方法、酶联免疫吸附试验和胶体金技术等。其中RT-PCR是以RNA的反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式反应，该反应的精准性，特异性，敏感4 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查性都很高，由于此方法需要精密的仪器以及严格的实验操作，因此具有一定的局限性，不适合临床的快速诊断；酶联免疫吸附试验是血清学检测技术的一种，因其具备良好的特异性、敏感性，在实验室中的应用比较广泛，同时对临床上大批量样品的检测提供了重要的参考；胶体金技术现已发展为一种成熟的临床快速检测的新方法，有着快速、经济、准确的检测优势，被广泛应用于临床的快速诊断中。1.1.5防控现状目前还没有有效措施阻止PEDV的暴发。严格的生物安全是预防和控制急性PED暴发的最重要措施之一，在原则上阻止PEDV进入养猪场(肥育和繁育场)，尽量减少不必要的物品或无关人员进入。为了做到这一点，消毒必须彻底，将污染物合理科学的处理。PEDV在大多数病毒消灭剂中没有被完全杀死，通过RT-PCR仍可检测到PEDV的RNA。因此，我们需在不同的条件下进行消毒剂的评估，特别是在冬季，以便选择合适的消毒剂成分和适当的消毒程序进行消毒。其他的生物安全措施包括：不要将外来物品带入场内，限制人与人之间的接触。接种疫苗是控制和消灭在流行病的基本工具。因此，为了跟好的控制PEDV的传播，有必要对断奶仔猪进行疫苗主动免疫。在猪场严格的规章制度下，那么它们将有望成为预防或控制PED的实用工具[20]。最后，我们应该使疫苗、生物安全规程和管理联合应用，以达到预防和控制PED的目的。这需要研究人员、兽医、生产者、养猪业专家、生产者协会和有关部门的一致努力，以达到必要措施的有效实施。1.2传染性胃肠炎1.2.1病原学猪传染性胃肠炎（Porcinetransmissiblegastroenteritis，TGEV）属于尼多病毒目（Nidovirales），冠状病毒科（Coronavirus）、冠状病毒属（Coronavirus），为冠状病毒I群，该群还包括人冠状病毒229E（Humancoronavirus229E，CoV-229E），冠状病毒NL63（HumanCoronavirusNL63，L），冠状病毒（Felinecoronavirus，eCoV），冠状病毒（Caninecoronavirus，CV）[21]。通过电镜观察发现TGEV病毒粒子呈椭圆形，边形等不规则形状，形态与其他冠状病毒相似，病毒囊膜是由双层脂质层而构成。与膜相关的结构蛋白是纤突蛋白（S）、小膜蛋白（sM）、膜蛋白（M）这3种蛋白均镶嵌在囊膜脂质双层中（图1）[22]。这三种结构蛋白的分布排列情况是：S纤突糖蛋白，在囊膜的外膜上，形似花瓣状，有长度约在12-25nm的纤突，覆盖在病毒表面，所占比例较高；M蛋白为膜糖蛋白，能够贯穿脂质的双层，数量较多；而sM为镶嵌在囊膜中的小包膜蛋白，其数量较S、M蛋白相比要少的多[23]。在对病毒粒子进行复染后电镜观察时，内部成透明状，外部有深色的日冕状冠状结构，因此又称日冕病毒。5 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查图1TGEV模型图Fig1TGEVmodeldiagramTGEV的复制繁殖场所可在猪体内，也可以细胞系上。目前发现该病毒较为敏感的细胞系有以下几种：猪甲状腺细胞、唾液腺细胞、猪睾丸细胞、胎猪和仔猪肾细胞。实验室常用到的繁殖TGEV细胞系为ST与PK15这两种。近期研究发现冠状病毒复制的一个标志就是TGEV感染这两种细胞系会引起DMVs（doublemembranevesicles）的形成[24]。冠状病毒在全球各地都普遍存在，多种动物对其均易感染，一些冠状病毒可导致人和动物的死亡，甚至有些人感染的冠状病毒来源于动物源性冠状病毒，因此研究学者对冠状病毒高度关注并非常重视，冠状病毒的TGEV在动物传染病防控中的地位也就十分重要。该病毒的理化特性为：TGEV不耐热，在56℃下加热45min或65℃加热10min可以被完全灭活，毒滴度也会随着温度的升高而下降。在37℃的条件下放置96h则会完全灭活。因TGEV是囊膜病毒，所以对有机溶剂比较敏感如乙醚，氯仿等[25]。毒株毒力的强弱对PH的敏感性也不一样，TGEV在pH4-8中可以保持相对稳定。病毒对光和紫外线敏感。在冷冻的情况下病毒的毒滴度比较稳定，可在-80℃的条件下保存病毒细胞培养物，在几年内病毒滴度基本不会下降。因此采集的病料，可在-80℃内进行保存，同时TGEV在胆汁内也可以稳定存在。1.2.2国内外流行现状TGEV的流行与发生情况在不同季节有明显的差异性，每年的春季和冬季是TGEV的发病高峰时期，这是与TEGV的理化特性有关，TGEV在高温状态下要比低温状态下更加敏感。TGEV的流行形式为多以下3种[26]，a.周期性流行，这种流行方式多见于病毒反复侵入已经免疫的繁育场；b.地方性流行，这方式常见于发病地和疫区，TGEV与易感猪群在猪场内可持续感染；c.呈爆发性流行，常见于没有发生过的地区，尤其是在冬季，病猪受到感染的日龄不同，临床症状也有不同，死亡率也差异较大，特别是7日龄内的仔猪死亡率最高。TGEV于1933年首次在美国发现，1946年美国Doyle和HutChings对TEGV进行6 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查了一些相关的研究分析，确定为病毒性传染病，并详细报道该病毒。随后加拿大、韩国和波兰等多个国家都报道了本病。1956年日本学者在多个地区发现存在TGEV的流行，1957年英国也报道发生本病；1994年西班牙研究人员针对1987-1989年间采集的569个猪群的血清样品进行抗体ELISA检测，发现TGEV阳性率为86.6%[27]。该病已成为一种全球流行的猪传染病。中国于1956年在广东首次报道该病，随后在中国各地区都有该病的发生和流行的有关报道，且常与PEDV和PoRV发生混合感染，近年来这种流行趋势不断加剧。我国从1973年起开始进行TGEV病毒的分离工作，其中分离的TGEV华毒株和TH-98毒株具有一定的代表性，国外的代表株有美国的Miller和Purdue，韩国的HK12，英国的FS772/70等。特别是进入21世纪以来，伴随着生猪养殖业的快速发展，腹泻病的大面积爆发，我国大部分省市都有本病的发生，对于TGEV的报道也越来越多。李龙在2010年冬季对仔猪病毒性腹泄的流行情况的调查中发现，TGEV为引起仔猪流行性腹泻的主要病因之一；郭容利等研究发现，2011年10月-2013年2月江苏省及周围地区养猪场腹泻仔猪的154份病料中，TGEV的阳性率检出率为80.4%；曹玉琴等对2012-2014年间采自四川省的135份临床样品进行实验室检测，TGEV的阳性率为96%[27]。根据OIE的统计，2005年-2011年我国有29个省，市出现过该病，其中以湖南，广东，湖北，贵州等地为典型，2011年感染TGE数达到36.6万头之多，造成了我国养猪业巨大的经济损失，被《国际动物卫生法典》中被列B类传染病。1.2.3临床症状及病理变化猪传染性胃肠炎（TGE）是一种肠道传染性疾病，其特点为急性和高度的接触性，在临床上主要以腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为特征。各个阶段猪均易感，以哺乳仔猪症状最为显著，该病潜伏期一般为1-8h，发病突然，常在感染后16-24h出现呕吐症状，随后发生持续性腹泻，粪便呈黄绿色或灰白色，部分粪便其中还会夹杂未消化完全的凝乳块并伴有恶臭的水样腹泻[28]。病猪会出现脱水，消瘦导致体内血液酸碱平衡混乱，发病后2-5d衰竭死亡，即便仔猪耐过后，也会出现发育不良，僵猪等现象。母猪临床上感染常表现为脱水，不吃以及断乳等症状，哺乳母猪常与患病仔猪接触，可能会导致病情多次反复，一般不会死亡，偶尔会有流产现象。TEGV感染后死亡的病猪，通过病理剖检观察：猪只胃中充满了没有消化的黄绿色或乳白色的凝乳块，胃底黏膜观察可见明显的充血和出血，剖开小肠主要病变见于肠绒毛出现明显的萎缩，主要是病毒在小肠上皮细胞上增值而导致。肠壁菲薄呈透明状态同时失去弹性，肠管有不同程度的扩张，肠内留存有黄绿色粘稠液体[29]。肠系膜有充血现像出现，肠系膜淋巴结发生肿胀，病理组织学观察：肠上皮细胞大量脱落坏死，肠绒毛变短，正常绒毛长度与隐窝深度降至3:1远小于正常，可以进一步证实小肠绒毛发生了严重萎缩。绒毛的萎缩情况也会受到猪群免疫情况，免疫情况较好，萎绒毛萎缩情况就越轻，其主要发生在回肠和非空肠段内。外周淋巴结发生肿胀增大，偶尔会发生肾囊下出血现象，胃部有出血现象等。1.2.4发病机理及鉴别诊断7 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查TGEV感染经口鼻进入易感猪体内后，病毒颗粒在鼻粘膜和肺中进行繁殖，随后进入猪的消化道和血液循环，由于病毒具有可以抵抗蛋白水解酶和PH值的特性，能够保护自身的感染性及活性，后经胰酶和胃酸的作用，到达对TGEV最敏感的小肠粘膜上皮细胞上，在胞浆中进行大量的复制繁殖[31]。从而导致肠绒毛上皮细胞遭到病毒侵害坏死脱落，肠绒毛缩短，萎缩，使其酶生成能力及肠道吸收功能受到抑制，乳糖和蛋白质不能分解及有效成分不能被充分有效的吸收，使机体出现消化吸收不良的症状[32]。乳糖等物质在肠腔内没有消化分解存在过多，造成肠内渗透压上升，组织水分大量进入肠道，从而导致腹泻成水样，部分猪体内会出现高血钾和代谢性酸中毒，使得心，肾衰竭，最终导致死亡。传染性胃肠炎病毒（TGEV）是一种以高发病率和腹泻为特征的疾病，7日龄内的哺乳仔猪病死率较高。TGEV感染的猪大部分会受到与其他病毒和细菌的混合和继发感染，所以不能简单的根据经验和临床症状来诊断该病，因此TGEV的诊断方法可使用RT-PCR方法、酶联免疫吸附试验和胶体金技术，同时还可结合病毒的分离培养鉴定，电镜观察病毒的形态，来进行确诊此病[30]。1.2.5防控现状最近这几年来，TGE发病率一直在持续增高，许多国家都在流行，在国内也是经常发生，猪是唯一的易感宿主，所有猪群均能感染发病，其传染途径复杂多样，且容易与其他疾病造成混合感染，表现出高死亡率，特别是7日龄以内的仔猪死亡率最高，极大的制约了养猪业的健康发展。该病目前治疗方式都没有取得很好的效果，准确的诊断和科学有效的预防，是当前有效降低仔猪死亡率，减少不必要经济损失的方式。TGEV的预防，首先是加强饲养管理，日常的防疫制度需严格执行，时常注意猪群的情况变化，强化引种管理制度，禁止从疫区引种[33]。此病冬春季流行季节，禁止引进带毒猪，严格消毒管理，避免间接传播感染此病。此病常年流行的地区，常通过以下几点，来预防控制该病的发生。第一接种防疫疫苗是当前最未有效的预防方式[34]，目前市场上使用的猪传染性胃肠炎疫苗有基因工程苗和常规疫苗这两大类，其中常规疫苗包括弱毒疫苗及组织灭活苗，基因工程苗等。妊娠母猪在产前40d产后20d，用猪传流二联苗进行接种，肌肉注射各1次，能有效提升母源抗体水平，仔猪通过吮吸哺乳获得被动免疫能力，达到有效保护易感仔猪群的目的，第二改善管理模式，严格全进全出，不在疫区引进种猪，加强猪群的饲喂管理，饲喂用料必须均衡营养、新鲜，避免变质和腐败。另外，依据日龄阶段的不同，在日常饲料中添加中药保健药物，可以提高猪群抗病力，提升母猪健康度并且可以很好抵抗肠胃炎的发生。第三改善饲养管理，加强圈舍内通风，保持舍内适宜的温湿度，猪场消毒需严格执行，消毒不留死角，空圈熏蒸消毒，可有效的切断传染途径[35]。时常留意猪群动态，发现有疑似病例，需立即隔离诊治或扑杀，避免感染其他猪群。8 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查1.3轮状病毒1.3.1病原学轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠病毒科，轮状病毒属，共有A、B、C、D、E、F和G77个群，在动物发生腹泻中以A群最常见，感染猪的RV有A群、B群、C群和E群。其中A群为典型RV，其他则称为非典型RV[36]。轮状病毒在电镜下略呈球形，无囊膜，直径65-75nm，有三层衣壳，面体对称，形状像车轮而得名。病毒核心是由11个不连续节段的双链RNA组成。每一片段分别编码一种蛋白，共有6种结构蛋白（Viralstructureprotein，简称VP）即VP1-VP4，VP6和VP7。VP1-VP3为芯髓蛋白，由VP4和VP7组成病毒的外衣壳，VP6组成外层及中层衣壳。VP4在病毒侵入组织细胞的过程中起到重要作用，VP4由胰蛋白酶裂解产生VP5和VP8，跟病毒黏附、聚集有着密切的关系，能够提高病毒感染性。轮状病毒基因含有11个RNA节段，核苷酸序列经常转移，重组等使轮状病毒具有变异性和多样性的特点，使得不同轮状病毒之间免疫交叉性很差。轮状病毒具有较强的抵抗外界环境的能力，如次氯酸盐和碘制剂等常用的消毒剂有较强抵抗力，可以耐受乙醚和氯仿等，对酸和胰蛋白酶等相对稳定[37]。在56℃下存在30min可以使其感染力下降2个对数。轮状病毒在18-20℃的粪便中存在7个月仍具有感染性，对火碱，双季胺盐类等不耐受。1.3.2国内外流行特点轮状病毒感染（Rotavirusinfection）是一种对多种幼龄动物的急性肠道传染病。每种幼龄动物都有显著的致病性在感染轮状病毒后，只要出现一次发病会导致每年的连续发生，本病的重要传染源为病畜和隐性感染动物。其主要特征为腹泻、厌食、呕吐、脱水和体重减轻[38]。猪轮状病毒于1974年Woode等在英国首次报道，随后美国、欧洲等许多国家均报道了由轮状病毒引起的仔猪腹泻，轮状病毒的迅速传播引起了众多国家学者的关注。