马红球菌病血清学与病原学检测方法的建立及其流行病学调查

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学校代码：10564学号：2013202903分类号：S854.4+3密级：硕士学位论文马红球菌病血清学与病原学检测方法的建立及其流行病学调查龚凤平指导教师：李守军、教授学院名称：兽医学院专业名称：临床兽医学答辩委员会主席：王贵平、研究员中国·广州2016年6月 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要马红球菌（Rhodococcusequi）是马群聚居地常见的一种存在于土壤中的兼性细胞内寄生的革兰氏阳性球杆菌，可导致马驹亚急性或慢性化脓性支气管肺炎和广泛性肺部脓肿。马红球菌病致死率可达80%以上，可对马场乃至马业造成严重的经济损失。到目前为止，我国R.equi的报导几乎为零，缺乏标准的病原以及血清流行病学调查方法。最近报导，R.equi毒力相关脂蛋白A（VapA）是唯一的与细菌毒力相关的膜表面脂蛋白，可作为致病性R.equi的标志性抗原。因此，本研究通过构建表达VapA重组蛋白（rVapA），建立了检测致病性R.equi血清抗体的间接ELISA检测方法以及检测土壤中致病性与非致病性R.equi的菌落印记方法，并对我国马群及马聚居地R.equi进行了流行病学调查，为我国马红球菌病的防治提供技术支持、数据支撑和理论基础。首先，本研究选用pMAL-c5x原核表达体系，通过表达条件优化，融合表达了可溶性rVapA，经WB验证，其具有良好的反应原性。其次，以纯化的rVapA作为包被抗原，经条件优化，构建了致病性R.equi血清抗体间接ELISA检测方法，阳性临界值为0.370。经特异性、重复性及敏感性试验，结果表明，其与H3N8马流感、马鼻肺炎、马传染性贫血抗血清无交叉反应，且批内与批间变异系数均小于15%，具有较好的特异性、重复性和敏感性。采用该方法，首次对我国部分地区马匹进行R.equi血清流行病学调查。结果表明，致病性R.equi血清抗体总体阳性率高达53.93%，且抗体水平呈显著的地区性差异，存在品种、性别和季节特点，而与年龄无关。最后，本研究使用兔抗非致病性R.equi多抗以及兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗，并通过条件优化，构建了可用于R.equi检测并区分致病性与非致病性R.equi的菌落印记检测方法。与细菌分离鉴定及R.equiPCR鉴定方法相比，该检测方法具有敏感性高、特异性好、检测快速的优点。采用该方法对我国部分地区马场土壤中R.equi进行流行病学调查。结果表明，R.equi在马场土壤中的分布与马匹活动有关，所有土壤样本采集马场均可分离鉴定出R.equi，土壤中R.equi的平均阳性率为43.21%，未发现致病性R.equi。本研究获得融合表达rVapA蛋白，为R.equi致病机制研究提供材料基础，并为马红球菌病的诊疗方法的建立提供物质基础。本研究建立的间接ELISA检I 测方法以及菌落印记检测方法为马红球菌病流行病学调查提供技术支撑。本研究获得的全国马匹R.equi血清学及马场R.equi流行病学信息，填补了我国R.equi流行情况空白的现状，为我国R.equi的防控提供基础数据。关键词：马红球菌；毒力相关脂蛋白A；间接ELISA；菌落印记；流行病学调查II TheEstablishmentofSerologicalandPathogenicDetectionMethodofRhodococcusequiandItsEpidemiologicalInvestigationGongFengping(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:RhodococcusequiisaGrampositivefacultativeintracellularpathogen,whichmainlycausessubacuteorchronicabscessatingbronchopneumoniaoffoalsinfoalsupto6months.ThemortalityrateofRhodococcusequidiseaseisupto80%,itcancausesevereeconomiclossestothestud-farmandhorseindustry.Sofar,thestudyofR.equiinChinaisrarelyseen,lackingofthestandardpathogenicandserologicalsurveymethods.Recentlyresearchsuggested,virulence-associatedlipoproteinA(VapA)istheonlymembranelipoproteinassociatedwithbacterialvirulenceofR.equi,whichcanbeusedasanantigenmarkerofvirulenceR.equi.Therefore,weutilizedtheprokaryoticexpressionsystemtoexpressarecombinantVapAprotein(rVapA)fordevelopinganindirectELISAtesttodetectR.equiserumantibody.Meanwhile,acolonyimmunoblottestwasestablishedtodetectR.equiandtodistinguishthevirulenceandnonvirulenceR.equi.First,basedonthepMAL-c5xprokaryoticexpressionsystem,asolublerVapAproteinwasobtainedanditwasidentifiedtobeagoodantigenreactivitybywesternblot.Secondly,anindirectELISAtestwasdevelopedtodetectR.equiserumantibodyusingthepurifiedrVapAproteinasacoatingantigenandthecut-offvaluewas0.370.Throughthespecificity,repeatabilityandsensitivitytest,theresultsshowedthattheELISAtesthadnoanycrossreactionswithotherpositivesera,suchasthepositiveseraofH3N8equineinfluenza,equinerhinopneumoniaorequineinfectiousanemia.Inaddition,thecoefficientofvariationsinbothinter-andintra-assaywerelessthan15%.InsomeprovinceofChina,itwasthefirsttimetoinvestigatetheR.equiseroepidemiologybyusingtheELISAtest.TheresultsindicatedthatthetotalpositiverateofR.equiserumantibodywasupto53.93%.Thereexistedsignificantdifferencesintheregions,sexes,breedsandseasonsinthelevelofantibody,butnotwithages.Finally,acolonyimmunoblottestwasestablishedtodetectR.equibyusingtheRabbitantivirulenceR.equiVapApolyclonalantibodyandRabbitantinonvirulenceIII R.equipolyclonalantibody.Afteroptimizingtheexpressionconditions,thecolonyimmunoblottestcandifferentiatethevirulenceandnonvirulenceR.equi.ComparedwithbacteriaisolationandPCRmethod,thecolonyimmunoblottesthadtheadvantagesofhighsensitivity,goodspecificityandfastdetection.ByusingthemethodtoinvestigatetheR.equiepidemiologyinsoilinsomeprovincesofChina,suggestedthattheR.equidistributioninfarmsoilwasrelatedwithhorseactivityandtheaveragepositiverateofR.equiinsoilwas43.21%,withoutvirulenceR.equi.ThepurifiedrVapAproteincanoffermaterialbasisforpathogenicmechanismresearch,diagnosisandtreatmentmethodestablishmentofR.equi.Inthisstudy,theindirectELISAtestandcolonyimmunoblottestwereestablishedtoprovidetechnicalsupportfortheepidemiologicalinvestigationofR.equi.AndthehorsesR.equiepidemiologicalinformationwasobtained,itwouldprovidebasicdataforthepreventionandcontroloftheRhodococcusequidiseaseinourcountry.Keywords:Rhodococcusequi；virulence-associatedlipoproteinA；indirectELISAassay；colonyimmunoblottest；epidemiologicalinvestigationIV 常用缩写词与英汉对照英文缩写英文全称中文全称R.equiRhodococcusequi马红球菌PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸bpBasepair碱基对PAIPathogenicityisland毒力相关致病岛基因VapAVirulenceassociatedlipoproteinA毒力相关脂蛋白ArVapARecombinantvirulenceassociatedlipoproteinA重组毒力相关脂蛋白AMBPMaltosebindingprotein麦芽糖结合蛋白GSTGlutathioneS-transferase谷胱甘肽转移酶EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸WBWesternblotting免疫印迹试验HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶DAB3,3-diaminobenzidine3,3-二氨基联苯胺TMB3,3,5,5-tetramethylbenzidinedihydrochloride3,3,5,5-四甲基联本胺IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GSDS-PAGESodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel十二烷基硫酸钠聚丙烯electropheresis酰胺凝胶电泳ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验PVAPolyvinylalcohol聚乙烯醇PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液CVCoefficientofvariation变异系数SDStandarddeviation标准差H3N8EIH3N8equineinfluenzaH3N8马流感EREquinerhinopneumonia马鼻肺炎EIAEquineinfectiousanemia马传染性贫血BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白PVAPolyvinylalcohol聚乙烯醇V EIVEquineinfluenzavirus马流感病毒EP管Eppendorftube微量离心管CFUColonyformingunit菌落形成单位SPFSpecificpathogen-free无特定病原kgKilogram千克gGram克μgMicrogram微克hHour小时minMinute分钟secSecond秒MMoleperliter摩尔每升mMMmolperliter毫摩尔每升LLiter升mLMilliliter毫升μLMicroliter微升TSATryptonesoyaagar大豆胰蛋白胨琼脂TSBTryptonesoyabroth大豆胰蛋白胨肉汤16SrRNA16SribosomalRNA16S核糖体RNAVI 目录前言................................................................................................................................11马红球菌病概述........................................................................................................11.1R.equi的流行概况.................................................................................................11.2马红球菌病的临床症状及诊断.............................................................................21.3马红球菌病的防治.................................................................................................22R.equi毒力相关蛋白研究概况................................................................................22.1致病性与非致病性R.equi的区别.......................................................................32.2致病性R.equi毒力相关蛋白概述.......................................................................32.3毒力相关蛋白VapA的研究进展.........................................................................43马红球菌病流行病学调查研究进展........................................................................53.1马红球菌病的病原学调查情况.............................................................................53.2马红球菌病的血清学调查概况.............................................................................54本研究的目的意义....................................................................................................6第一部分马红球菌毒力相关蛋白VapA的表达与纯化..........................................71材料............................................................................................................................71.1菌种与质粒..............................................................................................................71.2主要试剂及耗材......................................................................................................71.3主要溶液的配置.....................................................................................................71.4主要仪器及设备.....................................................................................................92方法..........................................................................................................................102.1R.equi的复苏与培养...........................................................................................102.2引物设计...............................................................................................................102.3VapA基因的PCR扩增与克隆............................................................................112.3.1VapA基因的PCR扩增.....................................................................................112.3.2VapA基因PCR产物的回收纯化.....................................................................112.3.3VapA基因PCR产物与pZeroBack/bluntvector的连接.................................122.3.4连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞..........................................................132.3.5可疑菌落的筛选................................................................................................13VI 