黑龙江省双鸭山地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查

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中图分类号学校代码１０２２４密级公开学号２０１３０６１６２圭＃条誉聲专业学位硕士学位论文黑龙江省双鸭山地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查作者邹昊博导师徐世文高佃平学位类别兽医硕士所在学院动物医学学院研究领域不分领域学习方式非全日制二〇一八年六月 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书一使用过的材料。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期対年４月Ｇ日印ＩｆｌＳ学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：１＾１谓Ｓ期：Ｗ脾如／曰］导师签名：戈曰期：知乂年＜月曰之乃 ClassifiedIndex：Code：10224Confidential(yes/no)：noNo.201306162DissertationfortheProfessionalMasterDegreeEpidemiologicalInvestigationofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeinShuangyashanCity,HeilongjiangProvinceCandidate:ZouHaoboSupervisor:Prof.XuShiwen＆GaoDianpingDegreeCategory:MasterofVeterinaryCollege:VeterinaryMedicineResearchField:NoFieldStudyMode:Part-TimeHarbinChinaJune2018 目录摘要..............................................................................................................................................I英文摘要.....................................................................................................................................III1引言...........................................................................................................................................11.1蓝耳病的历史和分布..........................................................................................................11.2蓝耳病的流行特点.............................................................................................................21.2.1流行病学......................................................................................................................21.2.2临床症状......................................................................................................................31.2.3病理变化......................................................................................................................31.3蓝耳病的致病机理.............................................................................................................31.4蓝耳病病毒的分类地位......................................................................................................41.5PRRSV的病原学特性和生物学特性..................................................................................41.5.1PRRSV的病原学特性..................................................................................................41.5.2PRRSV的生物学特性..................................................................................................51.6蓝耳病病毒基因组编码的蛋白及病毒复制过程................................................................51.6.1病毒蛋白......................................................................................................................51.6.2病毒复制过程..............................................................................................................71.7蓝耳病的诊断.....................................................................................................................71.7.1病原学检测..................................................................................................................71.7.2血清学检测..................................................................................................................71.7.3存在问题及发展趋势...................................................................................................81.8研究的目的与意义.............................................................................................................82材料与方法.............................................................................................................................102.1材料..................................................................................................................................102.1.1样品来源....................................................................................................................102.1.2试剂盒........................................................................................................................102.1.3工具酶及相关试剂....................................................................................................102.1.4主要仪器与实验设备.................................................................................................102.2实验方法...........................................................................................................................112.2.1问卷调查....................................................................................................................112.2.2PRRS的血清学抗体检测...........................................................................................132.2.3PRRS的病原学检测...................................................................................................142.2.4PRRS综合防控效果对比...........................................................................................143结果.........................................................................................................................................173.1调查问卷的发放与回收....................................................................................................173.2双鸭山市PRRS血清学抗体检测.....................................................................................19I 