在英国[39]哺乳仔猪的轮状病毒发病率大于80%，死亡率为10%-30%，发病会导致猪体重下降10%-20%，恢复到正常生长速度需至少半个月时间，在养殖经济上有着重大影响。波兰学者Markowska-Daniel等人对十几个大型规模化猪场的腹泻仔猪进行随机抽样，共采集了1230份血清和531份腹泻粪样，通过ELISA对轮状病毒抗体检测，其中有1214份血清轮状病毒呈阳性，粪便经抗原检测，有169份显示阳性。挑选ELISA抗原呈阳性的粪样28份用MA-104细胞系进行分毒，结果显示有18份具有CPE反应，占64.3%，电镜检查和免疫荧光显示均为阳性，有22份PAGE电泳测定为阳性，占79%。BarmanN等对印度Assam地区猪场采用间接ELISA检测随机抽检的528份血清样品，结果显示轮状病毒阳性率最高，占51.1%，高于猪流行性腹泻的21.2%与猪传染性胃肠炎的39.4%，其中血清样品中超过3种病毒抗体的约占13.6%[40]。在美国病毒性腹泻中，由轮状病毒造成的经济损失仅低于猪传染性胃肠炎，因此国外非常重视对轮状病毒的防治。1982年中国在腹泻猪粪便中检测并分离到轮状病毒，随后江苏，山东等地也有相继有报道，在流行地区由于大多猪群都己感染过而获得免疫力，多为隐性感染，并没有明9 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查显症状。该病能够导致仔猪腹泻的死亡，成年猪的不长，饲料转化率升高，大大增加了养殖成本。2002年10月程建频等在甘肃省对2100头哺乳仔猪进行调查诊断，结果显示发病仔猪1460头，发病率达69.5%。2016年冬季至2018年春季，新疆北疆部分地区规模化猪场已按疫苗程序给生产母猪在产前40天和产前20天，进行了猪传流二联疫苗的注射，还是没有阻止刚出生仔猪的大规模腹泻，经诊断检查仍有50%的猪感染流行性腹泻的现象，由轮状病毒和流行性腹泻混合感染的占20%，由轮状病毒和大肠杆菌和混合感染的占30%，英国学者研究发现，猪轮状病毒和致病性大肠埃希菌混和感染时，在致病过程中会起协同作用，危害要大于二者之和，是使得断奶仔猪重复感染的一个重要原因，给养殖户造成了巨大的经济损失。1.3.3临床症状及病理变化猪只感染病毒后一般具有1-2d的潜伏期。病猪会出现精神沉郁，食欲下降，不愿走动等现象，过几个小时后则会出现粪便呈黄绿色、灰色或糊状的水样腹泻，并混杂一些的絮状物伴随着恶臭味，哺乳仔猪哺乳完后还会发生呕吐，感染发病猪还会出现脱水严重，体重减轻等症状[41]。同时也会根据病猪的发病日龄不同，机体的免疫情况及饲养环境的好坏，所表现出症状的严重程度也不尽相同。由于缺乏母源抗体保护，常规饲养的乳猪出生前几天，感染发病后还会继发出一些大肠杆菌等病原体形成相互交叉感染的情况，使病症加重，死亡率可高达100%。如仔猪有母源性抗体的保护，则不易感染发病。3周内的乳猪感染后腹泻一般持续几天就可康复，死亡现象很少发生，3-8周龄或断奶后的仔猪，死亡率通常在10%-20%，最严重时可达50%。本病的主要病变特征位于胃与小肠。眼观：胃壁迟缓，扩张，胃内充满大量黄色乳凝样块，棕黄色乳汁和胃肠黏膜充血。因胃内容物阻塞而导致肠道臌气，胃壁变薄呈半透明状；因小肠偶尔可见弥漫性出血，肠内容物则呈现灰黑色或淡红色。肠系膜淋巴结肿大，充血呈浆液性[43]。其余器官发生不同程度的变性变化。病理组织学观察：健康哺乳仔猪的肠绒毛细长，表皮细胞完整呈柱状。病猪在感染后24h，肠绒毛显著缩短、变钝，萎缩最明显的为膜皱襞顶端绒毛，表皮细胞变形为立方形或扁平状、胞浆中会有小空泡变性等变化。随着病程时间的延长，增值的立方上皮代替一些脱落的上皮，膜固有层中网状和淋巴细胞增加；48h见肠隐窝增生而变厚、伸长，168h后逐渐恢复正常。1.3.4发病机理及鉴别诊断仔猪感染猪轮状病毒后，病毒复制与繁殖的场所为小肠绒毛的上皮细胞胞浆内，在在盲肠和结肠的上皮细胞中也可进行[42]。病毒在细胞内进行大量繁殖后，会导致肠绒毛上皮细胞发生死亡和脱落，影响仔猪的消化吸收，造成肠内容物渗透压增高，离子和水分从肠腺进入肠腔，同时消化酶活性明显降低，使其在临床上症状上出现严重的水泻。同时仔猪由于损失了大量的电解质和水，导致机体发生酸中毒和脱水，是造成死亡直接的原因。本病因与TGE和PED临床症状和病变很相似，一般只能通过实验诊断进行确诊。目前，实验室诊断方法主要分为两类，即分子生物学检测和血清学检测。分子生物学检10 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查测主要包括：病毒分离培养鉴定、PCR技术和核酸杂交技术等；血清学诊断技术主要包括：免疫组织化学，酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光等。1.3.5预防措施目前对轮状病毒尚无有效的防治方法，需要依靠加强猪群的饲养管理，采取严格的全进全出制，引进猪群要确保从无感染该疾病的地区引进。饲喂同一批次的圈舍须经过全面彻底的冲圈消毒，保证母猪饲喂营养均匀丰富，提高母猪和乳猪的抗病能力，在轮状病毒高发流行的地区，让新生仔猪及时吃到初乳，获得母源抗体的保护，是降低仔猪发病数量和减轻病症的主要方法[44]。因母源抗体会随着时间的推移，使得抗体水平下降，只能防止仔猪在哺乳期间腹泻的发生，所以保持环境干净清洁，提供良好的通风及合适的温度，免疫程序科学的制定和严格的执行，定期的进行中药与微生态制剂等药物的保健，提升猪群抗病力，建立科学有效的防护屏障，是预防该病的重要措施[45]。2大肠杆菌性腹泻的研究进展2.1病原学大肠埃希菌（Escherichiacoli），又俗称大肠杆菌（colonbacillus），属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），希氏菌属（Escherichia）。属于革兰氏阴性菌，部分杆菌能够产生芽孢，大部分菌株具有微荚膜或荚膜，具有致病性的菌株外部表面会有一层具黏附性的菌毛，为一种毒力因子跟菌株的毒力有关，一些菌株具有鞭毛可进行运动，需氧兼性厌氧，可分解乳糖，发酵葡萄糖[46]。用普通营养琼脂培养基上呈顿圆型菌落，在伊红美蓝琼脂培养基上为黑色金属闪光的菌落；在麦康凯琼脂上有红色菌落出现，在SS培养基不生长或呈红色菌落。大肠埃希菌的抗原可对大肠杆菌的血清进行分群，为细胞壁中磷脂、多糖与蛋白质的复合物，又称菌体的内毒素。从化学性质上看抗原可分为多糖抗原和蛋白抗原。根据抗原产生的不同部位可分为鞭毛抗原（H）、表面抗原（K）和菌体抗原（O），是鉴定血清学的物质基础。当前已确认的H抗原有56种，K抗原有80种，O抗原有173种[47]。致病性大肠埃希菌依据菌株的毒力因子和发病机制不同可分为5类：即产类志贺毒素大肠埃细菌（Shiga-liketoxigenicEscherichiacoli，LTEC）、肠致病性大肠埃希菌（EnteropathogenicEscherichiacoli，PEC）、败血性大肠埃希菌（SepticaemicEscherichiacoli，EPEC）、产肠毒素大肠埃希菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli，TEC）、尿道致病性大肠埃希菌（UropathogenicEscherichiacoli，UPC）。当前，ETEC是在养殖场中是最为多见的致病因子，可导致幼畜腹泻以仔猪黄白痢较为多见，还可导致发育迟缓，致生产水平降低等现象，可在粪便中存活6月以上，传播方式较多，在其生长繁殖中，还会产生多种致病因子[48]，如常见的内毒素、黏附素和一些外毒素，其中黏附素包括K88、K99、987P和F41等，给仔猪腹泻的防控带来了一定的困难。2.2国内外现状在1934年McBryde首次报道了在3日龄哺乳仔猪大肠杆菌病在规模化种猪场暴发。此后全球各地的研究学者对此病进行了大量的调查研究。在美国，由大肠杆菌引起的仔猪黄白痢在10%-15%左右[49]，根据数据显示，近20年来在我国，仔猪发生黄痢超过1011 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查万头，造成经济损失达5000万元。有数据统计在我国东部地区一些规模化养殖场，仔猪黄白痢平均发病率为29.0%，死亡率则达到20.4%；1995-1997年，周应志等对甘肃省13个地区的规模化养猪场和60多家养殖户，进行大肠杆菌引起仔猪腹泻的流行病学调查，调查发现仔猪黄白痢的发病率达到49%，死亡率达16%。在贵州省的7个地区，调查发现仔猪黄白痢的发病率为54.79%，病死率为34.97%，在母猪存栏量200头以上的养殖场；在重庆市对3个规模化猪场进行调查发现，仔猪黄白痢的发病率达60%-80%，死亡率达15%-20%；2012年，研究人员对黑龙江3处具有一定规模的养猪场仔猪疾病发生情况进行调查，对其发病率和死亡率进行数据统计与分析，显示该地区仔猪黄痢发病率最高占到42.18%，而仔猪白痢的死亡率最高为46%。分析结果显示，0-60日龄仔猪发生的由大肠杆菌引起的仔猪腹泻，死亡率超过50%。目前由大肠杆菌引起的仔猪腹泻的发病日龄有往后延长的趋势。根据流行病学调查显示，每年在我国仔猪成活率下降的重要疾病之一就是由于大肠杆菌引起的仔猪黄白痢造成，给我国的养猪业带来了严重的危害和巨大的经济损失。2.3发病机理大肠杆菌是动物和人在肠道中正常存在的重要菌群，在动物出生后的几个小时就可通过呼吸道进入消化道，并在消化道的后段，进行快速地定居、繁殖、并一直伴随终生，然后又通过排泄物散播到环境当中，以此循环[50]。仔猪腹泻还一般与环境因素相关如圈舍温度较低、潮湿，消毒不及时彻底等因子，均可引发仔猪大肠杆菌性腹泻。有研究人员发现，目前由大肠杆菌性引起的猪腹泻在发病年龄、发病率上都有扩大的趋势，长达3月龄的猪同样也会发生大肠杆菌性腹泻。仔猪白痢在10-30日龄仔猪常见，粪便呈灰白色或乳白色，伴有腥臭味，发病率达80％，这与母源抗体减少，菌群失调等多种应激因素所导致。一周龄内仔猪常发生仔猪黄痢与仔猪红痢，仔猪黄痢粪便呈黄色并伴随凝乳块与气泡。研究发现引起仔猪腹泻的最主要致病性大肠杆菌为产肠毒素性大肠埃希菌（ETEC），可通过肠黏膜上皮细胞和菌毛黏附素而存在于肠道内，并产生一种或多种肠毒素，其中包括热敏肠毒素(ST)与耐热肠毒素（LT），从而导致肠细胞功能破坏，引起仔猪腹泻[51]。由ETEC引起的仔猪腹泻大约有40%，其中主要流行的血清型为：O8、020、O64等，其区域性的流行特点，给防治仔猪腹泻带来更大的挑战，同时也给养猪业的发展造成了巨大的经济损失。近期美国研究发现[52]，在没有发生仔猪腹泻的粪便中也分离出ETEC，说明当ETEC在肠道环境之下具有一定优势的时候，导致毒素的大量产生从而引起仔猪腹泻。2.4临床症状和病理变化仔猪大肠杆菌性腹泻是由致病性大肠杆菌引起的急性或慢性肠道传染病，在临床上多见于仔猪的黄白痢。仔猪黄痢（Yellowscourofnewbornpiglets），为早发性大肠埃希菌病，临床症状表现为突然发病，粪便呈黄色水样或浆糊状，并伴有凝乳块，肛门松弛红肿，电解质失衡和脱水消瘦，死亡率高。该病潜伏期短，经常在仔猪初生后12h内就可出现临床症状，12 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查几个小时内便死亡，多见于3日内的哺乳仔猪，同窝仔猪发病率可达100%，死亡率达90%。一周龄以上的哺乳仔猪发生较少。其中最要的因素是母猪携带由致病性大肠埃希菌[53]。病理剖检：主要病变在胃肠道，可见到胃鼓气扩张，胃大弯处静脉梗死，内有凝乳块，胃黏膜红肿、肠壁菲薄充血；肠道粘膜肿胀，充血，有大量黄色液状内容物，十二指肠最明显，肠系膜淋巴结有弥漫性针尖样出血等病理变化[54]。没有经过免疫的猪群首次感染发病率最高可达100%。后备母猪产的仔猪病死率要高于经产母猪。仔猪白痢（Whitescourofpiglets），为迟发性大肠埃希菌病。可在存活数周适宜的环境中，仔猪因食入致病菌而感染。常见于1-4周龄的哺乳仔猪，突然发病，排出灰白色或乳白色糊状粪便，伴有腥臭味，体温没有明显的升高，腹泻次数不等。病程多为急性或亚急性。发病时间长的仔猪出现脱水、消瘦，生长发育不良，精神不振，被毛杂乱，肛门附近及后肢常被粪便污染[55]。同窝仔猪发病率可达20%-100%，死亡率达10%-60%，根据猪场饲养条件而定，环境越差死亡率越高。本病于冬气温较低及夏季潮湿的季节多发，温度的突然变化和饲养卫生差可使发病率上升。病理剖检：病死仔猪体表苍白、消瘦，胃内有多量凝乳块，黏膜充血、出血，胃壁变薄有卡他性炎症的变化，肠系膜淋巴结发生轻微肿胀[56]。2.5防控措施目前大肠杆菌引起的仔猪腹泻给新生仔猪带来了严重的危害，造成仔猪的高发病率和死亡率，严重影响着养殖业的发展。因此防控仔猪大肠杆菌病，显的尤为重要。首先要提高猪群饲养管理的水平，坚持自繁自养，保持好的环境卫生，提供较好的饲料供应，保证营养的均衡，使母猪能够正常泌乳，保证仔猪吮乳需要。对产房实行全进全出制，保持清洁，干燥，温暖的环境，空圈后彻底清洗消毒[57]。其次加强妊娠母猪的防疫管理，在产前按疫苗程序对母猪进行接种猪传流二联疫苗及大肠埃希菌基因工程苗，仔猪出生后，可通过初乳而获得大肠埃希菌的抗体，使仔猪得到被动保护，降低仔猪的易感性；即便仔猪感染发病，也能降低仔猪发病率和死亡率，降低猪场的经济损失。最后用药物进行防治，当前由于抗生素类的药物在养殖场长期大量的滥用使得肠道内大肠杆菌容易产生耐药基因，从而导致耐药菌株不断增加。所以中药，益生菌，酵母菌等非抗生素化学药物的使用，不但能为新生仔猪提供所需的蛋白质，帮助其消化，对肠道有益菌的繁殖生长也有帮助，还可抑制病原菌株的繁殖及提高新生仔猪机体抗病力和免疫力，降低发病率和死亡率[58]。也是目前养殖经常采用的防治方法。在治疗病猪前，应先通过药敏试验，挑选出敏感性的抗生素，减缓猪群耐药性的产生，采用交叉用药的方法，这样不仅可以很好的把药物作用发挥出来，也可减少耐药菌株的产生，从而达到好的预防和治疗效果。