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1、土壤总DNA的几种提取方法SDS高盐法(方案1) 具体步骤:称取1g土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3次,使土壤颗粒研成粉末;将13.5ml提取缓冲液(0.1mol/L磷酸盐[pH=8.0],0.1mol/LEDTA[pH8.0],0.1mol/LTris-HCl[pH8.0],1.5mol/LNaCl,1.0%CTAB)和50μl蛋白酶K(10g/L)与5g土壤置于50ml的离心管中,放入37℃恒温摇床上,225r·min-1振荡30min;加入1.5ml20%SDS,轻轻混匀,65℃水浴加
2、热2h,每隔15～30min轻轻摇匀1次;5000r·min-1离心10min,将上清液转入新的50ml离心管中;取4.5ml提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5ml20%SDS,65℃水浴15min,用上述同样的离心速度离心10min,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1次;用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000r·min-1离心20min;收集上清液,并加入0.6倍体积的异丙醇,室温静置1h;25℃下12000r·min-1离心20min,倒出上清液,干燥后加入500μl去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA及
3、其杂质,并收集于1.5ml的微型离心管中.变性剂加SDS高盐法(方案2)具体步骤：取1g土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1ml变性剂(4mol/L异硫青酸胍,10mmol/LTris-HCl[pH7.0],1mmol/LEDTA[pH8.0],0.5%2-巯基乙醇);液氮冰冻,研磨至溶解,重复3次;转入50ml离心管中,加入9ml提取缓冲液(0.1mol/L磷酸钠[pH7.0],Tris-HCl[pH7.0],0.1mol/LEDTA[pH8.0],1.5mol/LNaCl,1%CTAB,2%SDS);65℃水浴1h,每10
4、min轻轻混匀1次;5000r·min-1离心10min,取上清;在原管中加入5ml提取缓冲液,混合后,65℃水浴10min,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5000r·min-1离心20min,取上清;加入0.6倍体积的异丙醇,室温沉淀1h;20～25℃,12000r·min-1离心20min,TE溶解沉淀.SDS-酚氯仿抽提法（方案3）称取1g土壤样品，加入1ml0.1mol/lPH8.0磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min
5、，加125μl20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200μlTE溶解。冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4）取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,200mmol/LNaCl,1.0%PVP,2.0%CTAB,PH8.0）,加玻璃珠旋涡5~10min，在液氮中冷却1min后迅速在沸水中煮2min，如此重复3次，13000r/min离
6、心10min。上清夜快速置于冰上备用，沉淀用于进一步裂解。将上述沉淀悬浮于0.2ml提取缓冲液中，旋涡10min，加入溶菌酶（100ml/l）50μl,轻轻混匀后，37C温浴30min，再加入250μlSDS缓冲液（100mmol/lTris-HCl,200mmol/lNaCl,2.0%SDS,PH8.0）,上下颠倒10min，13000r/min离心10min,收集上清夜。二、DNA纯化葡聚糖-200凝胶G离心层析纯化取2ml灭过菌的一次性塑料注射器，用注射器推杆将灭过菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm，然后向注射
7、器筒中加入TE缓冲液浸透的葡聚糖凝胶G-200，制成简式离心层析柱，再置于10ml的离心管中，于高速冷冻离心机上以3000r/min离心20min，去除葡聚糖凝胶G-200中的TE缓冲液，将离心层析柱再置于另一10ml的离心管中，在离心层析柱顶部加入50μl粗土壤DNA，以10min为周期于3000r/min离心，分别收集层析液。层析液浓缩至50μl三、DNA的琼脂糖凝胶电泳证明存在DNA。四、DNA的纯度和定量检测用紫外分光光度计测量纯化后的DNA溶液在波长为230nm、260nm、280nm下的OD值，分别算出A260/A230
8、及A260/A280值。来估计DNA的纯度。五、纯化后土壤DNA的PCR扩增PCR反应体系为50μL,模板为1μL。PCR反应引物（放线菌通用引物）:反应条件:94℃3min预变性;94℃1min,56℃1min,72℃1min,30
