纳米几丁质对小麦土传病原真菌抑菌作用及机理的初步研究

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河南农业大学学术硕士学位论文题目纳米几丁质对小麦土传病原真菌抑菌作用及机理的初步研究学位申请人姓名梁瑞导师姓名王合中学科专业植物保护研究方向纳米农药及其应用中国郑州2018年5月 分类号密级河南农业大学学术硕士学位论文论文题目：纳米几丁质对小麦土传病原真菌抑菌作用及机理的初步研究英文题目PreliminaryStudyonInhibitoryEffectsofNanochitinonSoil-borneFungalDiseasesandAntifungalMechanisim学位申请人：梁瑞导师：王合中专业：植物保护研究方向：纳米农药及其应用论文提交学位授予日期：日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论纳米几丁质对小麦土传病原真菌抑菌作用学位ＩＩ全日制学术学位硕士文题目及机理的初步研宄类别—梁瑞蠤植物保护王合＊ＳｆＩＩ｜否如需保密，解密时间年月曰疋否保治独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研宄工作及取得研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中做了。与我明确的说明，并表示了谢意。，特此声明。Ｋ：研宄生签名ｆ：导师签名：曰期：＞４年上月％曰曰期义年（月巧曰％丨￣￣￣￣学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南农业一署，，名单位为河南农业大学后就在校间的科研工作发表的第期从事所有论文否大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，则，承担。相应的法律责任注：保密学位论文在解密后适用于授权书。本研：：究生签名导师签名学导签名院领＇：：＞月：年日月日日期年ｒ日日期ｙ月日期年抑＾４一＜ 致谢本课题是在河南农业大学植物保护学院纳米材料实验室完成的，本论文的写作是在导师王合中教授的悉心指导下细致修改。感谢我的导师在科学研究上给予我的教导以及对待学习和科研上的言传身教。王老师渊博的学识、精湛的专业技能、对待科研一丝不苟的态度、广阔的眼界与博大的胸襟、精益求精的治学态度以及开拓创新的进取精神，为我完成科研任务奠定了基础！在论文完成之际，感谢导师在科研工作中对我的引导与培养，在日常生活中对我的理解与关爱，谨向导师表示我衷心的感谢与崇高的敬意！光阴荏苒，岁月如梭。转眼间，三年的硕士学习即将结束，三年的学习与工作中，许多的老师和同学在学业、生活、思想上都给予了我莫大的帮助和关怀，在此由衷地向他们表示感谢！感谢河南农业大学病理学实验室以及河南省动物免疫学重点实验室提供的设备支持以及技术支持。感谢河南农业大学植物保护学院汪敏老师在我课题开展初期给予的热情指导，在此表示真诚的感谢！感谢河南农业大学植物保护学院农药系周琳老师，李文明老师，程绎南老师，何睿老师，刘向阳老师，赵特老师，那日松老师，高飞老师，张静静老师，毋青男老师在课程学习中，给予的指导和帮助。感谢河南农业大学植物保护学院院长李洪连，副院长郭线茹，病理系邢小平老师，张晓婷老师，丁胜利老师，陈琳琳老师等给予的热情帮助和大力支持。感谢课题组成员李雪云、李振亚、周扬、薛卫杰、常琛、韩保军、谷雨师兄师姐，师妹张雪雅，程莹莹对我的帮助。2015，2016，2017届实习生董炫孜，原万玲，常一明，夏秋凡，张天宜，侯帅涛，金嵩尧，周鑫，张瑞娜在实验上给予我很大的帮助，感谢他们对我的支持与鼓励。感谢植保学院的同届同学张良、王海娇、马艺超，孙新艳，滕小慧，宋丹阳，马乐乐，杜振林，张坤，杜娟，赵清爽，周沛文，师兄师姐熊凤霞，王娟，赵扬，周海峰，师弟师妹范宜康、王轶楠、陈嘉洁、张光帆、申国富、王梦珂、张蒙萌、刘艳杰等同学给我实验上以及生活上的帮助和支持。再次感谢我的导师王合中教授以及师母王春霞教授对我学业的支持帮助以及为我发表的学术论文提供的建议和帮助。感谢我的室友王海娇，滕小慧，李贝贝对我生活上的关心和照顾。感谢我多年的朋友孙新艳，李雅茹，赵艳伟，吴昱君，满少鹏，严家昊，梁艳，李洁，郝庆丽，杨雪艳，邢一帆在生活和精神上给予我无私的帮助，理解与支持。深深感谢我父母含辛茹苦的养育与教育之恩，感谢姐姐在学习上生活上给我的帮助与关爱。感谢参与我硕士论文论文评阅的专家以及答辩评审专家教授的指导与建议。本研究由生物纳米材料提高小麦抗逆性分子机制研究（39990023），生物纳米技术及生物纳米材料在农业上的应用（30600473）以及河南省教育厅重点项目（14B210037）基金支持。梁瑞2018年5月I 本论文涉及的缩写词中英文对照表简写英文中文NCSnanochitinsuspension纳米几丁质水悬浮液Ttebuconazole戊唑醇（60mg/L，FSC，德国拜耳）Ssilthiopham硅噻菌胺（125mg/L，SC，先正达）Ffludioxonil咯菌腈（25mg/L，FSC，先正达）PODperoxidase过氧化物酶CATcatalase过氧化氢酶SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶PPOpolyphenoloxidase多酚氧化酶PALphenylalanineammonia-lyase苯丙氨酸解氨酶β-1，3-GAβ-1，3-glucanaseβ-1，3葡聚糖酶HRhypersensitiveresponse过敏性坏死反应SARsystemicacquiredresistance系统获得抗病性SAsalicylicacid水杨酸JAjasmonicacid茉莉酸II 目录摘要..................................................................................................................................................11文献综述...................................................................................................................................21.1小麦真菌病害的发生与防治...............................................................................................21.1.1小麦茎基腐病和小麦全蚀病的概述...........................................................................21.1.2小麦真菌病害的防治方法...........................................................................................21.2纳米材料及其在农业上的应用...........................................................................................31.2.1纳米材料，纳米技术与纳米药物的概述...................................................................31.2.2纳米材料在农业上的应用...........................................................................................41.2.2.1纳米材料在促进种子萌发和生理效应影响的应用..............................................41.2.2.2纳米材料在农药检测应用......................................................................................41.2.2.3纳米材料在昆虫学上的的应用..............................................................................51.2.2.4纳米材料在抗真菌研究上的应用..........................................................................51.3几丁质及其衍生物..............................................................................................................61.3.1几丁质概述...................................................................................................................61.3.1.1几丁质的结构与性质..............................................................................................61.3.1.2几丁质的制备方法..................................................................................................81.3.2几丁质的衍生物-壳聚糖.............................................................................................91.3.2.1壳聚糖的结构与性质..............................................................................................91.3.2.2壳聚糖的制备方法..................................................................................................91.3.3几丁质及其衍生物的应用.........................................................................................101.4纳米几丁质概述................................................................................................................101.4.1纳米几丁质的制备.....................................................................................................101.4.2纳米几丁质的性质.....................................................................................................101.4.3纳米几丁质的研究进展，纳米几丁质在农业领域的应用前景.............................111.5诱导植物抗性研究进展....................................................................................................122引言.........................................................................................................................................143材料与方法.............................................................................................................................153.1纳米几丁质的制备与表征.................................................................................................153.1.1材料与仪器.................................................................................................................153.1.2纳米几丁质的制备.....................................................................................................153.1.3纳米几丁质的表征.....................................................................................................16III 