13 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查第二章试验研究试验一：仔猪腹泻的现场流行病学调查摘要：为了查明北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的现场流行病学特征，本试验采用现场流行病学调查的方法，选择石河子、克拉玛依、伊犁和博乐地区7个近两年常发生仔猪腹泻的规模化养殖场为研究对象，查明仔猪腹泻的可能传染来源、传播途径和发病诱因，观察其主要临床症状及病理变化，同时对猪群的免疫抗体水平进行监测。结果表明，仔猪腹泻主要发生在冬春两季、夏季较少发生；仔猪腹泻的发生及传播速度快；其传播途径包括同窝之间的水平传播和母子之间的垂直传播两种方式；发病日龄以30日龄以内的仔猪为主，其中1周龄以内的仔猪所占比例最高，且发病率及死亡率最高可达80%-90%；发病仔猪以水样腹泻症状为主并伴有呕吐、脱水、消瘦等症状；病理剖检可见肠壁菲薄、呈半透明状、胃部充满未消化的乳凝块、空肠回场内充满稀黄色液体并可见部分出现臌气；病理切片观察可见肠绒毛断裂、粗短、脱落，肝脏肿胀，肝小叶不明显，脾脏红细胞增多，可见淋巴细胞空泡变性，淋巴结有嗜酸性粒细胞；发病诱因方面，包括猪舍环境差、通风不良、圈舍湿度大等，以及猪群猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征等免疫抗体水平层次不齐、离散度大等。关键词：现场流行病学调查；流性特征；病理变化；发病诱因仔猪腹泻通常指的是从出生到60日龄左右的仔猪，因各种原因导致的以急性腹泻、脱水为特征的疾病，因病因复杂，控制难度大，故常使仔猪生长缓慢、体质下降、抵抗力降低、高发病率和死亡率等危害[59-60]。据吴文福等调查研究，我国部分猪场仔猪腹泻率高达59%以上，死亡率为20%左右[61]。目前，病毒性腹泻和细菌性腹泻是引起仔猪腹泻造成重大经济损失的主要病原。病毒性病原引起仔猪腹泻的主要有猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒等；细菌性病菌有大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、肠球菌等[62]，近年来混合性感染、协同作用更是加剧了腹泻的发生，给养猪产业的造成了巨大的危害，因此，在发病地区进行流行病学调查分析，以建立有效的仔猪腹泻综合防控措施，降低疾病的风险损失，对推进北疆垦区的生猪科学饲养管理，促进生猪产业持续发展有着十分重要意义。2016年9月至2017年11月期间，北疆区域部分规模化猪场有发生较多仔猪腹泻的情况，主要症状为拉稀粪、精神差、有些脱水严重、体弱消瘦、发育迟缓以及生长缓慢，发病后传播速度快，越小的仔猪死亡率越高，大部分仔猪发病的日龄在0-60日龄。为了更加详细的调查此阶段发病的流行特点，本试验进行了以下调查。1调查的内容和方法1.1调查范围2016年9月至2017年11月期间，对北疆部分地区7个规模化猪场进行调查，调查14 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查范围包括：石河子142团、145团、148团、146团，克拉玛依白碱滩，伊犁70团和博乐89团。每个区域选取一个腹泻严重的规模化猪场作为调查对象，并对每个猪场的猪群情况进行统计，见表1-1，图1-1。表1-1调查规模化养殖场的猪群状况统计Tab1-1statisticsofpigpopulationinlarge-scalefarms猪场坐标母猪存栏数哺乳母猪数仔猪总数142团10981602000145团29863667148团478811000146团22249250白碱滩645108133370团2563633589团8291461680合计38266437265备注：表中的数字均为调查当时的猪场数据。图1-1北疆地区仔猪腹泻采样分布图Fig.1-1diarrheasamplingdistributionofpigletsinnorthernxinjiang.1.2流行特性对规模化猪场进行现场调查并与场内饲养人员、兽医等详细交流发病情况，主要从以下几个方面进行，包括：发病季节性、传染源、传播途径、易感猪群、发病率、死亡15 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查率、用药情况和疫苗免疫情况。并做好记录，以便分析结果。1.3临床表现查看发病仔猪的主要症状，包括仔猪的精神情况，量取仔猪的体温，对摄食情况，拉稀程度，粪便的稀稠、色泽、是否有粘液等进行仔细的观察及询问，并仔细询问发病后使用药物治疗的情况并做好记录。1.3剖解观察及病样采集对有腹泻程度严重且濒临死亡的仔猪进行剖检，观察腹泻情况，对肠道，胃，脾脏，肝脏，淋巴结等病变情况进行观察和记录。将各个场内腹泻仔猪的粪便、肝脏、脾脏、肾脏和肠道及其内容物等进行无菌采集，妥善保存，并做好详细记录。1.4病理组织学观察无菌操作取腹泻仔猪的小肠、肝脏和脾脏组织完全浸泡在10%的福尔马林溶液中，送至石河子大学医学院做石蜡切片。1.5仔猪饲养管理分别与这些规模化猪场的场主、饲养人员、兽医等工作人员进行沟通，了解仔猪猪舍的具体情况，主要包括猪圈的空气状况，圈里的温度、潮湿程度、各个年龄段的仔猪的饲喂情况，发病的仔猪是否隔离饲喂等，并做好详细的记录。1.6猪群抗体水平检测根据相关研究发现[63]，除主要致仔猪腹泻的病原外，PRRSV、PRV、CSFV等在一定程度上也可引起仔猪发生腹泻，虽不会伴有严重的腹泻症状，但是，为了对北疆地区部分规模化猪场仔猪腹泻的状况进行全面的调查，试验使用北京爱德士元亨生物科技有限公司产品猪伪狂犬病病毒gpI（gE）抗体检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒和猪瘟病毒抗体检测试剂盒的方法开展流行病学调查。对7个规模化猪场按照每个猪场各种类型猪总数量10%的比例分别抽取后备母猪全血、哺乳母猪全血、妊娠母猪全血、哺乳仔猪全血和保育仔猪全血（采血时间为每个猪场发生大量仔猪腹泻的阶段），登记并编号，常温静置3-5h，待血清析出后，小心吸取约400μL的血清转入1.5mL离心管中，置于冰柜中保存。试验按照CSF、PR和PRRS的使用说明书要求进行操作。结果判定：CSF：当阻断率≥40%为阳性，阻断率＜30%为阴性；PRRS：当抗体值≥0.4为阳性，抗体值＜0.4为阴性；PR（gE）：当抗体值≥0.7为阴性，抗体值＜0.6为阳性。1.7病原检测将采集回来的一部分粪便及其组织进行细菌的培养鉴定，一部分进行核酸的提取以便使用PCR仪对病样进行RT-PCR的检测。详见（试验二、试验三）2调查结果2.1规模化猪场猪群的情况调查陆续发病的7个规模化猪场在从北疆区域地图中看，所在位置是相互毗邻的，根据试验二和试验三的结果推测，这些猪场可能存在互相感染，感染的病原相似，发病程度16 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查相当。对各个猪场的猪群数进行统计，结合表2-1各猪场的发病情况，可以发现大型规模化猪场的猪只数虽多但总体发病率和死亡率却低于中小型规模的猪场，这与猪场的设备，饲喂条件是分不开的。2.1规模化猪场猪群的情况调查通过询问、查阅养殖档案等方法对这些规模化猪场的调查结果显示，北疆地区仔猪腹泻病一年四季均有发病，但冬春季节多发，主要集中在年前12月份及年后4月份；引发猪场发生腹泻的可能传染源包括粪便、饲料、水源、猪奶、衣帽、用具、运输货物的车辆、来往的人员、给猪的食品添加剂、野生动物、鸟类等；腹泻的传播途径为猪只间的相互传染和母子之间的水平传播；腹泻能感染所有年龄段的猪只，但仔猪因其个体小、免疫力低更容易发病和死亡，场内的大猪通常为隐性感染，仔猪的发病日龄主要集中在30龄内，表现出高发病率和死亡率，尤其是7日龄内的仔猪，死亡率高达80%-90%，而断奶猪、育肥猪常呈现萎靡、厌食和持续一周的腹泻，随后逐渐恢复正常，死亡率很低为1%-3%，成年大猪症状较轻，有些仅仅表现呕吐，严重的水样腹泻3-4d即可自愈；发病期间，部分猪场进行紧急免疫接种，主要接种腹泻二联苗，但仍未能减少死亡率；腹泻病在猪场内一旦发生，会迅速蔓延，整体发病率达到了47.7%，死亡率达到55%。具体数据详见表2-1：表2-12016年9月-2017年11月期间发病猪群的统计及分析Tab2-1Statisticalanalysisofduringtheperiodfrom规模化猪场名称场内总仔猪数发病数死亡数发病率死亡率（份）（份）（份）（%）（%）石河子142团200086032643.037.9石河子145团66745335467.978.1石河子148团100045026045.057.7石河子146团25020015280.061.0克拉玛依白碱滩133353327139.950.8伊犁70团33525119574.977.6博乐89团168071635042.648.8合计72653463190847.755.02.2临床症状发病仔猪常常表现为精神沉郁，不愿走动、食欲减退或废绝、被毛杂乱、行走蹒跚、拉稀黄色或灰色水样粪便、有些粪便会有腥臭味，粪便可顺着肛门流出，沾满臀部，体温升高，消瘦严重、部分脱水情况明显等症状，病程在2-4天左右死亡，且发病猪数量增加快，发病猪死亡率高，见图2-1，2-2。17 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查图2-1死亡的仔猪图2-2仔猪腹泻物Fig2-1pigletsdiedFig2-2diarrhoeainpiglets2.3病理剖检的观察及分析对濒临死亡的仔猪进行剖检，发现小肠有鼓气，且肠壁菲薄，半透明，里面充满黄色粘液，且胃、肠道中充满未消化的乳凝块（图2-3、图2-4、图2-5）；肠系膜淋巴结肿胀明显（图2-6）；脾脏稍有萎缩（图2-7）；肾脏表明上面有出血点，表膜不易剥离，有黏连（图2-8）；图2-3腹泻仔猪腹腔图图2-4胃内充满乳凝块Figure2-2abdominalcavitymapofdiarrheaFig2-6fullofmilkclotinthestomach18 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查图2-5腹泻仔猪肠道菲薄、半透明状图图2-6肠系膜淋巴结肿大Fig2-1diarrheapigletswerethinandtranslucentFig2-8mesentericlymphnodeenlargement图2-7脾脏缩小图2-8肾有出血点Fig2-5mesentericlymphnodeenlargementFig2-4ahemorrhagicpointinthekidney2.4病变组织的观察将临床采集的典型发病猪的空肠、脾脏、肝脏和淋巴结分别制作病例切片并观察各组织器官的病理变化：十二指肠肠部分肠绒毛断裂、萎缩甚至脱落，肠绒毛上皮细胞轻微空泡变性（图A）；空肠绒毛上皮细胞核溶解、萎缩、破裂，淋巴细胞浸润，粘膜上皮细胞空泡变性（图B）；肝脏充血，有含胆黄素沉积，肝小叶结构不明显（图C）；肝细胞肿胀、核溶解、坏死，可见有淋巴细胞浸润（图D）；脾脏红细胞增多，见淋巴细胞空泡变性多（图E）；淋巴结中见嗜酸性粒细胞较多（图F）。19 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查图A仔猪十二指肠（H.E.100×）图B仔猪空肠（H.E.400×）FigAPigletduodenum(H.E.100×)FigBPigletjejunum(H.E.400×)图C仔猪肝脏（H.E.100×）图D仔猪肝脏（H.E.400×）FiCPigletliver(H.E.100×)FigDPigletliver(H.E.400×)图E仔猪脾脏（H.E.100×）图F仔猪淋巴结（H.E.100×）FigureEPigletspleen(H.E.100×)FigureFPigletlymphnode(H.E.100×)2.5仔猪的饲养管理发病猪场的仔猪圈舍的饲养密度过大，空气质量较差，粪便冲洗不及时，以至部分20 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查猪场内仔猪腿部、肚皮和臀部沾满污垢，圈舍内通风不佳，湿度较大，温度在10℃-15℃左右。尤其在冬春两季，由于北疆地区温度很低，圈舍内采用地暖、火炉等取暖设施，为了保证猪圈温度且不浪费热源，一般将猪圈的门窗封严实，舍内不通风，但易滋生细菌和病毒。同时这些养殖场的防疫、消毒、没有一定的规章制度，使病原互相感染和传播的几率增大。2.6规模化猪场抗体水平检测及分析对7个规模化猪场的抗体CSF、PR（gE）和PRRS等进行检测，在7个采样猪场中CSF、PR（gE）和PRRS的商品疫苗均在使用，结果显示，7个猪场中CSF抗体的阳性率均在90%以上，说明猪场CSF免疫效果较为理想；7个猪场中PR（gE）抗体的阳性率差异较大，表明当前部分养殖场伪狂犬野毒感染压力较大；7个猪场中PRRS抗体的阳性率在均在80%以上，但S/P平均值超过2.5的较多，表明有野毒感染的可能性较大。