2.3.6重组质粒pZeroBack-VapA的提取.................................................................132.3.7重组质粒pZeroBack-VapA的双酶切与测序鉴定.........................................142.4原核表达重组质粒pMAL-VapA的构建与鉴定...............................................152.5可溶性重组蛋白rVapA的表达及最佳诱导条件的确定..................................152.5.1IPTG诱导温度的确定.......................................................................................152.5.2IPTG诱导时间的确定.......................................................................................162.5.3IPTG诱导浓度的确定.......................................................................................162.6重组蛋白rVapA的SDS-PAGE分析.................................................................162.7可溶性重组蛋白rVapA的非变性纯化..............................................................172.7.1蛋白粗提.............................................................................................................172.7.2rVapA的亲和层析.............................................................................................172.8重组蛋白rVapA的抗原性分析..........................................................................183结果..........................................................................................................................183.1VapA基因的PCR扩增........................................................................................183.2重组质粒pZeroBack-VapA的鉴定....................................................................193.3重组质粒pMAL-VapA的鉴定...........................................................................203.4重组蛋白的表达条件优化...................................................................................203.4.1重组蛋白的诱导表达以及最佳IPTG诱导温度的确定.................................203.4.2最佳IPTG诱导浓度与时间的确定.................................................................213.4.3重组蛋白的纯化................................................................................................223.5重组蛋白rVapA的抗原性分析..........................................................................234讨论..........................................................................................................................234.1重组蛋白rVapA中MBP的作用........................................................................244.2重组蛋白rVapA的诱导表达与纯化..................................................................245结论..........................................................................................................................25第二部分马红球菌病抗体间接ELISA检测方法的建立及其血清流行病学调查261材料..........................................................................................................................261.1参比血清及主要试剂材料...................................................................................261.2主要溶液的配制...................................................................................................26VI 2方法..........................................................................................................................262.1抗原包被浓度及血清最佳稀释度的确定...........................................................272.2酶标二抗最佳工作浓度的确定............................................................................272.3封闭液的选择.......................................................................................................272.4ELISA临界值的确定...........................................................................................272.5重复性试验...........................................................................................................272.6特异性试验...........................................................................................................272.7R.equi血清流行病学调查...................................................................................282.7.1马血清样本的采集............................................................................................282.7.2马血清样本的检测............................................................................................282.7.3统计学分析........................................................................................................283结果..........................................................................................................................293.1抗原包被浓度及血清最佳稀释度的确定...........................................................293.2酶标二抗最佳工作浓度的确定...........................................................................303.3封闭液的选择.......................................................................................................313.4ELISA临界值的确定...........................................................................................313.5重复性试验...........................................................................................................323.6特异性试验...........................................................................................................323.7R.equi血清流行病学调查...................................................................................333.7.1马匹致病性R.equi血清抗体阳性率...............................................................333.7.2致病性R.equi血清抗体水平的地区差异......................................................353.7.3马匹致病性R.equi血清抗体水平的种间差异..............................................363.7.4马匹致病性R.equi血清抗体水平的性别差异..............................................373.7.5致病性R.equi血清抗体水平的季节差异......................................................383.7.6致病性R.equi血清抗体水平与马匹年龄的相关性分析..............................394讨论..........................................................................................................................404.1R.equi间接ELISA检测方法的建立..................................................................404.2血清流行病学调查...............................................................................................414.2.1我国致病性R.equi血清抗体阳性率与世界各地区的比较..........................41IX 4.2.2我国地区间致病性R.equi血清抗体水平差异的分析..................................414.2.3我国马匹致病性R.equi血清抗体水平的季节特点......................................424.2.4我国马匹致病性R.equi血清抗体水平的性别特点......................................424.2.5我国马匹致病性R.equi血清抗体水平的品种特点......................................434.2.6我国马匹致病性R.equi血清抗体水平的年龄特点......................................435结论..........................................................................................................................43第三部分马红球菌菌落印记检测方法的建立及其病原流行病学调查................441材料..........................................................................................................................441.1菌株及主要试剂材料...........................................................................................441.2实验动物...............................................................................................................441.3引物.......................................................................................................................441.4主要溶液的配制...................................................................................................442方法..........................................................................................................................452.1R.equi的常规分离与细菌生化鉴定...................................................................452.2R.equi的PCR鉴定..............................................................................................462.316SrRNA测序鉴定..............................................................................................462.4R.equi菌落印记检测方法的建立.......................................................................462.4.1多克隆抗体的制备.............................................................................................462.4.2阳性样本的处理及细菌培养............................................................................472.4.3菌落印记法反应条件的优化............................................................................472.4.4特异性检测........................................................................................................482.4.5灵敏度检测........................................................................................................492.5R.equi流行病学调查...........................................................................................492.5.1土壤样本的采集................................................................................................492.5.2土壤样本的分离鉴定........................................................................................502.5.3马匹各活动区域R.equi分布情况分析..........................................................513结果..........................................................................................................................513.1致病性与非致病性R.equi的培养特性及生化特征.........................................513.2R.equi的PCR鉴定..............................................................................................51X 