3.1.3.1浓度检测................................................................................................................163.1.3.2Size和ZetaPotential的检测.................................................................................163.1.3.3TEM检测...............................................................................................................163.2纳米几丁质对病原真菌室内抑菌活性测定.....................................................................173.2.1供试菌株，培养基，实验仪器.................................................................................173.2.2纳米几丁质对几种病原真菌菌丝生长抑制率的测定.............................................183.2.3分生孢子抑制率...........................................................................................................183.2.4对小麦全蚀病病菌离体活性纳米几丁质与化学杀菌剂协同效应...........................193.3纳米几丁质对小麦生理指标的影响.................................................................................193.3.1供试材料，实验仪器.................................................................................................193.3.2试验设计.....................................................................................................................203.3.2.1病原菌扩繁............................................................................................................203.3.2.2各处理组的设计以及拌种处理............................................................................203.3.2.2试验条件与详细步骤............................................................................................203.3.3纳米几丁质对小麦株高和干重影响的测定.............................................................213.3.4纳米几丁质对小麦叶片叶绿素影响的测定.............................................................213.4温室试验纳米几丁质与化学杀菌剂协同作用.................................................................213.4.1供试材料，实验仪器，实验条件.............................................................................213.4.2纳米几丁质作种衣剂-温室试验对防治小麦茎基腐病协同效应............................223.4.3纳米几丁质喷施-温室试验对防治小麦茎基腐病协同效应....................................223.5纳米几丁质对小麦防御酶系活性影响.............................................................................233.5.1供试材料与实验仪器.................................................................................................233.5.2纳米几丁质对小麦防御酶系活性的测定方法.........................................................233.5.2.1小麦中POD活性的测定方法..............................................................................243.5.2.2小麦中CAT活性的测定方法..............................................................................243.5.2.3小麦中SOD活性的测定方法..............................................................................253.5.2.4小麦中PPO活性的测定方法...............................................................................263.5.2.5小麦中PAL活性的测定方法...............................................................................263.5.2.6小麦中β-1，3葡聚糖酶活性的测定方法...........................................................274结果与分析.............................................................................................................................284.1纳米几丁质的表征............................................................................................................284.1.1纳米几丁质的浓度.....................................................................................................284.1.2纳米几丁质的粒度和Zeta电位................................................................................28IV 4.1.3TEM检测...................................................................................................................294.2纳米几丁质对病原真菌室内抑菌活性测定.....................................................................304.2.1菌丝生长抑制率.........................................................................................................304.2.1.1NCS对F.pseudograminearum&F.graminearum菌丝生长的影响...............304.2.1.2NCS对P.capsici，C.capsici，R.solani3种菌丝生长的影响......................304.2.2纳米几丁质对F.pseudograminearum,F.graminearum分生孢子产量的抑制率.....314.2.3纳米几丁质与化学杀菌剂对小麦全蚀病病菌离体活性的协同效应.......................324.3纳米几丁质对小麦生理指标影响.....................................................................................334.3.1纳米几丁质对小麦株高和干重影响的测定.............................................................334.3.2纳米几丁质对小麦叶绿素影响的测定.....................................................................374.4纳米几丁质与化学杀菌剂协同作用.................................................................................384.4.1纳米几丁质作拌种剂-温室试验对防治小麦茎基腐病的协同效应........................384.4.2纳米几丁质喷施-温室试验对防治小麦茎基腐病的防病效果................................394.5纳米几丁质对小麦几种防御酶系活性的影响.................................................................404.5.1纳米几丁质对小麦叶片中POD活性的影响...........................................................404.5.2纳米几丁质对小麦叶片中CAT活性的影响...........................................................404.5.3纳米几丁质对小麦叶片中SOD活性的影响...........................................................414.5.4纳米几丁质对小麦叶片中PPO活性的影响............................................................414.5.5纳米几丁质对小麦叶片中PAL活性的影响............................................................424.5.6纳米几丁质对小麦叶片中β-1，3葡聚糖酶活性的影响.......................................425结论与讨论.............................................................................................................................435.1结论....................................................................................................................................435.2讨论....................................................................................................................................44参考文献：.....................................................................................................................................46ABSTRACT:...................................................................................................................................57V 摘要纳米技术与纳米材料在农业中的应用为病害防治和农业的可持续发展提供了新思路和新途径。纳米几丁质是由酸水解法将虾壳几丁质原粉制成的纳米晶体颗粒，具有较高的比表面积和结晶度以及聚阳离子的特性，具有较高生物学活性。然而，纳米几丁质作为一种综合性的生物纳米材料，在农业的应用技术研究还处在起步阶段。本研究拟以小麦为模式植物，探索了纳米几丁质的抗真菌活性及其抗小麦茎基腐病原菌的机理。主要研究结果如下：1.纳米几丁质的表征：通过酸解法可以得到有效粒径为150nm左右晶体粒子，Zeta电位+50.4mV，浓度为0.2%-0.6%（w/v）的结构稳定。2.纳米几丁质水悬浮液（Nanochitinwhiskersuspension，NCS）对病原真菌的离体活性:（1）0.03%，0.003%，0.001%，0.0003%w/v纳米几丁质水悬浮液对Fusariumpseudograminearum和F.graminearum的菌丝生长均有明显的抑制作用；（2）0.00005-0.006%w/vNCS对辣椒疫霉菌，辣椒炭疽菌和小麦立枯丝核菌的菌丝生长均有一定的抑制作用；（3）0.03%，0.003%，0.001%（w/v）浓度的纳米几丁质水悬浮液对F.pseudograminearum和F.graminearum的分生孢子产量有明显的抑制作用；（4）0.0003%w/v的NCS对Gaeumanmycesgraminisvar.tritici离体抑制率大约为22.10%，纳米几丁质与咯菌腈混合，对G.graminisvar.tritici抗菌活性具有协同效应，可以在维持药效的基础上使药剂的使用量减半。3.NCS以及与杀菌剂复配使用使小麦苗期变矮，但干重以及叶片中叶绿素含量增加：（1）纳米几丁质单独处理小麦种子，对小麦株高有抑制作用；（2）0.001%，0.009%，0.018%，（w/v）的NCS单独处理显著增加小麦干物质量；（3）0.001%，0.003%，0.009%（w/v）的NCS与戊唑醇（A2）混配处理的小麦，相比A2和对照综合来看，纳米几丁复配处理的小麦苗茎秆粗壮，叶片浓绿，更加健壮，显示出矮壮效应；（4）0.003%，0.009%（w/v）的NCS单独处理以及0.001%，0.003%，0.009%（w/v）的NCS与A2复配处理组的小麦，Chlorophylla和Chlorophyllb以及总叶绿素含量均明显高于空白对照组，差异显著。4.NCS与化学杀菌剂抗小麦茎基腐病的协同增效作用:不管是作为拌种剂还是喷雾处理，纳米几丁质与戊唑醇复配对防治小麦茎基腐病防治显示出较好的协同效应。5.NCS对小麦叶片中防御酶活性的影响：在一定时间段内0.003%的NCS可提高小麦叶片中SOD酶活性，PPO活性以及PAL酶活性。综上所述，纳米几丁质对一些病菌具有杀菌活性,纳米几丁质可以一定程度上减轻小麦茎基腐病的发病程度，减少了小麦种植中使用化学杀菌剂的使用量；纳米几丁质可以增加植株干重积累，提高叶片叶绿素含量，刺激叶片中防御酶含量增加，增强植物抗病性。这些初步分析的结果显示纳米几丁质的真菌活性并为研究NCS诱导抗性作用机理奠定基础。关键词：纳米几丁质；小麦茎基腐病；抑菌活性；协同作用；防御酶活性1 1文献综述1.1小麦真菌病害的发生与防治小麦是全球分布范围最广，种植面积最大，是仅次于玉米世界生产总量第二的重要粮食作物[1]。中国是东亚小麦主产区，近年来中国经济发展，人口增长带来的资源短缺，环境压力日益加剧，粮食生产问题愈发突出[2]。