详见表2-3：表2-3猪群检测结果统计表Table2-3statisticaltableoftestresultsforpigsCSFPR（gE）PRRS猪场名称样品数阳性数阳性率平均值阳性数阳性率阳性数阳性率平均值（份）（份）（%）（%）（份）（%）（份）（%）（S/P）石河子142团15014093.3189.56106.6713086.661.25石河子145团605591.6256.634066.645083.372.82石河子148团1009494.0575.263030.019090.011.83石河子146团605490.0971.6558.335591.792.96白碱滩12011091.6380.269680.0410688.321.95伊犁70团403895.0760.292562.523587.553.38博乐89团15014294.7286.214731.3614294.691.672.7病原检测经实验室检测发现腹泻仔猪测出猪流行性腹泻和猪轮状病毒的阳性，同时细菌检测发现病样有大肠杆菌的感染。结果详见试验二和试验三。3讨论与分析仔猪腹泻病较其他猪病来说发生的几率较高，并且造成仔猪腹泻的原因复杂，主要有病毒性原因、细菌性原因、寄生虫性原因以及饲养环境因素、应激因素、营养因素等[64-65]。通过本次对北疆部分地区7规模化猪场仔猪腹泻病的流行病学调查显示，此次发病具有一定的区域性，在地理位置上是互相关联的，时间上没有先后顺序；而不稳定的气温和潮湿的环境为病毒和细菌的传播提供了有利的条件，不规范的饲养管理方式为发病营造了良机，同时仔猪发病的严重情况与养殖场规模也有一定关系，规模大、养殖设施标准高、饲养管理水平高的养殖场，其仔猪腹泻病的发生几率较低，低于环境较差的21 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查养殖场，例如石河子142团的某规模化猪场（属于半机械化的大猪场），发病率和死亡均为40%左右，低于发病率和死亡率在70%左右的石河子145团某规模化养殖场（主要靠人力喂养的猪场）。杨井坤[66]等对双城市仔猪腹泻流行病学的调查结果表明，仔猪腹泻的发病情况与养殖规模的大小相关，这与本次调查结果相似。调查结果显示，北疆部分地区规模化养殖场一年四季均有仔猪腹泻的发生，发病高峰期在冬季或冬春交替之时，主要集中在年前12月份及年后3月份。毛黎红[67]等对贵州省部分地区发现仔猪腹泻多发生在冬春两季，这与我们此次调查相似。朱良强[68]等对安徽部分地区冬春季仔猪腹泻的流行病学调查与分析表明仔猪腹泻是寒冷季节的高发病，主要集中在12月到次年1和2月，且存在大肠杆菌混合感染，也与本次调查相一致。本病对哺乳仔猪最易感染，尤其是0-7日龄内的仔猪，其发生腹泻的几率和死亡率很高，达80%以上，治愈率几乎为零，30日龄以后的仔猪发生腹泻后，死亡率较低，一般很少死亡，治愈率较高在80%左右，这与其抵抗病毒的能力、免疫力等也有关系。调查结果与其他地区[69]报道的腹泻可以发生在哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各个年龄段上，尤其是哺乳仔猪的发病率和死亡率最为严重相一致。调查发现通过对各个猪场CSF、PR（gE）和PRRS抗体水平的评价，结果表明抗体的免疫效果不理想，这在一定程度上也可引发仔猪发生腹泻，但不会伴有严重的腹泻症状。王伟等对贵州省仔猪腹泻的流行病学调查的结果分析表明猪繁殖与呼吸综合证病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒在一定程度上可引起仔猪腹泻，这与本次调查结果相近。因此，在临床防控上，不仅需要针对病原菌及病原体进行防控，还需要重视养殖场中与腹泻相关的其他疾病的检测工作。4小结通过本次调查，减少仔猪发病的诱导因素，要在发病高峰期的春冬季节尽量改善仔猪的饲养条件，保证温度的同时注意通风，减少仔猪的各种应激反应，稳定猪群的抗体水平。同时加强母猪的饲养管理，保证营养均衡，维生素、微量元素和矿物质不能缺乏，对于要分娩的母猪注意做好相关疾病的疫苗免疫程序，以增加乳汁中的母源抗体的量，保证高质量的乳汁，增强仔猪抵抗病原的能力，减少仔猪肠道疾病的发生，降低腹泻的几率。22 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查试验二：仔猪病毒性腹泻的RT-PCR检测及序列的分析摘要：为了查明引起北疆7个规模化猪场仔猪腹泻的主要病原，本试验设计PEDVORF3基因及S基因、TGEV的S基因和PoRV的VP-6基因序列的扩增引物；无菌采集腹泻仔猪的粪便、小肠及其内容物；提取核酸；采用RT-PCR方法扩增PEDV、TGEV和PoRV基因序列，对阳性产物进行克隆测序，选择国内流行毒株及商品化疫苗毒株序列，构建系统进化树，进行同源性比对。结果显示，7个规模化猪场的111份病样中，PEDV的阳性率占67.5%（75/111），PoRV的阳性率占10.8%（19/111），并没有检测出TGEV；同源性分析及系统进化关系显示，7株PEDV阳性样品的ORF3基因的相似性为95%-99%之间，其中与疫苗株JX188454.1AJ1102的进化关系较近，与疫苗株GU372744.1Cv777和疫苗株JX002703.1ZJ08的关系较远；7株PEDV阳性样品的S基因的相似性为94-99%之间，其中与中国疫苗株JN599150.1CV777（S）的遗传距离较大，亲缘关系较远，而与流行毒株KY496315.1CHhubei2016和MG334003.1YnP2的距离差异稍小，亲缘关系较近；7株PoRV阳性样品的VP-6基因的同源性为为92-98%之间，与参考株L29186.14S（猪源）的相似性较低，在92%左右，在进化距离上较远，亲缘关系较近，与参考株JN034041.12010/WH-a（野猪源）的相似性较高，有较近的亲缘关系。关键词：猪流行性腹泻、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎、序列分析猪流行性腹泻病毒（PEDV）是单链RNA病毒，为冠状病毒科，冠状病毒属[70-71]。是由PEDV引起猪的一种常见病毒性肠炎。与该病的名称一致，腹泻是PED的主要症状，还伴有呕吐、厌食、脱水和体重减轻等各种临床症状[72]。PEDV可以感染任何年龄的猪，从仔猪到母猪，然而猪发病的严重程度取决于不同的日龄。危害最大的是7日龄左右的仔猪，死亡率高达80-100%。猪腹泻病毒在1971年的英国首次发现，随后PED在许多地区和国家流行，日本就曾发生过PEDV的暴发流行，共计造成仔猪死亡的数目约30万头[73]。我国最早从腹泻猪中分离到该病毒是在1973年，由上海农科院得到。在2010-2013这三年中，我国的许多地区相继发出了爆发PEDV的疫情，但是由于没有较好的防治措施对我国的养猪产业造成了不小的创伤[74]。轮状病毒（RV）属于呼肠病毒科，轮状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一[75-78]，架子猪和成年猪受到感染，临床症状一般不表现出来。病猪会出现精神沉郁，食欲下降，不愿走动等现象，过几个小时后则会出现粪便呈黄绿色、灰色或糊状的水样腹泻，并混杂一些的絮状物伴随着恶臭味，哺乳仔猪哺乳完后还会发生呕吐，感染发病猪还会出现脱水严重，体重减轻等症状[79]。猪轮状病毒于1974年Woode等在英国首次报道，随后美国、澳大利亚和法国等许多国家均报道了由轮状病毒引起的仔猪腹泻。中国于1982年在腹泻猪粪便中检测并分离到轮状病毒，随后江苏、山东等地也有相继有报道。2002年10月程建频等在甘肃省对2100头哺乳仔猪进行调查诊断，结果显示发病仔猪1460头，发病率达69.5%。其严重阻碍了养殖业的发展。23 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查猪传染性胃肠炎（TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种高度接触性肠道疾病[80]，它的致病机制是在宿主的小肠上皮细胞中复制定植，导致细胞变性、小肠绒毛脱落萎缩最终导致肠炎腹泻的发生[81]。临床上主要以呕吐、腹泻、和脱水为特征，能感染各个日龄的猪，尤其是新生仔猪发病率极高[82-83]。此病在1926年就已经由美国学者确定为病毒性传染病，有详细的报告[84]。此后世界的多个国家相继报告了此病的发生，例如日本、英国、加拿大等[85-87]。中国于1958在台湾首次发现此病，随后在吉林、河北等地陆续有了相关报道[88-90]。现如今，此病在我国已普遍存在，根据相关调查统计，我国TGEV的感染的感染数量高达37万头左右，给养殖业带来了严重的经济损失[91]。2016年9月北疆部分规模化猪场发生大量仔猪腹泻的病例，有些猪场仔猪因腹泻死亡的头数近千余头，给养殖户造成了巨大的经济损失，病猪的主要症状为腹泻，排水样稀粪，还有脱水症状，发病率高，且死亡率高。本试验采集不同规模化猪场的发病仔猪病料及部分健康大猪的样品，通过RT-PCR的方法对病样进行PEDV、PoRV和TGEV的检测，并将阳性样品送检测序，对序列进行对比分析。为规模化猪场病毒的防控提供相应的理论数据，为养猪业的发展提供参考。1材料1.1样品到2017年11月，北疆部分规模化猪场的仔猪发生了以严重腹泻，排出喷水状稀粪，部分严重脱水，发病日龄由新生仔猪到架子猪不等，发病率高，死亡率高为特征的疾病。在发病时间段分别采集7个猪场中濒临死亡和已死亡的仔猪的小肠及其内容物并每个剪取2cm长左右，放入干净的1.5mL离心管中，将场次、时间及号码编写于离心管的侧面，立即放入-80℃冰箱中保存，以免RNA降解影响后续试验的进行。1.2实验仪器超净工作台，购自上海鸿都电子科技有限公司产品；37℃恒温培养箱，购自北京市永光明仪器厂；4℃冰箱，-20℃冰箱，购自海信容声冰箱有限公司产品；TC-4000PCR仪，购自英国Bibby科技有限公司；DYY-6B电泳仪，购自杭州雷琪实验器材有限公司；电子天平（sartorius），购自上海欢奥科技有限公司；SiGMA离心机，购自德国SiGMA离心机公司；全自动凝胶成像系统仪，购自美国BIO-RAD公司；微波炉（M1-L1213B），购自广东美的厨房电器制造有限公司。1.3主要试剂普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、总RNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；2×PCRMIXDNAMarker，购自广州东盛生物科技有限公司；病毒DNA提取试剂盒，pMD19-T克隆载体，购自TaKaRa宝生物工程有限公司；DH5α感受态细胞，购自北京北京全式金生物科技有限公司。24 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查2方法2.1病毒总RNA的提取将置于-80℃冰箱中的样品分批量取出进行病毒总RNA的提取。使用编号为DP419的提取试剂盒来提取病毒总RNA，具体步骤如下：①将从-80℃冰箱中取出的样品分别用高压灭菌并高温烘烤4h以上的眼科剪剪取绿豆大小的小肠和内容物的混合块，置于事先加好的200μLRZ的无RNase离心管中，使用电动组织研磨器将其研磨成浆糊状，再向离心管中加入剩下的800μLRZ裂解液，用匀浆仪器进行匀浆处理。②为了让核酸蛋白复合物完全分离，把混匀的匀浆样品在常温下放置5min。③离心5min在4℃12000rpm下，谨慎的取上清，避免吸取到杂质，将其转入新的没有RNase的离心管中。④加入200μL氯仿，扣好离心管的管盖，经振荡器15s的剧烈震荡，随后在室温下放置3min。⑤离心10min在4℃12000rpm下，样品会分成显著的三层，而RNA主要在水相中，所用裂解液RZ试剂的50%约为水相的体积。把水相移到另一个新管中，进行下一步操作。⑥缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀。将得到沉淀和溶液一起转入吸附柱CR3中，离心30s在4℃12000rpm下，完成后弃掉离心管中的废液。⑦向吸附柱CR3中加入去蛋白液RD500μL，离心30s在4℃12000rpm下，弃废液，将吸附柱放入收集管中。⑧向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，4℃12000rpm离心30s，弃废液。此步骤操作两遍。⑨将吸附柱放入2mL收集管中，4℃12000rpm离心2min，去除残余液体，并于室温或超净台通风放置10min左右，以便充分晾干。⑩将吸附柱CR3转入一个新的1.5mL离心管中，加30μLRNase-FreeddH2O，室温放置2min，4℃12000rpm离心2min，为了提高RNA的获得率，此步骤重复操作一遍。2.2反转录根据Takala反转录试剂盒进行反转录，全程在冰上操作，向无RNase的PCR管中依次加入以下试剂：15xDNAEraserBuffer:2.0μL2gDNAEraser:1.0μL3cRNA浓度在1000左右的RNA（浓度不是1000的按照比例稀释成1000）1.0μL4RNaseFreeddH2O:6.0μL加完之后立刻在瞬时离心机中离心5s，之后放在PCR仪器中，按照42℃2min的程序进行反应。25 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查接着在上一步反应的PCR管中继续依次加入以下试剂：5RNaseFreeddH2O:4.0μL65xPrimecriptBuffer2(forRealtime):4.0μL7KTprimerMix:1.0μL8PrimerscriptRTEnzymeMixI:1.0μL加完后瞬时离心，之后放在PCR仪器中，按照以下程序进行PCR反应：37℃15min，85℃5sec，store4℃。将完成后的产物放在-20℃冰箱中保存备用。2.3引物设计与合成根据GenBank上登录的PEDVORF3基因序列和S基因序列、TGEV的S基因序列以及PoRV的vp-6基因序列，采用Primer5.0软件设计了4对特异性引物，引物由达尔文生物科技有限公司合成。