3.3土壤选择性培养分离菌株的16SrRNA测序鉴定............................................523.4R.equi菌落印记检测方法的建立.......................................................................523.4.1多克隆抗体的制备............................................................................................523.4.2菌落印记法反应条件的优化............................................................................533.4.3菌落印记法检测鉴定标准的确定....................................................................543.4.4特异性检测........................................................................................................553.5R.equi的PCR鉴定法与菌落印记法的灵敏度比较..........................................563.6R.equi病原流行病学调查...................................................................................573.6.1R.equiPCR鉴定法............................................................................................573.6.2R.equi菌落印记检测方法................................................................................583.6.3R.equiPCR鉴定法与菌落印记法的比较........................................................583.6.4马场各活动区域土壤R.equi分布情况分析..................................................594讨论..........................................................................................................................604.1常规R.equi分离鉴定、16SrRNA测序鉴定以及PCR鉴定..........................604.2R.equi菌落印记检测方法...................................................................................614.3R.equi流行病学调查...........................................................................................614.4R.equi病原学与血清学调查结果比对...............................................................625结论..........................................................................................................................63全文总结......................................................................................................................64致谢......................................................................................................................65参考文献......................................................................................................................66附录I硕士期间研究成果.........................................................................................72附录II16SrRNA测序鉴定菌株...............................................................................73XI 前言1马红球菌病概述马红球菌（Rhodococcusequi,R.equi）是马群聚居地常见的一种存在于土壤中的兼性细胞内寄生的革兰氏阳性球杆菌（Prescott,1991）。马匹R.equi感染表现为亚急性或慢性化脓性支气管肺炎和广泛性肺部脓肿，有时脓肿可在肺部以外呈散在分布（Giguereetal.,2011）。该病在小于6月龄的马驹发病率较高，仅次于创伤的发病率，居第二位（Prescott,1991）。该病的致死率可达80%以上（Hillidge,1987）。该病可导致育马场优良纯血马种丢失，并可直接影响马匹的拍卖价格，对马场乃至马业造成严重的经济损失。因此，马驹红球菌病严重影响世界育马业乃至整个马业经济的发展（Prescott,1991）。此外，该菌还可感染免疫缺陷病人（如艾滋病人），引起肺部、血液、胸腔、尿路等感染（Giguereetal.,2011；Muscatello,2012；Weinstocketal.,2002；Witkowskietal.,2011；Yamshchikovetal.,2010；蒙志好等，2009）。因此，该病受到全世界公共卫生学的广泛重视。1.1R.equi的流行概况马驹马红球菌肺炎呈地方性流行（Prescott,1987），大量研究报道证实，R.equi普遍存在于土壤、粪便以及空气当中（Grimmetal.,2007；Kuskieetal.,2011；Takaietal.,1991）。影响该病感染和流行的因素包括：母马与马驹数量、饲养马场大小、温度、土壤湿度以及草场覆盖率等。在母马与马驹数量多、密度高、温度高、土壤湿度低以及草场覆盖率低的大型马场，该菌呈流行性，且该病的发病率较高（Muscatelloetal.,2006），致死率可达80%以上（Hillidge,1987）。普遍认为马驹感染R.equi的途径为呼吸道感染（Muscatelloetal.,2009），有研究表明空气中致病性R.equi的量与马驹自然感染马红球菌肺炎呈正相关（Muscatelloetal.,2006）。据了解，R.equi普遍存在于自然环境土壤中，且可在土壤中长期存在（Gartonetal.,2002）。调查表明，50～95%的农场土壤中均存在该菌。R.equi呈世界范围分布，美国、澳大利亚、意大利、印度以及日本等国均有报道R.equi的存在（Cuterietal.,2003；Grimmetal.,2007；Miretal.,2015；Muscatelloetal.,2006；Takaietal.,2001）。在我国内蒙古地区也对该病原菌的土壤存在情况进行了调查，并报导了R.equi的存在（丁壮等，2008）。但我国马群R.equi的感染率尚未可1 知，全国范围内R.equi分布情况仍为未知状态。到目前为止，我国还未有在马场发现致病性R.equi的报道。1.2马红球菌病的临床症状及诊断马驹R.equi感染初期临床症状表现为发热、精神不振以及咳嗽等非特异性临床症状。当病情进一步加深时，演变为肺炎，临床表现为厌食、心动过速、呼吸急促、鼻翼扩张、腹式呼吸等。可通过X-Ray或者B超诊断为肉芽肿性支气管肺炎。该病需对气管盥洗液进行细菌培养鉴定并结合R.equiVapA基因进行PCR鉴定以确诊。1.3马红球菌病的防治目前，该病常采用利福平与大环内酯类药物（红霉素，阿奇霉素或者克拉霉素）联合用药进行抗生素治疗。然而，耐药性R.equi的出现给该病的治疗带来很大困难（Ciseketal.,2014），而高免血清治疗又不确切（Prescottetal.,1997）。因此，该病应以预防为主。到目前为止有大量关于R.equi疫苗的研究报道。如：使用R.equi灭活疫苗免疫接种小马，可使小马获得R.equi抵抗能力（Vargaetal.,1997）；同样使用R.equi灭活疫苗免疫接种孕马，并将孕马血清被动免疫小马，可有效保护小马免受R.equi感染（Erganisetal.,2014）；使用R.equi减毒苗进行气管内与口服接种小马，可使小马抵抗R.equi野毒株感染（vanderGeizeetal.,2011）；使用致病性R.equi毒力相关蛋白VapADNA疫苗免疫接种小鼠，可增强Th1型免疫应答反应（Haghighietal.,2005）；使用表达VapA蛋白的减毒沙门氏菌口服或滴鼻免疫接种小鼠，可诱导Th1型免疫应答，并产生长效免疫保护作用（Cardosoetal.,2013；Oliveiraetal.,2007）。然而，这一系列疫苗，均未能获得推广应用，其免疫保护作用均缺乏强有力的数据支撑。因此，对育马场饲养管理的加强以及产犊季节前该病的普查更具实际意义。降低母马以及马驹饲养密度，减少马场内粉尘，增加草场覆盖率，适时更换马匹训练场地沙土，做好马场内垫料以及粪便的消毒处理等，可在一定程度上控制R.equi的传播。产犊季节对马驹肺炎进行实时监控，定期抽查马场内马驹R.equi血清抗体水平，可及时应对R.equi疫情的发生发展。2R.equi毒力相关蛋白研究概况一直以来，关于R.equi的致病机制并不清楚。最近研究发现，马驹肺炎病2 例分离的R.equi菌株含有一个遗传编码质粒DNA（Takaietal.,1991）。其内含有一个毒力相关致病岛基因，可编码毒力相关脂蛋白（Vap），其中VapA为其主要表达蛋白，与细菌毒力相关（Jainetal.,2003），其有无直接影响R.equi的致病能力（Jainetal.,2003）。2.1致病性与非致病性R.equi的区别马源性R.equi总体上可分为两种，一种为致病性R.equi，另一种为非致病性R.equi。此两种菌无论是细菌形态学还是生化特性上均极为相似。据报道，在患有马驹肺炎的病例中分离的R.equi菌株含有一个大小为80～90kb的遗传编码质粒DNA（Takaietal.,1991）。该质粒的有无直接影响细菌的毒力。有研究证实，缺失该质粒的R.equi对马匹和小鼠无致病能力（Giguereetal.,1999；Takaietal.,1995；Wadaetal.,1997）。实际上，所有的马驹肺炎病例临床分离R.equi菌株均含有该质粒，而大多数的环境分离R.equi菌株却不含有该质粒（Giguereetal.,1999；Haitesetal.,1997；Takai,1997）。这些均可说明，致病性R.equi含有该毒性质粒，可引起马匹和小鼠的感染，而非致病性R.equi缺少该毒性质粒，不能引起马匹和小鼠发病。因此，可通过毒性质粒的有无，判断R.equi为致病性还是非致病性菌株。2.2致病性R.equi毒力相关蛋白概述致病性R.equi含有毒性质粒DNA，其内含有一个大小约21kb的毒力相关致病岛基因（PAI），PAI上共26个编码序列（CDS），可编码R.equi特有的毒力相关脂蛋白家族，即Vap家族（Takaietal.,2000），共有9个毒力相关脂蛋白（VapA、C、D、E、G、H、F、I和X）（Leteketal.,2008）。其中VapA蛋白是唯一的由Vap基因编码的与细菌毒力相关的温度诱导膜表面脂蛋白（Takaietal.,1992；Tanetal.,1995），其有无直接影响R.equi在小鼠巨噬细胞内的繁殖能力（Jainetal.,2003）。而其他的Vap蛋白（VapC、D、E、G、H、F、I和X）与R.equi毒力并无太大关系（Coulsonetal.,2010）。同时，VapA蛋白也是唯一一个由非调控区致病岛基因编码的细胞膜相关毒力因子（Wangetal.,2014），该蛋白的表达受virR操纵子（virR-icgA-vapH-orf7-virS）内VirR（Orf4）与VirS（Orf8）转录调节子调控（Jainetal.,2003；Renetal.,2004；Russelletal.,2004）。然而，近年研究发现virR操纵子内icgA对于R.equi在巨噬细胞内增殖起负性调节作用，是继VapA之后的第二个也是唯一的由调控区致病岛基因编码3 的对R.equi在细胞内增殖起直接作用的结构蛋白（Wangetal.,2014）。除毒性质粒DNA上毒力因子外，还存在染色体基因编码毒力因子，例如：荚膜多糖、分枝菌酸以及胆固醇氧化酶（ChoE）等（Navasetal.,2001）。其中ChoE为膜损伤毒力因子，可能与R.equi感染的细胞毒性以及巨噬细胞损伤有关（Hondalus,1997；Prescott,1991）。然而，经ChoE基因等位替换突变验证，得知ChoE的有无对于R.equi毒力并不重要（Peietal.,2006）。2.3毒力相关蛋白VapA的研究进展自20世纪90年代发现马驹肺炎病例中分离的R.equi菌株含有一个大小为80～90kb的遗传编码质粒DNA以来（Takaietal.,1991），关于R.equi毒力的研究就不断浮出水面。其中研究得最多的就是由致病岛基因（PAI）编码的大小为15-17ku的毒力相关脂蛋白VapA。R.equi为兼性细胞内寄生菌，可干扰巨噬细胞吞噬小体的成熟（Fernandez-Moraetal.,2005）。在2003年，ShrutiJain首次通过VapA基因敲除的方式，证实VapA基因的缺乏可直接影响R.equi在小鼠巨噬细胞内的繁殖能力（Jainetal.,2003）。毒力相关蛋白VapA是R.equi在免疫缺陷小鼠体内持续感染并且是R.equi在巨噬细胞内生长繁殖所必须的成分（Giguereetal.,2011；Jainetal.,2003）。VapA蛋白与R.equi干扰巨噬细胞吞噬小体成熟的作用有关。VapA蛋白通过抑制巨噬细胞吞噬小体的成熟，从而使含有R.equi的吞噬小体不能被溶酶体消化溶解，以达到R.equi在巨噬细胞内生长繁殖的目的（vonBargenetal.,2009）。随着R.equi毒力相关脂蛋白VapA作用机制的研究不断深入，VapA的应用也在不断铺展开来。VapA蛋白为细胞膜表面脂蛋白（Takaietal.,1992；Tanetal.,1995），曾有研究人员使用酸诱导表达并通过提取细胞膜的方法来纯化VapA蛋白（Benoitetal.,2001），然后将纯化的VapA蛋白结合水性纳米微粒佐剂制成疫苗接种孕马，而使母马以及初生小马获得高水平的抗VapA蛋白IgG抗体，该免疫可在一定程度上保护小马免受R.equi感染（Cauchardetal.,2004）。然而由于免疫接种马匹数量较少，并不具有代表性，其能否推广使用还需经过大规模的实验接种进行验证。之后，又有报道使用VapA-DNA疫苗免疫接种小鼠，可加强小鼠对R.equi的免疫应答（Haghighietal.,2005）。近年，还有研究人员通过构建表达VapA蛋白的减毒沙门氏菌活疫苗，口服或者鼻腔接种小鼠，均可使小鼠获得长效的免疫保护作用（Cardosoetal.,2013；Oliveiraetal.,2007）。由于VapA蛋白在R.equi中的独特功能，使得其被广泛的研究与应用。4 3马红球菌病流行病学调查研究进展从20世纪八九十年代开始，关于R.equi的研究报道不断增多，其中关于R.equi流行病学调查研究的报道不在少数。R.equi流行病学调查可分为病原学与血清学调查两个层面，其调查方法较多，现归纳如下。3.1马红球菌病的病原学调查情况马驹感染R.equi呈下呼吸道疾病临床症状，细胞学证据显示为感染性气道炎症，声像学诊断为支气管肺炎，然而这些均不足以确诊。R.equi感染病例的确诊还需对病驹气管渗出物进行细菌培养并结合VapA基因的PCR鉴定（Giguereetal.,2011）。R.equi的分离培养与鉴定，比较常规的方法即是通过NANAT选择性培养基（Woolcocketal.,1979）以及血平板进行筛选，结合菌落形态以及细菌革兰氏染色进行判断，并通过细菌生化鉴定或者16SrRNA测序鉴定进行确认。常规的R.equi分离和细菌生长特点和生化鉴定方法比较费时费力，而且金额昂贵，对于个别病例的临床诊断具有一定的可行性。然而，在进行大量样本的R.equi病原学调查时，则存在明显的弊端。为此，研究人员开始寻找较为简便快速的分离鉴定方法，以便于大量临床样本以及环境样本的检测。有报道使用R.equiChoE基因PCR扩增进行R.equi的快速鉴定（Ladronetal.,2003）。后来，结合NANAT选择性培养的菌落印记方法得以快速应用。已有研究人员使用放射性同位素标记DNA，构建了可检测并区分致病性与非致病性R.equi的DNA杂交菌落印记方法（Muscatelloetal.,2004）。之后又有研究人员通过制备VapA蛋白单克隆抗体，构建了可鉴定致病性R.equi的菌落免疫印迹方法（Grimmetal.,2007）。3.2马红球菌病的血清学调查概况到目前为止，用于R.equi血清抗体检测的方法非常之多。有使用琼脂糖凝胶免疫扩散试验用于检测R.equi血清抗体的报道（Giguereetal.,2003），但使用最多的为R.equi血清抗体ELISA检测方法。然而R.equiELISA检测方法非常繁多，根据包被抗原的不同主要可分为以下几种：ELISA-6939、ELISA-33701、ELISA-VapA、ELISA-California。ELISA-6939和ELISA-33701使用的包被抗原分别是非致病性R.equiATCC6939和致病性R.equiATCC33701菌体蛋白（Takaietal.,1985；Takaietal.,1986）；ELISA-VapA的包被抗原为TritonX-114萃取的5 R.equi细胞膜蛋白，其主导成分即为VapA蛋白（Prescottetal.,1996）；ELISA-California则是基于各种R.equi培养液上清的低压冻干物制成的包被抗原（Hietalaetal.,1985）。后期又有其他种类的R.equiELISA检测方法的建立，例如：通过使用马驹肺炎病例分离的R.equi，将其细胞裂解物作为包被抗原构建ELISA检测方法（Witkowskietal.,2012）；另外还有使用pGEX-2T载体，合成以包涵体形式存在的GST-VapA重组蛋白，并以此为包被抗原构建ELISA检测方法（Hooper-McGrevyetal.,2001；Hooper-McGrevyetal.,2003；Hooper-McGrevyetal.,2005）。由于R.equi血清抗体检测的方法繁多且各方法间难于比较，以致到目前为止R.equi血清流行病学调查方法仍未形成一个统一的标准。4本研究的目的意义近十年，随着中国马术运动的兴起，引进马匹在不断增加。伴随着中国现代马业的迅速发展，马匹流动性也在持续增长。因此，马病的防治将是我国兽医界面临的严峻问题。但是，我国马疫病流行情况不清晰，近20年间有关马疫病的研究甚少，R.equi的报导几乎为零。因此，本研究通过使用pMAL-c5x原核表达系统，对VapA蛋白进行可溶性融合表达（龚凤平等，2016），并以VapA重组蛋白为基础，构建致病性R.equi血清抗体间接ELISA检测方法（龚凤平等，2016）以及R.equi菌落印记检测方法。同时，运用此两种方法对我国各地区马匹及马场进行马红球菌病的血清及病原流行病学调查，这将为我国马病防控平台提供基础依据和数据支撑，并为中国现代育马场的建设提供必要的参考。6 第一部分马红球菌毒力相关蛋白VapA的表达与纯化1材料1.1菌种与质粒克隆宿主菌株E.coliDH5α与原核表达菌株E.coliBL21购买于上海依科赛生物制品有限公司，ATCC33701致病性R.equi菌株购买于ATCC细胞库。基因克隆载体pZeroBack/bluntvector购买于天根生化科技有限公司，原核表达载体pMAL-c5x购买于NEB公司。1.2主要试剂及耗材限制性核酸内切酶EcoRI-HF、NotI-HF、10×NEBuffer和AmyloseResin均购自NEB公司；T4DNA连接酶、核酸染料、DNAladderMarker1kb、DNAMarkerDL5000、DNAMarkerDL2000与IPTG诱导剂均购自TakaRa有限公司；2×TaqPCRStarMix购自Genstar公司；琼脂糖为Biowest公司产品；FastHiFidelityPCRKit、零背景快速连接试剂盒（ZeroBackFastLigationKit）、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANgelMidiPurificationKit）、快速质粒小提试剂盒（TIANprepRapidMiniPlasmidKit）以及增强型HRP-DAB底物显色试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；SDS-PAGE试剂盒购买于谷歌生物；预染蛋白Marker购自Thermo公司；5×SDS-PAGE上样缓冲液购买于鼎国生物有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗马IgGFab'2购自LSBio公司；R.equi参比阳性血清由肯塔基大学馈赠；硝酸纤维素膜（NC膜，0.45μm）购买于GEHealthcareLifeSciences公司；3mm滤纸均购自广东展辰生物有限公司；脱脂奶粉购买于鼎国生物科技有限公司。1.3主要溶液的配置0.5MEDTA（pH8.0）：称取Na2EDTA·2H2O186.1g，置于1L烧杯中，加入约800mL的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节pH值至8.0（约20gNaOH），此时EDTA可完全溶解，再加去离子水将溶液定容至1L，高压灭菌后室温保存。50×改良TAE：分别称量冰乙酸57.1mL、Tris242g、0.5MEDTA（pH8.0）10mL，然后加双蒸水定容至1L。使用时稀释为1×的TAE工作液。1%的琼脂糖凝胶：称量1g琼脂糖，加入100mL的TAE工作液，微波炉加热溶解，待凉后（50℃左右）再加入5μL核酸染料，混匀后倒入相应的胶槽中7 即可。DEPC处理水：将DEPC加入双蒸水中比例为1:1000（v/v），室温放置12h以上，高压灭菌后4℃保存。0.25%考马斯亮蓝R-250染色液：分别称量考马斯亮蓝R-2502.5g、冰醋酸100mL、甲醇450mL，然后加入双蒸水定容至1L，溶解后用滤纸过滤以便除去颗粒状物质，室温密封保存。考马斯亮蓝脱色液：分别量取冰醋酸100mL，甲醇450mL，然后加入双蒸水定容至1L，于棕色瓶中室温密封保存。