小麦生产过程中常常受到多种真菌病害的侵染，导致小麦产量减少以及品质降低。其中土传病害后果尤为严重，小麦茎基腐病和小麦全蚀病是发生在小麦作物上的两种重要的土传病害，而目前尚缺乏高抗品种以及高效绿色的药剂防治措施。1.1.1小麦茎基腐病和小麦全蚀病的概述小麦茎基腐病（WheatCrownRot），是一种由多种病原真菌混合侵染引起的世界性的小麦土传病害[3]。最早于1951年在澳大利亚昆士兰州被发现，目前已遍及欧洲、北美、南美、非洲、亚洲西南部、澳洲等小麦产区[4-6]。病原菌在小麦的整个生长发育期均会引起小麦茎基腐病，其表现症状主要为小麦茎基部变褐、变黑甚至腐烂枯死[7]。在小麦幼苗期感染病菌会引起烂种，种子萌发率降低，幼苗生长细弱，小麦茎基部腐烂变褐，最终死亡；成株其表现为小麦茎基部叶鞘，茎秆变褐变黑，严重的植株发育迟缓或接近死亡[7,8]。小麦茎基腐病已报道的势病原菌主要有：假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum）、黄色镰刀菌（F.culmorum）、禾谷镰刀菌（F.graminearum）以及根腐离蠕孢（Bipolarissorokiniana）。2012年李等首次报道在我国河南省发现由假禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病[9]。近年该病在我国黄淮麦区发生比较普遍，而且部分地区病害严重，对我国小麦生产造成严重威胁。小麦全蚀病（WheatTake-all）是一种典型的根部土传病害，广泛分布于世界各地，由子囊菌亚门的禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomycesgraminisvar.tritici）侵染所致。英国于1884年最早记载，中国于1931年前后在浙江省发现，以后在部分省（自治区）零星发生[10-12]。20世纪70年代初小麦全蚀病在山东烟台严重发生，而今已扩展到西北、华北、华东等地19个省（自治区），成为小麦生产的重要灾害和防治对象[13]。小麦全蚀病从苗期开始危害，造成苗期叶片发黄，麦苗生长缓慢；小麦成熟期引起植株成簇或大片枯死；严重影响产量，轻病地减产10%-20%，重病地减产50%以上[12,14]。1.1.2小麦真菌病害的防治方法目前条件下，我国小麦茎基腐病和全蚀病主要采取以农业措施和药剂防治相结合的防治策略，同时也在不断加强抗病品种筛选和培育、生物防治等研究工作进展。休耕，轮作，改变耕作方式，良好的田间卫生，适时播种，合理施肥，合理灌溉等农业措施有利于提高土壤墒情，对大多数田间病害的发生与发展均有良好控制作用。小麦茎基腐病和小麦全蚀病都是土传病害，使用药剂拌种或包衣可以在一定程度上减轻病害的发生。研究报道，甲基托布津、多菌灵、嘧菌酯、戊唑醇、氟硅唑、丙环唑、灭菌唑、苯醚甲环唑、咯菌腈、萎锈灵等杀菌剂对禾谷镰刀菌（F.graminearum）均有一定的抑制作用[15-18]。12.5%2 全蚀净SC、3%敌萎丹FSC和2%立克秀FSC是小麦全蚀病常用的化学药剂，有比较好的防效[13]。据报道，洋葱伯克氏菌（Burkholderiacepacia）对F.pseudograminearum引起的小麦茎基腐病具有一定的生物防治的效果[19]。另一些生物防治方法，比如利用拮抗菌处理种子，增强植株的抵抗力，也可以起到抗病效果。比如说利用可以定殖于小麦内部的小麦内生细菌来防治小麦全蚀病，室内测定中也表现出较好的防治效果[20]。据报道豫麦18对小麦茎基褐腐病有较好的抗性，且对产量的影响最低[21]。所有防治方法中种植抗病品种是最经济有效且安全的措施，但目前抗小麦茎基腐病的小麦品种数量较少且抗性普遍较低[22]。有学者对河南省内常见的108个小麦品种或品系进行了对小麦全蚀病抗性的鉴定，结果表明所有供试品系中感病和高感品种共占总的品种的99%所以对全蚀病这些小麦品种品系展现出较差的抗性[23]。1.2纳米材料及其在农业上的应用1.2.1纳米材料，纳米技术与纳米药物的概述纳米材料，其至少有一维尺度在纳米尺度范围内（1-100nm），与普通材料相比，具有较大的比表面积，优异的力学、电学、磁学、机械性能及化学反应性能[24]。纳米的研究范围涉及非常广泛，因而纳米技术种类繁多，纳米技术（Nanotechnology）是在1-100nm空间尺度内对原子分子进行控制、操纵的高新科学技术，包括纳米材料的制备技术、纳米颗粒的表面改性和修饰技术，以及把纳米材料应用于各领域和各产品上的关键技术[24-26]。纳米药物实际上是一种纳米级别的结构，它一般包括药物、载体材料、附加剂和修饰剂如抗体、配体等，其制备过程较为复杂。纳米载体是指溶解或分散有药物的各种纳米粒。纳米药物则是指直接将原料药加工成纳米粒。纳米药物载体分为大分子药物载体和颗粒型纳米药物载体，其中包括聚合高分子，树型高分子，单克隆抗体，脂质体，聚合物纳米颗粒，嵌段共聚物胶束等。文献报道已有十多种纳米粒制备技术，像乳液法，微乳液法，超声波法，渗析及溶剂挥发法，沉淀法，不同的制备技术和工艺适合于不同种类的纳米粒的制备[27-30]。依据制备方法和药物的性质不同，可将其制成纳米胶囊、纳米球、纳米片层、纳米胶束等。例如：壳聚糖纳米粒的制备方法分别有共价交联法，离子诱导法，大分子复合法，去溶剂化法，自组装法，改性后的壳聚糖仍保持良好的生物相容性，低毒性和稳定性，同时自组装发制备的纳米壳聚糖载体对生物活性大分子具有独特的保护和靶向控释作用，特别适合包载蛋白质、多肽、疫苗和基因等生物活性大分子药物[31]。为提高抗肿瘤药物成分槲皮素的溶解度和生物利用度，许多学者开展了槲皮素的纳米制剂研究，如纳米结晶混悬剂、聚合物纳米粒、聚合物胶束、类脂纳米囊等，尹华珍[32]等探究得到脂质固体脂质纳米粒和类脂纳米囊均可获得比较小的纳米粒径，纳米结构脂质载体和聚合物胶束可实现药物的缓慢释放和高稳定性。3 1.2.2纳米材料在农业上的应用由于纳米科技拓宽了现代农业的研究范围，克服了传统农业技术的局限性，加之纳米材料所拥有的优良特性，使得它们在农业领域中具有极为广泛的应用，如昆虫方面可用作纳米荧光探针、病毒载体等；农药学方面也可用作新型纳米农药、杀虫剂、驱虫剂、纳米农药载体等；还可用作土壤、水源改良、修复剂等（环境改良与清洁生产方面）。包括纳米肥料，纳米载体兽药与疫苗，纳米饲料添加剂，纳米植物生长调节剂，纳米基因载体应用于动植物遗传育种，农产品加工包装过程中应用纳米材料与纳米技术，纳米材料对于农业环境的改良以及纳米检测技术应用于食品药品监测等[33]。目前应用纳米材料技术的植物营养缓释型肥料已报道应用：主要包括纳米结构肥、纳米磁性液态肥以及纳米材料胶结包膜型缓释肥等[34]。李小康等[35]报道了关于碳纳米颗粒对植物产生影响的分子机制及其在植物体内的迁移等，这将对纳米材料应用于植物保护领域以及纳米材料作用于植物的防病机制研究具有很好的指导作用。以下我们针对纳米材料在促进种子萌发和生理效应影响，纳米材料在农药检测，纳米材料在昆虫学以及纳米材料在抗真菌研究共4个方面简述纳米材料在农业上的应用。1.2.2.1纳米材料在促进种子萌发和生理效应影响的应用近年来，很多学者对纳米材料在植物上的促生作用进行了初步的研究。比如，有学者研究纳米TiO2溶液对杉木种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均有促进作用，而且浓度为50，100，500，1000mg/L纳米TiO2溶液的促进作用随处理浓度的增加呈现先增强后减弱的趋势，100mg/L溶液处理对种子发芽指标提高效果最佳，该浓度处理下种子发芽率、发芽势、发芽指数与活力指数分别比对照高65.98%，91.70%，70.78%和299.36%[36]。研究表明碳纳米材料对植物种子萌发刺激作用，多表现为促进种子对水分的吸收、加快萌发进[37]程以及提高发芽率。碳纳米材料调节植物生长发育的研究中涉及到的材料种类包括碳纳米管（carbonnanotubes）、石墨烯（graphene）、富勒烯（fullerenes）、碳纳米角（carbonnano-horns，CNHs）以及碳纳米颗粒（carbonnano-particles，CNPs）以及单壁碳纳米管（SWCNTs）和多壁碳纳米管（MWCNTs）等。多壁碳纳米管处理的番茄种子在的培养基中处理6d之后发芽率[38]提高40%；被氧化的多壁碳纳米管比普通多壁碳纳米管表现出更好的刺激荠菜种子萌发[39][37,40,41]的效果；纳米碳管可以促进特定作物大麦、玉米、大豆、水稻以及番茄的种子萌发。也有研究报导纳米粒子能够激发植物体内氧化酶活性，抵御逆境或者外来入侵病原菌，促进[42]植物生长。1.2.2.2纳米材料在农药检测应用传统的农药检测需要经过样品的采集、分离、测定、校对等步骤，该方法工作量大、效率低、成本高。而基于纳米材料制成的纳米探测器以及利用纳米材料的一些农药检测技术具备高灵敏性、检出限低，受环境影响较小、高选择性、重现性好等特性。表1汇总了一些纳米感应器在农药检测上的应用。4 表1纳米材料在检测农药残留上的应用Table1Applicationsofnanomaterialsforpesticideresiduesdetection检测农药感应器材料最低检测限参考文献金纳米颗粒/聚（二甲基二烯丙大蒜中的久效磷0.8pg/mL[43]基氯）蔬菜中的有机磷农药Fe[44]3O4，ZrO2磁性纳米粒0.01-0.05ug/mL四乙烯五胺的氨基功能化纳米洋白菜中有机氯，有机磷0.29ug/kg[45]材料水中的甲基对硫磷纳米二氧化锆/石墨/石蜡2ng/mL[46]甲氰菊酯胶体金免疫层析试纸0.5μg/mL[47]水中的螨胺磷和啶虫脒磺酸盐中碲化镉量子点0.12-0.34nM[48]纳米二氧化锆和纳米金的复合水中的对硫磷3ng/mL[49]物银纳米修饰聚纤维素酯薄膜超杀虫剂敌百虫1*10-16mol/L[50]疏水界面此外纳米材料不仅可以检测农药和除草剂的残留物质，也可以用于降解农药。Zeng等[51]研究表明掺杂了铼的纳米二氧化钛可以使番茄叶片和土壤中的有机磷和氨基甲酸酯农药以15%-30%的速率光解。虽然基于纳米材料的传感器在检测农药残留上的应用空间是巨大的，但是在推广应用方面还存在一些问题，比如纳米探测器的广谱性，即一种探测性是否可以检测到多种的农药残留物质、探测器的制备方法是否简单易行、对残留物质的追踪、成本问题、在自然环境下的有效性等[52-54]。纳米材料的应用从环境毒理方面还存在一些争议性讨论[55]。1.2.2.3纳米材料在昆虫学上的的应用纳米材料在昆虫学研究上主要涉及以下三个方面：纳米荧光分子探针特异性标记昆虫组织细胞内的细胞器，纳米粒子作为基因载体用于携带外源核酸进入昆虫细胞，以及新型纳米杀虫剂及载体的应用研究[56]。随着合成及应用技术的不断改进，许多新型的纳米荧光探针以其独特的性能可以灵敏地探测生物进程如细胞分裂与凋亡、细胞增殖、酶促反应，同时还可以标记生物体组分如DNA、蛋白质、微量金属离子、中性分子等，还能够监视胞质器如核内体、溶酶体在细胞内的分布及运动状况[56,57]。纳米基因载体通常是由生物兼容性材料制备而成的纳米微囊或纳米粒子，可以通过包裹或吸附外源DNA等核酸分子形成纳米载体基因复合物[58]。纳米载体粒径在100nm以下，较大的比表面积使其均有高吸附性，起到浓缩保护DNA的功能，对外源基因发挥吸附、运转功能[59]。胡林等[60]研究表明，鱼藤酮纳米悬浮剂相比于传统药剂有更好的包封率，悬浮率以及光稳定性，而且24小时后对松材线虫的毒力鱼藤酮纳米悬浮剂是鱼藤酮丙酮溶液的7.5倍。1.2.2.4纳米材料在抗真菌研究上的应用真菌是自然界中广泛存在一种真核生物，其中有200多种可引起人体疾病，也有可引起5 植物病害的一类叫植物病原真菌。植物真菌病约占植物病害的70～80%，一种作物上可发生几种甚至几十种真菌病害，一种植物病害的形成也可能由多种病原菌引起[61]。然而近年来由于广谱性杀菌剂的大量使用，基于杀菌药物种类限制，对于杀菌剂的生物耐药性明显增强。研究者将关注点转向了基本不产生耐药性、安全性更高的纳米材料[62]。目前，应用比较广泛的主要有金属型纳米抗真菌材料、光催化型抗真菌材料及复合型抗真菌材料[62]。常用的纳米金属粒子有Ag、Cu、Zn，Pd及稀土元素等，其中金属纳米抗真菌材料研究比较多的是纳米银，因其具有抗菌性能高，耐久性好，用量小无毒无刺激等优点。研究表明纳米银对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌具有很高的抗菌活性，且含银的过滤器对空气[63]和水有较好的抗菌性能。周琳等研究表明纳米级载银无机抗菌剂对白色念珠菌的最低杀菌浓度为3.42mg/mL，在模拟口腔环境中显示对白色念珠菌的良好抗菌活性[64]。光催化型抗真菌材料光催化氧化物具有广谱杀菌抗菌效能耐热性高、安全性好、持续性好、价格便宜、使用方便等优点，在杀菌除臭、预防疾病、美化环境等方面日益受到人们的重视[65]。常见的包括纳米二氧化钛纳米氧化锌，纳米氧化硅以及其之间的复合物。研究表明纳米二氧化钛在陶瓷、玻璃、不锈钢、塑料、涂料方向均显示出抗菌作用[66]。Lili等[67]研究表明浓度高于3mmol/L纳米ZnO可以显著抑制Penicillium.expansum和Botrytis.cinerea的生长，引起B.cinerea真菌菌丝的变形，抑制P.expansum孢子萌发。更多抗菌效果更好，时效性更快的复合型抗真菌材料被不断探索。1.3几丁质及其衍生物1.3.1几丁质概述1.3.1.1几丁质的结构与性质几丁质（chitin）是自然界中储量仅次于纤维素的第二大天然多糖，广泛存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官，以及真菌类的细胞壁等[68]。几丁质是氨基多糖高分子聚合物，自然状态复杂，刚性强，具有良好的生物相容性，可生物降解性，无毒性。几丁质，化学名称为（1，4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，分子式为（C8H13NO5）n，如图1中A所示。几丁质结构属于多个N-乙酰氨基葡萄糖基团通过β，（1，4）糖苷键连接而成的分子链，各个分子链间由氢键通过不同的方式连接，形成了不同晶体结构的几丁质。自然界中的几丁质包括三种晶体结构：α-几丁质（见图2）、β-几丁质（见图3）、γ-几丁质[69-71]。其中，α-几丁质是由反向平行的分子链，通过分子内和分子间氢键，牢固地结合在一起，α-几丁质主要存在于虾、蟹的外壳中，几乎所有的天然几丁质，都包含α-结构；β-几丁质是由正向平行的分子链，通过分子间氢键结合在一起，牢固程度弱于α-几丁质，主要存在于墨鱼、乌贼及管状蠕虫中。γ-几丁质分子链的连接方式既有反向平行，又有正向平行，主要存在于蚕丝纤维、甲壳纲昆虫和鱿鱼的胃中[69]。纯净几丁质呈白色、灰白色粉末状或半透明的片状。试验中最常使用的是α-几丁质。然而，因为几丁质分子间和分子内存在着强烈的氢键，它的化学性质并不活泼，常温下，6 几丁质的化学性质非常稳定，不易溶于水、稀酸碱和一般的有机溶剂，每年有超过一亿吨的虾蟹壳作为食品废物被丢弃，但加工或表面改性后的几丁质性质极为优异，可以广泛应用。将这些废弃品加以利用，可以节省大量的资源，因此将几丁质作为功能性材料来开发利用是非常有必要的。但加工或表面改性后的几丁质性质极为优异，可以广泛应用。