引物序列如下表2-1：表2-1四种基因的引物序列Tab2-1Primersequencesofthefourgene基因名称序列片段长度PEDVORF3上游引物（5’-3’）ATGTTTCTTGGACTTTTTCAATACACG673bp下游引物（5’-3’）TCATTCACTAATTGTAGCATACTCGPEDVS上游引物（5’-3’）GCCAATTTCTTTTGTTACTTTGCCA852bp下游引物（5’-3’）TTCCCAGTAACCGTGGGTGTGEVS上游引物（5’-3’）ACCAGTGGAATCTCATTGAAACCT544bp下游引物（5’-3’）ACCAAAGGTCTACAAGCGTGCPoRVvp-6上游引物（5’-3’）AGTCTTCGACATGGAGGTTCTG1021bp下游引物（5’-3’）GTCCGCAAGCACAGATTCAC2.4RT-PCR反应扩增四种基因RT-PCR反映体系（20μL和25μL）和条件见表2-2、2-3和2-4：表2-2PEDV-ORF3/S基因PCR的反应体系及扩增程序Tab2-2ReactionsystemandamplificationprocedureofPEDV-ORF3/SgenePCR.PCR反应体系（20ul）扩增条件Mix10μL95℃预变性5minddH2O7μL94℃变性30s上游引物1μL55℃退火30s30cycle下游引物1μL72℃延伸1mincDNA1μL72℃终延伸10min26 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查表2-3TEGV-S基因PCR的反应体系及扩增程序Tab2-3ThereactionsystemandamplificationprogramoftheTEGV-SgenePCRPCR反应体系（20ul）扩增条件Mix10μL95℃预变性5minddH2O7μL94℃变性40s上游引物1μL57℃退火40s30cycle下游引物1μL72℃延伸1mincDNA1μL72℃终延伸10min表2-4PoRVvp-7基因基因PCR的反应体系及扩增程序Tab2-4ReactionsystemandamplificationprocedureofPoRVvp-7genePCRPCR反应体系(25ul)扩增条件Mix12.5μL94℃预变性3minddH2O9.5μL94℃变性30s上游引物1μL53℃退火30s30cycle下游引物1μL72℃延伸3mincDNA1μL72℃终延伸10min2.5RT-PCR扩增产物观察及回收称量0.5g电泳凝胶琼脂糖用天平，加入到0.5xTBE的50mL溶液中，在微波炉中加热2min使其充分溶解，趁热倒入胶板中，配制成1%的凝胶块。取RT-PCR扩增产物10μL，相应的加入琼脂糖凝胶孔内，在120V的电压下的电泳槽中使用49A的电流进行电泳，经过20min左右，之后使用凝胶成像系统仪对目的产物条带进行分析、拍照和观察，以RT-PCR产物出现相应大小的条带做为阳性结果。并尽可能快的将含有目的片段的琼脂糖凝胶用小刀完全的切下，装入相应的灭菌的1.5mL离心管中并做好标记。按DNA凝胶回收试剂盒说明进行回收目的产物片段。回收后的产物立即使用或保存于-20℃冰箱中。回收操作步骤：1）向相应数目的吸附柱CA里面加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，把收集管中的废液撇弃，吸附柱再一次放回收集管中。2）将切下的单一目的DNA条带称取质量后向其中加入3倍体积的溶胶液PN，静置10min在50℃水浴锅中，在此期间每隔3min左右，上下翻转离心管，使胶块能够快速充分的溶解。3）把溶解后的胶液放置常温后将其全部移到处理过的吸附柱中，在室温下搁置2min，12000rpm离心1min，把收集管中的离心液弃掉。4）向吸附柱C2中加入600μL的漂洗液PW，室温静置4min后12000rpm离心1min倒掉废液。5）重复操作步骤4）。27 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查6）将吸附柱C2置离心机中空离2min，倒掉收集管中的些许废液，室温静置25min，彻底除去PN。7）将吸附柱C2放入新的1.5mL离心管中，向吸附柱里面的膜中间位置悬空滴加双蒸水30μL，静置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。8）重复操作步骤7），增加回收率。10）将回收的DNA使用仪器检测浓度后存于-20℃备用。2.6连接T载体本试验使用pMD19-T载体试剂盒进行胶回收DNA产物的载体连接，连接体系（10μL）详见表2-5：2-5目的基因T载体连接反应体系Tab2-5TargetgeneTvectorbindingreactionsystem连接试剂添加量（μL）SolutionI5.0pMD19-T载体1.0胶回收DNA产物4.0Total10将以上的反应试剂轻微振荡混匀后，放在16℃的连接仪器中过夜，反应在18h左右。2.7感受态细胞的转化a用制冰仪器制备新鲜的冰碴，将高压灭菌的1.5mL离心管插入冰盒中，使其达到预冷的效果。b将感受态细胞DH5α从-80℃的低温冰箱中取出，快速插入冰盒中，使其在冰内低温溶解，之后在冰上将其分装于提前插入冰盒预冷的离心管内，每管50μL，即一分为二，并做好标记。c取6μL的连接产物，加入到含有50μL感受态细胞DH5α的离心管中，轻弹混匀，冰浴30min。d将取出的离心管放入42℃水浴锅热激90s，随后迅速置于冰中冰浴4min。e向离心管中加入37℃预热的无抗生素的LB液体900μL在肉汤培养基中，轻弹混匀，置于37℃200rpm的恒温摇床中振捣50min，来进行复苏菌体。f取出恒温摇床内的离心管，随后8000rpm离心2min，弃上清，保留离心管底部的沉菌及少许液体，吹打混匀用移液枪将沉菌。g将底管的菌液加到含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，用高压灭菌反复烧过的涂布棒进行涂布，将混合液涂干涂匀，约涂布15min左右，使用封口膜将平板封口并标记，之后放在37℃的恒温箱内培养18-20h，并查看单个菌落生长的状况。28 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查2.8菌液PCR验证将氨苄青霉素平板培养后取出，观察菌落生长情况，挑取3个在每个平板上不同区域挑取的单个菌落，将其分别接种于5mL的含有氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，并做好标记，培养4h置于37℃、180rpm的振荡培养箱中，观察培养液有雾状出现后，进行菌液的PCR验证。不同基因的PCR反应体系分别对应2.4中的PCR扩增体系。2.9序列测定与比对分析选取7个规模化猪场验证后的阳性产物各1份，送去北京睿博兴科生物科技有限公司测序，将测序回来的结果运用软件DNAMAN、DNAStar等对四个基因进行比对和分析，并使用MEGA5.0软件做进化图谱并对分析。3结果与分析3.1RT-PCR检测结果经过RT-PCR的检测，来自不同猪场的仔猪分别检测小肠及其内容物组织样品，其中67.5%（75/111）检出PEDV，扩增出673bp的目的片段；10.8%（12/111）检出PoRV，扩增出1021bp的目的片段，而在111份样品中并未检测出来TGEV，为0。具体结果见图3-1：12345678910111213141516M2000bp1000bp1021bp750bp852bp500bp673bp250bp100bp图3-1PEDVORF3基因、PoRVVP-6基因、PEDVS基因和TGEVS基因PCR电泳图1-8：为PEDVORF3基因检测样品(675bp)；9-12：为PoRVVP-6基因检测样品(1021bp)；13-14：为PEDVS基因检测样品（852bp）；15-16：为TGEVS基因检测样品；M:MarkerD2000.Fig3-1PEDVORF3gene、PoRVVP-6gene、PEDVSgeneandTGEVSgenePCRelectrophoresischart1-8:thePEDVORF3genewasusedtodetectthesamples(675bp);9-12:thePoRVVP-6genewasusedtodetectthesamples(1021bp);13-14:thePEDVSgenewasusedtodetectthesamples(852bp);15-16:theTGEVSgenewasusedtodetectthesamples;M:MarkerD2000.3.2RT-PCR结果统计对7个规模化猪场发病死亡或濒临死亡的仔猪采集样品进行RT-PCR的检测，发现7个规模化猪场中仔猪感染PEDV发病死亡的比例最高，检测率最高为石河子142团某规模化猪场，达到87.5%，并且石河子地区4个团场中的规模化猪场PEDV阳性率相对于伊犁和博乐较高；PoRV感染仔猪发病率较少，总共为17%左右，而对TGEV的检测中并没有检出此病毒的存在。说明北疆垦区仔猪因病毒感染而大量发病死亡的主要病原29 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查是PEDV，PoRV和TGEV感染病例较少，甚至没有。对于7个规模化的哺乳母猪、架子猪等大猪进行抽检，采取其没着地的新鲜粪便，进行病毒RNA的提取，并用PCR方法对大猪进行抽检，发现部分大猪存在隐性感染的状况，隐性感染病毒为PEDV，为23%左右，而PoRV和TGEV的感染没有检测出来。详见表3-1：表3-1PEDV、PoRV和TGEV的PCR检测结果Tab3-1PCRresultforPEDV、PoRVandTGEV样品来源发病仔猪PEDVPoRVTGEV健康猪PEDV样品数石河子142团1687.5(14/16)12.5(2/16)0(0/16)1838.9(7/18)石河子145团2080.0(16/20)15.0(3/20)0(0/20)2030.0(6/20)石河子148团1861.1(11/18)11.1(2/18)0(0/18)1526.7(4/15)石河子146团1266.7(8/12)8.3(1/12)0(0/12)137.7(1/13)克拉玛依白碱滩1566.7(10/15)6.7(1/15)0(0/15)128.3(1/12)伊犁70团1258.3(7/12)8.3(1/12)0(0/12)1520.0(3/15)博乐89团1855.6(10/18)11.1(2/18)0(0/12)1323.1(3/13)合计11168.5(76/111)10.8(12/111)0(0/81)10623.6(25/106)3.3PEDVORF3基因序列测定与对比分析使用DNAMAN、DNAMegAlign等软件，将送去测序的7个阳性产物进行序列对比，分析同源性。同时根据病样来源对序列进行命名，分别为SHZ142、SHZ145、SHZ148、SHE146、KLMYBJT、YL70、BL89；3个参考序列分别为：GU372744.1Cv777、JX002703.1ZJ08和JX188454.1AJ1102。结果显示，克隆的7个PEDVORF3基因，均有675个核苷酸组成，他们之间的统一性在95%-99%，本实验室获得的7个ORF3的基因序列同3株参考株的一致性均95%-100%，同源性高，见图3-2。图3-2ORF3基因的同源性分析图（%）Fig3-2AnalysisofhomologyoftheORF3gene(%)用MEGA6.0软件，对试验获得的PEDVORF3基因序列与Genbank中登录的3株参考疫苗株PEDVORF3基因序列进行进化树的构建。可以看出SHZ148和SHZ145与30 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查参考疫苗株JX188454.1AJ1102处于同一个较小分支，SHE146与其处于稍大的分支，SHZ142、KLMYBJT、YL70、BL89处以一个较大分支中，表明其相互之间的亲缘关系较近；而GU372744.1Cv777和JX002703.1ZJ08这两株参考疫苗株与基因序列处于一个大的分支中，代表亲缘关系较远。所有检测的毒株与参考序列都处于一个大的进化分支中，说明起源相同，为同一种类的毒株进化而来，见图3-3。图3-3PEDV的ORF3基因系统进化树Fig3-3ORF3genephylogenetictreemap3.4PEDVS基因序列测定与对比分析使用DNAMAN软件，将送去测序的7个阳性产物进行序列对比，分析同源性。7个参考序列分别为SHZ142、SHZ145、SHZ148、SHE146、KLMYBJT、YL70、BL89；3个参考序列分别为：MG334003.1YnP2、JN599150.1CV777（S）、KY496315.1CHhubei2016S。结果显示，克隆的7个基因，均有852个核苷酸组成，他们之间的同源性在95%-100%（7个PEDVS基因与3个参考毒株的相似性比对），结果见图3-4。图3-4S基因的同源性分析图（%）Fig3-4AnalysisofhomologyoftheSgene(%)用MEGA6.0软件，对试验获得的PEDVS基因序列与Genbank中登录的有代表性的3株PEDV参考毒株的S基因序列进行进化树的构建，结果显示，SHZ145S、SHZ148S、SHE146S、KLMYBJTS、YL70S、BL89S处于较小的分支中，亲缘关系较近，SHZ142S和MG334003.1YnP2、KY496315.1CHhubei2016共处于一个较小的分支中，而中国疫苗株JN599150.1CV777(S)与其虽在一个大的分支中，但是亲缘关系稍远。见图3-5。