3.2.1不同地区PRRSV抗体的检测结果............................................................................193.2.2不同季节猪只PRRSV抗体的检测结果....................................................................223.2.3不同生长阶段猪只PRRSV抗体的检测结果.............................................................223.3双鸭山市PRRS的病原学检测.........................................................................................233.3.1PCR检测结果.............................................................................................................233.3.2不同地区样品的病原学检测结果..............................................................................243.3.3不同生长阶段猪只的PRRS病原学检测结果...........................................................263.3.4PRRS综合防控效果对比结果....................................................................................264讨论.........................................................................................................................................284.1黑龙江省双鸭山地区PRRS的流行病学特点..................................................................284.2RT-PCR和ELISA两种方法检测PRRSV的应用............................................................294.3不同防控措施的效果比较................................................................................................305结论.........................................................................................................................................32致谢............................................................................................................................................33参考文献.....................................................................................................................................34攻读硕士学位期间发表的学术论文...........................................................................................43II CONTENTSAbstractinChinese......................................................................................................................IAbstractinEnglish....................................................................................................................III1Introduction..............................................................................................................................11.1ThehistoryanddistributionofPRRS...................................................................................11.2TheepidemiccharacteristicsofPRRS..................................................................................21.2.1Epidemiology................................................................................................................21.2.2Clinicalsymptoms.........................................................................................................31.2.3Pathologicalchanges.....................................................................................................31.3PathogenesisofPRRS..........................................................................................................31.4TheclassificationstatusofPRRSV......................................................................................41.5EtiologicalandbiologicalcharacteristicsofPRRSV............................................................41.5.1TheetiologicalcharacteristicsofPRRSV......................................................................41.5.2ThebiologicalcharacteristicsofPRRSV.......................................................................51.6ThegenomeencodedproteinandvirusreplicationprocessofPRRSV.................................51.6.1Viralproteins.................................................................................................................51.6.2Virusreplicationprocess................................................................................................71.7DiagnosisofPRRS...............................................................................................................71.7.1Etiologicaldetection......................................................................................................71.7.2Serologicaldetection.....................................................................................................71.7.3Theexistenceproblemanddevelopmenttendency.........................................................81.8Thepurposeandsignificanceofthisstudy...........................................................................82MaterialsandMethods...........................................................................................................102.1Materials............................................................................................................................102.1.1Samplesource.............................................................................................................102.1.2Kit...............................................................................................................................102.1.3Toolsandrelatedreagents............................................................................................102.1.4Themainlaboratoryapparatusandequipments............................................................102.2Experimentalmethods........................................................................................................112.2.1Questionnaire..............................................................................................................112.2.2SerologicalinvestigationofPRRS...............................................................................132.2.3EtiologicalinvestigationofPRRS................................................................................142.2.4PRRScomprehensivepreventionandcontroleffectcomparison..................................143Resultsanalysis.......................................................................................................................173.1Questionnairedistributionandrecycling............................................................................173.2TheserologicalinvestigationofPRRSinShuangyashanCity.............................................193.2.1ResultsofPRRSVdetectionindifferentareasofShuangyashanCity..........................19III 