图1（A）.几丁质的结构式;（B）.壳聚糖的结构式[69]Figure1（A）.structureofchitin；（B）.structureofchitosan[69]图2α-几丁质的构型[72]：（a）ac轴构象；（b）bc轴构象；（c）ab轴构象Figure2Structureofα-chitin[72]:（a）acprojection;（b）bcprojection;（c）abprojection.7 图3β-几丁质的构型：（a）ac轴构象；（b）bc轴构象；（c）ab轴构象。Figure3Structureofβ-chitin[73]:（a）acprojection;（b）bcprojection;（c）abprojection.1.3.1.2几丁质的制备方法几丁质可以从虾、蟹的甲壳及柠檬酸发酵的菌体等多种原料中分离得到，从虾、蟹壳的分离比较容易。虾蟹中除含有几丁质外，其余主要是碳酸盐和蛋白质，可通过简单的化学处理除去。一般用稀盐酸在常温下分解碳酸盐，用稀碱液经加热分解蛋白质，在经高锰酸钾处理后用有机溶剂萃取除去色素，可得到白色的几丁质产品，产率一般在15~30%之间，所得的几丁质的分子量因来源不同而异。几丁质制备方法有酸降解法、酶解法、氧化降解法、合成法等。传统工艺生产壳聚糖是化学脱酰反应或水解法，其原理是通过水解破坏几丁质的二级结构（主要是破坏非晶体结构部分），使分子键断裂，分子链中部分N-乙酰葡萄糖脱酰，[74]提高其亲水性。但化学脱酰或水解法反应条件要求较高，不宜控制，且反应时间较长，耗能，环境污染。纯净几丁质的制作工艺比较简单，目前生产上常用的方法是将原料（虾壳或蟹壳）经过脱蛋白、脱盐、脱色素、漂白、烘干研磨得到几丁质。下图4为几丁质的制备流程[69]。图4传统的几丁质生产工艺Figure4traditionalproductionprocessofchitin8 1.3.2几丁质的衍生物-壳聚糖1.3.2.1壳聚糖的结构与性质壳聚糖是几丁质最主要的衍生物，作为自然界唯一的碱性多糖，壳聚糖具有无毒性、可生物降解性、生物相容性和抑菌性等多种性能，其功能多样性取决于脱乙酰度和相对分子质量。壳聚糖，化学名称为聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-B-D葡萄糖[75]。壳聚糖分子的基本单位为氨基葡萄糖，其结构中含有大量的氨基和羟基，不溶于水和碱性溶液，可溶解于乙酸、甲酸等有机酸中。壳聚糖结构式见图1中的B图。1.3.2.2壳聚糖的制备方法几丁质经过脱乙酰化反应可获得壳聚糖，脱乙酰反应一般在40~60%的浓碱中，一般反应条件为100~180℃加热非均相进行，可得到脱乙酰度一般在80%左右的壳聚糖[76,77]。化学法中制备壳聚糖的关键是脱乙酰基的条件，提高碱液浓度、反应温度和反应时间均可达到提高脱乙酰度的目的，但伴随着主链的降解从而对壳聚糖的粘度、相对分子质量造成较大影响[78]。脱乙酰度的测定方法主要有电位滴定法、胶体滴定法、红外光谱法、苦味酸分光光度法、气象色谱法、热分析法及核磁共振法等[79]。与一般胺类物质不同，壳聚糖的氨基在碱溶液中十分稳定，即使在50%的氢氧化钠中加热至160℃也不易分解[80]。提高反应温度、碱液浓度及延长反应时间可提高脱乙酰度，但在碱液中甲壳素的主链也会发生水解，随着强化脱乙酰反应，大分子链的降解也变得严重[81]。通过降低脱乙酰的反应温度、缩短反应时间、增加反应次数并进行中间产物的溶解、沉淀处理，可得到脱乙酰度为99%以上的高分子壳聚糖[81]。此外，酶解法也可以以较高的效率生产壳聚糖，即通过几丁质脱乙酰酶的水解作用制备壳聚糖[82,83]。虽然酶解法制备壳聚糖具有很多优点，但仍存在着一些问题，如获得的几丁质脱乙酰酶菌株的产酶能力低，活性不稳定等。几丁质经部分脱乙酰得到壳聚糖反应过程见下图5。[84]图5几丁质部分脱乙酰生成壳聚糖Figure5Deacetylationreactionofchitosanfromchitin[84]9 1.3.3几丁质及其衍生物的应用自然条件下，几丁质不溶于水，也不溶于酸有机溶剂，因此很难被有效利用；但几丁质经过一系列化学修饰和改性，如磺化、羧甲基化、脱乙酰化等反应，可获得具有特定性能的几丁质系列衍生物，在食品、工业、医学、农业、生物科技等领域具有非常广阔的应用前景[68,75,85,86]。下表汇总了几丁质，壳聚糖及几丁质的其他衍生物在各个领域的应用，见下表2所示。表2几丁质及其衍生物的应用Table2Applicationsofchitinandchitinderivatives应用领域作用农业植物生长调节，壳聚糖可以植物细胞壁中的多聚半乳糖醛酸结合，增加植物细胞通透性，促进细胞内物质的代谢和排放[87]；诱导植物抗性[88-90]；促进种子萌发[91]；抗虫，抗真菌病害[92]；土壤改良剂[93]；废水治理用纳米几丁质晶体增强聚偏氟乙烯（PVDF）膜的力学性能和透水性用于污水处理系统[94]；污水处理[95][96]生物医学甲壳低聚糖具有调节小鼠肠道菌群及促进双歧杆菌增殖功能；[97]降血压，降血糖，调节免疫力化妆品皮肤保湿；修护干枯毛躁发质；防静电；口腔护理[98]生物医药纳米级几丁质和壳聚糖可用作伤口愈合材料[99]食品水果和饮料的脱酸，乳化剂，增稠剂，稳定剂和膳食补充剂[100]组织工程诱导皮肤再生，促进骨髓间充质细胞的增殖和骨骼矿化；修复软骨挫伤；促进神经再生[101]包装业壳聚糖/纤维素纳米复合材料抗氧化膜材料用于食品包装[102]纺织业改善染料的结合性，增加颜色的饱满度，提高顺滑度[103]1.4纳米几丁质概述1.4.1纳米几丁质的制备制备纳米几丁质常用的方法是盐酸水解[104]。已有的报道显示，纳米几丁质的制备方法还有界面聚合法，离子交联法，酸解法，复凝聚法，自组装法，实验室制备还有其他高效方法，比如通过TEMPO-NaBr-NaClO选择性氧化体系[105,106]，制备出携带负电荷的纳米几丁质，还有超高速水压研磨法，微波处理法，酶解法等[107]。1.4.2纳米几丁质的性质纳米几丁质是几丁质粉通过强酸水解法制得聚阳离子纳米几丁质晶须（nanochitinwhiskers），可制成均匀分散的水悬浮液。和壳聚糖相比，纳米几丁质携带少量聚阳离子但因其比表面积大，同样具有显著的生物活性[108]。且纳米几丁质不仅保留了几丁质及其衍生10 物无毒、生物相容、可生物降解的生物活性，纳米级别的粒径还赋予了其纳米生物材料独有的优良特性。因此纳米几丁质性能将优于壳聚糖。1.4.3纳米几丁质的研究进展，纳米几丁质在农业领域的应用前景由于纳米科技拓宽了现代农业的研究范围，克服了传统农业技术的局限性，加之纳米材料所拥有的优良特性，使得它们在农业领域中具有极为广泛的应用，如可用作纳米荧光探针、病毒载体等（昆虫学方面）[109,110]；也可用作新型纳米农药、杀虫剂、驱虫剂、纳米农药载体等（农药学方面）[111,112]；还可用作土壤、水源改良、修复剂等（环境改良与清洁生产方面）[113,114]。将纳米科技、纳米材料应用于农业领域，致力于发展纳米农业，不仅为现代农业科学发展提供了新的方向，拓宽了农业领域的研究范围，更为农业创新、科技创新提供了新的思路。近十年来，很多关于几丁质在农业病虫害防治上的生物活性测试已被报道。几丁质脱乙酰度大于60%的衍生物壳聚糖（chitosan）能够诱发植物的防御反应，也可作病虫害防治，种子包衣，水果蔬菜的涂层[115]。Zhang等[92]研究报道了壳聚糖衍生物包括N-烷基壳聚糖和苄基壳聚糖对棉铃虫、小菜蛾、棉蚜有一定的杀虫活性。我们之前研究报道了纳米几丁质对麦蚜的毒力及防效测定，得到纳米几丁质水悬浮液和混配制剂对防治麦蚜具有良好的速效性和持效性[116]。几丁质及其衍生物能够促进植株生长，有研究表明纳米几丁质施用于作物可以提高作物生长势，增加产量和作物品质。薛卫杰等[117]研究了纳米几丁质对冬小麦籽粒产量和品质的影响，结果表明，在土壤中施用0.006g/kg纳米几丁质可以分别提高小麦穗分化和小穗长度的23.0%和33.4%，在籽粒灌浆期，叶片净光合速率、气孔导度、细胞间CO2浓度、蒸腾速率均有显著提高。周扬等[108]也报道了纳米几丁质对烟草生物活性的影响，探究其对烟草种子萌发、幼苗生长以及杀菌剂的协同作用，试验结果表明，0.004%（w/v）纳米几丁质水悬浮液缩短烟草种子萌发时间，0.005%（w/v）纳米几丁质显著增加烟草株高，茎粗，叶片数，叶面积，0.001%（w/v）纳米几丁质对抑制烟草根腐病具有良好的协同效应。这表明纳米甲壳素的利用在未来农业的可持续性和作物生产中具有很大的潜力。关于几丁质的抗真菌活性，离体、活体测定均有报道，Ziani等[118]证明了几丁质衍生物壳聚糖对木生真菌、黑曲霉菌、烟草赤星病菌以及稻根霉菌具有显著抑制活性，特别是壳聚糖溶液处理烟草赤星病菌最高抑制率可达97%。Dutta等[119]在研究纳米几丁质纤维膜表面上氯化处理赋予其良好的抗细菌和抗真菌活性，检测对Alternariaalternata和Penicilliumdigitatum的孢子萌发抑制率分别达100%，80%。然而，目前几丁质类物质，尤其是纳米几丁质对于小麦茎基腐病和全蚀病等一些重要的小麦真菌病害病菌生物活性和防效研究还未见报道。本课题将利用新型生物纳米材料纳米几丁质，针对小麦茎基腐病和小麦全蚀病优势病原菌进行抑菌筛选，并探究其与常用杀菌剂的协同增效作用，以及其对植物抗性防治机理的初步探究。11 从而解决了大量使用化学制剂、农药、化肥等已造成病虫害抗性增加、土壤退化、环境污染、农产品农药残留超标等重大社会问题。同时也能对农业纳米技术等新学科的发展提供理论依据，为农业生产资料产业的更新换代起到积极的推动作用。1.5诱导植物抗性研究进展植物诱导抗性，是指植物在经过物理化学以及生物的方法处理后，预先激发启动植物体内防御机制，增强对恶劣环境，逆境条件以及入侵病原物的抵御能力。植物诱导抗性具有以下特点：非特异性，滞后性，不完全性，耗能性，诱导物种类繁多，可控性，持续性。植物诱抗剂，也叫做激发子，是一类能够诱导寄主植物产生防卫反应的特殊化合物的总称。这些激发子，在浓度很低的情况下即可被植物信号系统识别，诱发植物自身免疫系统[120-122]。研究表明，多种物质（毒性/无毒病菌、非病原菌、细胞壁碎片、植物提取物、化学合成物质）均可以在短时间内或者是在病原物侵入后，诱导植物产生局部/系统抗性；该途径并不能完全抵抗病原物的侵染，但是可以减少病菌侵入植物后引起的损伤和破坏[123]。表3SA/JA在植物诱导抗性中的应用Table3ApplicationofSA/JAonplantinducedresistance信号分子作物病害种类参考文献SA鹰嘴豆枯萎病[131]棉花黄萎病[132]菜豆镰孢菌枯萎病[133]烟草黑胫病[134]番茄根结线虫[135]黄瓜细菌性果斑病[136]JA黄瓜木霉病[137]葡萄叶螨[138]玫瑰白粉病[139]小麦白粉病[140]苜蓿匍柄霉叶斑病[141]水稻白叶枯病[142]植物诱导抗病性的机制主要集中在物理机制，生理生化机制和分子机制[124]。植物受到激发子刺激后，导致植物细胞壁或细胞内部发生一系列结构性改变，例如细胞壁木质化，木12 栓化和钙离子沉积，维管束阻塞等来阻止病原菌再次侵染。生理生化诱抗机制是，当植物收到激发子激发或病原菌侵染，植物体自身生理生化指标发生变化，一些可能与植物体整体或局部防御机制相关的氧化酶和糖酶会发生变化，用来抵御抗原的进一步侵染。POD，CAT，SOD，PPO，PAL以及β-1，3-GA等是植物体内重要的防御酶，参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合成，能抵御活性氧及氧自由基对细胞膜系统的伤害，增强植物对病害的抵抗能力[120,125,126]。分子机制方面主要涉及防卫基因的表达调控和信号的识别与传导，过敏性坏死反应HR（Hypersensitiveresponse）和系统获得抗病性SAR（Systemicacquiredresistance）是植物经诱导后普遍产生的两种抗病分子。对于那些对入侵病原物的反应防御被削弱的植物突变体的遗传学分析后，研究学者发现了一些不同但互相关联的可能被正负调控的信号分子，多项研究已经确认了水杨酸，茉莉酸，乙烯等主要的信号分子与植物诱导抗性信号传导途径有关，且信号分子间存在协同作用和拮抗作用，精准的对特定病原侵扰做出防御[127-130]。表3列举了水杨酸SA（Salicylicacid），茉莉酸，JA（Jasmonicacid）在诱导植物抗病性中的应用。13 2引言小麦是我国重要的粮食作物，在我国粮食安全生产中占有十分重要的地位。小麦茎基腐病和小麦全蚀病是近年来发生在小麦作物上的两种主要病害，而目前尚缺乏高抗品种以及高效绿色的药剂防治措施。众所周知，化学制剂及产品是我国目前农业病虫害防治的主要有效手段，化学农药的大量使用已经引起部分农业病虫害的抗性逐年增加，环境污染，农产品药物残留超标等广泛关注的社会问题，并且威胁到食品卫生安全及人们的生产生活健康。近年来，绿色纳米科学技术在减少或者消除有毒物质，重建环境方面有着强大的作用。特别是以自然界蕴藏量丰富的生物材料为原料开发出的绿色纳米材料，例如，纳米几丁质，因其具备无毒性、可生物降解性、生物兼容性、低密度、超高的比表面积、高结晶度和聚阳离子特性等被广泛的应用于生物医药、化妆品添加剂，以及保健食品等领域。然而纳米几丁质作为一种综合性能超高的生物纳米材料在农业上的应用还没有被系统研究。尤其是，纳米几丁质对于小麦茎基腐病和全蚀病等一些重要的小麦真菌病害病菌生物活性和防效研究还未见报道。本课题利用新型生物纳米材料纳米几丁质来提高小麦的产量与品质，以及利用其与常用杀菌剂的协同增效作用来防治小麦茎基腐病和小麦全蚀病等常见小麦土传病害，为今后小麦土传病害防治新方法提供方案。并且为解决化学药剂抗药性及农药残留提供新模式，解决大量使用化学制剂、农药、化肥等已造成病虫害抗性增加、土壤退化、环境污染、农产品农药残留超标等重大社会问题。为纳米几丁质等纳米材料在农业领域应用提供新理论依据，为作物安全生产提供新施药思路。14 3材料与方法3.1纳米几丁质的制备与表征3.1.1材料与仪器材料：几丁质粗粉（C24H40O5MW=408.57，来自虾壳，美国Sigma公司）；36%-38%HCL（双双化工公司，山东烟台）；超纯水（去离子水）来自明澈超纯水系统（电阻率在25℃，18.2MΩ）；甘油（市售）；Spectra/Por透析膜（MWCO:12-4kD）；其它化学试剂购自国药化学试剂有限公司（中国）：甲醇、氯化钠、盐酸标准溶液（c=0.1005mol/L）和氢氧化钠（c=0.05023mol/L）。所有化学品都是分析级的。仪器：超纯水净水系统：明澈-D24UV；数显型混合顶置式机械搅拌器：IKA，RW20；数字恒温油浴锅：江苏金怡仪器科技有限公司，W-201C；磁力搅拌器：CRYSTAL，MS2-P1H；实验室pH计：梅特勒-托利多，FE20；电导率仪：雷磁，DDS-307；赛多利斯电子分析天平：BT125D；真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司，DZF-6050；电热恒温鼓风干燥箱：上海一横科学仪器有限公司；高速冷冻离心机：HITACHI，GR21GⅡ；超声细胞破碎仪：SONICS，VCX750；纳米粒度仪：MalvernNanosizer，Nano-ZS90；透射电子显微镜（HE-TEM）：JEOL，JEM-1400。