10×SDS-PAGE电泳缓冲液：分别称量Tris15.1g、SDS5g、甘氨酸94g，然后加入双蒸水定容至500mL，室温保存，使用时稀释为1×的工作液。1MTris-HCl（pH8.0）：称取Tris12.11g置于100mL烧瓶中，加入80mL去离子水，充分搅拌溶解后，加入浓盐酸约4.2mL调节pH至8.0（溶液冷却至室温后再调定pH），将溶液定容至100mL，高压灭菌后，室温保存。1MTris-HCl（pH7.4）：称量Tris12.11g置于100mL烧瓶中，加入80mL去离子水，充分搅拌溶解后，加入浓盐酸约7mL调节pH至7.4，（溶液冷却至室温后再调定pH），将溶液定容至100mL，高压灭菌后，室温保存。TBST缓冲液：（20mMTris-HCl，150mMNaCl，0.05%(v/v)Tween20）称取NaCl8.8g，并量取1MTris-HCl（pH8.0）20mL，加入800mL去离子水中充分搅拌溶解，再加入0.5mLTween20，混匀后定容至1L，4℃保存。封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉）：称取脱脂奶粉5g加入100mLTBSTBuffer中充分搅拌溶解后，4℃备用。（该试剂需现配现用）转膜缓冲液：（39mMGlycine，48mMTris，0.037%(w/v)SDS，20%(v/v)甲醇）：分别称量Glycine2.9g，Tris5.8g，SDS0.37g，置于1L烧杯中，加入约600mL去离子水，充分搅拌溶解后，用去离子水定容至800mL，然后加入200mL的甲醇，混匀后室温保存。柱子缓冲液：（20mMTris-HCl（pH7.4），0.2MNaCl，1mMEDTA，10mMβ-疏基乙醇）分别称量1MTris-HCl（pH7.4）20mL、NaCl11.7g、0.5MEDTA2.0mL、β-疏基乙醇0.7mL，然后用去离子水定容至1L，0.22μm滤膜过滤，4℃保存。柱子洗脱液：（20mMTris-HCl（pH7.4），0.2MNaCl，1mMEDTA，10mM8 β-疏基乙醇，10mM麦芽糖）分别称量1MTris-HCl（pH7.4）20mL，NaCl11.7g，0.5MEDTA2.0mL，β-疏基乙醇0.7mL，麦芽糖3.6g，然后用去离子水定容至1L，0.22μm滤膜过滤，4℃保存。0.1%SDS：称量SDS0.1g于100mL去离子水中，混匀后室温储存。LB肉汤：称取30gLB肉汤于1LddH2O中，搅拌混匀后，高压灭菌30min，待冷却后，置于4℃贮存。LB琼脂：称取40gLB琼脂于1LddH2O中,搅拌混匀后，高压灭菌30min，倒入9mm直径的无菌平皿内，待冷却凝固后，置于4℃贮存。氨苄抗性LB肉汤：（氨苄青霉素50µg/mL）高压灭菌的LB液体培养基冷却后，加入氨苄青霉素至终浓度为50µg/mL，4℃保存。氨苄抗性LB琼脂：（氨苄青霉素50µg/mL）高压灭菌的LB固体培养基冷却至50℃左右，加入氨苄青霉素至终浓度为50µg/mL，混匀后分装入9mm直径的无菌平皿内，待冷却凝固后，置于4℃贮存。1.4主要仪器及设备仪器名称品牌高压蒸汽灭菌器日本雅马拓电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司移液枪美国吉尔森恒温培养箱上海智城分析仪器制造有限公司多振幅轨道摇床上海智城分析仪器制造有限公司超净工作台苏净安泰DK-8D型电热恒温水槽上海一恒科学仪器有限公司低温高速离心机5810R德国Eppendorf低温高速离心机5424R德国EppendorfSZ-93自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂超纯水仪美国Think-labTMS1000型PCR仪美国BIO-RAD超微量紫外分光光度计德国IMPLEN凝胶电泳成像系统香港基因有限公司9 仪器名称品牌核酸电泳仪美国BIO-RADSDS-PAGE垂直电泳槽美国BIO-RAD全能型蛋白转印系统美国BIO-RAD定轨摇床江苏海门Kylin-Bell涡旋震荡器德国IKA超声波破碎仪美国SONICS酸度计北京赛多利斯科学仪器有限公司HJ-3数显恒温磁力搅拌器江苏金坛荣华仪器制造有限公司恒温金属浴北京天根生化科技有限公司温控酶标仪美国ThermoScientific精密天平瑞士Mettlertoledo制冰机美国Grant96微孔板震荡仪江苏海门Kylin-Bell瞬时离心机北京天根生化科技有限公司2方法2.1R.equi的复苏与培养按照ATCC33701操作说明进行，复苏培养R.equi。2.2引物设计根据NCBI基因库中R.equi致病基因VapA序列（1238336）、pZeroBack/bluntvector与pMAL-c5x载体酶切位点，运用Oligo6.0软件设计一对VapA全基因序列扩增引物，其内含有NotI与EcoRI酶切位点。该引物由上海英维捷基生物技术有限公司合成，序列如下：F：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAGACCCTGCACAAGACGGTCTC（下划线为NotI酶切位点）R：CCGGAATTCCTAAGCGTTGTGCCAACTACCCGAG（下划线为EcoRI酶切位点）10 2.3VapA基因的PCR扩增与克隆2.3.1VapA基因的PCR扩增参照FastHiFidelityPCRKit说明，PCR反应体系如下：PCR反应体系（50μL）试剂体积FastHiFidelityPolymerase1μL5×FastHiFidelityPCRBuffer10μL20×FastPCREnhancer2.5μLDEPC水33.5μLVapA全基因引物F1μLVapA全基因引物R1μLATCC33701菌液1μL反应条件为：94℃，2min；94℃、30sec，55℃、30sec，68℃、45sec，30个循环；68℃，5min。预计扩增目的片段长度约为570bp。2.3.2VapA基因PCR产物的回收纯化参照天根生化科技有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANgelMidiPurificationKit）的使用说明书进行PCR产物的回收纯化。具体步骤方法如下：1）准备好1.5mLEP管，将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外线照射下切下含有目的基因的凝胶，并放入准备好的EP管中，称取重量。2）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（使用当天处理过的柱子）3）向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100µL，则加入100µLPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块），胶块完全溶解后将溶液温度降至室温再上柱。11 4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800μL可分批加入。5）向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW（使用前需先检查是否已加入无水乙醇），静置2-5min，12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。6）重复操作步骤5。7）将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm（13400×g）离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40μLddH2O，室温放置2min。12000rpm（13400×g）离心2min收集DNA溶液，将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解。2.3.3VapA基因PCR产物与pZeroBack/bluntvector的连接参照零背景快速连接试剂盒（ZeroBackFastLigationKit）说明，连接反应体系如下：连接反应体系（10μL）试剂体积pZeroBack/bluntvector0.3μLT4DNALigase0.5μL2×ReactionBuffer5μLddH2O2.2μLVapA基因PCR纯化产物2μL混匀后，22℃，5min。结束后置于冰上，进行后序转化实验，连接后质粒命名为重组质粒pZeroBack-VapA。12 2.3.4连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞本研究采用热休克法将连接产物转入E.coliDH5α细胞中，具体操作步骤如下：1）从-80℃冰箱取一份感受态细胞悬液，立即放于冰上解冻。2）加入适量目的质粒或连接产物，轻轻混匀后，冰上放置30min。3）42℃水浴热击60sec，迅速置于冰上冷却3-5min。4）加入800μLLB液体培养基，混匀后37℃，180rpm振荡培养60min。5）3000rpm离心5min后，去掉上清液剩余100μL，重悬菌体，将其涂布于氨苄抗性LB琼脂上，正面向上放置于37℃恒温培养箱中待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，培养12-16h。2.3.5可疑菌落的筛选用灭菌10μL枪头挑取可疑菌落于氨苄抗性LB肉汤中，于37℃，180rpm振荡培养4~6h，取适量菌液作VapA基因的PCR鉴定，PCR扩增体系如下：PCR扩增体系（20µL）试剂体积2×TaqPCRStarMix10μLVapA全基因引物F1μLVapA全基因引物R1μLDEPC水7μL菌液1μL反应条件为：94℃，5min；94℃、1min，55℃、1min，72℃、1min，30个循环；72℃，10min。预计扩增目的片段长度约为570bp，将VapA基因PCR扩增出现相应条带大小的菌液，进行扩大培养以提取质粒。2.3.6重组质粒pZeroBack-VapA的提取将VapA基因PCR鉴定阳性的菌液进行扩大培养，参照天根生化科技有限公司快速质粒小提试剂盒（TIANprepRapidMiniPlasmidKit）的使用说明书进行质粒抽提，具体步骤如下：1）取1-4mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，1200013 rpm（13400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。2）向留有菌体沉淀的离心管中加入150μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA和TIANRed），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。3）向离心管中加入150μL溶液P2，温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解。此时菌液变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。4）向离心管中加入350μL溶液P5，立即快速地上下颠倒混匀12-20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀。12000rpm（13400×g）离心2min。5）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。6）向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（13400×g）离心30sec。倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm（13400×g）离心1min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。8）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μLddH2O。12000rpm（13400×g）离心30sec将质粒溶液收集到离心管中。9）将提取的重组质粒pZeroBack-VapA置于-20℃储存。2.3.7重组质粒pZeroBack-VapA的双酶切与测序鉴定将上步中提取的重组质粒pZeroBack-VapA使用限制性内切酶EcoRI与NotI进行双酶切鉴定，酶切体系如下：酶切体系（50µL）重组质粒pZeroBack-VapA1µg10×CutSMartBuffer5μLEcoRIHF1μLNotIHF1μLddH2OUpto50µL14 混匀后，置37℃水浴2-4h，将酶切产物使用1%琼脂糖凝胶进行核酸电泳分析。预计出现两条目的片段，长度分别为3200bp与570bp。若为阳性，则取部分重组质粒pZeroBack-VapA送广州华大基因生物技术有限公司进行序列测定。同时，通过互联网NCBI基因库下载致病性R.equiVapA基因片段（1238336），结合VapA引物特点，并使用LasergeneMegAlign进行比对，分析序列是否正确。2.4原核表达重组质粒pMAL-VapA的构建与鉴定将原核表达载体pMAL-c5x和已经测序正确的重组质粒pZeroBack-VapA分别用限制性内切酶EcoRI与NotI进行双酶切处理，操作同“2.3.7”所述。将pMAL-c5x和pZeroBack-VapA的酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收。具体回收步骤参照“2.3.2”。目的条带大小分别为5600bp与570bp。将回收的pMAL-c5x与VapA基因利用T4DNA连接酶于16℃连接仪中过夜连接。然后按“2.3.4”方法转入E.coliDH5α，并挑取白色单菌落接种于10mL氨苄抗性LB肉汤中，37℃培养，180rpm震荡培养12-16h。经菌液VapA基因PCR鉴定阳性后，提取质粒，方法参照“2.3.6”。将其送华大基因测序，验证序列是否正确，并将其命名为pMAL-VapA。2.5可溶性重组蛋白rVapA的表达及最佳诱导条件的确定按照“2.3.4”方法将pMAL-VapA质粒转入E.coliBL21表达菌中。VapA基因PCR鉴定为阳性之后，将菌液按1:100比例接种于氨苄抗性LB肉汤中。37℃摇床中180rpm振荡培养至菌液OD600nm为0.6左右时，使用IPTG诱导表达VapA蛋白。该蛋白可与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合，构成重组蛋白MBP-VapA，并将其命名为rVapA。2.5.1IPTG诱导温度的确定按前所述，当菌液的OD600nm达0.6左右时，加入浓度为1mM的IPTG。并分别于20℃、28℃和37℃的条件下，180rpm震荡培养至恰当的诱导时间取样。然后4000rpm离心10min，弃上清，最后用原体积1/10的柱子缓冲液将沉淀重悬。经超声破碎细胞约10min（冰浴条件下），然后4℃。12000rpm离心20min，再用和上清体积相同的柱子缓冲液重悬菌体沉淀。按常规方法进行SDS-PAGE，检测上清和沉淀中rVapA的表达，以确定表达蛋白是以可溶形式存在还是以包涵体形式存在，并确定最佳诱导温度。15 2.5.2IPTG诱导时间的确定采用上述最佳诱导温度进行诱导表达。当菌液OD600nm达0.6左右时，加入浓度为1mM的IPTG。分别诱导表达0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h后取样。4000rpm离心10min。弃上清，剩下沉淀用原体积1/10的柱子缓冲液重悬。进行SDS-PAGE分析，确定IPTG最佳诱导时间。2.5.3IPTG诱导浓度的确定采用上述最佳诱导温度与时间，当菌液OD600nm达0.6左右时，分别用终浓度为0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM和1.4mM的IPTG进行诱导表达。样品以4000rpm离心10min，弃去上清，收集菌体，用原体积1/10的柱子缓冲液重悬。使用SDS-PAGE分析，确定IPTG最佳诱导浓度。2.6重组蛋白rVapA的SDS-PAGE分析将上步中诱导表达的重组蛋白rVapA参照《蛋白质技术手册》方法进行SDS-PAGE分析，具体步骤如下：1）按照如下配方配置12%的分离胶（10mL）和5%的浓缩胶（3mL）。SDS-PAGE配方12%分离胶5%浓缩胶去离子水3.3mL去离子水2.1mL30%丙烯酰胺4.0mL30%丙烯酰胺0.5mL1.5MTris（pH8.8）2.6mL1.0MTris（pH6.8）0.38mL10%SDS0.1mL10%SDS0.03mL10%过硫酸铵（APS）0.1mL10%过硫酸铵（APS）0.03mLTEMED0.004mLTEMED0.003mL2）按以上的配方将12%分离胶各组分混匀后，再用移液器沿隔片加入模具内。等凝胶溶液加至距离前玻璃板顶端约1.5-2.0cm时，在分离胶溶液上覆盖一层去离子水。待凝胶表面平整压实后静置，凝固时间约20-50min。3）分离胶凝固后，配制5%浓缩胶。用滤纸吸尽分离胶上的去离子水，注意动作要轻，防止破坏已凝的分离胶。在分离胶的上层加入配好的浓缩胶溶液，当到达前玻璃板顶端时再将梳子插入凝胶内，前玻璃板的顶端要与梳子的底部平16 齐，尽量避免气泡产生，待浓缩胶凝固后（大约20-50min）拔出梳子。4）样本处理，将处理好的蛋白样本与5×SDS-PAGE上样缓冲液按4:1比例混合，沸水中变性处理6-10min，然后冰上冷却后用于后续电泳。5）将配制好的凝胶与电泳槽组装好后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，保证凝胶的前玻璃板顶端均浸泡在电泳缓冲液中。6）将处理好的样品以及蛋白Marker用微量移液器加样，每个泳道的最大上样量为15μL。当样品进入浓缩胶时电压为80V，之后随着进入分离胶，电压调至120V，最后当样品抵达分离胶底部时结束电泳。7）取出凝胶，然后做好标记，再用考马斯亮蓝G-250染色液震荡染色45-60min。弃去染色液后将凝胶在清水中漂洗，再加入考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。之后将凝胶在清水中漂洗，最后观察分析结果。2.7可溶性重组蛋白rVapA的非变性纯化将含有pMAL-VapA质粒的E.coliBL21菌液按1:100的比例接种于氨苄抗性LB肉汤中。于37℃，180rpm振荡培养至菌液OD600nm约0.6左右时，加入浓度为0.7mM的IPTG，20℃诱导8h。按照AmyloseResin的说明书，利用AmyloseResin与MBP的特异性结合效应，对重组蛋白rVapA进行非变性纯化。具体操作如下：2.7.1蛋白粗提将诱导表达后菌液，4000rpm离心10min，收集菌体。用原体积1/10的柱子缓冲液重悬，然后置于-20℃冷冻，冷水中化冻。将解冻后菌液置于冰水浴中，以4sec破碎、5sec间隔程序，超声破碎菌体，持续超声破碎直到所释放的蛋白质达到最大量，此时菌悬液变为清亮液体。将破碎后菌液，4℃，12000rpm，离心20min，其上清即为含有目的蛋白rVapA的粗提物。使用微量分光光度计测量总蛋白浓度，将rVapA粗提物进行SDS-PAGE分析，使用Bandscan软件对SDS-PAGE图片进行分析处理，依据条带粗细以及颜色深浅，计算出rVapA条带占总蛋白条带的比例，以此估算出rVapA的表达量。2.7.2rVapA的亲和层析1）柱子的准备：将1mLAmyloseResin介质填充于规格为1.0x10cm的柱子中，用5倍介质体积的柱子缓冲液冲洗柱子。2）上柱：介质的量决定融合蛋白质的量，每毫升介质体积可结合6-8mg17 rVapA，根据估算的目的蛋白表达量计算rVapA粗提物上样体积。控制最大线性流速为24cm/h，即0.3mL/min，按公式（2.7.2）进行换算。2线性流速（cm/h）×πr=体积流速（mL/h）（2.7.2）3）洗脱：用10倍介质体积的柱子缓冲液洗柱子，然后用10倍介质体积的柱子洗脱液洗脱目的蛋白，以每组分1mL收集10个组分，使用微量分光光度计测量每组回收蛋白的浓度。2.8重组蛋白rVapA的抗原性分析将纯化的重组蛋白rVapA用于WB检测，具体步骤如下：1）将含有rVapA的SDS-PAGE凝胶置于转印平皿中。剪一张与SDS-PAGE凝胶一样大小的8张3mm滤纸及1张硝酸纤维素膜（NC膜，0.45μm），浸泡于转膜缓冲液中大约15min左右，以驱除留于滤膜上的气泡。2）干法电转：三明治组装，负极、4层滤纸、SDS-PAGE凝胶、NC膜、4层滤纸、正极，使用玻璃棒滚压以排除气泡。接通电极，以恒定电压15V转移12min。3）封闭：电转结束后，取出NC膜，用TBST缓冲液洗涤两次，每次5min。加封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉），室温封闭2h。