3.2.2ResultsofPRRSVdetectionindifferentseasonsofShuangyashanCity......................223.2.3ResultsofPRRSVdetectionatdifferentgrowthstagesofShuangyashanCity.............223.3TheetiologicalinvestigationofPRRSinShuangyashanCity.............................................233.3.1ResultsofPCRtest......................................................................................................233.3.2Resultsofsampleetiologytestindifferentregions......................................................243.3.3Resultsofetiologicaltestatdifferentgrowthstages....................................................263.3.4PRRScomprehensivecontroleffectcomparisonresults...............................................264Discussion................................................................................................................................284.1EpidemiologicalCharacteristicsofPRRSinShuangyashanCity,HeilongjiangProvince....284.2ThepracticalityofRT-PCRandELISAmethodstotestPRRSV.........................................294.3Comparisonofeffectsofdifferentpreventionandcontrolmeasures...................................305Conclusion...............................................................................................................................32Acknowledgement......................................................................................................................33References..................................................................................................................................34PaperpublishedintheperiodofPh.M.education...................................................................43IV 摘要猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸综合征”（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性高致死性猪传染病。该病毒不仅致病力非常强，传播速度也极快，猪群发病率极高，猪只感染后表现为体温迅速升高到40℃以上，精神沉郁，呼吸困难、败血症和共济失调等症状，还有的猪只耳和躯体末端发绀。发病率可达100%，死亡率可达50%以上，母猪流产率达30%以上。猪只一旦感染猪繁殖与呼吸综合征病毒，绝大多数会长期带毒，且难以消灭，可导致重大的经济损失。本研究采用问卷调查、ELISA方法以及PCR方法对黑龙江省双鸭山地区规模化养猪场、散养户的猪血清样品、病料、拭子样品、粪便样品进行检测，初步了解该病在双鸭山地区的流行情况，并根据临床实践，总结防控猪繁殖与呼吸综合征的技术措施，为该市各养猪户提供参考。本研究从2016年10月至2017年10月，对黑龙江省双鸭山市8个县（区）内存栏量500头以上的59个规模化养猪场以及散养殖户341户进行数据采集，采集包括保育猪、生长育肥猪、后备母猪和种猪四种不同生长阶段的猪群。通过问卷调查的方式进行流行病情况调查，为进一步开展血清学调查和病原学调查奠定基础。调查内容包括猪群基本信息，临床症状、治疗情况、消毒情况、免疫情况、疫病史、自然环境和发病猪舍的情况等。总共发出了400份调查问卷表，回收372份。从回收到的调查问卷表的统计结果看，临床上确诊为PRRS的总共有20份，占回收调查问卷表的5.38%。说明双鸭山地区部分猪场（户）的猪只临床上具有猪繁殖与呼吸障碍综合征的症状。在此期间内不间断地从黑龙江省双鸭山市宝清县、友谊县、集贤县和饶河县，四方台区、宝山区、岭东区以及尖山区共8个县（区）共采集临床表现健康且未进行PRRSV疫苗接种的猪血清样品780份。其中，存栏量500头以上的27个规模化养猪场采集到496份血清样本，存栏量500头以下的散养殖户53户共采集到血清样本284份，应用酶联免疫吸附试验进行PRRS抗体检测。结果显示153份血清样品阳性，阳性率为19.62%，其中，规模化养猪场的阳性率为19.76%，散养殖户的阳性率为19.37%，27个规模化养猪场中有15个场，53户散养殖专业户中有37个场的血清样品抗体检测全为阴性。根据统计结果显示，4~7月为该病的发病高峰期，不同日龄的猪群均可感染，以保育猪发病率最高。规模化养殖场的PRRSV感染率低于散养殖户。自2016年10月至2017年10月间不间断地从黑龙江省双鸭山地区的部分猪场无菌采集发生疑似PRRSV感染且未进行PRRSV疫苗接种的160头病死猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织器官，应用RT-PCR方法进行病原检测，结果显示有34份病料PCR检测结果为PRRSV阳性，阳性率为21.25%。同时随机采集外观正常健康无临床症状且未进行PRRSV免疫的30个猪场猪只样品，包括鼻拭子和粪便共156份进行病原检测，结果确诊为PRRSV感染的共有24份，阳性率为15.38%；阳性猪场数为9个，阳性率为30.00%。自2017年10月至2018年4月针对蓝耳病的防治，对宝清县、友谊县、集贤县和饶河县四个地区开展了一系列综合防控措施，同时也对以上四个地区按原有方式进行饲养管理，不间断地从黑龙江省双鸭山地区的部分猪场无菌采集发生疑似PRRSV感染且未进行PRRSV疫苗接种的180头病死猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织器官进行病原检测。I 结果显示阳性样品数为35份，其中在加强饲养管理条件的宝清县、友谊县、集贤县以及饶河县四个地区阳性数为14份，阳性率为15%，四个地区的阳性率均有所下降，按原有方式饲养管理的地区宝清县、友谊县、集贤县以及饶河县阳性数为21份，阳性率为23%，四个地区蓝耳阳性率基本保持不变。通过以上调查表明猪繁殖与呼吸综合征在该市各大小猪场均有所存在，是该市养猪业健康发展的一大潜在危险，一旦大面积爆发流行，将造成巨大损失。因此，做好诸多防控措施以应对病毒的感染和传播是非常必要的。根据此次调查走访过程中出现的问题总结出以下防控综合措施：做好猪场几种主要疫病的免疫工作，确保免疫效果；加强生物安全措施以及饲养管理；感染后控制细菌继发感染；血清学阳性或病原学检测阳性但未见明显临床症状的猪场，应做好各阶段猪只的药物保健，尽可能淘汰带毒猪只，以保证猪群健康。关键词：PRRSV；流行病学调查；RT-PCR；ELISA；防控措施II EpidemiologicalInvestigationofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeinShuangyashanCity,HeilongjiangProvinceAbstractPigblueeardisease,alsoknownas"porcinereproductiveandrespiratorysyndrome"(PRRS),isanacute,highfatalswineinfectiousdiseasecausedbytheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV).Thevirusnotonlyhasverystrongpathogenicity,butalsohasanextremelyfastspreadrate.Thepigpopulationhasaveryhighincidence.Afterthepigbecomesinfected,itshowsarapidincreaseinbodytemperatureabove40°C,depression,dyspnea,sepsisandataxia.Otherpigshavepurpleearsandhairends.Theincidenceratecanreach100%,themortalityratecanreachmorethan50%,andthesowabortionratecanreachmorethan30%.Oncepigsbecomeinfectedwithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,thevastmajorityofthemarechronicallypoisonedanddifficulttoeliminate,leadingtosignificanteconomiclosses.Inthisstudy,aquestionnairesurvey,ELISAmethod,andPCRmethodwereusedtotestswineserumsamples,diseasesamples,swabsamplesandfecalsamplesfromlarge-scaleswinefarmsandfree-ranginghouseholdsinShuangyashanCity,HeilongjiangProvince.ApreliminaryunderstandingoftheepidemicsituationinShuangyashanwasconducted,andaccordingtotheclinicalpractice,thetechnicalmeasuresforthepreventionandcontrolofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeweresummarizedandprovidedreferenceforpigfarmersinourcity.FromOctober2016toOctober2017,thisstudycollecteddatafrom59large-scalepigfarmswithmorethan500stocksand341householdsin8counties(districts)ofShuangyashanCity,HeilongjiangProvince.Thecollectedspeciesincludednurserypigs,growingpigs,giltsandbreedingpigsinfourdifferentgrowthstages.Thesurveyofepidemiologicalconditionswasconductedthroughaquestionnairesurveytolaythefoundationforfurtherserologicalsurveysandetiologicalinvestigations.Theinvestigationincludedbasicinformationofthepigs,clinicalsymptoms,treatmentstatus,disinfection,immunization,historyoftheepidemic,conditionsofthenaturalenvironmentandthediseasedpighouse.Atotalof400questionnaireswereissuedand372wererecovered.Fromthestatisticalresultsofthequestionnairesretrieved,thereare20clinicallydiagnosedPRRSVs,accountingfor5.38%ofthequestionnaires.ItshowsthatpigsinsomepigfarmsinShuangyashanCityhaveclinicalsymptomsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome.Duringthisperiod,clinicalperformancewascollectedfromeightcounties(districts)inBaoqingCounty,YouyiCounty,JixianCounty,RaoheCounty,ShuangyataiDistrict,BaoshanIII