3.1.2纳米几丁质的制备采用改良后的酸水解法制备纳米几丁质。具体操作步骤如下：a.将300ml，3mol·L-1的盐酸装入三颈烧瓶中，放入磁子，设置冷凝回流管和氮气保护，用盛有甘油的电磁搅拌器搅拌并加热，直至瓶内盐酸温度升至85℃；b.加入1g几丁质粉末，反应体系应继续保持85℃恒温，使几丁质粉末与盐酸充分接触反应；c.1.5h后将反应体系从三颈烧瓶中取出，立即用4倍于反应体系体积的4℃去离子水冷却，再4℃，15min，8000rpm·min-1离心，弃上清；d.沉淀加入300ml，3mol·L-1的盐酸，再次重复上述步骤反应两次；e.第三次离心沉淀加一定量去离子水再分散，并转入透析膜用去离子水透析5-7天，除去残余盐酸，待透析膜外去离子水pH稳定后，从透析袋中取出；15 f.用超声细胞破碎仪进行冰浴超声处理，设置35%输出功率，工作5s，间歇5s，超声20min；h.然后离心最终得均匀分散的携带聚阳离子纳米几丁质水悬浮液。3.1.3纳米几丁质的表征3.1.3.1浓度检测依据《2010版中国药典二部附录ⅧL干燥失重法》，制备好的纳米几丁质水悬浮液通过干燥失重法测定其浓度。具体操作步骤如下：a.取铝箔纸制成一次性干燥碟，置于恒温鼓风干燥箱70℃预烘干15min，取出干燥碟分别于分析天平称重记为m1；b.用移液器精确吸取3mL纳米几丁质水悬浮液，盛放于干燥碟中，置于干燥箱90℃烘干2h，待干燥碟上液体完全干透后取出称重记为m2；c.干燥碟前后两次重量的差值即为3mL纳米几丁质的重量，重量除以体积即为纳米几丁质水悬浮液的浓度。每批次样品重复3次，样品浓度取三次重复的浓度均值。m2-m1cሾ%(wv)ሿ=×100(1)V式中：c为计算出的某批次纳米几丁质某次重复的浓度（g/mL，%（w/v））m1为预烘干后空干燥碟重量（g）；m2为加入纳米几丁质的干燥碟烘干后的重量（g）；V为加入纳米几丁质的体积（mL）。3.1.3.2Size和ZetaPotential的检测在河南省动物免疫学重点实验室，通过马尔文纳米粒度仪，利用动态光散射（DLS）原理测定纳米几丁质的尺寸大小和Zeta电位。检测尺寸的步骤如下：a.将纳米几丁质悬浮液稀释至0.03%（w/v），用超声细胞破碎仪进行超声处理（输出功率35%，工作时间15s，工作间隔15s，超声总时间2min）；b.将样品注入标准样品池中（样品高度在10-15mm），打开Zetasizer软件选在相对应的程序进行测定，每个样品重复3次；c.zeta电位测定方法和尺寸测定方法基本一致，需要注意的是使用Zeta电位专用DTS1060弯曲式毛细管样品池，注入样品过程保证无气泡产生，同样每个样品重复3次。3.1.3.3TEM检测在河南省中医药大学中心试验室，在实验老师指导下通过JEOL高分辨透射电子显微镜JEM1400对样品进行检测。具体操作步骤如下：a.配制2%的磷钨酸染液；b.将洁净的碳涂层铜网放置在干净的玻璃培养皿中，在碳涂层铜网上滴加一滴0.003%（w/v）纳米几丁质悬浮液，再滴加一滴2%的磷钨酸染液；16 c.用滤纸吸掉多余液体后，自然条件下染色3-4h，直到干燥，也可以钨光灯下炙烤缩短干燥时间（操作期间保证样品的洁净度）；d.然后将碳支持膜放入样品杆中，插入样品室，缓慢送入观察位置，找到要观察的样品镜像，观察纳米几丁质结构和形态，并保存图片。3.2纳米几丁质对病原真菌室内抑菌活性测定3.2.1供试菌株，培养基，实验仪器供试病原真菌：以下均来自植物保护学院病理实验室保存菌种：假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum）；禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）；小麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.tritici）；辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici）；辣椒炭疽病菌（Colletotrichumcapsici）；小麦立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）。试验所需培养基与试剂：该部分纳米几丁质对几种病原真菌的室内抑菌活性测定主要用到两种培养基，以下为制备方法：马铃薯琼脂培养基（PDA）的制备：称取去皮马铃薯200g，切片，加去离子水煮至能用玻璃棒戳破倒出，然后用四层纱布过滤，将滤液倒回锅中，葡萄糖20g，加入琼脂粉17g，同时加热搅拌均匀，用大量筒定容至1000mL，待稍冷后分装到三角瓶中，加透气封口膜和报纸，包扎，平稳放置高压蒸汽灭菌锅中，0.1Mpa，121℃，20min，湿热灭菌。结束后冷却，放置洁净的储物柜中备用。绿豆培养液的制备：称取40g绿豆，冲洗干净后，放入锅中加去离子水煮约20min至绿豆将破未破时倒出，用四层纱布过滤，用大量筒定容至1000mL，待稍冷后分装到三角瓶中，加透气封口膜和报纸，包扎，平稳放置高压蒸汽灭菌锅中，0.1Mpa，121℃，20min，湿热灭菌。结束后冷却，放置洁净的储物柜中备用。NCS:纳米几丁质水悬浮液（nanochitinwhiskersuspension）；化学杀菌剂：硅噻菌胺（Silthiopham，125mg/L，SC，先正达）；咯菌腈（Fludioxonil（25mg/L，FSC，先正达）；抗生素：头孢霉素（CefotaximeNaSalt，Biotopped）。实验仪器：该部分试验所使用到的仪器主要有：光照培养箱，高压蒸汽灭菌锅，恒温震荡摇床，超净工作台，紫外分光光度计（ThermoND-1000V3.6），光学显微镜。17 3.2.2纳米几丁质对几种病原真菌菌丝生长抑制率的测定检测不同浓度纳米几丁质水悬浮液NCS（0.03%，0.003%，0.001%，0.0003%w/v）对两种小麦茎基腐病病原菌F.pseudograminearum，F.graminearum菌丝生长抑制率。检测NCS（0.0005%，0.001%，0.005%，0.01%，0.02%，w/v）对其他3种植物真菌病原物P.capsici，C.capsici，R.solani的菌丝生长抑制率。采用平板培养菌落生长速率法测定纳米几丁质的抑菌效果。PDA培养基放入微波炉中加热2分钟使其融化，冷却至40-50℃，加入50μg/mL的头孢霉素混合均匀，然后以纳米几丁质水悬浮液（0.0005，0.001，0.005，0.01，0.02%，w/v）与PDA培养基体积比1:9混合均匀，去离子水同样与PDA培养基混合作为空白对照，然后各处理等量倒入灭菌的平板培养皿中制成带毒培养基平板。将复壮后生命力旺盛的菌株培养3天，在菌落外沿新鲜菌丝处选取菌丝生长状态一致区域，用直径5mm已灭菌的打孔器打制成待接种菌饼。用接种针轻轻挑起圆形的完整菌饼，使得菌丝生长一面朝下，接种于带毒培养平板中映处，每皿接种一枚菌饼，在培养皿上贴标签标出相应编号，用封口膜密封，置于恒温培养箱25℃培养4天，采用十字交叉法测量菌落的直径（并减去菌饼），并计算不同处理液对病原菌的菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率的计算公式如下所示：空白对照组菌丝生长直径-处理组菌丝生长直径菌丝生长抑制率=×100%(2)空白对照组菌丝生长直径3.2.3分生孢子抑制率该部分我们检测了不同浓度纳米几丁质水悬浮液(0.03%,0.003%,0.001%w/v)对两种小麦茎基腐病病原菌F.pseudograminearum,F.graminearum的分生孢子产量的抑制率。采用绿豆汤培养液作为培养基，以不同浓度纳米几丁质水悬浮液与绿豆汤培养液1:9（V/V）的比例配置孢子培养液，去离子水同样与绿豆汤培养液混合作为空白对照，所有处理均加入50μg/ml头孢霉素防止细菌污染。然后将培养液分装在100mL的小锥形瓶中，每瓶30mL培养液，并在每个小锥形瓶中接种等量的六分之一5mm的圆形琼脂菌块，塑料封口膜封好，以上步骤操作均在超净工作台进行。最后将培养瓶放置于恒温震荡摇床，黑暗，25℃，150rpm/min,培养5天。以上每个处理均设置3个重复。5天后取出，过滤菌饼和少量悬浮菌丝，摇匀，吸取少量液体，用细胞计数板在光学显微镜下观察，计数。统计每个处理中每1mL培养液分生孢子的数量，并计算出不同浓度纳米几丁质水悬浮液(NCS)对F.pseudograminearum,F.graminearum两种病原菌的分生孢子抑制率。培养液中分生孢浓度（c）和分生孢子抑制率（%）计算方法如下：分生孢子浓度（cells/mL）=细胞计数板计数区400个格中分生孢子数量×10000(3)空白对照组分生孢子浓度−处理组分生孢子浓度分生孢子抑制率(%)=×100(4)空白对照组分生孢子浓度18 3.2.4对小麦全蚀病病菌离体活性纳米几丁质与化学杀菌剂协同效应以小麦全蚀病病原菌G.graminisvar.tritici作为靶标病原菌，探究了在离体条件下纳米几丁质与2种化学杀菌剂咯菌腈（Fludioxonil）和硅噻菌胺（Silthiopham）复配使用，其对于抑制病原菌生长的协同效应。采用平板培养菌落生长速率法。将以下单剂以及与NCS复配药剂与PDA培养基体积比1:9混合均匀，去离子水同样与PDA培养基混合作为空白对照，然后各处理等量倒入灭菌的平板培养皿中制成带毒培养基平板。纳米几丁质水悬浮液（0.0003，0.003，0.03%，w/v培养基中终浓度）分别标记为N1，N2和N3，咯菌腈（25mg/L）用去离子水稀释8000倍液，4000倍液和2000倍液（培养基中终浓度）分别标记为F1，F2，F3，硅噻菌胺（125mg/L）用去离子水稀释8000倍液，4000倍液（培养基中终浓度）分别标记为S1，S2。纳米几丁质水悬浮液N1，N2，N3分别与这五组化学杀菌剂按照体积比1:1混合均匀，并标记为对应字母结合。将复壮后生命力旺盛G.graminisvar.tritici菌株培养4天，在菌落外沿新鲜菌丝处选取菌丝生长状态一致区域，用直径5mm已灭菌的打孔器打制成待接种菌饼。用接种针轻轻挑起圆形的完整菌饼，使得菌丝生长一面朝下，接种于带毒培养平板中央处，每皿接种一枚菌饼，在培养皿上贴标签标出相应编号，用封口膜密封，置于恒温培养箱25℃培养6天，采用十字交叉法测量菌落的直径（并减去菌饼），并计算不同处理液对病原菌的菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率（%）的计算方法同上述公式（2）。3.3纳米几丁质对小麦生理指标的影响3.3.1供试材料，实验仪器供试材料与试剂：小麦品种：冬小麦矮抗58，购自河南秋乐种业；营养基质：绿沃精制营养土，河南绿沃园艺植材植料厂；供试病原菌：假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）；盆钵：8cm×8cm（φ×h）若干个个；该试验所需培养基：小米培养基的制备，将小米洗净后放入沸水中煮沸1-2分钟，然后将小米倒出，用冷水冷却冲洗3-4次，将冲洗干净的小米置于干净报纸上于通风处晾至表面无水后分装，加棉塞，包扎，将装好小米的三角瓶置于湿热灭菌锅中，在压强0.1Mpa，温度121℃条件下湿热灭菌30min。PDA培养基；该试验用到化学杀菌剂：戊唑醇（tebuconazole）（60mg/L，FSC，德国拜耳）试验仪器与试验条件：该部分试验所使用到的仪器主要有：光照培养箱，超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，温室，玻璃干燥皿，直尺，分析天平。19 3.3.2试验设计3.3.2.1病原菌扩繁该试验利用小米培养基进行病原菌扩繁：首先在PDA培养基中接种假禾谷镰刀菌，培养3天后取边缘新鲜菌丝处打直径为8mm的菌饼。然后在灭过菌的小米培养基（冷却后并适量干燥后）中接入假禾谷镰刀菌菌饼，每个锥形瓶中接种量相同。放入25℃培养箱培养大约7天，期间定期摇晃，防止结块确保菌丝均匀分布在小米表面，待菌丝在小米粒表面均匀覆盖即可倒出，平铺在洁净的纸上并置于阴凉干燥处晾干（尽量置于室外通风处）备用。暂时不用可晾干后塑料袋封好-20℃保存。3.3.2.2各处理组的设计以及拌种处理该试验一共设置了20个不同的处理组。纳米几丁质水悬浮液NCS（0.001%，0.003%，0.009%，0.018%，w/v）分别为不同浓度的纳米几丁质，单独处理种子，分别记作B1，B2，B3，B4。根据小麦茎基腐病的已报道研究[22]，化学杀菌戊唑醇包衣处理可以起到一定的防病效果，所以将戊唑醇（60mg/L）作为阳性对照，也作为复配使用的化学杀菌剂，设置3个药种比1:1000，1:1500，1:2000，ml/g，分别记作A1，A2，A3，具体拌种剂量见表4。4个不同浓度的纳米几丁质水悬浮液分别与3个浓度的药剂复配后拌种，分别对应记作AnBm。去离子水对种子进行同样的处理作为空白对照，记作CK。每个处理组设置6个重复，3组用于小麦株高干重测定，另外3组处理用于小麦叶片叶绿素的测定。拌种具体步骤如下所示：戊唑醇药剂处理组，按照表4的剂量拌种。拿A1举例：取1mL的戊唑醇制剂于洁净的容器中，加15mL的去离子水稀释并搅拌均匀，然后倒入1000g小麦种子，充分混合搅拌并静置5分钟，使得所有的小麦种子表面均匀的裹上一层药液，最后倒出平摊在洁净的托盘阴凉处晾置20分钟，之后收至洁净的自封袋并贴好标签，备用；复配处理组是将对应浓度的纳米几丁质水悬浮液代替去离子水作为溶剂稀释药剂也按照表一的剂量拌种，具体操作同上。不同浓度的纳米几丁质处理组，直接用不同浓度的纳米几丁质水悬浮液，15mL/1000g种子，同样步骤充分搅拌静置5分钟后，20分钟晾干备用；空白对照组，用去离子水同NCS组剂量同步骤。表4小麦戊唑醇拌种剂量详表Table4Thedosageofwheatseedcoating剂量(g(a.i.)/100kg种子)药种比杀菌剂/mL溶剂（水或NCS）/mL小麦种子/g6*10-31:100011510004.02*10-31:15000.671510003*10-31:20000.51510003.3.2.3试验条件与详细步骤将假禾谷镰刀菌小米培养基扩繁菌种和无菌营养土以质量比0.75：100的比例混匀，将20 带菌营养土转入营养钵中（营养钵高8cm，口径8cm），每钵大概200g菌土，播种8粒种子，每个处理设置6钵。于25℃/20℃，14小时光照，10小时黑暗，湿度70%的条件下，培养20天后对各处理组的小麦株高，干重，单位质量小麦叶片叶绿素a和叶绿素b的含量进行调查计算并记录。3.3.3纳米几丁质对小麦株高和干重影响的测定形态指标测定方法：株高使用直尺测量，植株于105℃杀青30min后在70℃下烘干至恒重测定干重，使用电子天平测定，并记录。每组处理的均株高是取本处理各个样品分别测量取均值，均干重是用上述方法烘干后，直接测量一组处理总质量再除以总株数求得该处理的均干重。3.3.4纳米几丁质对小麦叶片叶绿素影响的测定采用80%丙酮提取法，具体步骤按照植物生理学实验指导（高俊凤）[143]中实验29叶绿素含量的定量测定方法，分别从各处理组采集新鲜小麦叶片，每组处理取3份，每份精确称取0.25g，研磨得样品液，定容到25mL棕色容量瓶中。