去除封闭液，用TBST缓冲液洗膜一次，10min。4）一抗孵育：一抗为R.equi参比阳性血清，使用封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉）将其作1:100稀释，4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤四次，每次5min。5）二抗孵育：使用羊抗马IgGFab'2-HRP酶标二抗，以封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉）作1:1000稀释，室温孵育2h。用TBST缓冲液洗涤四次，每次5min。6）显色：使用增强型HRP-DAB底物显色液显色，暗环境操作，按试剂盒说明书进行。3结果3.1VapA基因的PCR扩增以ATCC33701R.equi菌液为模板，以F和R做为引物，进行PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，呈现一条大约570bp大小的目的片段，与预期VapA扩增产物大小一致（图1）。18 图1VapA基因的PCR扩增1：目的基因的PCR扩增产物M：DL2000marker3.2重组质粒pZeroBack-VapA的鉴定pZeroBack-VapA重组克隆菌经VapA基因PCR鉴定，出现大小约570bpDNA条带，与预期目的基因大小一致（图略）。提取重组质粒pZeroBack-VapA，经限制性内切酶EcoRI和NotI的双酶切鉴定，可获得一条3200bp左右的条带和一条570bp左右的条带，与预期结果相符（如图2）。测序结果经LasergeneMegAlign序列比对分析，与VapA引物及序列（1238336）相吻合，且酶切位点均正确。表明VapA基因已成功构建到pZeroBack/bluntvector中。图2重组质粒pZeroBack-VapA的双酶切鉴定1：pZeroBack-VapA重组质粒的EcoRI与NotI双酶切鉴定M：DL5000marker19 3.3重组质粒pMAL-VapA的鉴定pMAL-VapA重组克隆菌经VapA基因PCR鉴定，出现大小约570bpDNA条带，与预期目的基因大小一致（图略）。送华大基因测序鉴定结果显示酶切位点均正确（序列见图3），并经LasergeneMegAlign序列比对分析，与目的VapA序列一致。表明pMAL-VapA质粒构建成功。ACATATGTCCATGGGCGGCCGCATGAAGACCCTGCACAAGACGGTTTCTAAGGCGATCGCAGCCACAGCCGTAGCTGCGGCTGCGGCTATGATTCCCGCCGGCGTCGCTAATGCGACCGTTCTTGATTCCGGTAGCAGCAGTGCGATTCTCAATAGTGGGGCAGGCAGTGGCATTGTCGGTTCTGGGAGCTATGACAGCTCGACGACTTCGTTAAACCTTCAGAAAGACGAACCGAACGGTCGAGCAAGCGATACCGCCGGGCAAGAGCAGCAGTACGACGTTCACGGAGACGTCATCAGCGCGGTCGTCTACCAGAGGTTTCACGTATTCGGGCCAGAAGGAAAGGTCTTCGATGGCGATGCAGGGGGACTCACGCTTCCTGGGGCCGGCGCGTTCTGGGGGACTCTCTTCACAAATGACCTTCAGCGTCTCTACAAAGACACCGTCTCGTTCCAGTACAACGCCGTGGGGCCATACCTGAACATCAACTTCTTCGATAGCTCAGGTAGCTTCCTCGGCCATATCCAGTCCGGTGGAGTTAGTACTGTGGTGGGCGTCGGCGGCGGCTCGGGTAGTTGGCACAACGCTTAGGAATTCCCTGCAGGTA图3pMAL-VapA质粒测序鉴定结果下划线部位分别为NotⅠ与EcoRⅠ酶切位点3.4重组蛋白的表达条件优化3.4.1重组蛋白的诱导表达以及最佳IPTG诱导温度的确定pMAL-VapA重组表达菌诱导表达产物经SDS-PAGE分析，出现一条突出表达蛋白，蛋白大小约为59ku，与预期蛋白大小一致（如图4）。经IPTG诱导温度优化试验，发现在20℃条件下，目的蛋白的表达量最大，且绝大部分以可溶形式存在（如图5）。20 图4rVapA的诱导表达M：蛋白marker1-2：BL21空载菌诱导后与诱导前3-4：pMAL-c5x质粒BL21对照菌诱导后与诱导前5-6：pMAL-VapA重组质粒BL21表达菌诱导前与诱导后图5rVapA的诱导温度优化与可溶性分析M：蛋白marker1：诱导前2：20℃诱导后超声裂解液上清3：20℃诱导后超声裂解沉淀4：28℃诱导后超声裂解液上清5：28℃诱导后超声裂解沉淀6：37℃诱导后超声裂解液上清7：37℃诱导后超声裂解沉淀3.4.2最佳IPTG诱导浓度与时间的确定在20℃诱导条件下，经IPTG诱导浓度梯度和诱导时间梯度的试验，确定采21 用0.7mM的IPTG进行诱导8h时，重组蛋白的表达量最大（如图6与图7）。图6rVapA的IPTG诱导浓度优化M：蛋白marker1-7：IPTG诱导剂浓度0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM、1.4mM图7rVapA的诱导时间优化M：蛋白marker1-8：IPTG诱导剂分别诱导0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h3.4.3重组蛋白的纯化经SDS-PAGE分析，使用AmyloseResion纯化目的蛋白，可获得较高纯度22 的重组蛋白rVapA（如图8）。图8rVapA的纯化M：蛋白marker1-2：pMAL-VapA重组质粒BL21表达菌诱导前与诱导后3：rVapA纯化蛋白4：pMAL-VapA重组质粒BL21表达菌诱导后超声裂解液上清5：pMAL-VapA重组质粒BL21表达菌诱导后超声裂解沉淀3.5重组蛋白rVapA的抗原性分析WB检测纯化后重组蛋白rVapA的抗原性，结果显示，其可被R.equi参比阳性血清特异性识别。表明rVapA蛋白具有良好的抗原性（图9）。图9rVapA的WB分析1：rVapAM：蛋白Marker4讨论近二十年来，有大量关于R.equi致病机理的报道，其中研究最多的就是由致病岛内基因编码的R.equi毒力相关脂蛋白VapA，是目前为止发现的唯一的由非调控区致病岛基因编码的细胞膜相关毒力因子（Wangetal.,2014），VapA蛋23 白被视为马源致病性R.equi的标志性抗原。4.1重组蛋白rVapA中MBP的作用融合表达重组蛋白的方法不仅可以防止包涵体的形成，而且还有提高蛋白翻译和折叠效率、减少蛋白水解的作用。近年，人们发现很多蛋白可以作为融合蛋白来促进重组蛋白的可溶性表达，例如：硫氧还蛋白、谷胱甘肽转移酶（GST）（Mukhopadhyayetal.,2002）、麦芽搪结合蛋白（MBP）（Bachetal.,2001）、周质蛋白TloAⅢ（Anderluhetal.,2003）等。因此，本研究尝试使VapA蛋白与MBP融合表达，并通过IPTG诱导条件的优化。发现在20℃条件下，本实验获得的重组蛋白rVapA几乎全部以可溶形式存在。也有报道采用谷胱甘肽转移酶（GST）融合的方式表达VapA蛋白，但该融合表达的目的蛋白以包涵体形式存在（Hooper-McGrevyetal.,2001）。有证据表明，MBP的融合表达可溶性蛋白的能力强于GST和硫氧还蛋白（Bachetal.,2001）。本实验所获得的rVapA经WB检测，表明具有非常好的抗原性。其抗原性可能优于其它方法融合表达的VapA蛋白。因为，自然状态下的VapA蛋白是位于R.equi细胞膜表面的脂蛋白（Meijeretal.,2004）。在重组表达菌内，MBP发挥其分子伴侣作用，将脱离核糖体的MBP融合蛋白迅速地定位于细胞膜上，避免了表达菌内膜蛋白转运机制对外源表达蛋白的干扰或破坏（Kulothunganetal.,2009），而其他表达质粒无法规避此破坏。因此，与其他研究者融合表达的VapA蛋白相比，本实验表达的rVapA抗原性可能更好，更接近R.equi天然表达VapA蛋白的拓扑结构。4.2重组蛋白rVapA的诱导表达与纯化致病性R.equiVapA蛋白为温度诱导膜表面脂蛋白，在低温（25-32℃）条件下致病性R.equi不表达VapA蛋白，在高温（34-41℃）条件下可得到大量表达（Takaietal.,1992；Tanetal.,1995）。低温诱导表达蛋白，可降低蛋白降解速率，增强蛋白生物结构稳定性。本研究采用pMAL-c5x体系表达重组蛋白rVapA，可在低温（20℃）条件下大量诱导表达，可相对提高rVapA的生物结构稳定性。目前，检测用VapA蛋白的获得途径主要有两种。其一，通过使用TritonX-114处理致病性R.equi，以获取细胞膜蛋白（Prescottetal.,1996），该方法获取的VapA蛋白混有大量其他膜蛋白。另外一种方法是重组表达VapA蛋白，目前该24 方法遇到的主要问题是表达的VapA蛋白多以包涵体的形式存在（Hooper-McGrevyetal.,2001），这种形式的蛋白抗原性较差，且其后续纯化以及检测用生物制品的生产开发工艺繁琐。本研究采用pMAL-c5x体系表达可溶性重组蛋白rVapA，可利用AmyloseResin与MBP特异性结合的性质进行纯化，可很大程度上简化融合表达蛋白的纯化程序，更易于工业化生产。且获得的重组蛋白rVapA具有抗原性好、纯度高的特点。5结论本实验使用pMAL-c5x表达体系，通过表达条件的优化，获得了重组蛋白rVapA的大量可溶性表达。其具有良好的抗原性，可作为致病性R.equi感染的检测抗原，且其具有纯化操作简便、易于工业化生产等优点。25 第二部分马红球菌病抗体间接ELISA检测方法的建立及其血清流行病学调查1材料1.1参比血清及主要试剂材料R.equi参比阴血清由肯塔基大学馈赠；马传染性贫血（EIA）参比阳性血清来自马传染性贫血琼脂糖扩散检测试剂盒（购于哈尔滨兽医研究所）；H3N8马流感（EI）参比阳性血清及马痹肺炎（ER）参比阳性血清由广东出入境检验检疫局技术中心提供；R.equirVapA的来源及制备参照“第一部分”；TMB底物显色试剂盒购自KPL公司，ELISA板购于JETBIOFIL，其余各种试剂、仪器均参见“第一部分”材料。1.2主要溶液的配制包被液：（0.1MNaHCO3，pH9.6）称取8.4gNaHCO3，溶于800mL去离子水中，充分溶解后，调节pH至9.6，然后用去离子水定容至1L，4℃储存。PBS：（137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，2mMKH2PO4，pH7.2）分别称量NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO41.42g、KH2PO40.27g于1L的烧杯中，向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH值调节至7.2，然后加入去离子水将溶液定容至1L，4℃储存。PBST：（0.05%Tween20）向1L的PBS缓冲液中加入500μLTween20，充分震荡混匀后于4℃储存。封闭液（0.5%聚乙烯醇（PVA））：称取1gPVA，置于100mL去离子水中，80℃加热至完全溶解，待冷却后按等比例加入PBS，混匀后置4℃储存。终止液：（2MH2SO4）将96%的浓H2SO4（化学纯）11.1mL逐滴加入到88.9mL去离子水中，混匀后常温储存。2方法纯化的rVapA经包被液（0.1MNaHCO3，pH9.6）稀释后，100μL/孔，包被于ELISA板，4℃过夜（>8h）；使用PBST（pH7.2）洗涤，200μL/孔，将其置于96微孔板震荡仪上，洗涤4次，每次3min；加入封闭液200μL/孔，于室温封闭1h；如上方法洗涤4次；血清用PBST（pH7.2）稀释，100μL/孔，37℃温浴1h；如上方法洗涤4次；将羊抗马IgGFab'2-HRP酶标二抗用PBST（pH7.2）26 稀释，100μL/孔，37℃温浴1h；如上方法洗涤4次；TMB显色液100μL/孔，室温避光10min；终止液（2MH2SO4）100μL/孔；置于酶标仪OD450nm读数。2.1抗原包被浓度及血清最佳稀释度的确定采用矩阵滴定法确定抗原、抗体的最佳浓度。以纯化的rVapA作为包被抗原，分别以100、50、25、12.5、6.25ng/孔包被96孔板。将R.equi参比阴、阳性血清分别作1:100、1:200、1:400、1:800稀释。以R.equi参比阳性血清OD450nm值在1.0左右，且P/N值最大为评定标准，确定抗原的最佳包被浓度和血清的最佳稀释度。P/N值按公式（2.1）计算。P/N=（阳性血清OD450nm值－阳性血清无抗原对照OD450nm值）/（阴性血清OD450nm值－阴性血清无抗原对照OD450nm值）（2.1）2.2酶标二抗最佳工作浓度的确定使用上述最优抗原浓度和最佳血清稀释度，酶标二抗分别以1:1250、1:5000、1:20000、1:80000、1:320000稀释度，进行ELISA操作。并以上述标准判定酶标二抗的最佳稀释度。2.3封闭液的选择分别使用2%牛血清白蛋白（BSA）、1%BSA、5%脱脂奶粉、1%聚乙烯醇（PVA）和0.5%PVA做为ELISA封闭液，采用上述最优条件，进行ELISA操作。并以上述标准选择最佳封闭液。2.4ELISA临界值的确定采用上述优化条件进行ELISA操作，检测R.equi参比阴性样品1份、无疫区马匹血清样品19份，根据公式（2.4）计算阴、阳性临界值。临界值=X+3SD（2.4）2.5重复性试验采用同一批次包被的ELISA板，分别在不同时间对5份血清进行ELISA检测，计算批内变异系数。使用不同批次包被的96孔板，并对5份血清进行ELISA检测，计算批间变异系数。2.6特异性试验采用优化的ELISA操作方法，并以R.equi参比阴、阳性血清做对照，对H3N8EI、ER和EIA参比阳性血清进行检测。27 2.7R.equi血清流行病学调查2.7.1马血清样本的采集在2014年1月至2016年1月两年间，分别在广东、香港、内蒙以及新疆地区马场采集马血清样本，总共采集534份马血清（见表1）。其中广东地区马血清样本分别采集于春末初夏季节（4月底与5月初）、秋季（9月与10月）以及冬季（11月与12月）（见表2）。而香港、内蒙以及新疆地区仅为单次采集样本，不具有时间连续性。所有样本当中，新疆地区血清样本全部来源于母马，而广东地区样本则绝大部分来源于公马。各地区马血清样本，区分不同品种与年龄。分别存在以下品种：纯血马、蒙古马、伊犁马、混血马以及其他马匹（国产马与血源不明马匹），马匹年龄则由1岁至25岁均有采集。表1国内马血清样本采集数据列表广东香港内蒙古新疆3771912126总计：534份马血清样本表2广东地区不同季节采集马学清样本数据列表春末初夏秋季冬季4月底5月初9月10月11月12月10925171102019322302.7.2马血清样本的检测采用优化的ELISA操作方法对采集的马血清样本进行检测，计算总体致病性R.equi血清抗体阳性率，同时计算不同地区、品种、性别以及季节样品采集的致病性R.equi血清抗体阳性比率。2.7.3统计学分析本实验使用SigmaPlot软件，对血清学调查结果进行数据统计学分析。采用28 OneWayANOVARanks方法，比较分析不同地区、品种、性别以及季节的组间差异显著性，分析各组之间致病性R.equi血清抗体水平的差异。采用LinearRegression方法，进行年龄与致病性R.equi血清抗体水平的统计学相关性分析，观察是否存在相关性。3结果经抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度以及包被液的选择优化，获得最佳ELISA反应条件如下：以纯化的rVapA作为包被抗原，以包被液（0.1MNaHCO3，pH9.6）稀释为125ng/mL，100μL/孔，包被于ELISA板，4℃过夜（>8h）；使用PBST（pH7.2）洗涤，200μL/孔，将其置于96微孔板震荡仪上，洗涤4次，每次3min；以0.5%PVA作为封闭液，200μL/孔，于室温封闭1h；如上方法洗涤4次；血清以PBST（pH7.2）按1:400稀释，100μL/孔，37℃温浴1h；如上方法洗涤4次；羊抗马IgGFab'2-HRP酶标二抗以PBST（pH7.2）按1:20000稀释，100μL/孔，37℃温浴1h；如上方法洗涤4次；TMB显色液100μL/孔，室温避光10min；以终止液（2MH2SO4）100μL/孔终止反应；置于酶标仪OD450nm读数。3.1抗原包被浓度及血清最佳稀释度的确定当rVapA以125ng/mL包被且血清以1:400稀释时，R.equi参比阳性血清OD450nm值在1.0左右、P/N值最大、背景值低且抗原用量少（如图10）。因此，确定其为该ELISA的最佳抗原包被浓度和抗体稀释浓度。29 图10.抗原抗体稀释度优化结果以及对应的P/N值3.2酶标二抗最佳工作浓度的确定以R.equi参比阳性血清OD450nm值在1.0左右，且P/N值最大为标准，确定羊抗马IgGFab'2-HRP最佳稀释倍数为1:20000稀释（如图11）。30 图11羊抗马IgGFab'2-HRP酶标二抗稀释度优化结果以及对应P/N值3.3封闭液的选择与其它封闭液相比，当使用0.5%PVA封闭时，R.equi参比阳性血清OD450nm值在1.0左右、P/N值最大、背景值低（如表3），所以最佳封闭液为0.5%PVA。表3封闭液优化结果2%BSA1%BSA5%脱脂奶粉1%PVA0.5%PVA阳性血清2.7912.5911.6611.6191.444阳性血清无抗原对照2.0052.0100.5860.2180.283阴性血清0.2650.3200.3370.3360.279阴性血清无抗原对照0.0930.1010.1320.0870.095P/N值4.5622.6645.2345.6256.2943.4ELISA临界值的确定对R.equi参比阴性血清及无疫区马匹血清样品进行ELISA检测，确定该ELISA的临界值为：（X+3SD）=（0.210+3×0.054）=0.370。因此，当样品的OD450nm值≥0.370为阳性，OD450nm值<0.370为阴性。用于计算临界值的阴性样本值检测呈正态分布，如图12。31 图12阴性样本OD450nm值正态分布图3.5重复性试验使用同一批次包被的ELISA板，分别在不同时间进行检测，5份血清批内变异系数在5.90%-14.23%之间。采用不同批次包被的96孔板进行试验，5份血清的批间变异系数在8.78%-9.66%之间。以上结果表明该方法具有良好的重复性，数据见表4。表4重复性实验结果批内变异系数批间变异系数样品平均数±标准偏差变异系数平均数±标准偏差变异系数（X±SD）CV（%）（X±SD）CV（%）10.239±0.03414.230.145±0.0149.6620.439±0.0265.900.397±0.0358.7830.423±0.0358.190.412±0.0389.1740.168±0.02212.870.193±0.0178.9451.371±0.1319.550.988±0.0888.913.6特异性试验使用该ELISA对H3N8EI参比阳性血清、ER参比阳性血清以及EIA参比32 阳性血清检测的OD450nm平均值分别为0.147、0.129和0.083，均小于临界值，为阴性（表5）。表明该ELISA具有较好的特异性。表5特异性实验结果H3N8EIER阳性血EIA阳性R.equi阳R.equi阴阳性血清清血清性血清性血清0.1530.1320.0801.1120.217OD450nm值0.1420.1270.0851.1190.2220.1470.1280.0851.1180.218OD450nm平均0.1470.1290.0831.1170.219值3.7R.equi血清流行病学调查3.7.1马匹致病性R.equi血清抗体阳性率ELISA检测马血清样本，广东、香港、内蒙古以及新疆地区在2014年1月至2016年1月两年间致病性R.equi血清抗体总体阳性率为53.93%。广东地区总体阳性率为46.68%（见图13），其中2014年为48.21%、2015年为46.42%，两年间广东地区致病性R.equi血清抗体阳性率无显著差异。香港的19份马学清样本抗体水平均为阴性，阳性率为0（见图13）。内蒙地区的12份血清致病性R.equi血清抗体阳性率为58.33%（见图13）。新疆地区采集的样本均来源于母马，其致病性R.equi血清抗体总体阳性率高达83.33%，高于其他地区（见图13）。33 图13全国各地区血清样本ELISA检测阳性率所有样本来源马匹品种分别为纯血马、蒙古马、伊犁马、混血马以及其他（国产马与血源不明马匹），其致病性R.equi血清抗体总体阳性率分别为47.52%、43.48%、76.81%、84.38%以及30.43%，可见混血马血清抗体阳性率最高，伊犁马次之（见图14）。