District,LingdongDistrict,andJianshanDistrict,ShuangyashanCity,HeilongjiangProvince.780serumsamplesofpigsthatwerehealthyandnotPRRSV-vaccinated.Amongthem,496serumsampleswerecollectedfrom27large-scalepigfarmswithapopulationofmorethan500,and284serumsampleswerecollectedfrom53householdswithatotalpopulationoflessthan500.TheELISAwasusedtodetectPRRSantibodies.Theresultsshowedthat153serumsampleswerepositive,withapositiverateof19.62%.Amongthem,thepositiveratewas19.76%inlarge-scalepigfarms,and19.37%inscatteredfarmers.15farmsin27large-scalepigfarmsand37farmsinthe53specializedbreedinghouseholdsthatserumsampleswereallnegativeforantibodytesting.Accordingtostatistics,fromApriltoJulyisthepeakperiodofthedisease,pigsofdifferentagescanbeinfectedandnurserypigshavethehighestincidence.ThePRRSVinfectionrateofthescaledfarmsislowerthanthatofthescatteredfarmers.FromOctober2016toOctober2017,lung,liver,spleen,andlymphnodetissuesof160deadpigswithsuspectedPRRSVinfectionwereasepticallycollectedfromsomepigfarmsinShuangyashanCity,HeilongjiangProvince.Theresultsshowedthat34casesofPCRdetectionresultswerepositiveforPRRSV,andthepositiveratewas21.25%.Atthesametime,randomsamplesofpigsfrom30pigfarmswithnormalappearanceandnoclinicalsymptoms,includingnasalswabsandfecessamples,wereusedforpathogendetection.Theresultsconfirmedthattherewere24PRRSVinfections,withapositiverateof15.38%;thenumberofpositivepigfarmswas9andthepositiveratewas30.00%.Theaboveinvestigationshowsthatpigreproductiveandrespiratorysyndromeispresentinallpigfarmsinthecity.Itisapotentialriskforthehealthydevelopmentoftheswineindustryinourcity.Onceawidespreadoutbreakoccurs,itwillcausehugelosses.Therefore,itisnecessarytodoalotofpreventionandcontrolmeasurestodealwiththeinfectionandspreadofthevirus.Accordingtotheproblemsduringthesurveyvisit,thefollowingcomprehensivemeasuresforpreventionandcontrolweresummedup:Doagoodjobofimmunizationworkonseveralmajordiseasesofpigfarmstoensureimmunizationeffects;Strengthenofbiosafetymeasuresandfeedingandmanagement;Controlofsecondarybacterialinfectionsafterinfection;Forpigfarmsthatarepositiveforserologyorpositiveforetiologicaldetectionbutdonothaveobviousclinicalsymptoms,thepigsindifferentgrowthstagesshouldbewell-preservedandpigswiththevirusshouldbeeliminatedasfaraspossibletoensurethehealthofthepigs.Keywords:PRRSV;EpidemiologicalInvestigation;RT-PCR;ELISA;PreventionandcontrolmeasuresCandidate:ZouHaoboSpeciality:VeterinaryMedicineSupervisor:Prof.XuShiwen＆GaoDianpingIV 1引言猪蓝耳病也称“猪繁殖与呼吸综合征”（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性高致死性猪传染病，感染的母猪和仔猪因为出现蓝耳而得名“蓝耳病”。该病毒不仅致病力强，而且传播速度极快，猪群发病率极高，常常引起大批的仔猪死亡[1]。临床上主要表现为妊娠母猪的流产、早产、死胎以及木乃伊胎和仔猪的呼吸道症状为主要特征，是目前猪场猪繁殖与呼吸疾病的主要原因之一[2,3]。PRRSV是一种表面有囊膜的RNA病毒，临床上主要表现为猪的呼吸和繁殖功能障碍，使猪的免疫功能大幅度的下降。仔猪感染后表现为体温迅速升高至40℃以上，精神沉郁，呼吸困难、败血症，共济失调等症状，还有的仔猪耳呈紫色和躯体末端发钳。发病率可达100%，死亡率可达50%以上，母猪流产率达30%以上。猪只一旦感染猪繁殖与呼吸综合征病毒，绝大多数会长期带毒，且难以消灭，可导致重大的经济损失。PRRS除了本身引起猪的疾病外，由于它能侵害宿主的免疫系统，抑制猪的免疫功能。所以，它还能够继发猪流感、猪圆环病等，加重猪的病情。本病最早于1987年在美国的北卡罗林那州和依荷华州暴发流行[4,5]。以后，本病不断在各国出现，1987年秋季的加拿大，1989年的日本，1990年的德国，1991年的荷兰，西班牙、法国和英国暴发流行，希腊，澳大利亚也相继报道了此病[6-11]。我国在1995年首次发现PRRS疑似病猪，一年后，郭宝清等学者从国内疑似的PRRSV感染猪群中成功分离出PRRSV，从而从证实了蓝耳病在我国的存在[12,13]。到2010年为止，我国大部分的省市都间隙性的有PRRS的报道[14]。目前该病已是规模化猪场重点防范的重大传染病之一。1.1蓝耳病的历史和分布PRRS是由PRRSV引起的以孕猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等，仔猪和育肥猪呼吸道疾病为特征的猪的高度接触性传染病[15,16]。该病于八十年代末期和九十年代同时在北美与西欧被报道首次爆发[17,18]，从此以后，这种疾病就迅速传播到世界其他地区[19]，同时新型的强毒变异株不断的进化并在全球引起该疾病新的爆发。1991年，Wensvort首次分离到PRRSV，并将其命名为Lelystandvirus（LV）[20]；1992年，Collins和Benfield等利用传代细胞系CL2621分离到PRRSV，并命名为ATCC-VR2332[21]。目前，该病在绝大多数养猪地区均有报道，并且在世界范围内影响了养猪业发展，每年造成巨大的经济损失[22]。在美国，每年因猪繁殖与呼吸综合征造成的损失超过5亿美元。特别是2006年在中国和越南发现的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒迅速蔓延至周边国家，给全球养猪业带来极大挑战[23-25]。而回顾我国PRRSV的流行历程，其先后经历了经典猪繁殖与呼吸综合征流行期、高致病性猪繁殖与呼吸综合征流行期、多种基因型PRRSV的稳定控制期。当前，我国猪繁殖与呼吸综合征的流行形势表现为点状散发，国内猪场以高致病性PRRSV流行为主，由于养殖户防控意识增强、诊断技术成熟和疫苗的科学使用，大规模爆发流行的风险较低。但是，该病亚临床感染或隐性感染在我国猪场普遍存在。因此，该病的防控仍是兽医工作者的研究重点之一。1 1.2蓝耳病的流行特点1.2.1流行病学美国于1987年首次报道了PRRS，但一项回溯研究表明PRRSV在1980~1985年间就已经入侵爱荷华州的猪群。此后，该病在北美于1989年达到流行高峰，随后发病率下降。德国于1990年发现了该病，随后欧洲在1991年达到流行高峰[26]。1991年初我国台湾地区出现此病。郭宝清博士等1996年首次从流产胎儿中分离到PRRSV，从而证实我国也存在该病[27]。该病在国内所有省份均有不同程度的发生，特别是2006年以来，我国暴发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫情，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[28-30]。目前，该病在全世界主要养猪地区均已发现，且流行后病毒可在多数猪群中持续存在。PRRSV主要有三种传播途径，即接触传播、空气传播及精液传播。猪感染PRRSV后15周内均可通过接触向其他易感猪只传播病毒[31]。接种病毒157天后仍可从口咽样品中分离到病毒，证明病毒可在上呼吸道或扁桃体长期存在[32]。因此，临床无症状的带毒猪只是该病的重要病毒来源。易感公猪受到感染后会在精液中长期携带病毒。利用RT-PCR方法在感染92天后的公猪精液中检测到了病毒RNA[33]，且人工授精也会使得PRRSV向母猪传播。本病是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。目前来看，猪是唯一能够感染PRRSV同时具有临床反应的自然宿主，其中包括了各个品种以及各个年龄和用途的猪群，但最容易被感染的还应该是妊娠母猪以及小月龄仔猪。最近几年里，育肥猪感染PRRSV的几率有所提高，而且具有高死亡率特征，在20~80公斤的猪身上都可出现[34]。耐过的猪只生长发育停滞，能长期带毒。营养条件好，健康状况好的猪群通常是隐性带毒或持续感染。患病猪及带毒猪是该病的重要传染源，主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可以通过胎盘垂直传播。易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉以及子宫内接种等多种途径而感染病毒，猪感染病毒后2~14周均可通过接触将病毒传播给其他易感猪。从病猪的鼻腔、粪便以及尿液中均可检测到病毒。易感猪与带毒猪直接接触或与污染有PRRSV的运输工具、器械接触均可受到感染。感染猪的流动也是本病的重要传播方式。持续性感染是PRRS流行病学的重要特征，PRRSV可在感染猪体内存在很长时间。高致病性PRRSV传播和流行的重要特征是持续排毒和感染。PRRS多发于春、秋两季，盛夏更为严重，其实低温或高温均可发生本病，如东北比较寒冷地区，冬天猪舍为了避寒有的关窗，导致空气流通不好，容易发病。其临床表现趋于复杂化，由流产风暴型转向混合感染高热型。高致病性PRRSV在我国发展速度快，流行范围从主要分布在南方扩大至华东、华北，东北[35]。其具备两种主流传播方式，一个是水平传播，包括和患病猪相接触以及空气传播等；另一个是通过精液和胎盘垂直传播，这也是重要的传播途径。有实验结果证明母猪可以被精液传染上PRRSV病毒[36,37]。持续性感染是猪蓝耳病在流行病学上的一个重要特征。病毒在猪群中生存、循环及再次传播，造成感染及未感染猪之间的直接或间接接触传播，尤其是引进带病毒血症的后备种猪与原猪群的平行和垂直传播为其主要传播途径；不同的猪群还可以通过感染公猪精液传播。带毒母猪的血液、淋巴结、脾脏及肺脏的组织中病毒可存在很长时间，向外排毒达2 112天之久。病毒可通过胎盘和精液传播，其妊娠母猪产下的仔猪有的可成活，但长期带毒，在猪群中表现出持续性感染，并将长期存在。隐形感染的种猪长期带毒，既可发生垂直传播，又能进行水平传播，其危害性更大，这样的猪群随时都有发生种猪繁殖障碍和呼吸道病的问题。在临床上常见蓝耳病和圆环病毒Ⅱ型或猪瘟病毒等混合感染。常继发的病原有猪副嗜血杆菌、链球菌和多杀性巴氏杆菌等，呈现双重感染或多重感染，引起较大死亡。PRRSV感染可降低肺泡巨噬细胞的功能，诱导感染细胞的凋亡，造成猪体免疫抑制，产生免疫麻痹和免疫耐受。PRRSV对猪瘟弱毒疫苗和气喘病活菌苗的免疫应答能产生干扰作用，降低免疫效果。1.2.2临床症状根据病的严重程度和病程不同，临床表现症状各不相同。母猪初期精神倦怠、厌食、发热。妊娠后期发生早产、流产、死胎、木乃伊胎及弱仔，常造成不育或者产奶量下降，少数猪耳部发紫，皮下出现一过性血斑，有的甚至出现肢体麻痹性神经症状。