31 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查图3-5S基因系统进化树Fig3-5Sgenephylogenetictreemap3.5PoRVVP-6基因序列测定与对比分析使用DNAMAN软件，将送去测序的7个阳性产物进行序列对比，分析同源性。7个基因序列分别为SHZ142、SHZ145、SHZ148、SHE146、KLMYBJT、YL70、BL89；2个参考序列分别为：L29186.14S（猪源）、JN034041.12010/WH-a（野猪源）。结果显示，克隆的7个基因，均有1021个核苷酸组成，他们之间的同源性在98%左右，7个PoRVVP-6基因与参考毒株L29186.14S的VP-6相似性较低，在92%左右，与参考毒株JN034041.12010/WH-a的相似性较高，在97%左右，结果见图3-6。图3-6VP-6基因的同源性分析图（%）Fig3-6AnalysisofhomologyoftheVP-6gene(%)用MEGA6.0软件，对试验获得的PoRVVP-6基因序列与Genbank中登录的有代表性的2株PoRV参考毒株的VP-6基因序列进行进化树的构建，结果见图3-3。图中为参考毒株的VP-6基因序列。结果表明，KLMYBJT和YL70、SHZ142和BL89、SHE146和SHZ145两两处于一个小分支中，亲缘关系较近，他们与SHZ148、JN034041.12010/WH-a和L29186.14S处于一个大分支中，进化距离稍远。可以确定的是7个PoRVVP-6基因序列与两个参考序列起源是相同的，为同一种的类毒株进化而来。32 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查图3-7VP-6基因系统进化树Fig3-7VP-6genephylogenetictreemap4讨论与分析因病毒感染而使仔猪发生腹泻的病原较为复杂，目前PEDV、PoRV和TEGV这三种病毒是导致仔猪腹泻较为严重的主要原因。各个年龄段及其不同品种的中均易受PEDV的侵袭，尤其对仔猪的危害极为严重，发病率可达100%，致死率高达80-100%，目前为止仔猪发病后并没有有效的药物防治措施，且此病毒的传播途径多，可通过环境、饲料、粪便及水源传播，而有相关报道表明：垂直传播的主要途径可能是通过乳汁进行传播[92]，这对病毒的预防又多了一层障碍。PEDV基因组中的ORF3基因是被认为与病毒毒力有关的唯一附属基因，其决定病毒在宿主上的致病性的强弱[93-97]，它还具有较高的保守性，核苷酸序列同源性较高，不存在有多样性的分离株，而PEDV中的S基因的核苷酸序列同源性就比较低，发生变异的可能也高，会有多样性的PEDV分离株[98]，有研究表明不同地区的病毒毒株就有明显的差异[99]。本研究中，对北疆垦区中的7个规模化发生腹泻的猪场进行PEDV的检测分析，发现规模化猪场仔猪的PEDV检测率达到67%，健康大猪的检出率也在23%左右。选取部分阳性结果进行序列的测定，结果表明，PEDV的ORF3基因与疫苗株GU372744.1Cv777、疫苗株JX002703.1ZJ08和疫苗株JX188454.1AJ1102的相似性均较高，但在进化距离上实验室获得的7株序列与科前的疫苗株JX188454.1AJ1102进化距离近，表明亲缘关系较近；与疫苗株GU372744.1Cv777、疫苗株JX002703.1ZJ08在进化关系中有较远的距离。同时PEDV的S基因与中国疫苗株JN599150.1CV777（S）遗传距离差异较大，亲缘关系较远，可能存在变异，与参考株KY496315.1CHhubei2016和MG334003.1YnP2的距离差异稍小，亲缘关系较近。所被检测毒株与参考株都处于大的进化分支中，起源相同。猪轮状病毒是能够引起猪的急性肠道传染病，仔猪最易感染，发病猪主要症状为呕吐、腹泻、排水样粪便，目尚无特效治疗药物。同时也是一种人兽共患病，不仅可以引起畜牧幼龄动物发生腹泻，还可以引起新生幼儿发生腹泻，给人类的健康和畜牧业造成了较大的危险和损害。研究表明VP-6是抗原性较强的蛋白质，常被实验室用来进行鉴定轮状病毒的种类，主要用于轮状病毒A群感染证的检测上面[100]。并且PoRV的VP6序列是相对较为保守的。本研究共采集111份腹泻仔猪的样品，其中有19份检出有33 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查PoRV，为10.8%，说明北疆地区已有轮状病毒的存在。仔猪对于此病毒是非常敏感的，尤其是一月龄左右的仔猪，发病率有80%，死亡率在7-20%。据王振玲等对北京地区某些规模化猪场仔猪病毒性腹泻的PoRV的检测表示，有14.5%的阳性率在400份样品中，本试验结果与相关报道相符[4]。本试验得到的7株PoRV序列之间的同源性很高，在98%左右，7株分离株与L29186.14S（猪源）的同源性较低为92%左右，在进化树中与他们不在一个小分支上，处于一个大分支上，说明差异性较大，亲缘关系稍远一些；7株分离株与JN034041.12010/WH-a（野猪源）的同源性较高在97%左右，在进化树中与XJSHZ/142VP-6、XJSHZ/148VP-6处于一个小的分支上，亲缘关系较近，系统进化分析表明分离到的7株分离株的VP6基因同2010年分离到的野猪源A组猪轮状病毒亲缘性最近，具有较近的进化距离。猪传染性胃肠炎在我国近年来有进一步的流行趋势，以冬春寒冷季节发生较为严重，具有明显的季节性，发病高峰期在1-2月份。一般通过携带病毒的猪或发病猪的呼吸、拱舔、排泄物等途径将病毒排出体外后使得健康猪只接触这些污染的环境从而发病。TEG现如今已经是导致仔猪腹泻病毒性原因之一的重要疫病，在《国际动物卫生法典》中，此病已被列入B类传染病，是我国的重点防治疫病[101]。朱蕴暖等[102]在2017年于安徽合肥某发病猪场的腹泻仔猪的小肠内容物中分离出了此病毒；李蕊彤等[103]在201年于四川地区部分猪场的腹泻病料中检测出TGEV；而本研究中在所采集的病样中没有检测出TGEV，可能的原因一方面是冬天的北疆地区虽然寒冷，但是有暖气、炉子、热风炉、小太阳等供暖设施为猪舍提供温暖；另一方面是病毒对外界环境的抵抗力弱，在阳光下照射6h即可灭活，紫外线能使病毒迅速灭活[104-105]；病毒对乙醚、氯仿和去氧胆酸钠敏感，0.05%甲醛溶液在37℃消毒20min也可以使病毒灭活，对许多消毒剂液也较为敏感；可能还存在的原因是采集的样品数量还是少，导致TGEV未在样品中检测出，需要今后继续采集更多的样本进行综合分析。5小结综述所述，北疆地区的病毒株与传统疫苗株之间存在变异的可能，在选择PEDVORF3基因为主免疫疫苗时建议选取亲缘关系较近的疫苗株JX188454.1AJ1102、而部分猪场对猪免疫的腹泻苗是疫苗株GU372744.1Cv777或疫苗株JX002703.1ZJ08，这就导致免疫效果不佳，或者需要和因此在采用疫苗免疫腹泻之时效果并不显著。同时，PEDV的S基因与中国疫苗株JN599150.1CV777（S）的亲缘关系较远，用于疫苗防控易出现免疫失败的现象。因此，一方面需要选择适合当地流行毒株的疫苗株，另一方面应从当前流行毒株中筛选出新的疫苗株，这是防控该病继续蔓延的关键措施。34 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查试验三致仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定及部分生物学特性研究摘要：为了确定导致7个规模化猪场中仔猪腹泻的主要病原菌并给予一定的治疗方案，本试验采用常规微生物学方法，对该北疆地区部分规模化猪场开展了仔猪腹泻的病原学诊断，从腹泻仔猪的肝脏、肾脏、脾脏、小肠及其内容物等组织中分离细菌，然后对分离株的形态学特征、生长特性、生化特性、致病性、药物敏感性以及分子生物学等进行检测鉴定。试验结果表明，共分离鉴定到89株大肠杆菌。分离株呈革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌；麦康凯培养基上呈光滑的红色单个菌落，伊红美蓝培养基上为泛有绿光带有金属光泽的黑色菌落；89株分离株的生理生化特性均符合大肠杆菌的生物学特性；10株代表株的PCR扩增及序列分析结果表明，与MG270576.1相似性均在95%-99%之间，系统进化关系表明与大肠杆菌的参考菌株在同一个大的分支上；不同来源分离株的药物的敏感性有所不同，但对阿莫西林、复方新诺明、四环素、诺氟沙星等药物耐受率≥50%，对头孢喹肟、新霉素药物较为敏感，敏感率≥50%；代表菌株的动物感染试验结果表明，腹腔注射小白鼠后在18h死亡数大于50%，在36h小白鼠全部死亡。关键词：大肠杆菌；分离鉴定；生物学特性；PCR大肠杆菌(Escherichiacoli)，为革兰氏阴性短杆菌，有鞭毛，能运动，无芽孢。在1885年被Escherich首次发现，一直以正常肠道菌群的身份存在[106]，后来随着科学的发展，研究的深入，认识到大肠杆菌拥有某些血清型可以使任何动物发生较大的致病性[107]。1955年一些科学家就证实大肠杆菌能使猪有较严重的腹泻病[108]。随后，大肠杆菌引起仔猪腹泻的研究就此展开[109]。2014年吕雯对石河子某一规模化猪场进行调查，发现仔猪发病率高达90%，死亡率有80%，主要为大肠杆菌引起的仔猪黄痢并有病毒性混合感染[110]。陈冠雄[111]于2016年对石林县233份仔猪腹泻的样品进行鉴定，结果大肠杆菌阳性率100%。仔猪一旦出现严重拉稀的症状，尤其是新生仔猪，其发病率和死亡率都比较高，并且这些年来，仔猪泄泻病的发生呈上涨趋势，造成较高的发病率和死亡率，给养殖场带来了不小的经济损失，同时给防治工作也带来了较大的挑战。2016年10月以来北疆地区部分规模化猪场相继出现仔猪腹泻的现象，仔猪拉稀黄色水样粪便，严重者呈喷射状样稀粪，并伴有呕吐、脱水等症状，仔猪生长缓慢或停滞，病程在5天左右，治愈率不高，抗生素治疗效果不佳；剖解可见肠壁菲薄，里面充满黄色液体，剪开胃部及十二指肠可见大量未消化的乳凝块，尤其是新生仔猪，发病率高，死亡率高，治愈率几乎为零。本试验采用常规细菌分离鉴定方法和分子生物学方法，对发病仔猪进行病原菌的检测，并对分离株致病性、药物敏感性等进行了测定。为北疆地区的规模化猪场的防治提供了一定的理论依据。35 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查1材料1.1病料来源2016年9月至2017年11月通过采集北疆地区不同区域7个规模化猪场出现腹泻症状仔猪的直肠粪便和小肠及其内容物，储存于-80℃的低温冰箱中备用。1.2主要试剂药物敏感性纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌生化鉴定微量发酵管，购自海博生物技术有限公司；快速革兰氏染液，购自珠海贝索生物科技有限公司；A、B、CIFFQUIK染液，购自德国纳博科临动物临床检验实验室；2xTaqPCRmix购自BIOMIGA公司；100bp的DNAMarker，购自北京全式金生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，均购自天根生化科技有限公司；香柏油，购自中国上海懿洋仪器有限公司。1.3主要仪器超净工作台，上海鸿都电子科技有限公司；显微镜，日本OLYMPU公司；37℃恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；恒温摇床（ZHWY-2102C），上海智城分析仪器制造有限公司；4℃冰箱、-20℃冰箱，海信容声冰箱有限公司；T4000PCR仪，英国Bibby科技有限公司；DYY-6B电泳仪，杭州雷琪实验器材有限公司；电子天平（sartorius），上海欢奥科技有限公司；SiGMA离心机，德国SiGMA离心机公司；全自动凝胶成像系统仪，美国BIO-RAD公司；微波炉（M1-L1213B），美的厨房电器制造有限公司；小型振荡器（G560E），美国BOHEMIA公司。1.4分离培养菌用培养基LB肉汤培养基、脑心浸液（BHI）肉汤培养基，购自海博生物技术有限公司；琼脂粉，购自国药集团化学试剂有限公司；麦康凯固体培养基、伊红美蓝琼脂培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；LB固体培养基、BHI琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）培养基等均为自己配置，配置方法如下：1）LB肉汤培养基：称取LB粉25.0g，量蒸馏水1000mL，先向锥形瓶中加入约250mL的蒸馏水，防止粉末粘黏底部，LB粉倒入锥形瓶中，搅拌均匀后，分装于10mL试管中，每个约为3mL，塞好橡胶塞，做好标记，置于高压锅中121℃灭菌20min，待温度降到50℃左右，拿出放凉后再放入4℃冰箱保存备用。2）LB琼脂培养基：称取LB肉汤粉25.0g，琼脂粉18.0g，量取蒸馏水1000mL，向锥形瓶中倒入少许的蒸馏水，再将称取的LB粉和琼脂粉一同倒入锥形瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，盖好橡胶塞，置于高压锅中121℃灭菌20min，待温度降到60℃左右时取出，倒板备用，并做好标记。3）BHI肉汤培养基：称取BHI肉汤粉38.5g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，平均分装于10mL36 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查试管中，每个约为3mL，塞好橡胶塞，置于高压锅中121℃灭菌20min，待温度降到50℃左右，拿出放凉，做好标记，4℃冰箱保存备用。