将色素提取液倒入厚度为1cm的比色皿中，将分光光度计的波长分别调至663、645nm处，以80%丙酮调零，测定两波长处的吸光度值。计算出提取液中叶绿素a、b和总叶绿素浓度[143]。计算方程如下所示：Ca=12.72×A663-2.59×A645(5)Cb=22.88×A645-4.67×A663(6)Ca&b=Ca+Cb(7)式中：Ca表示提取液中叶绿素a的浓度（mg/L）；Cb表示提取液中叶绿素b的浓度（mg/L）；Ca&b表示提取液中叶绿素a和叶绿素的总浓度（mg/L）；A645和A663表示样本提取液分别在645nm，663nm处的吸光度值。求样本材料单位质量叶绿素a、b和总叶绿素含量，再将对应浓度值代入以下方程：C×V单位质量叶绿素含量(mg／g)=(8)m×1000式中：C表示叶绿素浓度（mg/L）；V表示提取液总体积（mL）；m表示叶片鲜重（g），求出所测材料单位重量总叶绿素含量。3.4温室试验纳米几丁质与化学杀菌剂协同作用3.4.1供试材料，实验仪器，实验条件同3.3部分中该部分内容。21 3.4.2纳米几丁质作种衣剂-温室试验对防治小麦茎基腐病协同效应该试验同3.3部分中处理组的设置完全相同，拌种方法也相同。分别有杀菌剂A组（戊唑醇，60mg/L，药种比1:1000，1:1500，1:2000），纳米几丁质B组（NCS，0.001%，0.003%，0.009%，0.018%，w/v），还有纳米几丁质做拌种剂的AnBm复配组，加去离子水空白对照组共20个不同的处理组。每个处理设置3个重复。将假禾谷镰刀菌小米培养基扩繁菌种和无菌营养土以0.75：100的比例混匀，将带菌营养土转入营养钵中（营养钵高8cm，口径8cm），每钵大概200g菌土，播种6粒种子，每个处理设置3钵。于25℃/20℃，14小时光照，10小时黑暗，湿度60-70%的条件下，培养30天后对各处理组小麦进行病情调查。将麦苗从营养钵中取出，小心的用清水冲干净，小麦茎基腐病的分级标准参考Poole等和贺小伦[144,145]的分级标准并计算各处理的病情指数和防病效果（%），病情分级标准具体如下：0级：植株未发病；1级：地中茎明显变褐或第一叶鞘出现轻微症状；3级：第一叶鞘明显变褐，但叶鞘未变黑；5级：第一叶鞘变黑或者第二叶鞘变褐；7级：第三叶鞘出现变褐症状，或植株因发病而发育迟缓或接近死亡；9级：植株因发病而死亡。各处理的病情指数，防病效果计算公式：∑（各级病株数×级数代表数值）病情指数=×100(9)调查总株数×分级标准中最高病级数空白对照组平均病情指数-处理组病情指数防病效果=×100%(10)空白对照组平均病情指数记录各组数据，利用IBMSPSS20.0软件中的Duncan’s新复极差法检验在p=0.01，p=0.05水平上的差异显著性，并分别用大写字母和小写字母标记。3.4.3纳米几丁质喷施-温室试验对防治小麦茎基腐病协同效应该试验中纳米几丁质我们采取喷雾的施用方式，并且设计了1次喷雾处理和3次喷雾处理（标记为P-组）。设置了纳米几丁质水悬浮液NCS（0.001%，0.0025%，0.005%，0.01%，w/v）4个不同浓度，来检测喷施NCS对防治小麦茎基腐病的协同效应，咯菌腈（25mg/L，药种比1:1000）作为药剂对照。两组分别设置单独的空白对照（去离子水对照），记为CK，P-CK。每个处理组3个重复。P-组（3次喷雾）的处理组为种子撒入盆钵（每钵8粒种子）后再盖一层约2cm厚度的含假禾谷镰刀菌小米培养基（0.75%）的菌土，播种当天，3天，7天分别喷施处理对应药剂，共3次。喷雾一次的处理组只在播后第7天喷雾处理一次。所有喷施每次每钵30mL。22 于25℃/20℃，14小时光照，10小时黑暗，湿度60-70%的条件下，培养30天后对各处理组小麦进行病情调查，调查方法同3.4.2的具体方法与病害分级标准。各处理的病情指数，防病效果依照公式9，公式10进行计算，数据分析方法同上。3.5纳米几丁质对小麦防御酶系活性影响3.5.1供试材料与实验仪器实验材料：植物样本：小麦叶片；小米培养基扩繁的假禾谷镰刀菌菌种；粗酶液提取所需工具：剪刀，塑封袋，研钵，研锤，生物冰袋，1mL塑料离心管，10mL塑料离心管；主要试剂：以下6种试剂盒均来自苏州科铭生物技术有限公司过氧化物酶（POD）试剂盒，货号（POD-2-Y）；过氧化氢酶（CAT）试剂盒，货号（CAT-2-Y）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，货号（SOD-2-Y）；多酚氧化酶（PPO）试剂盒，货号（PPO-2-Y）；苯丙氨酸解氨酶（PAL）试剂盒，货号（PAL-2-Y）；β-1，3葡聚糖酶（β-1，3-GA）试剂盒，货号（GA-1-Y）。仪器：紫外可见分光光度计，台式4℃离心机，1000μL可调式移液器，200μL可调式移液器，1mL石英比色皿，1mL玻璃比色皿。3.5.2纳米几丁质对小麦防御酶系活性的测定方法该试验探究了0.003%,w/v纳米几丁质水悬浮液对小麦中六种抗病相关酶过氧化物酶（POD），过氧化氢酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），多酚氧化酶（PPO），苯丙氨酸解氨酶（PAL）和β-1，3葡聚糖酶（β-1，3-GA）活性的影响。试验共设置4个处理组，空白对照组（去离子水），记作CK；0.003%,w/v纳米几丁质处理，记作NC；接种假禾谷镰刀菌作为阳性对照，记作F；同时接种假禾谷镰刀菌又施用0.003%,w/v纳米几丁质处理组，记作F-NC。无菌营养土装入营养钵中（营养钵高25cm，口径30cm），每钵播种18粒种子。于25℃/20℃，14小时光照，10小时黑暗，湿度60-70%的条件下，培养20天后对小麦进行处理。CK组和F组每钵浇施去离子水500ml，NC组和F-NC组每钵浇施0.003%,w/v纳米几丁质水悬浮液500ml，并且记录此时的时间为零点。8小时后分别在F组和F-NC组的盆钵中接种小米培养基扩繁的假禾谷镰刀菌菌种。均匀的撒施在盆钵土表面6g，再加盖一层无菌营养土防止菌种飘散。其他两组只加盖相同的一层无菌营养土。选取以零点为基准的0h，4h，8h，20h，24h，32h，44h，56h，68h共9个时间点分别取小麦叶片作为样本。23 我们一共进行了三次酶活性测定试验。上述为最后第三次试验，还有之前两次试验没有设置F-NC处理组，测定样本的时间点也稍有不同，第一次试验取样时间点为：2h，4h，8h，20h，24h，30h；第二次试验的取样时间点为0h，4h，6h，10h，12h，24h，30h，36h，60h，72h，96h，120h。其中过氧化氢酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD）前两次试验没有测量。该试验采取试剂盒测定法。所有测定前均需要将从各个处理采集的样本提取粗酶液待测。以下为样本粗酶液提取的详细步骤：小麦叶片属于组织样本，按照组织质量（g）计算，提取液体积为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液，本试验中所有酶活性的测定粗酶液提取均按此剂量），进行冰浴研磨成匀浆。之后8000g或10000g，4℃，离心10min，取上清，转置于1mL的塑料离心管中，做好标记，置于冰上待测。3.5.2.1小麦中POD活性的测定方法测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长至470nm，去离子水调零；2.测定前将试剂一，试剂二，试剂三在25℃放置10min以上；3.按照表5样本测定表加样，在1mL玻璃比色皿中按顺序加入试剂，立即混匀并计时，记录470nm下30s时吸光值A1和1min30s后的吸光值A2，计算△A=A2-A1。注意事项：1.若一次样本过多，可将试剂一、二、三和去离子水按比例配成混配液，在25℃放置10min以上，测定时加入15μL样本和1055μL混合液测定；2.如果△A小于0.005，可将反应时间延长到5min，如果△A小于0.5，可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应的稀释倍数（预实验测定测定数据在范围内）。POD活性计算公式：按样本鲜重计算，定义每g组织在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。POD(U/g鲜重)=△A×V反总÷൫W×V样÷V样总൯÷0.01÷T=71330×△A(11)式中：V反总：反应体系总体积，1.07mL；V样：加入样本体积，0.015mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；W：样本质量，0.1g。表5POD样品测定表Table5DeterminationofPODenzymeactivity试剂名称测定管（μL）样本15去离子水270试剂一520试剂二130试剂三1353.5.2.2小麦中CAT活性的测定方法测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm，去离子水调零；2.CAT24 检测工作液的配制；用时在每瓶试剂二（100μL）加入到试剂一，充分混匀作为工作液，用不完的试剂4℃保存一周；3.测定前将CAT检测工作液于25℃水浴10min；4.取1mLCAT检测液于1mL石英比色皿中，再加入35μL样本并计时，混匀，室温下立即测定240nm下的初始5s吸光值A1和1min5s后的吸光值A2，计算△A=A1-A2。CAT活性计算公式：按样本鲜重计算，定义每g组织每分钟催化1nmolH2O2降解定义为一个酶活力单位。9CAT(U/g鲜重)=△A×V反总÷(ε×d)×10൧÷൫W×V样÷V样总൯÷T=6780×△A(12)-3L；ε：H4式中：V反总：反应体系总体积，1.035*102O2摩尔消光系数4.36*10L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.035mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；W：样本质量，0.1g。3.5.2.3小麦中SOD活性的测定方法测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长至560nm，去离子水调零；2.将试剂三用去离子水稀释两倍，随用随配；3.测定前将试剂一，试剂二，试剂三在25℃放置5min以上；3.按照表6样本测定表加样，充分混匀，室温静置30min后，加入1mL玻璃比色皿560nm处测定各管吸光值A。注意事项：1.试剂三为酶，不可冷冻，使用时在冰上放置；2.对照管只需要做一管；3.若对照管吸光值大于2，建议将试剂三用去离子水稀释7倍后使用（预实验测定后该试验样本不需要稀释）。SOD活性计算公式：首先需要计算出一个抑制百分率，并记作R，计算公式如下：A对照管-A测定管抑制百分率（R）=×100%(13)A对照管尽量使样本的抑制率百分率在10-90%范围内，如果不在此范围，过高或过低要调整样本浓度重新测定（试验所有数据均在此范围）。SOD酶活力单位：在该黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD的酶活力定义为一个酶活力单位（U/mL）。以下为SOD酶活性计算公式：RSOD(U/g鲜重)=R÷(1-R)×V反总൧÷൫W×V样÷V样总൯×样品稀释倍数=114×1-R(14)式中：V反总：反应体系总体积，1.026mL；V样：加入样本体积，0.09mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，0.1g；稀释倍数，1。25 表6SOD样品测定表Table6DeterminationofSODenzymeactivity试剂名称测定管（μL）对照管（μL）试剂一240240试剂二510510试剂三66样本90--试剂四180180去离子水--903.5.2.4小麦中PPO活性的测定方法测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长至525nm，去离子水调零；2.按照表7样本测定表加样，25℃中准确水浴10min后，95℃水浴5min。3.充分混匀，10000g，25℃离心10min，取上清，525nm处检测测定管吸光值A1和对照管吸光值A2。△A=A1-A2。注意事项：1.每个测定管需要设一个对照管。可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行5min，95℃水浴处理。PPO活性计算公式：按样本鲜重计算，定义每分钟每g组织在每mL反应体系中使A525变化0.01为一个酶活力单位。PPO(U/g鲜重)=△A×V反总÷൫W×V样÷V样总൯÷0.01÷T=600×△A(15)式中：V反总：反应体系总体积，1.08mL；V样：加入样本体积，0.18mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；W：样本质量，0.1g。表7PPO样品测定表Table7DeterminationofPPOenzymeactivity试剂名称测定管（μL）对照管（μL）样本180--煮沸的样本--180试剂一720720试剂二180--去离子水--1803.5.2.5小麦中PAL活性的测定方法测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长至290nm，去离子水调零；2.按照表8样本测定表加样，充分混匀，静置10min后，290nm处检测测定管吸光值A1和对照管吸光值A2。△A=A1-A2。注意事项:对照管只需要一管。26 PAL活性计算公式：按样本鲜重计算，定义每g组织在每mL反应体系中每分钟使A290变化0.1为一个酶活力单位。PAL(U/g鲜重)=△A×V反总÷൫W×V样÷V样总൯÷0.1÷T=173×△A(16)式中：V反总：反应体系总体积，1.04mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；W：样本质量，0.1g。表8PAL样品测定表Table8DeterminationofPALenzymeactivity试剂名称测定管（μL）对照管（μL）样本20--试剂一780800试剂二200200混匀，30℃准确水浴30min试剂三40403.5.2.6小麦中β-1，3葡聚糖酶活性的测定方法测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，去离子水调零；2.按照表9样本测定表加样，充分混匀，95℃水浴5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，550nm处检测测定管吸光值A1和对照管吸光值A2。△A=A1-A2。表9β-1，3-GA样品测定表Table9Determinationofβ-1，3-GAenzymeactivity试剂名称测定管（μL）对照管（μL）样本100100去离子水--100试剂一100--混匀，37℃准确水浴60min试剂二600600注意事项:1.每个测定管均需要设定一个对照管。2.