感染的仔猪症状明显，死亡率可高达50%以上，早产仔猪在出生后当时或几天内死亡，大多数初生仔猪表现嗜睡、呼吸困难、肌肉震颤、后肢麻搏、共济失调、打喷噴以及神经症状，有的仔猪耳紫和躯体末端皮肤发绀。耐过猪长期消瘦，生长缓慢。育肥猪双眼肿胀、结膜炎和腹汚，有的表现厌食、咳嗽和呼吸困难。无继发感染死亡率普遍不高，但若发生继发性感染，可使症状加剧，出现生长缓慢或死亡。种公猪感染后表现咳嗽、喷嚏、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促和运动障碍、性欲减弱、精液质量下降、射精量少等症状。1.2.3病理变化剖检主要病变常见肺弥漫性间质性肺炎，并伴有细胞浸润和卡他性肺炎区，肺水肿，在腹膜以及肾周围脂肪、肠系膜淋巴结、皮下脂肪和肌肉等处发生水肿。在显微镜下观察，可见鼻激膜上皮细胞变性，纤毛上皮消失，支气管上皮细胞变性，肺泡壁增厚，膈有巨唆细胞和淋巴细胞浸润。母猪可见脑内灶性血管炎，脑髓质可见单核淋巴细胞性血管套，动脉周围淋巴銷的淋巴细胞减少，细胞核破裂和空泡化。1.3蓝耳病的致病机理PRRSV作为原发病毒通过呼吸道或生殖道进入猪机体后，侵入肺泡巨噬细胞，PRRSV侵染细胞先是需要与猪肺泡巨噬细胞相关受体相结合，之后被细胞吞噬之后可进入其中，随着细胞的破裂，崩解，凋亡，使巨噬细胞数量减少，肺泡壁增厚，病毒在肺泡巨噬细胞、淋巴结等处大量增殖，进入血液循环，结果可导致病毒血症的出现，包括皮肤出血以及坏死等，还有全身性的淋巴结感染[38]。短短几个小时就会对肺淋巴结造成较大损伤，常见的是特征性间质性肺炎，还会有全身淋巴结肿大的症状。猪肺泡巨噬细胞（PAM）是病毒入侵的关键，PRRSV通过膜表面的GP5蛋白借助唾3 液粘附素等受体与PAM上的相应受体结合，经过内吞作用进入细胞内，PRRSV在细胞内不断增殖，最终导致细胞崩解，病毒释放出来，随淋巴液和血液到达全身，并在相应的组织内增殖，导致全身淋巴结感染和病毒血症的发生，造成组织器官损伤。PRRSV感染猪后，T细胞亚群中的CD4+细胞数目减少，而CD8+细胞数目增加，CD4+/CD8+呈下降趋势。PRRSV还可以感染一些不同类型的树突状细胞，但由于单核细胞中缺乏病毒受体，因此PRRSV不易感染单核细胞[39-45]，病毒感染后造成免疫抑制，进而继发其他病毒或病原菌的感染。PRRSV可使感染的细胞发生凋亡，炎性因子和GP5可以诱导未感染的细胞发生凋亡[46-48]，但病毒导致细胞凋亡的机制和感染机理目前还不清楚[49]。1.4蓝耳病病毒的分类地位PRRSV在分类学上属于动脉炎病毒科，动脉炎病毒属[50]。欧洲毒株和美洲毒株都包括在该病毒分类之内，虽然二者在形态和理化性质上相似，但用多克隆猪抗体和小鼠单克隆抗体进行血清学试验，证实二者在抗原上有差异[51]。欧洲分离株仅能适应于猪肺巨噬细胞上，并能产生细胞病变（CPE），美国分离株（VR-2332）可在CL-2621、MarC-145、MA-104细胞系培养，并能出现CPE。因此，将PRRSV分为A、B两个亚群，分别为欧洲原型和美国原型[52]。1.5PRRSV的病原学特性和生物学特性1.5.1PRRSV的病原学特性1.5.1.1病毒学分类与病毒的结构特性PRRSV为不分节段的、单股正链、有脂质囊膜的RNA病毒，基因组全长约15.0Kb,其中含10个开放阅读框架[54-56]（ORFs），PRRSV的基因组结构示意图详见图1-1。在电镜下观察能够发现纯化病毒粒子的外形为圆形或者是椭圆形，直径一般是45~80nm，在表面上有约5nm的突起，外绕一层脂质双层膜[57]（如图1-2）。图1-1PRRSV基因结构示意图Fig.1-1GenomicorganizationofPRRSV4 图1-2电镜下的病毒粒子图Fig.1-2Electronmicroscopyofvirusparticles1.5.1.2PRRSV的理化特性PRRSV在低温下有较好的稳定性，-220℃~270℃可保存病毒，在-270℃条件下病毒可保存4个月以上其感染性不变；但其热稳定性差，56℃经45min完全失去致病性；干燥条件下PRRSV会迅速失去感染性，潮湿环境则有助于其存活；PRRSV对pH敏感，不耐酸碱，当pH大于7或者pH小于5时，病毒感染力丧失，在pH大于6.5小于7.5环境中该病毒稳定存在[58-62]。氯仿、乙醚等脂溶剂和去垢剂能有效降低PRRSV病毒活性，使其不能复制。根据PRRSV对温度和酸碱度的敏感性，若要保存病毒，应将病毒培养液置于低温环境中（-70℃或液氮中），同时要保证保存液的pH值在6.5~7.5。组织器官应保存在-70℃的环境中。1.5.2PRRSV的生物学特性PRRSV只能在猪原代肺巨噬细胞（PAMC）、外周血单核细胞，肺血管巨噬细胞（PIM）原代细胞和传代细胞系MARC-145、ATCC-CL2621以及HS2H细胞等少数细胞上生长。PRRSV能够针对肺巨噬细胞（PAMC）、单核细胞（PBMC）以及小胶质细胞大部分亚群形成显著的限制性亲嗜性[63]。其中，最容易被列为靶细胞的就是PAMC，通过细胞分化以及活化能够对易感性产生较大影响。1.6蓝耳病病毒基因组编码的蛋白及病毒复制过程1.6.1病毒蛋白PRRSV的非结构蛋白由位于5’端约占病毒基因组2/3的ORF1编码，ORF1有两个ORF组成：ORF1a和ORF1b，分别编码pp1a和pp1b。正常翻译产生的pp1a后来被水解为10个非结构蛋白[64]（nsp1α,nsp1β,nsp2-6,nsp7α,nsp7β,nsp8）。pp1ab最终水解成13个蛋白5 （nsp1α,nsp1β,nsp2-6,nsp7α,nsp7β,nsp9,nsp10,nsp11,nsp12）。NSP8和NSP9在N端享有共同的氨基酸序列[67,68]。非结构蛋白pp1a的处理与快速酶原与nsp1α,nsp1β,nsp2有关[69]，其他非结构蛋白的处理则与nsp4有关[70,71]。PRRSV主要结构蛋白：病毒粒子含有大量的GP5、M蛋白以及衣壳蛋白。GP5和M蛋白间形成二硫键进行连接，共同组成病毒粒子的主要糖蛋白复合体[72,73]。GP5或M蛋白在形成病毒粒子的过程中两者缺一不可[74,75]。衣壳蛋白仅存在于病毒的核衣壳，包裹着病毒基因组。共表达GP5、M蛋白和核衣壳时不能形成PRRSV病毒样颗粒，表明形成病毒粒子还需要其他组分[76-78]。蛋白结构如图1-3所示，蛋白间相互作用如图1-4所示：图1-3蛋白结构示意图Fig.1-3Proteinstructurediagram图1-4蛋白相互作用示意图Fig.1-4Proteininteractiondiagram6 1.6.2病毒复制过程同其他RNA病毒一样，一方面PRRSV自身复制所依赖的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRp）在参加复制过程中不具有核酸校正能力，使得PRRSV在不断变异，另一方面，由于药物和疫苗的大量使用，以及机体免疫功能的作用，使得PRRSV在选择的作用下朝着有利于其生存的方向变异、进化[79,80]。因此，通过对病毒的遗传变异研究，不仅可以了解目前PRRSV的流行情况，为PRRSV的防制提供可靠的参考依据，而且还能监测PRRSV的遗传变异趋势，并根据这些变异特点对其致病性进行研究[81-83]。1.7蓝耳病的诊断PRRSV急性感染与慢性感染所引起的临床病症差异较大，为该病的诊断带来了一定困难。临床诊断一般仅适用于急性PRRSV感染。目前诊断方式可分为病毒分离鉴定、抗原检测、血清抗体检测及分子生物学检测[84]。1.7.1病原学检测病毒分离与鉴定、免疫标记技术等是病毒学检测的常用方法[85]。其中病毒分离是最常规的检测方法，也是最可靠、最具说服力的方法之一，但费时费力。此法一般是采取发病猪的血清和脏器，经无菌处理后接种于PRRSV生长的细胞[86]，以是否出现细胞病变（CPE）来判定有无分离出病毒[87]。在操作过程当中，应选择死胎或者是活仔猪的血清、肝、肺、脑、肾以及脾等多种组织的匀桨混合物；母猪最好采集血清、血浆和白细胞；对哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪最好采集肺脏，木乃伊胎中的病毒己经灭活或发生自溶，一般很难分离到[88]。需要强调的是，用血清作分离病料时最好冻存，因为猪感染PRRSV后有较长时间的病毒血症。目前，在分离PRRSV过程中使用到的细胞是PAMs、MA-104细胞系、CL-2621细胞系，还有就是由Marc-145克隆获得的HS2H细胞，其具备更高的敏感度[89]，这些都是病毒适应性好的细胞。由于不同的毒株适合在不同的细胞上生长，因此并不是之前提到的细胞能分离到所有的毒株。其中PAMs是敏感性最高、也是大多数毒株都能适应的细胞，但其制作难度大且需要SPF猪；Marc-145和HS2H细胞对PRRSV敏感性高，毒株适应范围广，也容易培养，越来越得到广泛应用，我国的研究者多采用这两种细胞[90]。可是有些毒株在敏感细胞上生长并不出现CPE，这时就需要借助其他手段来确诊。1.7.2血清学检测主要方法有四种，分别是免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA）、血清中和试验（SN）以及酶联免疫吸附试验（ELISA）。有报道比较了四种方法在检测PRRSV抗体的表现[91]。结果发现，IPMA和IFA均能较早检测出抗体，在特异性和敏感性方面相似，但检测结果不易判断，不适宜大规模检测。中和抗体出现较晚，持续时间长，抗体水平高。因此血清中和试验适用时间范围较广，但不适用于早期诊断。ELISA方法特异性、7 敏感性与IFA和IPMA相似，但重复性和稳定性更好，适用于大规模快速检测PRRSV抗体。国内也已经利用商业化ELISA试剂盒对PRRSV抗体进行了大规模的免疫水平监测[92-94]。1.7.3存在问题及发展趋势自1996年PRRS在我国出现，尤其是2006年夏以来，PRRSV给我国养猪业带来了巨大的经济损失，PRRS的科学防控是确保我国养猪业健康发展得一个重大问题[95]。目前该病还没有有效可靠的治疗方法，除加强饲养管理外，仅能依靠疫苗进行防控来确保猪群的稳定。随着PRRSV的出现，其对我国乃至世界养猪业影响越来越大，国内外许多科研人员都对PRRSV疫苗的研究投入了大量的精力[96]。目前除了市场上广泛使用的PRRSV灭活苗和活苗外，还有新型的基因工程苗在不断出现[97,98]。灭活疫苗：西班牙、荷兰、美国、加拿大和中国等已研制出猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗并商品化[99]。2000年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所郭宝清等[100]用国内成功分离出来的第一例CH-la充当疫苗用毒株，完成了对PRRS佐剂灭活疫苗的制备，然后针对3月龄仔猪实施两次免疫，中间相隔二十天。结果显示，在第一次免疫的5天后，能够检测出病毒特异性抗体，在第28天处于峰值，第56天仍可以检测到抗体。采用国内PRRSV分离株S1制备出的油佐剂灭活苗接种保护期能够超过半年[101,102]。灭活疫苗虽然具有安全性好、不散毒，便于储存和运输，对母源抗体干扰不明显等优点，但是其只能产生体液免疫，而且免疫剂量大、次数多，免疫产生期较长、持续期短，因此通过灭活苗难以有效控制和根除PRRSV在猪场的存在和流行。弱毒疫苗：猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗能够更加有效地刺激猪体产生坚强而持久的免疫力，降低临床发病率，减少病毒血症持续时间，控制机体病毒载量，减少肺损伤，提高猪只日增重等生产性能，但是同时也可能存在毒力反强等安全隐患和交叉保护性差等问题。2007年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所蔡雪辉等由美洲型PRRSVCh-la株体外连续传代研制出猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗（CH-1R株）。随后我国相继研制成功高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗JXA1-R株、HuN4-F112株、TJM-F92株，为我国有效防控高致病性猪繁殖与呼吸综合征发挥了重要作用[103-106]。当前PRRSV各结构蛋白免疫原性相对明确[107]，在被PRRSV感染之后，可以在血清里面发现的抗体首要针对N蛋白，其次针对M蛋白和GP5蛋白。其中，M、GP5以及GP4蛋白可产生中和抗体，尤其GP5是产生中和抗体的主要抗原[108,109]。GP3虽然不能刺激机体产生中和抗体，但是可对仔猪提供保护。因此，新型疫苗的研究多以这些蛋白或修饰蛋白为靶抗原。1.8研究的目的与意义猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸综合征”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性、高传染性、高致病性的疫病。该病毒不仅致病力强，而且传播速度极快，猪群发病率极高，常常引起大批的仔猪死亡。主要以妊娠母猪繁殖障碍、早产、流产和死8 胎，以及各年龄段的猪，特别是以仔猪呼吸道疾病为特征的急性高致病性传染病，给养猪业带来一定的损失。目前己成为危害全球养猪业的主要疫病之一。