4）BHI琼脂培养基称取BHI肉汤粉38.5g，琼脂粉18.0g，量取蒸馏水1000mL，在瓶内倒入部分蒸馏水，再将BHI肉汤粉和琼脂粉依次倒入锥形瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，盖好橡胶塞，置于高压锅中121℃灭菌20min，待温度降到60℃左右，拿出，无菌操作倒入培养皿中，做好标记，紫外照射后于4℃中保存。5）麦康凯琼脂培养基称取麦康凯琼脂52g，加入量好的1L蒸馏水中，用力搅拌混匀，使其没有疙瘩121℃高压灭菌21min，温度降到50℃左右，无菌倒板，待平板凝固后置于4℃冰箱保存备用。6）伊红美蓝琼脂培养基称取伊红美蓝粉34.7g，加入1L蒸馏水中，使劲搅拌混匀，121℃高压灭菌20min，温度降到50℃左右，在超净台中无菌倒板，待平板凝固后置于4℃冰箱保存备用。1.5细菌微量生化鉴定管及培养基1）西蒙氏枸橼酸盐、MR-VP、甘露醇、尿酶素、乳糖、山梨醇、棉子糖、鼠李糖、硫化氢、赖氨酸脱氢酶肉汤（赖氨酸脱氢酶对照）、蔗糖、甘油、Kovacs等试剂购自海博生物技术有限公司。2）三糖铁琼脂（TSI）培养基：蛋白胨20.0g，牛肉浸粉5.0g，氯化钠5.0g乳糖10.0g，葡萄糖1.0g，蔗糖10.0g，酚红0.025g，硫酸亚铁铵0.2g，硫代硫酸钠0.2g，琼脂12.0g，所有成分加热溶解至1000mL蒸馏水中，调节pH值7.4±0.1，使用电热套加热至沸腾溶解，趁热分装于16mmx150mm试管中，121℃高压灭菌21min，温度降到50℃左右拿出，摆放在与水平面有30°夹角的斜面摆放，制成斜面，待其冷却凝固后置于4℃冰箱保存备用。1.6药敏纸片及试验动物庆大霉素、阿莫西林、氨苄西林、诺氟沙星、复方新诺明、恩诺沙星、头孢噻肟、新霉素、环丙沙星、卡那霉素、林可霉素、链霉素、四环素、洛夫沙星、阿奇霉素等药敏纸片为杭州滨和微生物试剂有限公司产品。试验小白鼠购自石河子大学动物实验中心。2方法2.1病料来源在2016年9月至2017年11月期间从北疆地区的石河子145团、石河子148团、石河子146团、克拉玛依白碱滩、伊犁70团、博乐89团、石河子142团这7个规模化猪场分别进行病样采集，无菌采取腹泻仔猪的小肠及其内容物、肝脏等组织置于灭菌的1.5mL离心管中，并在管壁写上日期、猪场简称、采取的样品名称等，放入带有冰袋的采样箱中，及时带回实验室并尽快放入-80℃冰箱中保存备用。37 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查2.2细菌的分离培养及纯化无菌采取因腹泻死亡或者濒临死亡的仔猪的小肠及其内容物、肝脏等，在超净台中分别无菌接种于LB肉汤培养基中，于37℃恒温培养箱中培养20h后，进行涂片染色镜检，观察细菌大概形态，再通过四区划线的方法将菌液分别接种于LB琼脂培养基和麦康凯培养基中，置于37℃恒温培养23h左右，观察平板中菌落的生长情况、菌落形态特征及菌落颜色的变化并染色镜检，共分离到89份可疑株。在麦康凯琼脂培养基上的单个菌落呈现玫红色、大小基本一致，挑取上面的单个菌落于LB肉汤培养中，扩增菌体，37℃培养24h后，在四区划线接种于伊红美蓝培养基中，37℃恒温培养20h，89株菌分别呈现黑绿色有金属光泽的单个菌落，对这些菌落进行进一步培养，不断纯化，直到在视野中观察到大小、体形、长短差不多一致的短杆菌。2.3分离株的形态学观察aA、B、C快速染液：1）涂片：选取采集来的一块组织，把眼科剪和小镊子在火焰上烧灼并用75%的酒精擦拭，用小镊子夹着酒精棉球在组织表面擦拭一下，用小剪刀剪取一块组织，小镊子夹住组织使剪取的新鲜组织切面在干净的载玻片上快速涂抹一面或者轻蘸一下，形成均匀的薄面，使其自然晾干。2）染色：在瑞特式快速染色液A中，使载玻片上的组织面完全浸没在染液里10s，稍微控掉载玻片上的染液A，再在B染液和C染液中按照A液步骤各自浸染10s后，拿出自然晾干，不可用滤纸擦拭或蘸拭。3）镜检：使用松柏油在油镜下观察。b.革兰氏染色：1）取片：用镊子取出在酒精中浸泡过的干净载玻片，在酒精上烧掉多余酒精，并用滤纸将多余的残液擦去，稍微晾凉后用白色玻璃蜡笔相应数量的格子。2）涂片：若是挑取单个菌落进行镜检，在画好的格子内滴加20μLddH2O，再用接种针无菌蘸取少许菌体涂抹于无菌水中；若是菌液镜检可用无菌接种环蘸取一环菌液涂抹于格子内就可。3）固定：将载玻片上的菌液自然晾干后，在酒精灯火焰上快速过几下进行固定。4）染色：将快速革兰氏染液的龙胆紫液、碘溶液、脱色液和沙黄染液依次滴加于载玻片上，每个停留15s，都用蒸馏水将多余染液冲洗掉，最后用滤纸轻轻擦去多余液体，自然晾干。5）镜检：将载玻片在油镜下滴加香柏油观察。2.4分离株的生理生化鉴定分离菌的生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》对病原菌进行生化鉴定：将分纯的大肠杆菌的单个菌落分别用无菌接种针刺穿接种于西蒙氏枸橼酸盐、尿酶素、半固体琼脂、三糖铁和硫化氢中37b℃培养12-48h分别观察其生化反应特性；将分离纯化的大肠杆38 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查菌的单个菌落至ddH2O中仔细研磨制成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液，分别吸取70μL滴入至乳糖、山梨醇、棉子糖、鼠李糖、赖氨酸脱氢酶肉汤及赖氨酸脱氢酶对照、蔗糖、甘油和Kovacs试剂中，37℃恒温培养24-48h后观察反应情况；将分纯的大肠杆菌单个菌落用无菌接种环接种至MR肉汤中，37℃培养2d，滴加甲基红试剂2-3滴轻轻混匀后观察；用无菌接种环将单个菌落接种至VP肉汤中，37℃培养2d首先滴加0.6mLA液与培养物充分混匀后，再加入0.2mLB液，再进行振荡混匀，最后静置1.5h后观察结果。2.5分离株的分子生物学鉴定2.5.1引物设计依据细菌高度保守的基因片段16SrRNA序列，设计一对特异性引物，预期目的条带大小为201bp，引物由北京睿博兴科生物科技有限技术公司。上游引物：5'-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3'下游引物：5'-TCATCCTCTCAGACCAGCTA-3'2.5.2大肠杆菌DNA的提取依据TIANGEN公司细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）操作步骤提取细菌的基因组DNA，具体操作步骤如下：1）用移液枪吸取菌液3mL于离心管中，10000r/min离心1min，轻轻的吸净上清，保留沉淀。2）加入200μL缓冲液GA向离心管中的沉菌中，使用振荡器上下振荡使菌体全部悬浮。3）向管中加入蛋白酶K溶液20μL，轻轻的上下翻转混制，并弹匀。4）加入缓冲液GB220μL后，经15s剧烈振荡，放置10min在70℃的水浴锅中后，拿起观察溶液是否由粘稠混合变得清澈明亮，并用小型离心机稍微离心3s以除去管盖内的水珠。5）加无水乙醇220μL，经15s振荡混匀，有絮状沉淀出现，经离心除去离心管内壁水珠。6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，撇弃收集管中的液体，在将吸附柱CB3放入收集管中。7）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，收集管的液体倒掉后将吸附柱放回。8）加入700μL漂洗液PW向柱子CB3中，经12000r/min离心30s，弃去废液，将CB3放入收集管中，重复此步骤一遍。9）将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，扔废液，将柱子在室温下放置23min，晾干吸附柱中的残液避免影响后续试验。10）在一个干净的离心管中放入晾干的吸附柱，滴加30μLddH2O向吸附膜的中间部位悬空，尽量不要滴加到管壁上，随后静置2min在室温下，12000r/min离心2min39 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查后得到DNA的溶液。11）为了有更高的DNA得率，将离心管底部的溶液再吸到吸附柱中间的膜上，静置2min，12000r/min离心2min，将回收的DNA收集起来，做好标记，放在-20℃冰箱备用。2.5.3PCR扩增以提取的大肠杆菌基因组DNA为模板进行扩增16SrRNA基因，PCR反应体系及条件见表2-2：表2-1：16SrRNA扩增程序Tab2-1:16SrRNAamplificationprogramPCR反应体系（20μL）扩增条件2xPCRTaqMIX5μL95℃预变性4minddH2O12μL95℃变性30s上游引物0.5μL52℃退火30s30cycle下游引物0.5μL72℃延伸30sDNA模板2μL72℃终延伸10minPCR结束后，将15μLPCR产物加入1%琼脂糖凝胶梳孔中在电泳槽内电泳，用凝胶成像系统仪检测目的片段，若出现大小在201bp处的条带即为的目的条带。2.5.4菌液PCR的验证PCR的DNA胶产物的回收、T载体连接、转化以及菌液的PCR验证方法同试验二中的2.5-2.9。2.6分离株的药物敏感性试验采用K-B纸片扩散法，根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准判定试验结果。将纯化菌株挑取单个菌落接种于LB肉汤中在37℃恒温培养箱中培养18h，用无菌生理盐水将菌液稀释至浓度约为2×106cfu/mL，用移液枪吸取200μL菌液，使用无菌涂布棒均匀涂于LB琼脂平板上，然后，将药敏纸片依次有间隔的轻按在平板中，每个平板贴7-8种药敏纸片，把握好距离，随后置于37℃恒温培养中培养24h观察结果，根据抑菌圈的直径，判定分离株对药物的敏感性（判定标准见表2-2）。40 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查表2-2药敏试验判定标准Tab2-2criteriafordrugsusceptibilitytesting药品名称纸片含量/μg标准抑菌圈直径/mmRIS新霉素30≤10>11~24<≥25链霉素10≤11>12~14<≥15四环素30≤11>12~14<≥15环丙沙星5≤15>16~20<≥21阿奇霉素15≤13>14~17<≥18诺氟沙星10≤12>13~16<≥17恩诺沙星5≤10>11~15<≥16阿莫西林10≤13>14~16<≥17氨苄西林10≤13>14~16<≥17卡那霉素30≤13>14~17<≥18庆大霉素10≤12>13~14<≥15头孢噻肟30≤14>15~22<≥23洛夫沙星10≤18>19~21<≥22复方新诺明23.75/1.25≤10>11~15<≥162.7分离株对小白鼠的致病性试验选取分离纯化后的大肠杆菌菌株，用LB肉汤培养基培养之后，与麦氏比浊管进行比浊（约109cuf/mL），通过腹腔注射小白鼠，每个场次随机选择1/2的分离菌株（145团分10株离株；148团10株分离株；146团8株分离株；克拉玛依白碱滩4株分离株；伊犁70团8株分离株；博乐89团5株分离株；142团5株分离株），每株分离株打2只小白鼠，每只小白鼠注射0.3mL的菌液，另外取14只小白鼠作为空白对照，腹泻注射0.3mL灭菌的生理盐水，观察小白鼠的死亡情况，并对死亡的小鼠进行剖检，无菌操作采集小白鼠肝脏组织，并进行培养，观察细菌形态特性。3结果3.1病原菌分离培养特性将采集回来的病样在无菌操作的情况下进行细菌的分离纯化培养，在LB固体培养基上，单个菌落为正圆形，边缘整齐，有凸起，为滑面，菌落湿润，颜色呈现奶白色（见图3-1）；在麦康凯琼脂培养基的长势为淡玫红色的圆形、光滑、中间颜色更浅的大小均匀的单菌落（见图3-2）；菌落在伊红美蓝上呈圆形凸起的紫黑色大菌落，培养基表明泛出绿黑色的光泽，而单菌落为深黑色且带典型的金属光泽（见图3-3）；将病料接种于灭菌的普通LB肉汤中，37℃过夜振荡培养18-23h，肉汤由澄亮变为均匀的浑浊，底部有少量沉菌，摇晃试管会有龙卷风样的菌雾出现（见图3-4）。41 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查图3-1.LB固体培养基上大肠杆菌菌落图3-2.麦康凯培养基上大肠杆菌Fig3-1.LBsolidmediumcoloniesofE.coliFig3-2.coloniesofE.colionmedium图3-3.伊红美蓝培养基上大肠杆菌菌落图3-4.LB液体培养基中大肠杆菌菌液Fig3-3.EMBmediumofE.coli.Fig3-4.LBliquidculturemediumforE.coli3.2细菌形态观察结果对腹泻猪的小肠、肝和脾等部位直接涂片进行瑞特氏染色镜检，可以观察到两端顿圆粉红色的短杆状杆菌（见图3-5），对细菌进行分离纯化培养，用革兰氏染色镜检，可见视野中为大小基本一致的短杆状大肠杆菌（见图3-6）。图3-5组织中大肠杆菌形态100×图3-6.大肠杆菌镜下形态100×Fig5formofE.coliintissue100×Fig6.morphologyofE.coli100×3.3分离菌的生化特性分离菌均能在乳糖生化管中发酵乳糖，颜色由黄色变为紫色，为阳性；在蔗糖、七叶苷等生化管中均为阳性；在脱氢酶肉汤生化管中使肉汤颜色由黄色变为紫色，在赖氨酸脱羧酶对照管中变黄反应为阳性；MR试剂在1.5h之内出现红色为阳性，vp培养液呈现无色反应为阴性，西蒙氏枸橼酸盐、在山梨醇、棉子糖、鼠李糖、尿酶素、苯丙氨酸脱氧酶中为阴性；Kovacs氏肉汤在培养96h之后振荡有龙卷风似菌体悬起为阳性；在三糖铁斜面培养基中使培养基变成均匀的黄色，并有底部产生空气柱，是管内培养基上移。