如果吸光值大于2，可以用去离子水稀释后测定，计算公式乘以相应的稀释倍数（该试验中均稀释3倍测量，n=3）。β-1，3-GA活性计算：首先我们需要标准条件下测定的回归方程（试剂盒提供），如下：y=0.0958*x-0.0192；式中x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。β-1，3-GA活性计算公式：按样本鲜重计算，定义每g组织在每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活力单位。β-1，3-GA(U/g鲜重)=(△A+0.0192)÷0.0958×V样൧÷൫W×V样÷V样总൯×n=104.38×(△A+0.0192)(17)式中；V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，0.1g；n；样本稀释倍数，3。27 4结果与分析4.1纳米几丁质的表征4.1.1纳米几丁质的浓度经过多次的试验结果表明，在实验室条件下用改良酸解法制备的纳米几丁质水悬浮液NCS浓度范围是0.2%-0.6%（w/v）。图6展示了浓度0.24%（w/v）和0.46%（w/v）的NCS。图6纳米几丁质水悬浮液Figure6NanochitinWhiskerSuspension（NCS）4.1.2纳米几丁质的粒度和Zeta电位通过MalvernNanosizer（Nano-ZS90）纳米粒度仪检测到纳米几丁质的平均有效粒径为126.0±1.8nm，平均多分散性指数为0.139±0.016（见表10和图7）。纳米几丁质水悬浮液的zeta电位为+50.4±9.81mV，导电率0.00993mS/cm（见图8）。表10纳米几丁质的粒度Table10Sizeofnanochitn重复平均粒平均多波峰1波峰2波峰3波峰1波峰2波峰3径分散性平均值平均值平均值（%）（%）（%）（nm）指数1124.50.135144.70.00.01000.00.02125.60.157151.131.140.099.50.50.03128.00.126146.80.00.01000.00.028 SizeDistributionbyIntensity15105Intensity(Percent)0110100100010000Size(d.nm)图7纳米几丁质的粒度检测Figure7ParticlesizedistributionofnanochitinZetaPotentialDistribution1200001000008000060000TotalCounts400002000000100200ApparentZetaPotential(mV)图8纳米几丁质的电位检测Figure8Zeta-potentialdistributionofnanochitin4.1.3TEM检测通过透射电镜TEM多次检测样品液得到单个纳米几丁质的平均有效粒径为50-150nm长，宽度为15-30nm。图9展示了纳米几丁质在扫描电镜下放大80000倍的形态。图9纳米几丁质TEM检测（标尺200nm）Figure9TEMofnanochitinwhisker（Bar-200nm）29 4.2纳米几丁质对病原真菌室内抑菌活性测定4.2.1菌丝生长抑制率4.2.1.1NCS对F.pseudograminearum&F.graminearum菌丝生长的影响图10可见0.03%，0.003%，0.001%，0.0003%（w/v）NCS对F.pseudograminearum的菌丝生长抑制率分别为34.83%，27.53%，19.10%,6.42%。0.03%，0.003%，0.001%，0.0003%（w/v）NCS对F.graminearum的菌丝生长抑制率分别为30.47%，28.91%，26.56%,6.18%。0.03%，0.003%，0.01%，0.0003%（w/v）四个浓度的纳米几丁质水悬浮液对F.pseudograminearum和F.graminearum的菌丝生长均有明显的抑制作用，且经数据分析得到不同浓度处理间显有著性差别（p<0.05）。60F.pseudograminearumF.graminearum50(%)40abbcbcc30d2010ee菌丝生长抑制率00.03%0.003%0.001%0.0003%不同浓度的NCS处理组图10NCS对F.pseudograminearum&F.graminearum菌丝生长的影响Figure10TheeffectsofvariousNCSonmyceliumgrowthofF.pseudograminearum&F.graminearum4.2.1.2NCS对P.capsici，C.capsici，R.solani3种菌丝生长的影响表11统计了六种浓度梯度0.00005%，0.0001%，0.0005%，0.001%，0.002%，0.006%（w/v）纳米几丁质水悬浮液对辣椒疫霉菌，辣椒炭疽菌和小麦立枯丝核菌的菌丝生长的抑制作用。0.0001%-0.002%w/v不同浓度的纳米几丁质对辣椒疫霉病菌没有明显的抑制作用，不同浓度处理间也没有显著性差异。0.00005%-0.006%w/v不同浓度的纳米几丁质对辣椒炭疽病菌的菌丝生长抑制率大约在5%-10%，各处理抑制率也没有显著性差异。0.00005%w/v纳米几丁质对小麦立枯丝核菌菌丝生长抑制率大约是4%；0.0001%-0.006%w/v不同浓度的纳米几丁质对小麦立枯丝核菌菌丝生长抑制率大约在8%-11%，不同浓度处理间也没有显著性差异。综上所述，六种浓度梯度0.00005%，0.0001%，0.0005%，0.001%，0.002%，0.006%纳米几丁质水悬浮液对辣椒疫霉菌，辣椒炭疽菌和小麦立枯丝核菌的菌丝生长均有一定的抑制作用。30 表11NCS对3种病原真菌菌丝生长的影响Table11InvitroinhibitionofvariousconcentrationsofNCSonmyceliumgrowthofplantpathogenicfungus处理组/抑制率（%）P.capsiciC.capsiciR.solaniNCS-0.00005%/7±1.53bAB4±1.86cBNCS-0.0001%4±0.53aA5±1.26bB11±1.13aANCS-0.0005%1±0.09aA6±0.58bAB9±0.97abANCS-0.001%2±0.12aA7±1.00bAB9±1.61abANCS-0.002%4±1.61aA10±0.00aA8±1.28bABNCS-0.006%/6±1.53bB10±2.28abA4.2.2纳米几丁质对F.pseudograminearum,F.graminearum分生孢子产量的抑制率在4.2.1.1中我们得到了0.03%，0.003%，0.001%（m/V,g/mL）NCS对F.pseudograminearum和F.graminearum菌丝生长的影响。该试验我们检测同样三种浓度0.03%，0.003%，0.001%（m/V,g/mL）NCS对F.pseudograminearum和F.graminearum分生孢子产生的影响。咯菌腈(25mg/L)的200倍稀释液作为阳性对照，对两种菌的分生孢子抑制率均为100%。图11可见不同浓度的纳米几丁质对分生孢子产生有明显的抑制作用，且浓度越高抑制作用越明显。0.03%，0.003%，0.001%NCS对F.pseudograminearum分生孢子抑制率分别为89.25%，74.19%，51.61%，各处理间存在极显著性差异（p<0.01）。0.03%，0.003%，0.001%NCS对F.graminearum的分生孢子抑制率分别为82.28%，74.68%，26.58%。其中0.03%NCS，0.003%NCS处理组抑制率无显著性差异，与0.001%NCS组有显著性差异。由此可见，处理组0.003%NCS，在培养基中实际浓度为0.0003%，对F.pseudograminearum和F.graminearum的分生孢子的产生均表现明显的抑制作用，且纳米几丁质用量少，这也与之前的研究相吻合[104]。低剂量效应可以使我们使用较低剂量的药剂，依然可以达到较高防效。120F.pseudograminearumF.graminearum100abcc8060d40e分生孢子抑制率(%)2000.03%0.003%0.001%不同浓度的NCS处理组图11NCS对F.graminearum&F.pseudograminearum分生孢子产生量的影响Figure11TheeffectsofvariousconcentrationsofNCSonconidiumofF.graminearum&F.pseudograminearum31 4.2.3纳米几丁质与化学杀菌剂对小麦全蚀病病菌离体活性的协同效应该试验检测了纳米几丁质与化学杀菌剂对小麦全蚀病病菌离体活性的协同效应，测定了高中低3种浓度的纳米几丁质0.03%，0.003%，0.0003%NCS单独处理G.graminisvar.tritici，还有咯菌腈，硅噻菌胺两种常用化学杀菌剂的稀释液单独处理G.graminisvar.tritici的作用效果，以及两者1:1复配使用的作用效果。各个处理组药剂对G.graminisvar.tritici菌丝生长抑制率如图12所示。70G.graminisvar.tritici60a%）50（40bbc30bccdcddcdcd20e10e菌丝生长抑制率effef0(10)纳米几丁质及处理组图12NCS，咯菌腈，硅噻菌胺对小麦全蚀菌菌丝生长的影响1；纳米几丁质水悬浮液（0.0003%，0.003%，0.03%，w/v培养基中终浓度）分别标记为N1，N2和N3，咯菌腈（25mg/L）用去离子水稀释8000倍液，4000倍液和2000倍液（培养基中终浓度）分别标记为F1，F2，F3，硅噻菌胺（125mg/L）用去离子水稀释8000倍液，4000倍液（培养基中终浓度）分别标记为S1，S2；纳米几丁质水悬浮液N1，N2，N3分别与这五组化学杀菌剂按照体积比1:1混合均匀，并标记为对应字母结合。Figure12EffectsofNCS，fludioxonil，silthiophamonmyceliumgrowthofG.graminisvar.tritici1.Threeaqueoussuspensionsof(0.003,0.03,0.3,w/v)ofnanochitinweremarkedrespectivelyasN1,N2,N3.ControlwasDIwater.TwochemicalfungicidesFludioxonil(diluted8000,4000,2000timesinmedium)andSilthiopham(diluted8000,4000timesinmedium)weremarkedrespectivelyasF1,F2,F3,S1,S2.RatiosofVariousmixtureswereall1:1,whichweremarkedasN1-F1,N3-F1,N3-F3,N1-S1,N3-S1.WetesttheinhibitionrateofabovetreatmentsonGaeumannomycesgraminisvar.triticionpetridishes.为了更直观的看出纳米几丁质单独使用以及对化学杀菌剂的复配作用，选出其中部分处理组进行对比，如图13所示。结果可见N1（0.0003%NCS）对G.graminisvar.tritici有相对较好的抑制效果，抑制率大约为22.10%。且根据数据分析可得N1的抑制率与其他两种化学杀菌剂F1（咯菌腈8000倍液）和S1（硅噻菌胺8000倍液）对G.graminisvar.tritici的抑制率无显著性差异，及三者的防效相当。此外，复配处理组N1-F1和N1-S1对比单独使用化学药剂F1与S1处理组，显示出了纳米几丁质水悬浮液对化学杀菌剂具有良好的协同效应。F1、N1-F1、S1、N1-S1的抑制率分别为20.99%、21.55%、26.52%、20.44%。虽然化学杀菌剂的用量在与纳米几丁质悬浮液混合后下降了一半，但N1-F1复配处理组与F1，32 N1-S1复配处理组与S1的抑制率相当，没有显著性差异（p<0.05）。40G.graminisvar.tritici35a30bbbb(%)25201510c5d0(5)菌丝生长抑制率纳米几丁质及复配处理组图13NCS，咯菌腈，硅噻菌胺对小麦全蚀菌菌丝生长的影响2；同图12Figure13EffectsofNCS，fludioxonil，silthiophamonmyceliumgrowthofG.graminisvar.tritici2;sameasfigure124.3纳米几丁质对小麦生理指标影响4.3.1纳米几丁质对小麦株高和干重影响的测定表12NCS和戊唑醇对小麦苗期生长发育的协同作用Table12SynergisticeffectsofNCS，andmixturewithtebuconazoleonwheatseedlingsgrowth.处理组*株高/cm干重/gCK16.47±1.43cde**0.09±0.01defghiB114.74±0.06def0.16±0.00aB214.38±1.32efg0.10±0.04cdefgB314.11±0.95fg0.11±0.01bcdefB417.84±2.61bc0.13±0.03abcdA112.06±0.10g0.05±0.00iA212.27±0.64g0.06±0.01hiA314.87±0.48def0.09±0.02defghiA1B112.29±0.34g0.08±0.01efghiA1B213.36±2.31fg0.14±0.05abcA1B312.91±0.62fg0.14±0.01abA1B413.93±1.43fg0.09±0.03defghA2B114.39±0.94efg0.10±0.02defgA2B213.65±1.18fg0.09±0.03defghiA2B312.19±0.29g0.12±0.02abcdeA2B416.92±0.47bcd0.09±0.02defghiA3B112.51±0.61fg0.12±0.01abcdeA3B218.98±0.97ab0.06±0.01ghiA3B320.87±2.35a0.07±0.01fghiA3B417.49±0.82bc0.09±0.02defghi*纳米几丁质水悬浮液NCS（0.001%，0.003%，0.009%，0.018%，w/v）分别为不同浓度的纳米几丁质，33 单独处理种子，分别记作B1，B2，B3，B4。戊唑醇（60mg/L）作为阳性对照，也作为复配使用的化学杀菌剂，设置3个药种比1:1000，1:1500，1:2000ml/g种子，分别记作A1，A2，A3。4个不同浓度的纳米几丁质水悬浮液分别与3个浓度的药剂复配后拌种，分别对应记作AnBm。**值以三次重复的均值±标准差标注，显著差异性（p<0.05）以小写字母标注。