因此，猪蓝耳病的感染及其感染状况非常值得人们重视和研究。本研究密切结合黑龙江省双鸭山地区当前养猪业生产实际的需要，开展对双鸭山地区猪蓝耳病的流行病学调查，通过问卷调查、血清抗体检测和病原学检测等手段来监测蓝耳病在双鸭山市不同地区的流行情况，同时通过分析该地区不同季节以及猪只不同生长阶段的抗体阳性率和抗原阳性率探寻蓝耳病在该地区的流行规律，为双鸭山地区猪蓝耳病的防控提供参考数据及提出合理性建议。9 2材料与方法2.1材料2.1.1样品来源自2016年10月至2017年10月间不间断地从黑龙江省双鸭山地区的部分猪场无菌采集发生疑似PRRSV感染且未进行PRRSV疫苗接种的160头病死猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织器官，采集的同时，登记并且编号，编号后置于-20℃冰柜中保存备用。随机采集外观正常健康无临床症状且未进行PRRSV免疫的30个猪场猪只样品，包括鼻拭子和粪便共156份。合计共采集样品316份。同时无菌随机采集双鸭山地区包括宝清县、友谊县、集贤县和饶河县，四方台区、宝山区、岭东区以及尖山区共8个县（区）内存栏量500头以上的27个规模化养猪场，以及存栏量500头以下的散养专业户53户中临床表现健康且未进行PRRSV疫苗接种的猪血清780份，登记并且编号，置-20℃冰柜中保存备用。2.1.2试剂盒猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，购自美国爱德士公司。2.1.3工具酶及相关试剂rTaq酶、RNA酶抑制剂（RRI）、反转录酶RTAce、DNAMarker、5×RTBuffer、dNTP、通用引物Oligo(dT）购自大连宝生物公司。2.1.4主要仪器与实验设备纯水仪：MilliporeMilli-QⅡ型；微量移液器：吉尔森公司；-20℃冷冻冰箱、4℃冰箱：海尔公司；低温台式高速离心机：BeckmanAvantiTM30；台式离心机：上海第三分析仪器厂；自动酶标检测仪：LabsystemsMultiskanMStype.352恒温振荡器：培英THZ-C型太仓实验设备厂梯度PCR仪：EppendoffMustercyclerGrudientPE2400；超净工作台：FromaScientific1829.SN.17069-15；电泳仪：BioRadMA120型MINIVERITICALGELSYSTEM；水平电泳槽DYC-31A型：北京六一仪器厂；10 凝胶成像仪：UVR-800UK；微量电子天平：METTERAE260型，Deltalange公司；M9B88微波炉：韩国三星；电热恒温水槽：DK-8D型，上海精宏实验设备有限公司；湿热高压灭菌锅：日本Sanyo。2.2实验方法2.2.1问卷调查2.2.1.1调查对象和方法2016年10月至2017年10月，对黑龙江省双鸭山地区8个县（区）内存栏量500头以上的59个规模化养猪场以及散养殖户341户进行数据采集，采集包括保育猪、生长育肥猪、后备母猪和种猪四种不同生长阶段的猪群。通过问卷调查的方式进行PRRS流行病情况调查，总共发出了400份调查问卷表，为进一步开展血清学调查和病原学调查奠定基础，使用的调查问卷见表2-1。调查内容包括猪群基本信息，临床症状、治疗情况、消毒情况、免疫情况、疫病史、自然环境和发病猪舍的情况等。表2-1双鸭山地区猪繁殖与呼吸综合征流行情况调查问卷表Tab.2-1ThequestionnaireabouttheprevalenceofPRRSinShuangyashanCity调查信息调查项目数据1.基本信息①调查日期②地址③填表人姓名④猪场规模规模化□散养户□⑤联系电话⑥品种⑦日龄⑧初发病时间⑨初始死亡时间⑩病程描述2.临床表现①发病猪群存栏数（）只②发病数（）只③主要临床症状①体温升高无□有□②耳部、体表皮肤发紫无□有□（转下页）（接上页）调查信息调查项目数据11 ③呼吸道症状（呼吸困难，腹式呼吸等）无□有□④母猪流产、死胎和木乃伊胎无□有□⑤生长迟缓无□有□3.治疗情况①抗病毒药物②激素类药物③中兽药④紧急接种无□有□接种效果⑤对症治疗措施⑥治疗效果很好□一般□无效□加重□⑦其他补充4.消毒①消毒设备雾化设备□熏蒸设备□其他□②猪舍消毒时间消毒次数消毒剂③运输工具消毒时间消毒次数消毒剂5.无害化处理①死猪处理②污物处理6.免疫无□有□检测结果7.采样及送检①肝脏（）份，结果②肺脏（）份，结果③淋巴结（）份，结果④脾脏（）份，结果⑤肾脏（）份，结果⑥其他部位（）（）份，结果8.环境①粪便存放区域上风向□下风向□距离（）米②周边养殖厂禽场□猪场□牛场□其他□9猪蓝耳病疫病史爆发情况无□有□最近一次爆发时间10.发病猪只的去向①销毁②销售①除场（户）名可不填外，其他请11.填报说明如实填写②如有以上情况请在□打√③如有其它情况可另附纸张2.2.1.2调查问卷的发放与回收12 此次调查问卷表发放至黑龙江省双鸭山地区8个县（区）内存栏量500头以上的59个规模化养猪场以及散养殖户341户，共400份调查表，待相关人员填写完毕后，将调查问卷表统一回收，进行下一步的数据统计工作。2.2.2PRRS的血清学抗体检测2.2.2.1血清的制备和保存（1）采血：成年猪通常在耳静脉上采血，仔猪在前腔静脉采血。相关工作人员对成年猪通常采用耳静脉采血方法，这种方法采血不仅快捷方便，而且采出的血还干净卫生，比一般的静脉抽血会节约很多时间。由于仔猪的个体小，采用耳静脉采血对仔猪身体的伤害较大，所以通常仔猪采用前腔静脉采血。颈部采血虽然血量多，但具有很高的难度。采血过程中要做好保定工作，注意人身安全，要根据猪只的体型来选择不同大小的针头，最后是保证进针部位要准。凭借相关工作人员多次的采血经验，在右侧采血对猪只造成的伤害性会相对较小。（2）血清的制备：首先将采集到的新鲜血液样品放置在37℃温箱中静置30min，等到血液发生凝固后，将其放入4℃离心机中以3000r/min离心5min左右。离心完毕后，清亮透明的上清液即为血清。如果离心完毕后血清中夹杂有破碎的红细胞，则要进行第二次离心。再次离心完毕后如果血清中还存有轻微的血凝块，可以用干净的牙签将其剔除。需注意的是如果溶血情况严重，会对实验结果造成影响，应放弃该血清。最后将符合要求的血清收集到干净的EP管中，做好标记4℃或-20℃冷冻保存备用，注意避免反复冻融血清样本。（3）血液样品的保存：将分离到的血清样品保存于密闭EP管中，存放于4℃冰箱内或冷冻。在检测血清时，必须将从冷冻室拿出的血清样品放置一段时间，当血清样品的温度达到室温之后，要反复摇晃，待血清样品混合均匀时，才能用来检验，否则会影响实验效果。2.2.2.2PRRSV抗体的检测方法及其判定标准（1）原理将重组的PRRSV抗原包被在微量反应板上，待检样品在反应孔中孵育时，针对PRRSV的特异性抗体与包被的抗原形成抗原抗体复合物。洗去包被孔中没有结合的成分后，加入辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗猪抗体，它与孔中的猪抗体结合。洗去没有结合的酶标抗体，再加入TMB底物。颜色反应的深浅与样品中存在的抗PRRSV特异性抗体的量成正比。（2）样品的准备使用前所有试剂应恢复至室温（18~26℃）。试剂应轻轻旋转或振荡混合。每个样品使用一个单独的吸头。估算洗板所需要的洗涤液的体积，使用前浓缩洗涤液用去离子水10倍稀释。用样品稀释液40倍稀释待检样品，对照不需要进行稀释。取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品在添加到PRRSV包被板前应混匀。13 （3）实验室操作（a）严格按照操作步骤进行操作可以得到最佳结果。在整个过程中，仔细地移液、计时和洗板是保证精确性和准确性的必要条件。（b）不要将TMB溶液暴露于强光下或与氧化剂接触，需使用洁净的玻璃或塑料器皿盛装。（c）小心操作，防止试剂盒组分污染。请勿将未用完的试剂倒回试剂瓶中。（d）不要用过期的试剂，也不要将不同批次试剂盒内的试剂混用。（4）具体操作步骤（a）取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置。如果只需要使用部分板条，则将需要的板条拆下进行实验，剩余的板条放在附赠的自封袋中，并放入干燥剂，封好口后置于4℃保存。（b）加入100uL没有稀释的阴性对照，每次检测加两孔。（c）加入100uL没有稀释的阳性对照，每次检测加两孔。（d）在相应的孔中加入100uL已经稀释完毕的样品。（e）18~26℃条件下孵育30min（±2min）。（f）将各孔的液体弃入废液桶。用300uL洗涤液洗涤板孔，共洗涤4次。每次洗涤后应吸去孔内的液体。在两次洗涤之间和加入酶标抗体之前，应避免包被孔干燥。在最后一次洗涤液吸去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。（g）每孔加入100uL酶标抗体。（h）18~26℃条件下孵育30min（±2min）。（i）重复步骤（f）。（j）每孔加入100uLTMB底物液。（k）18~26℃条件下孵育15min（±1min）。（l）每孔加入100uL终止液，终止反应。（m）测量并且记录样本和对照的吸光值A（650）。（n）计算结果：阴性对照平均值：NC⎯x=（NC1OD650+NC2OD650）/2阳性对照平均值：PC⎯x=（PC1OD650+PC2OD650）/2实验有效性判定：PC⎯x﹣NC⎯x≥0.150，NC⎯x≤0.150S/P值=（样品OD650﹣NC⎯x）/（PC⎯x﹣NC⎯x）当S/P值≥0.40时判为阳性；反之，则判为阴性。2.2.3PRRS的病原学检测2.2.3.1PCR引物的合成按照GB/T18090-2008猪繁殖与呼吸综合征诊断方法中的反转录聚合酶链反应试验（RT-PCR），应用PRRSV的国际标准检测方法引物PVU、PVD，其引物序列根据Genbank中美洲株和欧洲株的病毒RNA中高度保守的开放阅读框ORF7（N基因）设计，引物序列14 详见表2-2。此对引物的预期扩增片段长度为372bp的目的基因片段，以上引物由赛百盛基因技术有限公司合成。表2-2引物序列Tab.2-2Sequenceofprimers引物名称序列（5’-3’）PVUGCGGATCCATGCCAAATAACAACPVDAGCTCGAGTCATGCTGAGGGTGA2.2.3.2待检样品的处理在超净工作台中除去各待检组织的被膜与结缔组织，取各待检组织少量于研钵中剪碎并用杵研磨，加入少量体积的无菌生理盐水，继续以杵研磨。匀浆完毕后，转移至经DEPC水处理后的无菌1.5mLEP管中，置于-20℃~-40℃冰箱中反复冻融三次，然后4℃11000r/min离心2min，收集上清液，-20℃保存备用。2.2.3.3病毒RNA的提取及反转录取出-20℃冰箱中保存的病毒上清液，进行病毒RNA的提取及反转录实验，详细方法如下：（1）取病毒液250uL放入1.5mLEP管中后进行提取。（2）向EP管中加入500uLTrizol快速上下翻转，震荡2min，置于冰上10min，中间震荡1min。（3）分离阶段：加入350uL氯仿后将EP管盖严，剧烈震荡使其中液体混合均匀，冰上静置10min后，12000r/min离心7min，离心结束后，管内液体呈现分层状态，最底层是红色的苯酚-氯仿层，中央是“白膜”层，最上方是透明的水样层，RNA全部留于水样层中。（4）RNA的沉淀：缓慢地将上层液体移入一干净的不含RNA酶的1.5mLEP管中（约400~500uL），加入同等体积的异丙醇，混匀后放入-20℃中大于1h然后12000r/min离心7min。（5）RNA的洗涤：小心倒掉上清，留取沉淀。加入1mL现配的75%的无水乙醇（DEPC水配制，预冷）洗涤RNA沉淀一次，然后12000r/min离心7min。（6）RNA的再溶解：小心倒掉上清，将管倒扣于吸水纸上，在工作台里自然晾干，不可以让RNA沉淀完全干燥。再向管中加入22uL的DEPC水溶解，获得总RNA，之后立即进行反转录。（7）加入2uL通用引物Oligo(dT)，75℃水浴10min，再冰浴5min。（8）EP管中加入RRI2uL、RTAce2uL、5×RTBuffer8uL和dNTP4uL，总共40uL体系混匀。（9）顺离EP管，42℃水浴1h30min，72℃10min，冰浴5min后获得cDNA，-20℃保存备用。2.2.3.4PCR扩增15 以2.2.3.3实验中获得的cDNA为模板，PVU、PVD为上下游引物，PCR扩增PRRSV序列中的目的基因片段，反应体系如下：试剂用量（uL）cDNA4rTaq酶0.510×Buffer2.5dNTP3引物PVU1引物PVD1去离子水13总体积25样品混匀后瞬离，放入PCR仪中，扩增程序如下所示：95℃5min94℃30sec56℃30sec35cycles72℃1min72℃10min4℃pausePCR反应结束后，将PCR产物和2.5uL10×LoadingBuffer混匀，以DNAMarkerDL2000为对照，用0.8%琼脂糖凝胶经110V电泳20min，观察PCR的扩增结果。在阳性对照和阴性对照均成立的条件下，若出现一条372bp大小的条带即为目的基因片段判定为阳性，否则判定为阴性。2.2.4PRRS综合防控效果对比自2017年10月至2018年4月针对蓝耳病的防治，对宝清县、友谊县、集贤县和饶河县四个地区进行综合防控，防控措施包括以下内容：加强饲养管理，改善猪群的饲养条件，降低养殖密度，在保证猪舍温度的前提下加强通风，严格控制饲料和各种原料的质量。每周带猪消毒1~2次、场区至少每月消毒1次。