图14不同品种血清样本ELISA检测阳性率采集样本中所有雄性马匹致病性R.equi血清抗体阳性率为44.44%，雌性为80.00%，明显高于雄性（见图15）34 图15不同性别血清样本ELISA检测阳性率3.7.2致病性R.equi血清抗体水平的地区差异OneWayANOVARanks统计学分析显示各地区致病性R.equi血清抗体水平间差异显著。新疆地区马匹平均血清抗体水平最高（0.506，n=126），显著性高于广东（0.364，n=377，p<0.001）、内蒙古（0.378，n=12，p<0.001）、香港（0.196，n=19，p<0.001）地区，部分样本甚至达或超出R.equi参比阳性血清抗体水平（图16）。香港地区马匹血清抗体水平最低，显著低于新疆（p<0.001）、内蒙古（p<0.001）、广东（p<0.001）地区（图16）。广东地区平均血清抗体水平略低于内蒙古地区，但差异不显著（图16）。马匹致病性R.equi血清抗体水平的显著地区差异性表明我国致病性R.equi感染情况可能存在地区性流行特点。35 图16致病性R.equi血清抗体水平的地区差异比较与分析3.7.3马匹致病性R.equi血清抗体水平的种间差异马匹品种间致病性R.equi血清抗体水平的统计学分析显示差异显著。不同品种马匹血清抗体平均水平由高到低依次为：伊犁马（0.491，n=138）、混血马（0.459，n=32）、纯血马（0.364，n=101）、蒙古马（0.348，n=23）、其他马匹（国产马与血源不明马匹）（0.291，n=23）（见图17）。其中，伊犁马与混血马血清抗体水平均显著高于纯血马（p<0.001）与其他马匹（国产马与血源不明马匹，p<0.001），而伊犁马与混血马之间不存在显著性差异（见图17）；伊犁马血清抗体水平显著高于蒙古马（p<0.001）（见图17）；其余马匹品种间两两比较，不存在显著性差异（见图17）。结果表明：不同品种马匹可能对致病性R.equi感染的易感性不同。36 图17致病性R.equi血清抗体水平的种间差异比较与分析3.7.4马匹致病性R.equi血清抗体水平的性别差异不同性别间致病性R.equi血清抗体平均水平的统计学分析显示：雌性马匹血清平均抗体水平（0.494，n=155）显著高于雄性（0.358，n=243，p<0.001）（如图18）。结果表明：马匹致病性R.equi感染的性别差异是其流行病学特点之一，即母马对R.equi更易感。37 图18.致病性R.equi血清抗体水平的性别差异比较与分析3.7.5致病性R.equi血清抗体水平的季节差异使用SigmaPlot软件进行OneWayANOVARanks分析比较广东地区不同季节采集的样本间致病性R.equi血清抗体水平的差异。发现秋(0.368，n=322)、冬（0.429，n=30）季节采集的样本，其血清抗体水平显著高于春末夏初季节采集的样本（0.221，n=19），p值均小于0.001（如图19）。而秋季与冬季之间不存在显著性差异（如图19）。结果表明：广东地区，马匹致病性R.equi的感染存在季节性，马匹秋冬季节较春末、夏初季节易感。38 图19广东地区致病性R.equi血清抗体水平的季节差异比较与分析3.7.6致病性R.equi血清抗体水平与马匹年龄的相关性分析使用SigmaPlot软件进行LinearRegression分析比较年龄与致病性R.equi血清抗体水平间的统计学相关性。发现，马匹的年龄与样本血清抗体水平间不存2在线性关系（R=0.00823，p=0.069，如图20）。结果表明：致病性R.equi血清抗体水平可能与马匹年龄大小无关。39 2R=0.00823p=0.069图20致病性R.equi血清抗体水平与马匹年龄的相关性分析OD450nm值=0.459-（0.00307×年龄）4讨论4.1R.equi间接ELISA检测方法的建立本研究建立的ELISA方法经检验具有较好的敏感性、特异性和重复性。到目前为止，世界范围内，对于马匹R.equi血清抗体的检测方法仍未形成一个统一的标准。琼脂糖凝胶免疫扩散试验可用于检测R.equi血清抗体（Giguereetal.,2003），但因其方法的局限性，在R.equi感染的检测上敏感性低于ELISA方法。现今临床上用于R.equi感染检测的ELISA方法主要有三类。它们的区别在于包被抗原的不同，其抗原分别是R.equi菌体蛋白（Takaietal.,1985；Takaietal.,1986；Witkowskietal.,2012）、R.equi膜蛋白（Prescottetal.,1996）、或以包涵体形式存在的VapA重组蛋白（Hooper-McGrevyetal.,2001；Hooper-McGrevyetal.,2003；Hooper-McGrevyetal.,2005）。本文依赖可溶性表达rVapA建立的R.equi间接ELISA方法，有效避免了因致病菌灭活不全导致散毒而威胁生物安全、包涵体形式VapA抗原性低而致检测敏感度低的缺点。该ELISA检测方法，不仅具有特异性高重复性好的特点，还因其制作方法具备生物安全性、操作简便等优点，更易于工业化生产和推广，有望成为R.equi血清抗体检测的标准方法。该ELISA的应用，将有助于我国马匹R.equi感染情况的调查研究，为我国马病40 防控平台提供基础依据和数据支撑，并为中国现代育马场的建设提供必要的参考。4.2血清流行病学调查马驹R.equi肺炎呈地方性流行（Prescott,1987），R.equi在全球范围内均有分布（Cuterietal.,2003；Grimmetal.,2007；Miretal.,2015；Muscatelloetal.,2006；Takaietal.,2001）。在我国仅内蒙古地区对该病原菌进行了调查，并报导R.equi的存在（丁壮等，2008）。到目前为止，我国还未有在马场发现致病性R.equi的报道，且无相关血清流行病学调查研究信息。4.2.1我国致病性R.equi血清抗体阳性率与世界各地区的比较本研究通过对广东、香港、内蒙古以及新疆地区马匹采集血清样本，使用建立好的ELISA检测方法进行检测，发现我国致病性R.equi血清抗体总体阳性率高达53.93%。早年日本北海道有报道过使用ELISA检测马匹R.equi血清抗体总体阳性率为11.0%，然而不同马场阳性率差异显著，部分马场高达78.9%（Sanadaetal.,1992）。澳大利亚曾报道过3周至6月龄小马R.equi血清抗体总体阳性率高达68.52%（Phumoonnaetal.,2006）。意大利也曾有报道过1-6月龄小马R.equi血清抗体总体阳性率仅为13%左右（Cuterietal.,2003）。土耳其东南部马匹R.equi血清抗体总体阳性率仅为11.7%，不同省份间差异并不明显（Teletal.,2011）。综合以上信息可知，R.equi血清抗体阳性率，在世界范围内地区性差异明显，R.equi感染呈地方性流行特点。4.2.2我国地区间致病性R.equi血清抗体水平差异的分析本研究对我国不同地区R.equi血清流行病学进行调查，发现我国致病性R.equi感染情况可能存在地区性流行特点。新疆地区致病性R.equi血清抗体阳性率高达83.33%，其血清抗体水平普遍偏高，部分样本甚至达或超出R.equi参比阳性血清抗体水平。这在一定程度上可以说明，此种ELISA检测表现为高抗体水平的母马，处在R.equi感染期的可能性极大。新疆地区极有可能存在致病性R.equi，然而目前缺乏新疆地区R.equi流行病学调查研究数据。新疆地区育马场居多，对其环境中R.equi流行情况进行调查，极有可能打破我国目前致病性R.equi研究报道为零的现状，可更合理的解释我国致病性R.equi血清抗体阳性率偏高的原因。内蒙古地区致病性R.equi血清抗体阳性率为58.33%，平均抗体水平不高41 （0.378，n=12）。曾有报道内蒙古地区马场土壤内存在非致病性R.equi，但未发现致病性R.equi（丁壮等，2008）。其是否存在致病性感染还有待进一步研究。香港地区致病性R.equi血清抗体检测均为阴性，这与其为R.equi无疫区的报道相一致。其原因可能与该地区马匹结构以赛马为主、无育马场以及易感马驹有关。与香港类似，广东地区致病性R.equi血清抗体阳性率较低。其也可能与广东地区马匹构成有关。广东地区以马术、娱乐用马为主，较少有马场自繁马匹，马匹多为成年雄性。综上所述，我国致病性R.equi感染存在地方流行性，以新疆地区最高，其与地方马匹构成有关。该发现与其他国家报道一致。例如：在日本，与其总体11%的阳性率相比，部分育马场该病血清抗体阳性率高达78.9%（Sanadaetal.,1992）。4.2.3我国马匹致病性R.equi血清抗体水平的季节特点本研究发现，广东地区马匹致病性R.equi血清抗体水平存在秋冬高、春夏低的特点，该特点可能与地区的温湿度气候有关。曾有报道表明，在澳大利亚温暖以及干燥的季节，R.equi感染呈流行性，且感染发病率较高（Muscatelloetal.,2006）。与该发现相似，广东地区春末夏初温暖、潮湿、降雨量大的季节里，该病的马匹血清抗体水平较低。而马匹在秋冬较为温和、干燥、降水少的季节里抗体水平较高。这表明马匹致病性R.equi的感染存在季节性特点，马匹秋冬季节较春末、夏初季节易感。4.2.4我国马匹致病性R.equi血清抗体水平的性别特点本研究调查发现雌性马匹致病性R.equi血清抗体阳性率（80.00%）近于雄性马匹的2倍（44.44%），且血清平均抗体水平显著高于雄性。普遍认为母马为环境中R.equi的重要传播源。美国肯塔基州一农场调查发现所有母马粪便样本中均可分离到致病性R.equi（Grimmetal.,2007）。日本北海道也曾报道，其ELISA检测R.equi血清抗体，同样发现母马抗体阳性率显著性高于雄性（Sanadaetal.,1992）。以上信息可推测马匹致病性R.equi感染存在性别差异，母马对R.equi更易感。母马很可能是马驹感染致病性R.equi的主要传染源。另外，我国新疆地区母马致病性R.equi血清平均抗体水平非常高，该地区很可能是马驹红球菌病高发区。此地是我国最主要的伊犁马繁育区域，该地区育马场R.equi的防治应该引起高度重视。42 4.2.5我国马匹致病性R.equi血清抗体水平的品种特点研究发现我国马匹致病性R.equi血清抗体水平存在品种差异性。伊犁马血清抗体阳性水平最高，其次为混血马，伊犁马与混血马可能对致病性R.equi更易感。研究采集的伊犁马血清样本几乎全部为母马血清样本，绝大部分来源于新疆地区育马场，受一定地域与性别差异的影响。4.2.6我国马匹致病性R.equi血清抗体水平的年龄特点研究发现我国马匹的年龄与样本致病性R.equi血清抗体水平无关。小于6月龄的马驹为致病性R.equi的易感群体，然而有研究报道，ELISA检测R.equi血清抗体阳性率，14岁成年马匹最高，但与其他年龄间差异不显著（Sanadaetal.,1992）。这些信息证实，单独的ELISA检测并不能区分R.equi感染发病马匹与临床健康马匹（Giguereetal.,2003），ELISA检测R.equi血清抗体阳性，仅能说明该马匹可能接触感染过R.equi。R.equi为条件性致病菌，多数成年马匹感染R.equi但不发病。5结论本研究使用重组蛋白rVapA作为包被抗原，构建了致病性R.equi血清抗体间接ELISA检测方法。该方法具有特异性高、重复性好、操作简便等优点，且其生产不存在生物安全风险、易于工业化生产和推广。该方法为马红球菌病的全国血清学调查及防控提供技术支撑。本研究首次对我国内陆部分地区以及香港地区马场进行马红球菌病血清流行病学调查。广东、内蒙和新疆地区马场马匹致病性R.equi血清抗体检测呈阳性，香港地区呈阴性。致病性R.equi血清抗体水平呈显著的地区性差异，且存在品种、性别和季节特点，而与年龄无关。43 第三部分马红球菌菌落印记检测方法的建立及其病原流行病学调查1材料1.1菌株及主要试剂材料ATCC6939非致病性R.equi菌株购买于ATCC细胞库；TSA与TSB购自广东环凯微生物科技有限公司；新生霉素、亚碲酸钾以及硫酸葡聚糖购买于生工生物工程（上海）股份有限公司；放线菌酮购买于BIOSHARP公司；萘啶酸购自Sigma-Aldrich公司；脱纤维绵羊血购自广州蕊特生物科技有限公司；过氧化氢酶、精氨酸双水解酶以及葡萄糖等生化发酵管购买于杭州天和微生物试剂有限公司；LysisBufferforDirectPCR购买于TAKARA公司；MontanideGel01ST佐剂购自SEPPIC公司；3,3,5,5-四甲基联本胺（TMB）粉剂购自sigma公司；HRP标记羊抗兔抗体购买于Bioworld公司；其余各种试剂、仪器均参见“第一部分”。1.2实验动物3月龄，1.5-2kg，SPF级雄性新西兰白兔由南方医科大学实验动物中心提供。1.3引物胆固醇氧化酶（ChoE）与VapA基因检测引物，以及16SrRNA测序引物由上海英维捷基生物技术有限公司合成，序列如下：FRChoEGTCAACAACATCGACCAGGCGCGAGCCGTCCACGACGTACAGVapAGACTCTTCACAAGACGGTTAGGCGTTGTGCCAGCTA16SrRNAAGAGTTGATCCTGGCTCAGAAGGAGGTGATCCAACCGCA1.4主要溶液的配制新生霉素（40mg/mL）：1g新生霉素加入25mLddH2O中溶解，分装小管后，-20℃储存，避免反复冻融。放线菌酮（50mg/mL）：1g放线菌酮加入20mL无水乙醇中溶解，分装小管后密封，-20℃储存。萘啶酸（20mg/mL）：0.2g萘啶酸加入10mL氯仿中溶解，封装小管后密封，-20℃储存。44 TSA培养基：称量TSA培养基40g，溶于1L双蒸水，搅拌混匀后，高压灭菌30min，待冷却至50℃左右，倒入9mm直径的无菌平皿内，待冷却凝固后，置于4℃贮存。TSB培养基：称量TSB培养基30g，溶于1L双蒸水，高压灭菌30min，待冷却后，置于4℃贮存。NANAT培养基：高压灭菌的TSA培养基1L冷却至50℃左右，加入新生霉素625μL（25μg/mL），放线菌酮800μL（40μg/mL），萘啶酸1mL（20μg/mL），亚碲酸钾35mg（3.5%(w/v)）。将培养基混匀后，倒入9mm直径的无菌平皿内，待冷却凝固后，置于4℃贮存。血平板：高压灭菌的TSA培养基1L冷却至50℃左右，加入脱纤维绵羊血50mL（5%(v/v)），将培养基混匀后，到入9mm直径的无菌平皿内，待冷却凝固后，置于4℃贮存。柠檬酸-EDTA缓冲液：（10mM柠檬酸钠，10mMEDTA，pH5.0）分别称取柠檬酸钠2.94g，EDTA2.92g，加热溶解于800mL去离子水中，待冷却至室温后调节pH至5.0，然后用去离子水定容至1L，4℃保存。底物缓冲液：（0.2MNa2HPO4，0.1M柠檬酸，pH5.0）分别称量Na2HPO42.84g，柠檬酸1.92g，加入80mL去离子水中，充分溶解后调节pH至5.0，然后用去离子水定容至100mL，4℃保存。TMB/H2O2底物显色液：称量TMB1mg，溶于1mL无水乙醇中，溶解混匀后加入底物缓冲液9mL，然后加入30%H2O275μL，现用现配，注意避光操作。其余各种溶液的配制均参照“第一部分”内容。2方法2.1R.equi的常规分离与细菌生化鉴定采用细菌选择性培养、血平板纯培养菌落形态鉴定、以及生化鉴定对土壤样本进行细菌分离鉴定。使用NANAT选择性培养基，可在一定程度上抑制其他细菌的生长。R.equi在此平板上菌落形态不规则，呈粘液样，灰黑色（Woolcocketal.,1979）。挑选此种形态细菌划线接种于血平板。R.equi在血平板上菌落形态不规则，半透明，粘液样，呈淡粉色或橙红色（Prescott,1991）。同时，采用BD公司phoenixl00鉴定系统，对具备该菌落形态特征的单个菌落进行生化鉴定。生化检测符合如下特点的，即为R.equi：过氧化氢酶、尿素酶、溶菌酶试验均45 为阳性，不水解明胶，枸橼酸盐、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶均为阴性，不分解半乳糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、果糖、木糖以及蔗糖。整个实验以ATCC6939与ATCC33701R.equi菌株作为阳性对照。2.2R.equi的PCR鉴定ChoE基因为R.equi染色体DNA序列，可用于R.equi快速PCR鉴定（Ladronetal.,2003）。VapA基因为致病性R.equi所特有，可用于区分致病性与非致病性R.equi。当菌株经ChoE和VapA基因PCR鉴定，仅出现ChoE阳性者可判定为非致病性R.equi，ChoE和VapA均为阳性，则为致病性R.equi。结合R.equi的常规分离方法，将NANAT平板以及血平板分离纯化的菌株，经菌液PCR扩增ChoE和VapA基因，反应程序及条件参照“第一部分2.3.5”。ChoE预计扩增片段长度约为960bp，VapA预计扩增片段长度约为550bp。该实验以ATCC6939与ATCC33701R.equi菌株作为阳性对照。2.316SrRNA测序鉴定对菌株进行16SrRNAPCR扩增、测序及NCBIBlast比对，确定菌株种系，此方法已广泛应用于环境与临床微生物检测当中，可作为细菌种属鉴定金标准（Janssen,2006；Jonesetal.,2005；刘文强等，2006）。使用R.equi的常规分离方法，将NANAT平板以及血平板分离纯化的菌株，划线接种于TSA平板，于35℃培养48h以获得新鲜的单菌落。使用LysisBufferforDirectPCR试剂提取细菌DNA（参见试剂说明书），具体操作如下：挑取新鲜单菌落于50uLLysisBuffer中，80℃处理15min；6000rpm离心5min，取上清为模板。进行16SrRNA序列PCR扩增，反应程序及条件参照“第一部分2.3.5”。将PCR产物直接送华大基因测序。序列经NCBIBlast比对，确定该菌株种系。2.4R.equi菌落印记检测方法的建立2.4.1多克隆抗体的制备2.4.1.1兔抗非致病性R.equi多抗的制备使用TSA平板复苏非致病性R.equi菌株（ATCC6939）。挑取新鲜的单菌落于TSB培养液中，35℃，180rpm摇床中震荡培养。于OD600nm测量吸光度值，并绘制细菌生长曲线。取对数生长期菌液用于制备非致病性R.equi菌体灭活疫苗。将对数生长期菌液6000rpm离心后取细菌沉淀，使用PBS清洗3次，然后用PBS重悬菌体，取部分菌液梯度稀释，涂布TSA平板，进行细菌计数。使用46 0.8%浓度的甲醛溶液，37℃，100rpm，灭活24h，脱毒后进行无菌检测，确认8无菌后调节细菌浓度至10CFU。使用MontanideGel01ST佐剂，以8%浓度比8例配置菌液乳化剂，充分乳化后，获得数量级约10CFU的细菌灭活疫苗。基础免疫，在兔子颈背部皮下分点注射，将1.0mL菌液乳化剂进行多点注射，平均每点0.2mL。两周后，部位及剂量同上，进行二次免疫，再过两周，进行第三次加强免疫，部位及剂量同上。三免后两周经心脏采血，分离血清，送于武汉金开瑞生物工程有限公司，使用ProteinG进行多抗纯化，以获得纯化的兔抗非致病性R.equi多抗。2.4.1.2兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗的制备将纯化的rVapA稀释为浓度约1.1mg/mL，使用MontanideGel01ST佐剂，以8%浓度比例配制蛋白乳化剂，充分乳化后，获得蛋白浓度约1mg/mL的蛋白疫苗。免疫方法步骤同上，每次免疫剂量为1mL，即rVapA约为1mg。三免后两周经心脏采血，分离血清，送于武汉金开瑞生物工程有限公司，使用ProteinG进行多抗纯化，以获得纯化的兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗。2.4.2阳性样本的处理及细菌培养将ATCC6939以及ATCC33701R.equi菌株使用TSA平板复苏后，挑取新鲜的单菌落于TSB培养液中，35℃，180rpm摇床中培养12-16h，将两种菌取部分菌液分别混于无R.equi的新鲜土壤样本中，分别称取1g预混好的土壤样本溶于8mL生理盐水中，静置10min后，取上层液体进行10倍梯度密度稀释，然后每一稀释度取20μL涂布于NANAT选择性平板，平行做2个重复，35℃培养48h，选取菌落数量在15-150个的平板，用于后续的印记实验并计量平板上菌落的个数。2.4.3菌落印记法反应条件的优化将NC膜印于上步中培养的平板上，待膜完全浸润后，将NC膜与平板分离，并于室温风干。使用封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉），37℃封闭，TBST清洗3次，每次10min。将2个重复样本同时进行一抗孵育，分别使用上文中制备好的兔抗非致病性R.equi多抗和兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗，使用封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉）稀释，4℃摇床孵育过夜（>8h），TBST清洗，方法同上。二抗孵育，使用HRP标记羊抗兔抗体，以封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉）稀释，37℃孵育1h，TBST清洗，方法同上。