根据《伯杰细菌鉴定手册》判断，分离菌株符合大肠杆菌生化特性，分离到的8942 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查株分离菌均为大肠杆菌。表3-1分离株的生化反应及培养特性的结果Tab3-1Resultsofbiochemicalreactionandculturecharacteristicsof生化鉴定项目生化鉴定结果ABCDEFG西蒙氏枸橼酸盐-------尿酶素-------三糖铁-------硫化氢-------乳糖发酵管+++++++山梨醇-------棉子糖-------鼠李糖-------赖氨酸脱氢酶肉汤+++++++蔗糖+++++++Kovacs+++++++七叶苷+++++++MR+++++++VP-------苯丙氨酸脱氨酶-------注：A代表145团分离株；B代表148团分离株；C代表146团分离株；D代表克拉玛依白碱滩分离株；E代表伊犁70团分离株；F代表博乐89团分离株；G代表142团分离株。3.4分子生物学鉴定3.4.1分离株保守基因PCR检测结果对分离的大肠杆菌16SrRNA保守基因的特异性片段检测，大小在208bp出现目的片段检测结果与实验室保存的大肠杆菌的阳性对照相符，详见（图3-7）。12345678M2000bp1000bp750bp500bp208bp250bp100bp图3-7分离株大肠杆菌16SrRNA的PCR电泳图片M:MarkerDS2000；1-7：部分大肠杆菌分离株的PCR扩增结果；8：阳性对照Fig3-7PCRelectrophoreticpictureofE.coli16SrRNAisolatedfromisolatedstrainsM:MarkerDS2000;1-7:PCRamplificationresultsofpartialE.coliisolates;8:positivecontrol43 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查3.6.2大肠杆菌16SrRNA同源性比对及分析使用DNAMAN和MEGA5.0等软件，对10株大肠杆菌菌株的核苷酸序列与Genbank中登录的大肠杆菌16SrRNA参考菌株MG270576.1的序列进行比较（见图3-8），10株样品之间的同源性和与参考株MG270576.1的同源性都为95%-99%，说明试验分离纯化的菌株都是大肠杆菌。分离株与参考菌株MG270576.1的序列进行构建进化树，发现与参考菌株都在一个大的分支上，同属于一种菌株。同时对分离株命名为:E1-E10（见图3-9）。图3-8大肠杆菌分离株DNA序列同源性对比分析图Fig3-8HomologyanalysisofDNAsequenceofE.coliisolates图:3-9大肠杆菌分离株的进化树Fig:3-9PhylogenetictreeofE.coliisolates3.5药敏试验结果药敏结果显示：89株分离株对抗生素的敏感性不同，且存在地区差异，石河子145团分离的20株大肠杆菌耐药结果为：耐药率为100%的药物有链霉素、四环素、环丙沙星、氨苄西林、卡那霉素和复方新诺明等；耐药率≥50%的药物有新霉素、阿奇霉素、恩诺沙星和头孢噻肟；石河子148团20株大肠杆菌，耐药率为100%的药物有阿莫西林复方新诺明；耐药率≥50%的药物有链霉素、氨苄西林、庆大霉素、头孢噻肟和洛夫沙星；敏感率＞50%的药物有新霉素和环丙沙星；敏感率为100%的药物是新霉素和环丙沙星。石河子146团16株大肠杆菌，耐药率为100%的药物有链霉素、阿莫西林和复方新诺明；耐药率≥50%的药物有四环素、头孢噻肟和林可霉素；敏感率＞50%的药物有44 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查环丙沙星、阿奇霉素、诺氟沙星等。克拉玛依白碱滩8株大肠杆菌，耐药率为100%的药物有四环素、氨苄西林、庆大霉素、和复方新诺明；耐药率≥50%的药物有新霉素、链霉素、阿奇霉素和恩诺沙星；敏感率＞50%的药物有环丙沙星；敏感率为100%的药物是头孢噻肟；伊犁70团15株大肠杆菌，耐药率为100%的药物有诺氟沙星、氨苄西林、庆大霉素、头孢噻肟、洛夫沙星和复方新诺明；耐药率≥50%的药物有新霉素和阿奇霉素；敏感率＞50%的药物有链霉素。博乐89团10株大肠杆菌，耐药率为100%的药物有四环素、阿莫西林、洛夫沙星和复方新诺明；耐药率≥50%的药物有新霉素、链霉素、环丙沙星、庆大霉素和头孢噻肟；敏感率为100%的药物是阿奇霉素。石河子142团10株大肠杆菌，耐药率为100%的药物有新霉素、四环素、阿奇霉素、诺氟沙星、卡那霉素、头孢噻肟、洛夫沙星和复方新诺明；耐药率≥50%的药物有链霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、阿莫西林、氨苄西林和庆大霉素。表3-2不同场次分离菌株的药敏试验结果Tab3-2Drugsensitivitytestresultsofdifferentfieldisolationstrains抗生素名称ABCDEFGR%(n)R%(n)R%(n)R%(n)R%(n)R%(n)R%(n)新霉素80%10%12.5%50%80%70%100%链霉素100%60%100%50%0%70%70%四环素100%60%56.3%100%100%100%100%环丙沙星100%25%60%25%100%70%100%阿奇霉素80%85%18.7%75%80%0%0%诺氟沙星100%0%50%100%0%70%70%恩诺沙星60%0%12.5%50%100%70%70%阿莫西林100%100%100%100%100100%70%氨苄西林100%90%100%100%100%100%70%卡那霉素100%100%81.3%100%100%70%100%庆大霉素100%85%56.3%100%100%70%70%头孢喹肟60%50%81.3%0%100%70%100%洛夫沙星80%65%12.5%42%58%70%50%复方新诺明100%100%100%100%100%100%100%注：A代表145团分20株离株；B代表148团20株分离株；C代表146团16株分离株；D代表克拉玛依白碱滩8株分离株；E代表伊犁70团15株分离株；F代表博乐89团10株分离株；G代表142团10株分离株。3.6分离株对小白鼠致病力试验结果通过腹腔注射分离菌后，发现4h后试验组小鼠有些已经出现精神萎靡的症状，且不再上蹿下跳，老实的趴在笼子里，呼吸有些急促；10h左右观察发现部分小白鼠的皮毛成柳状，向外炸开，小鼠完全没有精神，依偎在一起蜷缩在角落中，微闭着眼睛，敲打鼠笼小白鼠也没有任何反应，翻动小白鼠，它不跑不动，只剩下微弱的呼吸，有些小45 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查鼠已经死了；17h左右再看小鼠部分死亡，有些小白鼠身体已经发硬，有些身体还有点软；28h左右观察小鼠，有些奄奄一息的小白鼠开始爬动，寻找水源，啃食鼠粮；39h左右观察小白鼠，有些已经活跃起来，上蹿下跳，精神状态又恢复了。对照组小白鼠无一死亡，精神抖擞，食欲极好，无明显变化。剖检死亡小白鼠腹腔无菌采取死亡小白鼠的肝脏，首先进行触片镜检观察细菌形态，并将肝脏组织无菌操作的情况下接种于LB肉汤培养基中进行增菌，可见接种于伊红美蓝培养集中的单个菌落为黑色带金属光泽，与分离株相符菌。表3-3攻毒后不同时间小鼠的累计死亡数Table3-3Thecumulativenumberofdiedmiceatdifferenttimeafterinfection组别0~12h12~24h24~36h36~48h1（n=20）510502（n=20）39353（n=16）23294（n=18）23305（n=14）35426（n=10）33207（n=10）2110对照组（n=14）00004讨论与分析近年来，由于仔猪腹泻导致仔猪死亡率的大幅度上升，给我国乃至世界范围内的养猪产业造成的经济损失不可小觑，严重影响了养猪业的持续健康发展。仔猪腹泻的病因复杂多样，有病毒、细菌、真菌和寄生虫等[112]，而细菌与病毒间的两两混合性感染又加剧了仔猪腹泻的发生。同时，由于饲养管理不当，生活环境差，早晚温差极大，仔猪免疫力不高及其他病原体感染的情况，导致仔猪肠道的菌群平衡被打破扰乱，使得大肠杆菌等条件致病菌有机可乘，最终导致仔猪腹泻的发生[113-114]。本研究通过对北疆垦区7个规模化猪场腹泻仔猪的病样采集，对其进行细菌的分离培养，共检测到大肠杆菌89株，阳性率为100%；通过生化鉴定，发现分离株均符合大肠杆菌生化特性；并且结合PCR方法和16SrRNA序列比对分析，选取的10株样品之间与参考菌株MG270576.1的同源性均为94%-98%，同源性较高，同时在进化图谱上10株检测样品与大肠杆菌参考株均处在同一个大的进化分支上，可以肯定的是分离株均为大肠杆菌，同时也表明大肠杆菌是导致仔猪腹泻的主要细菌性病原。对分离株的致病性试验结果表明，分离株对小鼠的致病性很高，通过健对康小白鼠腹腔接种分离菌的观察，发现大部分小白鼠在10-18h内死亡，其余的小白鼠在36h之内全部死亡，对死亡后小鼠进行剖解发现肠道有出血，通过对死亡小鼠肝脏细菌的鉴定，可发现试验小鼠肝脏中分离的细菌与大肠杆菌的形态特征、生化特性均一致，可以确定46 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查使试验小鼠死亡的正是试验从腹泻仔猪中分离的大肠杆菌菌株。药敏结果显示，7个规模化养殖业得到的分离株对抗生素的耐药性较高，且存在地区差异，石河子145团、伊犁70团和石河子142团中对多数药物表现出较高的耐药性，全部菌株的耐药率均高于50%；石河子146团、克拉玛依白碱滩和博乐89团分别对洛夫沙星，头孢噻肟，阿奇霉素敏感，敏感率＞50%。从结果可以看出北疆垦区部分规模化养殖场的细菌耐药性达到了一个很高的水平，这已经不再是一个地区性的问题，在世界范围内由于抗生素在的大量、不合理的使用，特别是为了促进生长、防控或治疗疾病，在动物饲料和饮水中长期添加抗生素，使抗生素在畜牧业饲料添加剂的使用越来越多而泛，而细菌在这样的选择性压力下大量的耐药性被迫产生了，这些抗菌药物的不合理使用乃至滥用最终会导致各种致病细菌耐药的情况越来越严重，使得疾病无法控制，也为食品安全带来一定的危害，例如动物源性细菌耐药性能借助食物的作用间接或直接感染人体或使感染人体的病原菌携带上这些耐药基因，从而引起人体发病，对人类健康也构成潜在的危害[115]。5小结综上所述，对几个规模化养殖场的防控不能以单纯大量的投药为主，一方面不合理的滥用合成抗菌剂、抗生素等，使生产出来的畜产品中药物残留严重超标，既影响了出口，导致了环境污染，也损害了人类的健康，造成严重的经济损失；另一方畜产品内残留的药物，给人体健康带来很大的潜在危害作用，如引起变态反应和过敏反应，三致作用等。因此，需要合理使用药物，采用联合用药，同时现在中药或中成药的防治效果越来越使人们接受，可以在平时的饲料饮水中加入一些微生态制剂、发酵饲料、苦参等，来提高仔猪免疫力，增强预防疾病的能力。47 北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查全文总结现场流行病学调查、细菌性病原的分离鉴定及病毒性病原的分子流行病学调查结果综合显示，北疆地区7个规模化养殖场仔猪腹泻的主要病原为流行性腹泻病毒和大肠杆菌。现场流行病学调查结果显示，本地区仔猪腹泻的发生较为严重，发病率和死亡率高，存在垂直和水平传播两种方式，有明显的发病季节与诸多的发病诱因。针对流行性腹泻病毒，根据其流行毒株的序列分析结果，结合商品化疫苗的毒株种类，优先选择与流行毒株亲缘关系略近的JX188454.1AJ1102疫苗株进行免疫。针对大肠杆菌性腹泻，结合分离株的药敏试验结果，选择耐药性较低的抗生素，例如头孢喹肟、阿奇霉素、洛氟沙星等药物进行防治。本研究建立的集免疫防控（根据流行毒株筛选疫苗）、药物防治（根据药敏试验筛选药物）及消除各种发病诱因三位一体的综合防控措施，基本控制了试验区猪场仔猪腹泻的大面积爆发，降低了猪场的经济损失。48 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北疆部分地区规模化养殖场仔猪腹泻的流行病学调查作者简介张华雷，男，生于1992年4月6日，籍贯陕西。2015年毕业于石河子大学动物科技学院动物医学专业。2016年9月于石河子大学动物科技学院攻读兽医硕士专业研究生学位，研究方向为兽医技术服务。在学期间发表的文章：张华雷,李慧,李傲寒,张莉.石河子148团某规模化猪场仔猪腹泻病因的调查[J].黑龙江畜牧兽医,待刊.56 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表研究；生姓名张华雷学制二年；业兽医研究方向兽医技术服务学术评语：张华雷同学的论文《北疆部分地ｇ规模化养猪场仔猪腹泻的流行病学调查》采用现场流行病学、分子流行性病学调查及细菌性分离鉴定相结合的方法对北疆部分地区规模化养猪场仔猪腹泻的原因进行研宄并制定了相应的防控措施。结果表明，北疆部分地区规模化猪场仔猪腹泻的主要病原为流行性腹泻病毒和大肠杆菌一，通过免疫防控、药物保健和环境控制为体的综合防控措施，对比本地Ｅ仔猪腹泻的防控提供了重要的理论依据。该论文写作规范，思路清晰，讨论深刻，结论可信。该生的理论知识扎实，对课题方面的知识掌握深入，熟悉本工作的国内外研究动态及本学科领域的前沿知识，能利用所学的知识解决研究工作中的实际问题，具有较强的科研工作能力和实践动手能力，完全达到了硕士学位论文水平。指导教师签字：＾年月日ｆ｜