同时也对宝清县、友谊县、集贤县以及饶河县四个地区按原有方式进行饲养管理，不间断地从黑龙江省双鸭山地区的部分猪场无菌采集发生疑似PRRSV感染且未进行PRRSV疫苗接种的180头病死猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织器官，样品经过研磨处理后通过RT-PCR方法进行PRRSV病原检测，对比阳性率。16 3结果3.1调查问卷的发放与回收此次调查问卷表发放至黑龙江省双鸭山地区8个县（区）内存栏量500头以上的59个规模化养猪场以及散养殖户341户进行数据采集，共发放调查问卷表400份，回收3748份。其中存栏量500头以上猪场发放59份，回收51份，回收率86.44%；散养殖户共发放调查问卷表341份，回收323份，回收率94.72%。从回收到的调查问卷表的统计结果看，临床上确诊为PRRSV的总共有20份，占回收调查问卷表的5.38%。说明双鸭山地区部分猪场（户）的猪只临床上具有猪繁殖与呼吸障碍综合征的症状，具体统计情况见表3-1、表3-2、表3-3。表3-1调查问卷表回收情况统计表Tab.3-1Surveyquestionnairerecoverystatistics回收调查表回收调查表存栏量500头以县（区）散养殖户数回收率上猪场数回收率份数份数（%）（%）宝清县535196.2310990.00友谊县363597.226466.67集贤县797493.67181794.44饶河县747398.659777.78四方台区222090.914375.00宝山区332987.887685.71岭南去191910022100尖山区252288.0033100合计34132394.72595186.4417 表3-2存栏量500头以上猪场问卷调查情况表Tab.3-2Surveyquestionnaireofmorethan500pigfarms临床症状县（区）回收份数未发病确诊PRRSV症症症症症状状状状状①②③④⑤宝清县96313222友谊县41313231集贤县1712524452饶河县72202210四方台区33000000宝山区64212111岭南去22000000尖山区33000000合计51331551411126表3-3散养殖户问卷调查情况表Tab.3-3Surveyquestionnaireofsncaifarmers临床症状县（区）回收份数未发病确诊PRRSV症症症症症状状状状状①②③④⑤宝清县51321841415142友谊县3530106128122集贤县74462292320215饶河县7358725561四方台区2013533440宝山区2922705541岭南区1912513421尖山区2214835342合计32322782287064671418 3.2双鸭山市PRRS血清学抗体检测3.2.1不同地区PRRSV抗体的检测结果3.2.1.1不同地区的采样情况自2016年10月至2017年10月间不间断地从黑龙江省双鸭山地区宝清县、友谊县、集贤县和饶河县，四方台区、宝山区、岭东区以及尖山区共8个县（区）共采集到血清样本780份，各个地区的采样分布情况如表3-4、图3-1所示：本次采样中，宝清县采集样品84份，占所有样品数的10.77%；友谊县采集样品57份，占所有样品数的7.31%；集贤县采集样品275份，占所有样品数的35.26%；饶河县采集样品233份，占所有样品数的29.87%；四方台区采集样品27份，占所有样品数的3.46%；宝山区采集样品42份，占所有样品数的5.38%；岭南区采集样品38份，占所有样品数的4.87%；尖山区采集样品24份，占所有样品数的3.08%。其中双鸭山地区四个区的其他产业发达，人力成本高，且人员流动性强，不利于疫病控制，导致猪场生产成本较高，而且面积较小，因此采样数量较少。其余四县地区面积相对较大，而且农业发达，人力成本低，猪场生产成本较低，因此采样的数量较多。表3-4双鸭山地区不同地区的采样情况Tab.3-4SamplingindifferentregionsofShuangyashancity地区样品数（份）所占比率（%）宝清县8410.77友谊县577.31集贤县27535.26饶河县23329.87四方台区273.46宝山区425.38岭南区384.87尖山区243.08合计78010019 图3-1采集样品的分布Fig.3-1Distributionofsamples3.2.1.2不同地区样品的血清抗体检测结果应用酶联免疫吸附试验，对从黑龙江省双鸭山地区8个县（区）内的存栏量500头以上的27个规模化养猪场，以及存栏量500头以下的散养专业户53户中采集临床表现健康且未进行PRRSV疫苗接种的猪血清样品780份进行了PRRS抗体的检测，结果显示153份血清样品阳性，阳性率为19.62%。其中，不同地区的血清抗体检测结果如表3-5、图3-2所示：表3-5不同地区的血清抗体检测结果Tab.3-5Serumantibodytestresultsindifferentregions血清来源血清样品数阳性数阳性率（%）宝清县842934.52友谊县571017.54集贤县2755018.18饶河县2333916.74四方台区27518.52宝山区42819.05岭南区38923.68尖山区24312.50合计78015319.6220 图3-2不同地区的血清抗体阳性率Fig.3-2Serumantibodypositiverateindifferentareas3.2.1.3不同养殖方式猪只的PRRSV抗体检测结果在所有地区中，存栏量500头以上的规模化养猪场阳性率为18.15%，存栏量500头以下的散养殖户阳性率为22.18%。27个规模化养猪场中有15个场，53户散养殖专业户中有37个场的血清样品抗体检测全为阴性，结果如表3-6、表3-7所示。表3-6不同养殖方式的血清抗体检测结果1Tab.3-6Serumantibodytestresultsofdifferentfarmingmethods1血清来源场（户）数血清样品数阳性数阳性率（%）存栏量500头以上274969018.15存栏量500头以下532846322.18合计8078015319.62表3-7不同养殖方式的血清抗体检测结果2Tab.3-7Serumantibodytestresultsofdifferentfarmingmethods血清阳性血清阴性阳性场（户）血清来源场（户）数场（户）数场（户）数阳性率（%）存栏量500头以上27121544.44存栏量500头以下53163730.19合计80305037.5021 3.2.2不同季节猪只的PRRSV抗体检测结果考虑到季节对病毒传播的影响，我们按照春夏秋冬的时间来整理数据。不同的季节，猪群中蓝耳病病毒血清抗体阳性率不同，主要表现为春夏秋季节高于冬季。其中，春季（2017.03~2017.06）的抗体阳性率为24.79%，夏季（2017.06~2017.09）的抗体阳性率为21.52%，秋季（2016.10~2016.12）的抗体阳性率为18.75%，冬季（2016.12~2017.03）的抗体阳性率为15.47%。具体结果详见表3-8、图3-3所示：表3-8不同季节的血清抗体阳性率Tab.3-8Serumantibodypositiverateindifferentseasons起止时间养殖场（户）数样品数（份）抗体阳性率（%）2016.102017.011611718.752017.012017.04139615.472017.042017.072426524.792017.072017.102730221.52合计8078019.62图3-3不同季节的血清抗体阳性率Fig.3-3Serumantibodypositiverateindifferentseasons3.2.3不同生长阶段猪只PRRSV抗体的检测结果不同生长阶段猪的蓝耳病病毒的抗体水平不同，其中，保育猪的抗体阳性率为40.13%，生长育肥猪的抗体阳性率为16.87%，后备母猪的抗体阳性率为11.06%，种猪的抗体阳性率为15.79%。保育猪的抗体阳性率最高，生长育肥猪和种猪的抗体阳性率略低于平均抗体水平。结果详见表3-9、图3-4所示：22 表3-9不同日龄的血清抗体检测结果Tab.3-9Serumantibodytestresultsatdifferentdaysofage血清来源血清样品数阳性数阳性率（%）保育猪1526140.13生长育肥猪2494216.87后备母猪2082311.06种猪1712715.79合计78015319.62图3-4不同生长阶段的血清抗体阳性率Fig.3-4Serumantibodypositiverateindifferentgrowthstages3.3双鸭山市PRRS的病原学检测3.3.1PCR检测结果将自2016年10月至2017年10月间不间断地从黑龙江省双鸭山地区的部分猪场无菌采集到的发生疑似PRRSV感染且未进行PRRSV疫苗接种的病死猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织器官进行研磨，同时将随机采集到的外观正常健康无临床症状且未经疫苗接种的猪场猪只样品，包括鼻拭子和粪便处理后均进行RNA的提取和反转录，以获得的cDNA为模板，以引物PVU、PVD进行PCR扩增，结果部分样品可见372bp的目的条带，与预期相符，结果如图3-5：23 M：DNAMarkerDL2000；1~8：宝清县、友谊县、集贤县、饶河县、四方台区、宝山区、岭南区、尖山区；9：水对照M:DNAMarkerDL2000;1~8:PCRproductofBaoqingCounty、YouyiCounty、JixianCounty、RaoheCounty、SifangtaiDistrict、BaoshanDistrict、LingnanDistrict、JianshanDistrict;9:Control图3-58个阳性代表样品PCR扩增结果Fig.3-58positiverepresentativesamplesPCRamplificationresults3.3.2不同地区样品的病原学检测结果自2016年10月至2017年10月间不间断地从黑龙江省双鸭山地区的部分猪场无菌采集发生疑似PRRSV感染且未进行PRRSV疫苗接种的160头病死猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织器官，样品经过研磨处理后通过RT-PCR方法进行PRRSV病原检测。结果显示阳性样品数为34份，阳性率为21.25%，如表3-10、图3-6所示：同时随机采集外观正常健康无临床症状且未进行PRRSV免疫的30个猪场猪只样品，包括鼻拭子和粪便共156份，样品经处理后同样进行RT-PCR实验以检测PRRSV病原。结果显示阳性猪场数为9个，阳性率为30.00%；阳性样品数为24份，阳性率为15.38%，如表3-11、图3-7所示：24 表3-10不同地区疑似感染样品的病原学检测结果Tab.3-10Etiologicaltestresultsofsuspectedinfectedsamplesindifferentareas地区样品数阳性数阳性率（%）宝清县27518.52友谊县12216.67集贤县331030.30饶河县31619.35四方台区13215.38宝山区18422.22岭南去17317.65尖山区9222.22合计1603421.25图3-6不同地区疑似感染样品的病原学检测结果Fig.3-6Etiologicaltestresultsofsuspectedinfectedsamplesindifferentareas表3-11不同地区随机抽检外观健康的样品检测结果Tab.3-11Randomsamplingindifferentregionsofhealthyappearance地区猪场数阳性数阳性率（%）样品数阳性数阳性率（%）宝清县4250.0014214.29友谊县3133.3313215.38集贤县7228.5750918.00饶河县6233.3344715.91四方台区2009111.11宝山区4125.0011218.18岭南去3133.331119.09尖山区100400合计30930.001562415.3825 图3-7不同地区随机抽检外观健康的样品检测结果Fig.3-7Randomsamplingindifferentregionsofhealthyappearance3.3.3不同生长阶段猪只的PRRS病原学检测结果按照不同的生长阶段划分，其中，随机抽检到的保育猪样品数27份，阳性数4份，阳性率为14.81%；生长育肥猪样品数52份，阳性数10份，阳性率为19.23%；后备母猪样品数47份，阳性数6份，阳性率为12.77%；种猪样品数30份，阳性数4份，阳性率为13.33%，如表3-12、图3-8所示：表3-12随机抽检样品按不同日龄段划分结果Tab.3-12Theresultsofrandomsamplingsamplesindifferentagegroups不同日龄阶段样品数阳性数阳性率（%）保育猪27414.81生长育肥猪521019.23后备母猪47612.77种猪30413.33合计1562415.3826 图3-8随机抽检样品按不同日龄段划分结果Fig.3-8Theresultsofrandomsamplingsamplesindifferentagegroups3.3.4PRRS综合防控效果对比结果自2017年10月至2018年4月针对蓝耳病的防治，对宝清县、友谊县、集贤县和饶河县四个地区采取措施进行综合防控，同时也对此四个地区按原有方式进行饲养管理。