然后使用柠檬酸-EDTA缓冲47 液，37℃清洗5min，再使用柠檬酸-EDTA缓冲液（含1%硫酸葡聚糖），37℃清洗10min，最后使用柠檬酸-EDTA缓冲液，37℃清洗3次，每次5min。使用HRP底物显色液显色，37℃显色30min，去掉底物显色液，使用蒸馏水终止反应，阳性菌在印膜上显紫色。2.4.3.1NANAT平板中亚碲酸钾浓度选择亚碲酸钾的浓度，分别使用0%(w/v)、3.5%(w/v)、5%(w/v)配置NANAT平板，其余成分配方参照“1.4”进行。使用不同亚碲酸钾浓度的NANAT平板进行菌落印记实验，以NANAT平板细菌生长量少、NC膜完整度以及底物显色背景色低为评判标准，确定最佳的亚碲酸钾使用浓度。2.4.3.2印膜风干时间的优化使用上述最优亚碲酸钾浓度配置的NANAT平板，进行菌落印记实验。NC膜印膜后风干时间分别控制为1h、1.5h以及2h。以NC膜完整度以及底物显色背景色低为评判标准，确定最佳的印膜风干时间。2.4.3.3封闭时间的优化使用上述最优亚碲酸钾浓度配置的NANAT平板以及最佳印膜干燥时间。采用5%(w/v)脱脂奶粉封闭缓冲液，分别封闭1h、2h以及3h。以菌落显色明显、背景色低为评判标准，确定最佳封闭时间。2.4.3.4一抗稀释度优化选择使用上述最优条件，一抗：兔抗非致病性R.equi多抗和兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗，分别做1:1000、1:2000、1:5000、1:20000、1:50000稀释，进行菌落印记实验。以菌落显色明显、背景色低为评判标准，确定最佳一抗稀释度。2.4.3.5二抗稀释度优化选择使用上述最优条件，酶标二抗分别以1:1000、1:2000、1:5000、1:20000、1:50000稀释度，进行菌落印记实验。以菌落显色明显、背景色低为评判标准，确定最佳二抗稀释度。2.4.3.6底物显色液的选择使用上述最优条件，进行菌落印记实验，分别采用TMB/H2O2与DAB底物显色液进行显色。以菌落显色明显、背景色低为评判标准，确定最佳底物显色液。2.4.4特异性检测以NANAT选择培养及16SrRNA测序鉴定的12株土壤中分离的非R.equi48 菌株（见表6）作为阴性对照，对R.equi菌落印记方法进行特异性检测试验。将这12株细菌以及ATCC6939与ATCC33701R.equi菌株分别划线接种于TSA平板，35℃培养48h，并使用优化的菌落印记检测方法对其进行检测，判断该方法的特异性。表6NANAT选择性平板上分离鉴定的非R.equi菌株列表菌株编号菌株名称HT44GordonianamibiensisstrainHB26PseudomonaskoreensisstrainHB35PantoeasepticastrainST52LuteococcusjaponicusstrainSB1DietziatimorensisstrainSB12CorynebacteriumcaseistrainSB40EscherichiacolistrainBZ5-2-6BacillusbeijingensisstrainNM11-4-3RhodococcusrhodochrousSB23AlcanivoraxdieseloleistrainNM4-1-2PhyllobacteriummyrsinacearumstrainBZ5-2-1Bhargavaeacecembensisstrain2.4.5灵敏度检测分别使用优化的菌落印记方法和上述PCR检测方法，对已通过“2.3”中16SrRNA测序鉴定的136株菌，以及ATCC6939非致病性R.equi与ATCC33701致病性R.equi，进行R.equi检测。分别计算其检测敏感性、特异性、假阳性以及假阴性，比较两种方法的检测灵敏度。136株16SrRNA测序鉴定细菌中，110株为非致病性R.equi，26株为非R.equi。敏感性：指R.equi中检测结果为阳性的比例，特异性：指非R.equi中检测结果为阴性的比例，假阳性：指非R.equi中检测结果为阳性的比例，假阴性：指R.equi中检测结果为阴性的比例。2.5R.equi流行病学调查2.5.1土壤样本的采集依据每一马场布局的不同，分区域采集表层土壤样本。马场一般布局有敞篷49 方形训练场、露天方形训练场、调教圈、马厩、跑道、以及其他（母马放牧圈、障碍训练场、员工活动区、放养方圈等）。各区域采集方式如图21，根据区域面积大小适当调整样本采集量，每一区域采集4-8个样本。图21马场不同区域土壤样本采集分布图本研究于2014年10月至2016年1月的秋、冬季节，分别对广东、内蒙以及天津地区马场的土壤样本进行了采集。共采集301份土壤样本。其中广东195份、内蒙古72份、天津34份，具体数据见表7。表7国内马场土壤样本采集数据列表广东内蒙古天津2014年冬季2015年秋季2015年冬季2015年秋季2016年冬季11月、12月9月、10月12月9月1月8252617234总计：301份马场土壤样本2.5.2土壤样本的分离鉴定对于广东地区2014年冬季以及2015年秋季采集的土壤样本，仅使用R.equiPCR鉴定法，分离鉴定R.equi菌株，对于广东地区2015年冬季土壤样本以及内蒙、天津土壤样本，则同时采用R.equiPCR鉴定法与新建的菌落印记法检测土壤中R.equi。分别计算两种方法对不同地区以及不同季节土壤样本的R.equi分离阳性率。50 分别计算R.equiPCR鉴定法与菌落印记法同时检测土壤样本时R.equi的分离阳性比率，比较两种方法间的差异。2.5.3马匹各活动区域R.equi分布情况分析分析菌落印记方法对马场各区域土壤R.equi分离鉴定结果进行分析。首先，计算各马场敞篷方形训练场、露天方形训练场、调教圈、马厩、跑道、以及其他（母马放牧圈、障碍训练场、员工活动区、放养方圈等）区域土壤R.equi分离阳性率。然后，使用SigmaPlot软件NormalOneWayANOVA方法，对马场各区域R.equi分离阳性率进行组间差异显著性分析。3结果3.1致病性与非致病性R.equi的培养特性及生化特征ATCC6939与ATCC33701R.equi菌株在NANAT选择性平板上的菌落形态为不规则、粘液样、灰黑色。血平板菌落形态不规则，半透明，粘液样，呈淡粉色或橙红色。细菌生化鉴定结果显示：两株菌均为过氧化氢酶、尿素酶试验阳性，不水解明胶，枸橼酸盐、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶，不分解半乳糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、果糖、木糖以及蔗糖。结果与预期一致。结合以上结果可知，该方法不能区别鉴定致病性与非致病性R.equi。3.2R.equi的PCR鉴定使用ChoE结合VapA的PCR检测方法，以ATCC6939与ATCC33701R.equi菌株以及17株样本分离非致病性R.equi菌株为对照进行R.equiPCR鉴定并区分致病性与非致病性R.equi。结果显示：ATCC6939以及所有样本分离非致病性R.equi菌株的ChoE基因PCR扩增，均出现大小约960bp的DNA片段，且VapA基因PCR扩增均为阴性（图22，图23），鉴定为非致病性R.equi。ATCC33701致病性R.equi菌株的检测结果显示：ChoE基因PCR扩增获得大小约960bp的DNA片段，且VapA基因PCR扩增获得大小约550bp的DNA片段（图22，图23），鉴定为致病性R.equi。以上两结果与预期相符，说明ChoE结合VapA基因的PCR检测可用于R.equi鉴定并区分致病性与非致病性R.equi。51 图22R.equi分离菌株ChoE基因的PCR鉴定结果M：D2000marker；1：ddH2O；2：ATCC33701；3：ATCC6939；4-20：R.equi分离株图23R.equi分离菌株VapA基因的PCR鉴定结果M：D2000marker；1：ddH2O；2：ATCC33701；3：ATCC6939；4-20：R.equi分离株3.3土壤选择性培养分离菌株的16SrRNA测序鉴定使用R.equi的常规分离方法，将NANAT平板以及血平板分离纯化的菌株，以细菌鉴定金标准：16SrRNAPCR扩增、测序及NCBIBlast比对，确定该菌株的种系。本研究于2014年10月至2016年1月间，共分离测序鉴定136株菌，其中有110株鉴定为R.equi，经VapAPCR鉴定均为非致病性R.equi，其余26株为非R.equi菌株。具体菌株以及NCBIBlast同源性比例见附录II。3.4R.equi菌落印记检测方法的建立3.4.1多克隆抗体的制备灭活的ATCC6939非致病性R.equi菌株和纯化的rVapA免疫新西兰大白兔获得的高免血清，经ProteinG纯化，分别获得兔抗非致病性R.equi和兔抗致病52 性R.equiVapA蛋白的IgG。这两种纯化IgG的SDS-PAGE分析结果显示其分别在52ku和22ku左右出现两条蛋白条带，与预期重链和轻链大小一致。表明其纯度较高（如图24所示）。图24兔多抗纯化结果1：兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗（10倍稀释）；2：兔抗非致病性R.equi多抗（10倍稀释）；3：BSA（1mg/mL）；M：蛋白marker3.4.2菌落印记法反应条件的优化分别使用ATCC6939和ATCC33701的土壤预混样本，进行菌落印记方法条件的优化。经对NANAT平板亚碲酸钾浓度、印膜风干时间、封闭时间、一抗与二抗稀释度以及底物显色液的选择，确定菌落印记法的最佳反应条件如下：NC膜转印NANAT细菌平板，亚碲酸钾浓度为3.5%(w/v)。印膜于室温风干1.5h。使用封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉），37℃封闭2h。TBST清洗3次，每次10min。一抗：兔抗非致病性R.equi多抗和兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗，使用封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉）做1:5000稀释，4℃摇床孵育过夜。TBST清洗，方法同上。二抗孵育，使用HRP标记羊抗兔抗体，以封闭缓冲液（5%(w/v)脱脂奶粉）按1:5000稀释，37℃孵育1h。TBST清洗，方法同上。然后使用柠檬酸-EDTA缓冲液，37℃清洗5min。再使用柠檬酸-EDTA缓冲液（含1%硫酸葡聚糖），37℃清洗10min。最后使用柠檬酸-EDTA缓冲液，37℃清洗3次，每次5min。使用TMB/H2O2底物显色液显色，37℃显色30min，去掉底物显色液，使用蒸馏水终止反应，阳性菌在印膜上显紫色。53 3.4.2.1NANAT平板中亚碲酸钾浓度选择亚碲酸钾浓度为3.5%(w/v)时，NANAT平板抑菌效果好，NC膜不易破损，完整度高，底物显色背景低（图略）。因此确定NANAT平板的最佳亚碲酸钾浓度为3.5%(w/v)。3.4.2.2印膜风干时间的优化NC膜印膜后风干时间为1.5h时，NC膜不易破损，完整度高，且底物显色背景低（图略）。因此确定最佳印膜风干时间为1.5h。3.4.2.3封闭时间的优化印膜采用5%(w/v)脱脂奶粉封闭缓冲液，封闭2h时，菌落显色最为明显，且背景色低（图略）。因此确定最佳封闭时间为2h。3.4.2.4一抗稀释度优化选择一抗：兔抗非致病性R.equi多抗和兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗，做1:5000稀释时，菌落显色最为明显，且背景色低（图略）。确定最佳的一抗稀释度为1:5000。3.4.2.5二抗稀释度优化选择酶标二抗以1:5000稀释度稀释时，菌落显色最为明显，且背景色低（图略）。确定最佳的二抗稀释度为1:5000。3.4.2.6底物显色液的选择使用TMB/H2O2底物显色液显色时，菌落显色明显，且背景色低（图略）。确定最佳的底物显色液为TMB/H2O2。3.4.3菌落印记法检测鉴定标准的确定在最佳反应条件下，分别使用兔抗非致病性R.equi和致病性R.equiVapA蛋白多抗对ATCC6939及ATCC33701预混土壤样本进行菌落印记检测。结果显示：在对ATCC6939预混土壤样本进行检测时，仅兔抗非致病性R.equi多抗，印记显紫色；而在对ATCC33701的预混土壤样本进行印记检测时，两种多抗均对菌落显色（图25）。这一结果说明，本实验建立的R.equi菌落印记检测方法，可有效的鉴定出土壤样本中的R.equi并区分致病性与非致病性R.equi。54 兔抗非致病性R.equi多抗兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗ATCC6939ATCC33701ATCC6939ATCC33701图25菌落印记检测方法建立阳性对照检测结果该方法的鉴定标准为：兔抗非致病性R.equi多抗检测未出现紫色印记，则该土壤样本鉴定为R.equi阴性，无需对其致病性R.equiVapA蛋白多抗检测结果进行判定；兔抗非致病性R.equi多抗检测出现紫色印记，则该土壤样本鉴定为R.equi阳性。在判定土壤样本R.equi阳性的前提下，当兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗检测未出现紫色印记，则鉴定为致病性R.equi阴性；当兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗检测出现紫色印记，则鉴定为致病性R.equi阳性。3.4.4特异性检测以ATCC6939与ATCC33701R.equi菌株作为阳性对照，采用菌落印记方法对NANAT平板上生长的12株土壤非R.equi菌株（见表6）进行R.equi检测，以检验该方法的特异性。结果显示，ATCC33701的免疫印迹，兔抗非致病性R.equi与致病性R.equiVapA蛋白多抗检测均为阳性（图26），判定为致病性R.equi；ATCC6939的免疫印迹，兔抗非致病性R.equi多抗检测阳性，且兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗检测阴性（图26），判定为非致病性R.equi；在对照检测成立的情况下，12株非R.equi菌株的免疫印迹，抗非致病性R.equi多抗检测均阴性（图26）。判定为非R.equi。在此基础上，这些样本中HB35菌株（Pantoeasepticastrain）出现了兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗检测阳性（图26），依据免疫印迹鉴定标准，不影响结果判定。此结果表明，兔抗非致病性R.equi多抗在NANAT平板上众多杂菌存在的情况下，可特异性识别R.equi；而兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗，虽对个别菌株出现假阳性反应，但不影响本实验建立的菌落印记检测方法对R.equi的检测判定。总之，该菌落印记方法具有特异性鉴别55 R.equi并区分其为致病性或非致病性R.equi的能力。兔抗非致病性R.equi多抗兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗ATCC6939ATCC33701HB35ATCC6939ATCC33701HB35图26菌落印记特异性检测结果3.5R.equi的PCR鉴定法与菌落印记法的灵敏度比较分别使用R.equiPCR方法与本实验建立的菌落印记方法，对16SrRNA测序鉴定的110株非致病性R.equi菌株与26株非R.equi菌株以及ATCC6939非致病性R.equi与ATCC33701致病性R.equi。进行R.equi的检测，并比较两者的检测灵敏度。PCR检测结果显示，所有菌株（112株R.equi与26株非R.equi）ChoE基因PCR扩增有130株出现目的大小约960bp的DNA条带，鉴定为R.equi阳性，其敏感性为95.54%、特异性为37.50%、假阳性为17.69%、假阴性为4.46%（如图27）。这表明R.equiChoE基因PCR扩增特异性较差，假阳性率高，检测结果不可靠。VapA基因PCR扩增除ATCC33701致病性R.equi出现大小约550bp的DNA条带，其余菌株检测均为阴性。说明R.equiVapA基因PCR扩增特异性强，可有效的区分致病性与非致病性R.equi。图27R.equiPCR鉴定结果菌落印记检测中，兔抗非致病性R.equi多抗，对所有R.equi菌株均显紫色，56 而非R.equi菌株均不显色，其检测敏感性与特异性均为100%、假阳性与假阴性均为0（如图28）。说明兔抗非致病性R.equi多抗可特异性识别R.equi，灵敏度高、特异性好、检测结果可信度强。使用兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗检测时，所有仅ATCC33701显紫色，其余所有菌株均未显色，说明在经“3.3”血平板筛选后菌株，其兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗可特异性识别致病性R.equi。图28R.equi菌落印记检测结果综合以上结果可知：菌落印记法检测R.equi灵敏度明显高于PCR鉴定法，且具有特异性高、检测结果可靠的特点，且可区分致病性和非致病性R.equi，更适用于R.equi的检测。3.6R.equi病原流行病学调查3.6.1R.equiPCR鉴定法使用R.equiPCR鉴定法对广东（195份）、内蒙古（72份）、天津（34份）等地区的总共301份土壤样本进行R.equi的流行病学调查。发现所有马场均可分离到R.equi，其总体样本检测阳性率为27.91%（表7），未发现致病性R.equi。57 表7土壤样本R.equiPCR鉴定结果广东内蒙古天津总计2014年2015年2015年2015年秋2016年冬季节冬季秋季冬季季季27.91R.equi检测阳26.83%19.23%40.98%%16.67%44.12%性比例合计：29.23%致病性R.equi0000检测阳性比例3.6.2R.equi菌落印记检测方法使用构建好的菌落印记检测方法，检测广东地区2015年冬季（61份）、内蒙古（72份）、天津（34份）总共167份土壤样本。结果发现，所有的样本采集马场均可分离鉴定出R.equi。使用兔抗非致病性R.equi多抗，其样本R.equi检测阳性率为43.21%（表8）。使用兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗时，发现有9份土壤样本出现阳性反应。兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗在大量杂菌存在的情况下，可能出现假阳性反应。将兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗阳性反应菌落进行常规细菌分离，经VapA基因PCR扩增验证为阴性，同时进行兔抗非致病性R.equi多抗检测也为阴性，判定为非R.equi。整个细菌分离鉴定过程未发现致病性R.equi。表8土壤样本R.equi菌落印记检测结果广东内蒙古天津总计季节2015年冬季2015年秋季2016年冬季43.21R.equi检测阳性比例56.67%32.35%41.76%%致病性R.equi检测阳性比例00003.6.3R.equiPCR鉴定法与菌落印记法的比较对于广东2015年冬季、内蒙古以及天津地区采集的167份土壤样本，同时采用了R.equiPCR鉴定法与菌落印记检测方法进行检测，其总体样本阳性率分别为31.14%与43.21%。各地区分别进行比较R.equiPCR鉴定法与菌落印记法58 检测样本阳性率，广东地区分别为40.98%与56.67%（图29）；天津地区分别为44.12%与41.18%（图29）；内蒙古地区分别为16.67%与32.35%（图29）。天津地区PCR鉴定法样本检测阳性率略高于菌落印记检测方法，与R.equiPCR鉴定法假阳性概率高有关。其余地区菌落印记法样本检测阳性率均比PCR鉴定法高，进一步说明菌落印记法检测灵敏度更好，更适用于环境中R.equi流行病学调查。图29R.equiPCR鉴定法与菌落印记法的样本检测灵敏度分析3.6.4马场各活动区域土壤R.equi分布情况分析使用SigmaPlot软件NormalOneWayANOVA方法，分析马场内不同区域间R.equi分离阳性率的差异情况。结果发现，露天方形训练场R.equi分离阳性率（83.1±7.96%）显著性高于其他（障碍训练场、员工活动区、放养方圈等，20.8±2.54%，p=0.0028，图30）区域。分析原因：露天方形训练场为马匹常用训练场地，而障碍训练场、员工活动区以及放养方圈等区域马匹活动少或已停置使用一段时间，这些区域R.equi分离阳性率甚至为0。这一现象表明，马匹活动对土壤中R.equi的分布有影响。马场内马匹活动频繁区域该菌的分布较多。因此，马场应加强这些区域的消毒防护措施。其余各区域间不存在显著性差异，然而敞篷方形训练场、调教圈、马厩以及跑道R.equi分离阳性率均略高于其他（障碍训练场、员工活动区、放养方圈等，图30）。