土壤微生物总dna提取方法的优化

《土壤微生物总dna提取方法的优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、ResearchPaper研究报告微生物学报ActaMicrobiologicaSinica52(9):1143－1150;4September2012ISSN0001－6209;CN11－1995/Qhttp://journals．im．ac．cn/actamicrocn土壤微生物总DNA提取方法的优化*赵裕栋，周俊，何璟华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉430070摘要:【目的】土壤中未培养微生物约占总量的99%，这就意味着绝大多数微生物资源还未得到开发和利用。本研究通过优化土壤微生物总DNA

2、的提取方法，获得较高质量的DNA，为后期研究土壤微生物的多样性及构建大插入片段的宏基因组文库奠定基础。【方法】通过综合比较已报道的微生物DNA提取方法的优缺点，我们设计出一种新的提取方案。对提取过程中的几个关键步骤进行了优化，包括联合使用SDS-CTAB和溶菌酶一起来破细胞，利用氯仿除蛋白，使用PVPP柱纯化DNA等。比较分析了优化后的方法和3种已报道方法所获得的土壤总DNA的产量、纯度及片段大小。【结果】优化后的方法所获得的土壤DNA质量明显有所提高:每克土壤最高能提取95μgDNA，A260/A280和

3、A260/A230比值更接近理想水平，PCR扩增能够得到明显的目标条带，DNA片段最大能达到100kb左右。【结论】通过比较分析，最终确立了一种较理想的土壤微生物总DNA提取方法，为更好地开发利用土壤未培养微生物资源提供了有力工具。关键词:土壤微生物，eDNA抽提，DNA的产量及质量，PCR扩增，大片段DNA中图分类号:Q93-3文献标识码:A文章编号:0001-6209(2012)09-1143-08土壤是自然环境中最复杂的异质体系，蕴含着基因组学在该领域的应用，利用分子生物学的研究丰富的微生物资源并表现

4、出高度的多样性，每克土方法绕过了传统培养方法的局限，直接研究微生物壤中含有几千到上百万种不同的基因组信息，近10的多样性及功能，为土壤微生物更全面的研究开辟［1－2］［6－7］亿的细菌细胞。土壤微生物不仅在生态循环系了新局面。统中扮演着重要的角色，而且一直以来都是结构独土壤微生物的研究，尤其是一些未培养微生物特多样、生物活性丰富的天然产物的重要来源之的基因资源信息以及分子生态学信息分析，很大程［3］一。目前人们对土壤微生物的基因组、代谢和多度上依赖于有效的且无偏好性的eDNA样性了解的仍然很少。长期以来，对

5、土壤微生物的(environmentalDNA)提取方法。然而，土壤样品含［8］研究仅限于极少部分可培养的微生物。实际上，绝有非常复杂的成分，微生物细胞可能与土壤颗粒大多数环境微生物都是不可或很难被培养的，利用紧密结合，而且土壤中富含腐殖酸等有机物质，这些传统的培养方法研究土壤微生物多样性及基因资源都会影响高产量、高纯度的大分子量土壤DNA的获［9］信息，具有很强的偏好性，因为可培养的微生物只占得。尤其是在提取过程中，腐殖酸、酚类化合物、［4－5］自然界微生物总量的0.01%－10%。随着宏重金属离子、不明

6、沉淀物等杂质很难除去，直接影响基金项目:国家自然科学基金(30800020，30970059);教育部留学回国人员科研启动基金项目(［2009］1590);教育部新世纪人才支持计划项目(NCET-08-0779);中央高校基本科研业务费专项资金项目(2009PY006)*通信作者。Tel:+86-27-87280163;E-mail:hejingjj@mail．hzau．edu．cn作者简介:赵裕栋(1986－)，男，江西省九江人，2009级硕士研究生，研究方向为土壤微生物宏基因组学。E-mail:zyd3

7、894816@yahoo．cn收稿日期:2012-03-31;修回日期:2012-05-111144YudongZhaoetal．/ActaMicrobiologicaSinica(2012)52(9)［10］［13－14］后续的PCR扩增、DNA杂交、内切酶消化等。研产率很低，而且片段大小往往小于20kb，不适究者尝试过多种多样的提取eDNA方法，根据微生合于大型基因簇、调控网络及基因组相关性的研究。物细胞壁裂解方法的不同，主要可分为三大类:(1)因此，确立高效且无偏好性的土壤微生物总DNA的物理方法(研

8、磨、高温、超声波等)，(2)化学方法(高提取方法，对土壤微生物的宏基因组学具有重要的盐浓度SDS法等)，(3)酶裂解法(蛋白酶K、溶菌酶意义。［11］等)。根据实验目的不一样，各种方法均有优缺本研究在比较现有提取方法优缺点的基础上，点。利用物理方法得到的DNA片段往往偏小，只有建立了一种优化土壤微生物总DNA提取的方案。［8］5－10kb左右，且DNA的产率较低，不适合推广。并对不同提取方法所获得的土壤总DNA的