在此期间不间断地从以上四个地区的部分猪场无菌采集发生疑似PRRSV感染且未进行PRRSV疫苗接种的180头病死猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织器官，样品经过研磨处理后通过RT-PCR方法进行PRRSV病原检测。通过对比加强饲养管理地区和按原有方式饲养管理地区的样本阳性率，从而对PRRS综合防控效果进行对比。结果显示阳性样品数为35份，其中在加强饲养管理条件的宝清县、友谊县、集贤县以及饶河县四个地区阳性数为14份，阳性率为15%，四个地区的阳性率均有所下降，按原有方式饲养管理的地区宝清县、友谊县、集贤县以及饶河县阳性数为21份，阳性率为23%，四个地区蓝耳阳性率基本保持不变，如表3-13所示：表3-13不同地区疑似感染样品的病原学检测结果Tab.3-13Etiologicaltestresultsofsuspectedinfectedsamplesindifferentareas地区样品数阳性数阳性率（%）宝清县30516.67友谊县16212.50加强饲养管理地区集贤县18422.22饶河县26311.54宝清县23521.74按原方式饲养管理友谊县15226.67地区集贤县25728.00饶河县27725.9327 4讨论4.1黑龙江省双鸭山地区PRRS的流行病学特点PRRSV最早由荷兰中央兽医研究所从自然感染和实验感染PRRSV的猪中首先用猪肺泡巨噬细胞分离培养获得的一种病原因子，后经鉴定为病毒，并以该研究所所在地将其命名为Lelystad病毒(LV)[110]。我国大陆在1995年首次发生，郭宝清等[111]于1996年首次从国内发病猪群中分离出PRRSV，从而证实我国存在蓝耳病。从此以后，PRRSV在我国迅速传播，到2006年，我国几乎所有省市都报道过PRRSV的感染[112]。本实验自2016年10月至2017年10月间对黑龙江省双鸭山地区8个县（区）内存栏量500头以上的59个规模化养猪场以及散养殖户341户进行数据采集，通过问卷调查的方式进行流行病情况调查，共发放调查问卷表400份，回收372份。其中存栏量500头以上猪场问卷回收率为86.44%；散养殖户问卷回收率为94.72%。从回收到的调查问卷表的统计结果看，临床上确诊为PRRSV的总共有20份，占回收调查问卷表的5.38%。说明双鸭山地区部分猪场（户）的猪只临床上具有猪繁殖与呼吸障碍综合征的症状。在此期间内同时不间断地从黑龙江省双鸭山地区的部分猪场无菌采集发生疑似PRRSV感染的160头病死猪的组织器官，并随机采集外观正常健康无临床症状的30个猪场猪只样品，包括鼻拭子和粪便共156份，通过RT-PCR方法进行PRRSV抗原检测。同时无菌随机采集双鸭山地区包括宝清县、友谊县、集贤县和饶河县，四方台区、宝山区、岭东区以及尖山区共8个县（区）内存栏量500头以上的27个规模化养猪场，以及存栏量500头以下的散养专业户53户中临床表现健康且未进行PRRSV疫苗接种的猪血清780份，通过ELISA方法进行PRRSV抗体检测。检测结果显示双鸭山地区的8个县（区）均存在不同程度地PRRSV感染。在发病率上，对于发生疑似PRRSV感染的160头病死猪的组织器官，通过RT-PCR方法进行检测，病原学调查结果显示，PRRS总阳性率为21.25％；随机采集外观正常健康无临床症状的30个猪场猪只样品，包括鼻拭子和粪便共156份，PRRS总阳性率为15.38％。虽然疑似PRRSV感染的猪发病率高于外观正常健康无临床症状的猪，但也提示外表健康，无高热、嗜睡、食欲差、精神沉郁、皮肤发红和被毛粗乱等典型症状的猪群也可能发生高致病性猪蓝耳病，进而对该市今后此病的防控提出了更高的要求。通过ELISA方法进行PRRSV抗体检测，血清学调查结果显示抗体总阳性率为19.62％。因为采集的血清均为未进行PRRSV疫苗接种，所以抗体检测阳性提示所对应猪只为PRRSV感染阶段或为带毒猪只。在养殖方式与PRRS发病情况的关系上，血清学调查结果显示，规模化养殖场PRRS阳性率为18.15%，散养户阳性率为22.18%。散养户PRRS阳性率高于规模化养猪场，分析其原因主要是由于规模化养猪场在养殖方式上属于集约化养殖，较为重视对猪群疫病的防控管理，能够采取良好的管理模式和监测手段对PRRS疫病进行监测，并能够应用先进的免疫注射技术对PRRS疫病进行防控，应用前沿的防疫消毒知识对猪群卫生进行净化，28 进而大大的提高了PRRS的防控效果，降低了疫病发病率。而散养户在养殖方式上属于散养模式，对猪群疫病的防控意识薄弱，饲养管理缺乏规范性，卫生条件较差，消毒不够严格，且未建立完善的疫病防控体系，故PRRS发病率较高。在季节与高致病性猪蓝耳病发病关系上，血清学调查结果显示，全年1~12月份均有PRRS发病，其中4~7月份PRRS阳性率为24.79%，高于其他月份，结果提示该季节为我市PRRS发病的高峰期。春夏季节PRRS的发病率高于其他季节，主要由于气温逐渐升高，空气中湿度也逐步提高，高温的环境很容易导致病菌大量繁殖，此种气候对该病的流行十分有利，因此，必须采取有效措施，抓紧做好防控工作。在猪群生长阶段与PRRS发病情况的关系上，血清学调查结果显示，保育猪PRRS阳性率为40.13%，生长育肥猪阳性率为16.87%，后备母猪阳性率为11.06%，种猪阳性率为15.79%。其中，保育猪的PRRS阳性率远高于其他三个生长阶段的猪只，分析其原因主要是因为保育猪生理功能尚未发育完善，抗病能力薄弱，加之脱离了母源抗体的保护，其免疫能力较差，对新环境的适应能力差，故PRRS发病率较高。处于保育时期的猪只是猪群机体最脆弱的时期，母源抗体消失的同时自身免疫系统尚未建立，极易在环境、营养应缴、支原体感染等因素作用下发病。因此，保育猪为PRRS发病的高危猪群，应作为PRRS防控的重点对象。4.2RT-PCR和ELISA两种方法检测PRRSV的应用猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种动脉炎病毒，在80年代后期首次在欧洲和美国报道，不同的毒株具有多变的抗原性[113]。该病毒引起繁殖问题[114]（流产、产弱仔、死胎、母猪死亡）、呼吸系统疾病（肺炎、呼吸困难、行动迟缓、死亡）和轻度神经症状。PRRS引起严重的经济损失，被认为是影响养猪业最重要的疾病之一。临床上常应用RT-PCR方法对PRRSV抗原进行检测[115]，同时应用ELISA方法对PRRSV抗体进行检测[116]。目前，PCR技术在病毒学领域己得到日益广泛和深入的应用，尤其是近几年来用于病毒鉴定和检测等方面的研究已取得了很大的成功。采用PCR方法对病毒某段具有种特异性的DNA进行序列分析开辟了病毒鉴定研究的新纪元。RT-PCR具有敏感度高和特异性好等优点[117]。但是应用RT-PCR检测PRRSV的同时，也有其缺点，如病毒量太少，导致DNA提取少或者很难提出，极大地影响病毒的检测和鉴定。或者是由于各地的病毒株的变异不同病毒株的序列之间存在一定差异，从而使设计的引物特异性低导致无法扩增出目的片段。尽管如此，随着近年来分子生物学的发展，RT-PCR方法也在不断的改进和发展，其敏感性有了极大的提高，这对PRRSV的检测和防治将起到巨大的作用[118]。其中，RNA提取技术是进行RT-PCR必须应用的重要的实验技术，从组织、细胞或病毒中提取高质量的RNA对于分子克隆和基因表达分析等实验是非常重要的，是实验成功与否的重要因素。本研究中采用Trizol法进行RNA的抽提，其优点在于与其他纯化方法相比，此法能够大幅度的提高产率，并且其操作简便不需要超速离心，全程可在1~2h内即可获得特异病毒的RNA。本方法提取获得的RNA浓度较高，可以更好地应用于后续实验。29 通过检测血清或血浆中的抗体，便于评估猪只是否感染过PRRSV，无论是自然感染或人工免疫疫苗。这种免疫学诊断方法对于检测不同的PRRS毒株的敏感性都是非常高的。ELISA方法主要用于检测PRRSV抗体[119]。大量研究表明，ELISA的敏感性和特异性高，具有抗原用量少，节省材料，不需要特殊仪器，快速、经济及敏感，结果便于长期保存等优点。其缺点是不适于单个群体的确诊。国内己经建立N蛋白的基因工程表达，并研发出试剂盒可供使用。4.3不同防控措施的效果比较首先，加强饲养管理是预防猪蓝耳病最基本的措施[120]。目前集约化养殖场的猪群饲养密度过大引起圈舍通风不良，导致猪群长期处在一种人为的应激状态下，此时猪体免疫力下降会导致免疫效果下降。饲料变质发霉不仅引起猪采食量下降，还会产生一些毒素比如黄曲霉、褐曲霉等抑制免疫应答，主要机理是由于霉变饲料中含有各种霉菌，它们产生毒素被猪采食后可引起肝细胞的变性坏死，淋巴结出血、水肿等病理变化，导致机体的免疫器官严重破坏，造成机体的免疫抑制从而影响疫苗的免疫效果。饲料营养不全面或者不均衡都会影响机体的生长状态，在抵抗力下降，营养不良的条件下注射疫苗，抗体产生的速度和数量必定会有所下降。因此，科学管理猪场，要保证猪群密度、通风、保暖等生活措施；要严格控制饲料和各种原料的质量也是提高PRRS疫苗免疫的重要因素之一[121]。本实验自2017年10月至2018年4月针对蓝耳病的防治，对宝清县、友谊县、集贤县和饶河县四个地区采取措施进行综合防控，同时也对此四个地区按原有方式进行饲养管理。通过对比加强饲养管理地区和按原有方式饲养管理地区的样本阳性率，从而对PRRS综合防控效果进行对比。结果显示总阳性样品数为35份，其中在加强饲养管理条件的四个地区阳性数为14份，阳性率为15%，四个地区的阳性率均有所下降，按原有方式饲养管理的地区阳性样本数为21份，阳性率为23%。加强防控措施后，PRRSV的感染率有明显下降。生产应坚持自繁自养，建立稳定的种猪群。不要轻易引进种猪，如果有必要引进种猪和补栏，应该先调查该地区猪蓝耳病及其它疫病的流行情况。此外，在引进种猪前，还应进行血清学检测，严禁引入带毒猪。引进的猪应当进行隔离观察至少4~5周，确定没有疾病后，才能进场。在引进种猪的过程中，要严格对周围环境、人员及车辆进行消毒，每周应带猪消毒1~2次、场区至少每月消毒1次。如果周边有疫病流行时，应该把防治工作提上日程，消毒等防治工作应该加倍。规模养殖场要实行封闭管理，尽量不要让无关人员随意进入。夏季高温季节要做好猪舍通风和降温等防暑工作，高温的环境很容易导致病菌大量繁殖，造成疾病的发生和流行。冬季既要注意猪舍保暖又要注意通风，冬春季猪舍要保持在22~26℃。寒冷的季节容易引起小猪的肠道疾病，因此既要加强对猪的精心护理，又要保证猪饲料的营养全面。其次，制定科学的免疫程序是预防猪蓝耳病最有效的措施[122]。制定科学的合理的免疫程序不但应根据本场的具体情况和当地的疫病流行情况而定，而且还应该随着季节变化等其它因素灵活地制定本场的免疫程序。再次，切断传播途径也是防治本病的一种较为理想的方法。通过加强兽医工作者和广大养殖户的学习，强化业务培训，使他们掌握一些流行病学知识，确保技术措施到位，对30 切断疾病的传播途径和控制该病的流行和扩散有一定的作用。控制该病流行传播无非就是切断猪与猪之间的传播，另外运输工具也是传播途径中不可忽视的重要方面。还要注意强化责任意识，确保责任落实到位，即与各县区畜牧兽医站签订年度防疫工作责任状，同时各村委会与村级防疫员签订了免疫服务合同，各乡镇畜牧兽医站与辖区内的养殖场签订重大动物疫病防控工作责任状，落实PRRS疫病防控工作机制，把动物防疫工作责任和任务不折不扣地落实到最基层。相关负责人要强化监督检查工作，确保检查指导到位。同时注重免疫实效，提高免疫抗体保护率，强化应急处置，确保应急处置到位。综上所述，散养户养殖地为PRRS发病的高危场所，保育猪、哺乳猪及未予以抗体免疫的猪只为PRRS发病的高危猪群[123]。每年4~7月份为PRRS发病的高危季节，在防控措施上，应从强化责任意识、强化业务培训、强化监督检查、注重免疫实效、强化应急处置等方面着重开展。猪蓝耳病在目前无特效治疗药物，建议将猪场已经发病的猪全部淘汰，对于刚刚发病或者症状轻微的病猪应及时隔离，对于未发病的猪，紧急接种疫苗，并采用金霉素、阿莫西林和支原净拌料，连续服用1周，以防继发感染[124]。31 5结论（1）2016年10月至2017年10月间，双鸭山地区部分猪场（户）的猪只临床上具有PRRSV感染的症状。（2）黑龙江省双鸭山地区猪繁殖与呼吸综合征，4~7月为该病的发病高峰期，不同日龄的猪群均可感染，以保育猪发病率最高。（3）规模化养殖场的PRRSV感染率低于散养殖户，加强综合防控措施后，PRRSV的感染率由23%降至15%。32 致谢光阴荏苒，转眼间三年的研究生生活即将走向尾声，在这三年的学习和生活中我获益良多，既有即将获得硕士学位的喜悦之情，又有离开的不舍之恋。本实验及论文全部都是在导师徐世文教授的悉心指导下完成的，值此毕业之际，向恩师致以最崇高的敬意和最真诚的感谢。徐老师对科研一丝不苟的严谨治学态度和敬业精神将成为我一直学习的榜样，在实验遇到困难停滞不前时，徐老师一直耐心指导，帮我度过难关。感谢导师在我研究生在读期间给予我的帮助、教导和关怀，给我们指明人生方向，是同学们的心灵导师。在此对徐老师一直以来对我的支持、关心和帮助再次表示感谢！其次要感谢本实验室的所有老师对实验室建设的辛勤付出，感谢我所有的同门，对我实验的帮助和支持。感谢我所有的朋友们，是你们在我最低落的时候给予我鼓励和安慰，陪伴着我重新扬帆远航！衷心感谢我的父母和家人在我学习生涯中给予我的支持和鼓励，是他们的无私奉献伴我完成学业并继续前进！最后，由衷感谢所有关心和帮助过我的老师、同学和亲人们！33 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