建议马场内各区域适当的交替停59 置使用，以减少土壤中R.equi的存在。图30马场内不同区域R.equi分布情况（菌落印记法）4讨论R.equi在全球范围内均有分布（Grimmetal.,2007；Miretal.,2015；Muscatelloetal.,2006；Takaietal.,1991），据了解，R.equi普遍存在于自然环境土壤中，且可在土壤中长期存在（Gartonetal.,2002）。有调查显示，50～95%的农场土壤中均存在该菌，而大多数环境中分离的R.equi菌株均不含有毒性质粒，均为非致病性R.equi（Giguereetal.,1999；Haitesetal.,1997；Takai,1997）。本文通过使用常规细菌分离、16SrRNA测序鉴定、PCR鉴定以及菌落印记检测方法，同时对广东、内蒙以及天津地区马场内土壤进行R.equi流行病学调查，发现所有马场内均有该菌存在，然而未发现致病性R.equi。4.1常规R.equi分离鉴定、16SrRNA测序鉴定以及PCR鉴定采用常规R.equi分离鉴定方法对大量环境样本进行R.equi病原流行病学调查，发现不仅耗时长，而且工作量巨大，实施起来极其困难，同时细菌生化鉴定费用较为昂贵，并不适合用于大量样本的R.equi病原流行病学调查。从本研究调查结果分析可知，常规细菌分离鉴定方法的检测效率极低，初期主要依靠菌落60 形态进行判断与筛选，且其样品检测灵敏度受主观因素的影响比较大，细菌生化鉴定不能区别鉴定致病性与非致病性R.equi，。到目前为止，该方法已逐渐被取代。16SrRNA测序鉴定，可快速鉴定出菌株种系，然而对于大量环境样本R.equi流行病学调查，其费用极为昂贵。该方法对于个别临床样本检测较为实用，而对于大量样本检测则不可取。本研究使用ChoE结合VapA基因的R.equi快速PCR鉴定的方法（Ladronetal.,2003），虽然操作简便快速，然而ChoE基因PCR扩增敏感性不高，特异性较差，易出现假阳性结果，并不适用于环境样本R.equi流行病学调查。4.2R.equi菌落印记检测方法本研究以兔抗非致病性R.equi多抗与兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗建立的R.equi菌落印记检测方法，可特异性检测环境中的R.equi且可有效的区分致病性与非致病性R.equi。R.equi菌落印记方法具有检测灵敏度高、特异性强以及耗时短的优点，可有效的分离鉴定土壤中的R.equi，适用于大量样本的R.equi检测。然而，使用兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗进行检测时，存在特异性缺陷，易出现假阳性的结果。其特异性缺陷可能与rVapA中融合蛋白MBP有关，兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗同时也存在抗MBP蛋白抗体，其非特异性反应多由此引起。对于这一问题，较好的应对方法是将rVapA中MBP切除，仅取VapA蛋白部分进行多克隆抗体的制备。pMAL-c5x原核表达系统表达的重组蛋白可通过特异性蛋白酶因子Xa将MBP去除，然而由于VapA蛋白相对较小，以至其切除MBP蛋白后较难纯化，且蛋白稳定性较差，这些问题有待后续研究予以解决。根据新建的R.equi菌落印记鉴定标准，兔抗非致病性R.equi多抗可特异性识别R.equi，在其鉴定为阳性的前提下，使用兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗可有效的区分致病性与非致病性R.equi。4.3R.equi流行病学调查本研究对我国广东、内蒙古以及天津地区马场土壤样本，进行R.equi流行病学调查，发现R.equi总体分离阳性率高达43.21%。所有样本采集马场均可分离到R.equi，说明R.equi在我国马场环境中普遍存在，然而均未分离到致病性R.equi。本研究通过对马场内不同区域R.equi分离阳性率进行比较，发现马匹常活动区域R.equi分离阳性率普遍高于马匹活动较少区域，部分停置使用区域61 R.equi分离阳性率甚至为0。这一现象表明，马匹活动对土壤中R.equi的分布有影响。马场内马匹活动频繁区域该菌的分布较多。因此，马场应加强这些区域的消毒防护措施。另外，马场内各区域适当的交替停置使用可有效的减少土壤中的R.equi。4.4R.equi病原学与血清学调查结果比对本研究对广东地区马场，同时进行了大量样本的R.equi病原学与血清学流行病学调查。病原学调查发现所有马场土壤中均有R.equi的存在，总体分离阳性率56.67%，然而并未发现致病性R.equi。血清学调查有近50%的马匹致病性R.equi血清抗体反应阳性。据分析，所有广东地区采集的马血清样本，大部分来源于成年马匹或者老年马，几乎全部为雄性。广东地区无育马场，自繁马匹极少，多为外部引入，且雄性多于雌性，成年马与老年马居多。据ELISA检测分析，其致病性R.equi血清抗体水平平均为0.364，阳性血清抗体水平普遍在0.4-0.6之间，抗体水平较低。据以上信息可推测，广东地区致病性R.equi血清抗体阳性率高的原因极有可能与其马群结构以及马匹流动性大有关。早年已有关于内蒙古地区R.equi流行病学调查研究的报道，证实了R.equi的存在，总体分离阳性率为37.0%，未发现致病性R.equi（丁壮等，2008）。本研究也对内蒙古地区马场内土壤样本进行了R.equi病原学调查，同样证实了R.equi的存在，总体分离阳性率为32.35%，未发现致病性R.equi。血清学调查马匹致病性R.equi血清抗体阳性率为58.33%（n=12），其血清抗体平均水平为0.378，抗体水平较低。但由于样本数量过小，不具有代表性。对于新疆地区血清样本，全部来源于育马场母马。其致病性R.equi血清抗体阳性率高达83.33%，且其抗体水平普遍偏高。部分样本甚至达或超出R.equi参比阳性血清抗体水平，此部分马匹处在R.equi感染期的可能性极大。据了解母马为环境中R.equi的重要传播源（Grimmetal.,2007），新疆地区极有可能存在致病性R.equi。然而目前缺乏新疆地区马场R.equi病原流行病学调查信息，后续研究可对新疆地区育马场进行土壤样本采集并检测是否存在致病性R.equi，这很有可能打破我国致病性R.equi调查研究为零的近况，并为我过育马场建设提供有力的数据支撑与帮助。62 5结论本研究使用兔抗非致病性R.equi多抗以及兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗，构建了可用于R.equi检测并区分致病性与非致病性R.equi的菌落印记检测方法。与R.equi常规分离鉴定以及PCR鉴定方法相比，该检测方法具有灵敏度高、特异性好、检测快速的优点。我国广东、内蒙古以及天津地区马场土壤中均存在R.equi，阳性率为43.21%，未发现致病性R.equi。R.equi在马场土壤中的分布与马匹活动有关。因此，马场应加强马匹活动区域的消毒防护措施以降低土壤R.equi的存在。63 全文总结1.本实验使用pMAL-c5x表达体系，通过表达条件的优化，获得了重组蛋白rVapA的大量可溶性表达。其具有良好的抗原性，可作为致病性R.equi感染的检测抗原，且其具有纯化操作简便、易于工业化生产等优点。2.本研究使用重组蛋白rVapA作为包被抗原，构建了致病性R.equi血清抗体间接ELISA检测方法。该方法具有特异性高、重复性好、操作简便等优点，且其生产不存在生物安全风险、易于工业化生产和推广。该方法为马红球菌病的全国血清学调查及防控提供技术支撑。本研究首次对我国内陆部分地区以及香港地区马场进行马红球菌病血清流行病学调查。广东、内蒙和新疆地区马场马匹致病性R.equi血清抗体检测呈阳性，香港地区呈阴性。致病性R.equi血清抗体水平呈显著的地区性差异，且存在品种、性别和季节特点，而与年龄无关。3.本研究使用兔抗非致病性R.equi多抗以及兔抗致病性R.equiVapA蛋白多抗，构建了可用于R.equi检测并区分致病性与非致病性R.equi的菌落印记检测方法。与R.equi常规细菌分离鉴定以及PCR鉴定方法相比，该检测方法具有灵敏度高、特异性好、检测快速的优点。我国广东、内蒙古以及天津地区马场土壤中均存在R.equi，阳性率为43.21%，未发现致病性R.equi。R.equi在马场土壤中的分布与马匹活动有关。因此，马场应加强马匹活动区域的消毒防护措施以降低土壤R.equi的存在。64 致谢本论文是在导师李守军教授的悉心指导和殷切关怀下完成的。恩师的教诲与严格要求使我不断进步并将令我终身受益，在此谨向李老师致以最衷心的感谢！在此我需要特别感谢孙凌霜老师在我课题设计、实验操作以及论文写作上所给予的具体指导和帮助。孙老师在我研究生三年中，无论是学习还是生活上都给予了我非常多的指导与帮助，在此谨向孙老师致以最诚挚的谢意！感谢我的父母家人多年来对我物质上的支持，学习上的理解以及精神上的鼓励，在此向他们表示最衷心的敬意！在这三年里，张桂红老师、远立国老师、贾坤老师、熊惠军老师、黄群山老师、唐兆新老师、杨世华老师、刘宇老师、宁章勇老师、王衡老师、吴玄光老师、郭世宁老师、詹耀明老师、潘家强老师、石达友老师、郭剑英老师、陈义洲老师、苏荣胜老师以及临床系的其他各位老师都给予了我耐心的指导和热情的帮助，在此也表示衷心的感谢！感谢本教研室所有师兄师姐师弟师妹们以及同级同学在生活和学习上给予我的鼓励和关心！谨此，向所有关心、支持和帮助过我的老师、同学、朋友及亲人致以最诚挚的感谢！祝他们身体健康，工作顺利，万事如意！本实验在广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室及广东省宠物工程技术研究中心完成，本研究获得了国家自然科学基金（31402259）、广东省兽医临床重大疫病综合防控重点实验室（2013A061401013）、广东省自然科学基金（S2013040015745）、国家质检总局科研项目（2012IK006）、广东出入境检验检疫局科研项目（2011GDK53）的资金支持，在此表示感谢！65 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附录II16SrRNA测序鉴定菌株编号菌株同源率GT93RhodococcusequistrainDSM2030799%GT105RhodococcusequistrainWGC198%HB27Pseudomonaskoreensisstrain99%HB37Pseudomonaskoreensisstrain98%HT14RhodococcusequistrainWGC199%HT19RhodococcusequistrainWGC198%HT29Rhodococcusequistrain99%HT35RhodococcusequistrainWGC199%HB46Rhodococcusrhodochrousstrain99%HT133Rhodococcusrhodochrousstrain99%GT80Rhodococcusequistrain98%GT84Gordonianamibiensisstrain98%GT103Rhodococcusequistrain99%GT104Rhodococcusequistrain97%GT109RhodococcusequistrainWGC198%GT113Rhodococcusequistrain99%HB26Pseudomonaskoreensisstrain98%HB30Pseudomonaskoreensisstrain97%HB38Pseudomonaskoreensisstrain97%HT9Rhodococcusrhodochrousstrain99%HT10RhodococcusequistrainWGC198%HT21RhodococcusequistrainWGC199%HT31RhodococcusequistrainWGC198%HT44Gordonianamibiensisstrain99%HT46Rhodococcusrhodochrousstrain98%HT132Rhodococcusequistrainpony198%SB23Alcanivoraxdieseloleistrain99%SB40Escherichiacolistrain95%ST45Rhodococcusrhodochrousstrain99%ST62Rhodococcusequistrainpony199%ST67RhodococcusequistrainWGC198%73 编号菌株同源率ST68Rhodococcusequistrainpony196%ST74RhodococcusequistrainWGC199%GT82RhodococcusequistrainWGC198%GT93RhodococcusequistrainDSM2030799%NM4-1-1Pseudomonaskoreensisstrain98%NM4-1-2Phyllobacteriummyrsinacearumstrain98%NM4-3-1Rhodococcusrhodochrousstrain99%NM4-4-2RhodococcusequistrainWGC198%NM9-4-1RhodococcusequistrainWGC199%NM10-3-1Rhodococcusequistrainpony198%NM11-3-3Rhodococcusequistrainpony198%NM11-4-3Rhodococcusrhodochrousstrain98%NM13-2RhodococcusequistrainWGC198%NM13-3-1Rhodococcusequistrainpony198%NM13-3-2RhodococcusequistrainWGC199%NM13-4RhodococcusequistrainWGC199%BZ1-3-1RhodococcusequistrainSW999%BZ5-2-1Bhargavaeacecembensisstrain99%BZ5-2-6Bacillusbeijingensisstrain98%BZ6-1-1RhodococcusequistrainSW999%BZ6-1-2RhodococcusequistrainSW998%BZ6-1-3RhodococcusequistrainSW998%BZ6-1-4RhodococcusequistrainSW998%BZ6-1-5RhodococcusequistrainWGC199%BZ10-1-1RhodococcusequistrainWGC199%BZ10-1-2RhodococcusequistrainSW998%BZ10-1-3RhodococcusequistrainI-A-R-3099%BZ4-1-4RhodococcusequistrainSW999%NM10-1-1RhodococcusequistrainWGC199%A3-2RhodococcusequistrainWGC199%H5-2RhodococcusequistrainDSM2030799%H7-1RhodococcusequistrainBS2699%74 编号菌株同源率H8-1RhodococcusequistrainDSM2030799%H11-3RhodococcusequistrainDSM2030799%BZ2-6-3RhodococcusequistrainWGC199%TJ22-2RhodococcusequistrainSW998%HC2-4-1RhodococcusequistrainWGC199%SH2-1-1RhodococcusequistrainWGC199%SH3-2-2RhodococcusequistrainSW999%BZ4-4-1RhodococcusequistrainWGC199%SH1-1-3RhodococcusequistrainWGC198%TJ12Bhargavaeabeijingensisstrain99%SH2-4-1RhodococcusequistrainWGC199%HC2-3-1RhodococcusequistrainKUDC181599%HC2-4-2RhodococcusequistrainWGC199%HC3-8-1RhodococcusequistrainWGC198%BZ3-6-1RhodococcusequistrainWGC197%TJ8-1RhodococcusequistrainWGC199%TJ22-3RhodococcusequistrainWGC199%TJ6-2RhodococcusequistrainWGC199%HC3-4-2RhodococcusequistrainWGC198%HC2-1-1RhodococcusequistrainWGC199%HC2-2-1RhodococcusequistrainSW998%KYHC2-4-6RhodococcusequistrainWGC198%TJ33-3RhodococcusequistrainWGC198%TJ32-3RhodococcusequistrainWGC199%HC3-3-1RhodococcusequistrainWGC199%SH1-2-1RhodococcusequistrainWGC199%HC3-4-1RhodococcusequistrainSW998%BZ2-7-2RhodococcusequistrainWGC199%BZ4-3-1RhodococcusequistrainWGC198%KYHC2-4-5RhodococcusequistrainSW999%SH2-3-1RhodococcusequistrainWGC199%KYBZ4-4-1RhodococcusequistrainWGC199%75 编号菌株同源率HC2-2-2RhodococcusequistrainZJY-12497%SH3-2-1RhodococcusequistrainWGC198%KYHC2-4-2RhodococcusequistrainWGC198%SH2-3-3RhodococcusequistrainWGC199%SH2-2-1RhodococcusequistrainZJY-12497%TJ23-2RhodococcusequistrainWGC199%SH1-4-1Pseudomonasputidastrain99%TJ19-2RhodococcusequistrainSW999%TJ2-2Pseudomonasmoraviensisstrain99%TJ25-1RhodococcusequistrainSW999%TJ11-2RhodococcusequistrainR16396%BZ4-2-2RhodococcusequistrainWGC199%BZ4-2-3RhodococcusequistrainWGC199%SH4-2-1RhodococcusequistrainWGC199%TJ4-1RhodococcussolistrainDSD51W98%SH2-4-3RhodococcusequistrainWGC199%SH1-6-1RhodococcusequistrainWGC199%HC2-4-1RhodococcusequistrainWGC199%SH1-1-2RhodococcusequistrainWGC199%KYHC2-4-4RhodococcusequistrainWGC199%KYHC2-4-3RhodococcusequistrainWGC199%SH2-5-1RhodococcusequistrainWGC199%TJ3-1RhodococcusequistrainWGC199%TJ2-1RhodococcusequistrainWGC199%HC2-4-3RhodococcusequistrainWGC199%BZ2-7-1RhodococcusequistrainWGC198%SH2-5-2RhodococcusequistrainWGC199%SH2-2-2RhodococcusequistrainSW998%TJ22-1RhodococcusequistrainWGC199%SH2-3-2RhodococcusequistrainWGC199%SH1-2-2Pseudomonaskoreensisstrain99%TJ4-3RhodococcusequistrainWGC199%76 编号菌株同源率HC2-3-3RhodococcusequistrainWGC199%TJ10-1RhodococcusequistrainWGC199%TJ10-3RhodococcusequistrainWGC199%TJ20-2RhodococcusequistrainWGC198%TJ19-3Pseudomonasmoraviensisstrain99%TJ25-3RhodococcusequistrainWGC198%TJ10-2RhodococcusequistrainWGC199%HC2-1-2RhodococcusequistrainWGC199%HC2-1-3RhodococcusequistrainWGC199%77