*FoursuspensionsofNCs(0.001,0.003,0.009,0.018%,w/v)weremarkedasB1,B2,B3,B4,respectively.Threeseeddressingratiosoftebuconazole(1:1000,1:1500,1:2000,dosage/seed,mL/g)weremarkedrespectivelyasA1,A2,A3.AnBmrepresentsthemixtureofNCsandtebuconazole.DIwaterservedasacontrol.Eachtreatmentwascarriedoutintriplicate.**Valuesrepresentmean±S.D.oftriplicatemeasurementsfromoneofthreeindependentexperiments,significantdifferencesmarkedwithlowercaseletter(p<0.05).该试验测定了4个不同浓度0.001%，0.003%，0.009%，0.018%（w/v）NCS，3个比例戊唑醇拌种处理，以及用各浓度纳米几丁质代替去离子水作溶剂与戊唑醇混合拌种的12个处理，对小麦种子进行拌种处理后播种，播种到0.75%假禾谷镰刀菌菌土中生长20天，记录其对小麦株高和干重，结果见表12。分析NCS和戊唑醇对小麦苗期生长发育的协同作用，各组对比详见以下各表13，14，15和图14，15。表13，图14展示了不同浓度NCS对小麦苗期株高和干重的影响。根据表13可见，B4组0.018%w/vNCS的小麦株高高于其他三组纳米几丁质处理，与空白对照组没有显著性差异。所以纳米几丁质单独处理小麦种子，对小麦株高生长没有明显影响。根据表格可见B1，B3，B4组，即0.001%，0.009%，0.018%w/vNCS处理的小麦干物质量要高于空白对照组和B2组（0.003%,w/vNCS）。表13不同浓度NCS对小麦苗期生长发育的影响Table13EffectsofdifferentconcentrationofNCS（B1，B2，B3，B4）ongrowthofwheatseedlings.处理组*株高/cm干重/gCK16.47±1.43ab**0.09±0.01bB114.74±0.06b0.16±0.00aB214.38±1.32b0.10±0.04bB314.11±0.95b0.11±0.01abB417.84±2.61a0.13±0.03ab*纳米几丁质水悬浮液NCS（0.001%，0.003%，0.009%，0.018%，w/v）分别为不同浓度的纳米几丁质，单独处理种子，分别记作B1，B2，B3，B4。**值以三次重复的均值±标准差标注，显著差异性（p<0.05）以小写字母标注。*FoursuspensionsofNCs(0.001,0.003,0.009,0.018%,w/v)weremarkedasB1,B2,B3,B4,respectively.**Valuesrepresentmean±S.D.oftriplicatemeasurementsfromoneofthreeindependentexperiments,significantdifferencesmarkedwithlowercaseletter(p<0.05).34 图14不同浓度NCS对小麦苗期生长发育的影响Figure14EffectsofdifferentconcentrationofNCS（B1，B2，B3，B4）ongrowthofwheatseedlings.表14，图15展示了戊唑醇1:1500药种比拌种处理，以及其与不同浓度NCS复配使用对小麦苗期株高和干重的影响。根据表14可见，A2B3组0.009%(w/v)NCS混配处理的小麦株高与A2处理相当，不过其株干重与A2组具有显著性差异，大约是A2处理的两倍。而且从图15直观来看，A2B1，A2B2，A2B3组，即0.001%，0.003%，0.009%w/vNCS混配处理的小麦以综合来看，相比与A2对照来看，纳米几丁复配处理的小麦苗茎秆粗壮叶片浓绿，更加健壮，而A2对照叶片枝叶稍显细弱，叶片有些黄绿。表14戊唑醇（1:1500）与不同浓度NCS对小麦苗期生长发育的协同作用（不跨页）Table14Synergisticeffectsoftebuconazole（A2）withNCSonwheatseedlingsgrowth.处理组*株高/cm干重/gCK16.47±1.43a**0.09±0.01abA212.27±0.64c0.06±0.01bA2B114.39±0.94b0.10±0.02aA2B213.65±1.18bc0.09±0.03abA2B312.19±0.29c0.12±0.02aA2B416.92±0.47a0.09±0.02ab*纳米几丁质水悬浮液NCS（0.001%，0.003%，0.009%，0.018%，w/v）分别为不同浓度的纳米几丁质，单独处理种子，分别记作B1，B2，B3，B4。戊唑醇（60mg/L）作为阳性对照，也作为复配使用的化学杀菌剂，设置1个药种比1:1500ml/g种子，记作A2。4个不同浓度的纳米几丁质水悬浮液与药剂复配后拌种，分别对应记作A2Bm。**值以三次重复的均值±标准差标注，显著差异性（p<0.05）以小写字母标注。*FoursuspensionsofNCs(0.001,0.003,0.009,0.018%,w/v)weremarkedasB1,B2,B3,B4,respectively.Oneseeddressingratiooftebuconazole(1:1500,dosage/seed,mL/g)weremarkedrespectivelyasA2.A2BmrepresentsthemixtureofNCsandtebuconazole.DIwaterservedasacontrol.Eachtreatmentwascarriedoutintriplicate.**Valuesrepresentmean±S.D.oftriplicatemeasurementsfromoneofthreeindependentexperiments,significantdifferencesmarkedwithlowercaseletter(p<0.05).35 表14可见，A2B4处理组的小麦植株，明显高于其他组包括A2组和空白对照组，但是其干重与A2组相当没有显著性差异，图15可见A2B4处理组显著高于其他各个处理，但是小麦枝叶纤细泛黄，没有其他几组小麦综合生长状态好。图15戊唑醇（1:1500）与不同浓度NCS对小麦苗期生长发育的协同作用Figure15Synergisticeffectsoftebuconazole（A2）withNCSonwheatseedlingsgrowth.表12和表15展示了戊唑醇1:1000和1:2000药种比拌种处理，以及其与不同浓度NCS复配使用对小麦苗期株高和干重的影响。表12中可见，A1组各浓度纳米几丁质与戊唑醇1:1000复配处理只显示出比单独戊唑醇1:1000植株增高生长。表15可见，A3B1组处理的小麦苗的株高要显著低于A3组株高，而A3B1组的株干重却显著高于A3组，显示出矮状的效果。A3B2，A3B3，A3B4三个复配处理组，株高明显高于其他各组包括A3组，但株干重与A3组小麦相当，没有显著性差异，因此这三组小麦苗相对纤细瘦弱表15戊唑醇（1:2000）与不同浓度NCS对小麦苗期生长发育的协同作用Table15Synergisticeffectsoftebuconazole（A3）withNCSonwheatseedlingsgrowth.处理组*株高/cm干重/gCK16.47±1.43cd**0.09±0.01bA314.87±0.48d0.09±0.02bcA3B112.51±0.61e0.12±0.01aA3B218.98±0.97ab0.06±0.01cA3B320.87±2.35a0.07±0.01bcA3B417.49±0.82bc0.09±0.02bc*纳米几丁质水悬浮液NCS（0.001%，0.003%，0.009%，0.018%，w/v）分别为不同浓度的纳米几丁质，单独处理种子，分别记作B1，B2，B3，B4。戊唑醇（60mg/L）作为阳性对照，也作为复配使用的化学杀菌剂，设置1个药种比1:2000ml/g种子，记作A3。4个不同浓度的纳米几丁质水悬浮液与药剂复配后拌种，分别对应记作A3Bm。**值以三次重复的均值±标准差标注，显著差异性（p<0.05）以小写字母标注。*FoursuspensionsofNCs(0.001,0.003,0.009,0.018%,w/v)weremarkedasB1,B2,B3,B4,respectively.Oneseeddressingratiooftebuconazole(1:2000,dosage/seed,mL/g)weremarkedrespectivelyasA3.A3BmrepresentsthemixtureofNCsandtebuconazole.DIwaterservedasacontrol.Eachtreatmentwascarriedoutintriplicate.**Valuesrepresentmean±S.D.oftriplicatemeasurementsfromoneofthreeindependentexperiments,significantdifferencesmarkedwithlowercaseletter(p<0.05).36 4.3.2纳米几丁质对小麦叶绿素影响的测定表16中展示了0.001%，0.003%，0.009%，0.0018w/vNCS以种衣剂的方式单独处理小麦种子，和四个浓度NCS与戊唑醇（1:1500）复配处理小麦种子后对小麦苗期叶片中叶绿素含量的影响。各组处理中，小麦叶片叶绿素a含量最高的两组是B2组，即0.003%w/v纳米几丁质水悬浮液处理组，Chlorophylla和Chlorophyllb以及总叶绿素含量分别为：1.879，0.682，2.562mg/g，其次是B3组（0.009%,w/vNCS），Chlorophylla和Chlorophyllb以及总叶绿素含量，分别为：1.631，0.604，2.235mg/g。B2，B3两处理组的Chlorophylla和Chlorophyllb以及总叶绿素含量均明显高于空白对照组，且与CK具有极显著差异。B1组（0.001%,w/vNCS）小麦叶片叶绿素含量与空白对照组相当，没有显著性差异。B4组（0.0018%w/vNCS）小麦叶片中Chlorophylla和Chlorophyllb以及总叶绿素含量分别为：1.093，0.483，1.576mg/g，显著低于空白对照组，也是所有处理组中最低值或倒数第二低值。表16纳米几丁质对小麦叶片叶绿素含量的影响Table16EffectsofnanochitinoncontentofChlorophyllaandbinwheatseedlings处理组*Chlorophylla/（mg/g）Chlorophyllb/（mg/g）Chlorophylla&b/（mg/g）CK1.593±0.002fE**0.605±0.004eE2.197±0.006eEB11.599±0.001fE0.551±0.002fF2.150±0.003fFB21.879±0.001aA0.682±0.001aA2.562±0.002aAB31.631±0.001eD0.604±0.001eE2.235±0.002dDB41.093±0.002hG0.483±0.003gG1.576±0.005iIA21.483±0.002gF0.481±0.001gG1.964±0.002gGA2B11.860±0.008bB0.629±0.004dD2.489±0.003bBA2B21.850±0.013cB0.645±0.004cC2.494±0.009bBA2B31.794±0.001dC0.666±0.002bB2.460±0.003cCA2B41.489±0.002gF0.458±0.004hH1.948±0.006hH*纳米几丁质水悬浮液NCS（0.001%，0.003%，0.009%，0.018%，w/v）分别为不同浓度的纳米几丁质，单独处理种子，分别记作B1，B2，B3，B4。戊唑醇（60mg/L）作为阳性对照，也作为复配使用的化学杀菌剂，设置1个药种比1:1500ml/g种子，记作A2。4个不同浓度的纳米几丁质水悬浮液与药剂复配后拌种，分别对应记作A2Bm。**值以三次重复的均值±标准差标注，显著差异性（p<0.05，p<0.01）分别以小写字母，大写字母标注。*FoursuspensionsofNCs(0.001,0.003,0.009,0.018%,w/v)weremarkedasB1,B2,B3,B4,respectively.Threeseeddressingratiosoftebuconazole(1:1000,1:1500,1:2000,dosage/seed,mL/g)weremarkedrespectivelyasA1,A2,A3.AnBmrepresentsthemixtureofNCsandtebuconazole.DIwaterservedasacontrol.Eachtreatmentwascarriedoutintriplicate.**Valuesrepresentmean±S.D.oftriplicatemeasurementsfromoneofthreeindependentexperiments,significantdifferencesmarkedwithlowercaseletteranduppercaseletter(p<0.05，p<0.01).再看各纳米几丁质与化学药剂复配处理组对小麦叶片中叶绿素含量的影响。A2处理组（戊唑醇1:1500拌种处理组）Chlorophylla和Chlorophyllb以及总叶绿素含量分别为：1.483，0.481，1.964mg/g，与B4处理组相当水平或稍高。然而化学杀菌剂与纳米几丁质水37 悬浮液进行复配后处理种子，A2B1，A2B2，A2B3处理组分别叶绿素含量明显增加，这三组处理处于B2组和B3组之间，且对Chlorophylla和Chlorophyllb的含量，3个复配处理组之间互相差异显著。各组间Chlorophylla和Chlorophyllb的含量高低水平稍有差异，总体基本一致。A2B4处理组（0.0018%w/vNCS），对于Chlorophylla含量与A2相当，对于Chlorophyllb和叶绿素总量，其比A2组要更低一差异水平。综上所述，0.001%，0.003%，0.009%(w/v)纳米几丁质水悬浮液以种衣剂的方式单独处理小麦种子和与杀菌剂复配使用，均可以显著提高小麦苗期叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量；而0.0018%w/v纳米几丁质水悬浮液则相反的明显降低了小麦苗期叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量。这可能与纳米材料的低剂量效应有关。4.4纳米几丁质与化学杀菌剂协同作用4.4.1纳米几丁质作拌种剂-温室试验对防治小麦茎基腐病的协同效应表17纳米几丁质作拌种剂与戊唑醇复配对防治小麦茎基腐病的协同作用Table17SynergisticeffectsofNCSasseedcoatingwithtebuconazoleoninhibitionofwheatcrownrot.处理组*病情指数防病效果（%）CK75.31±2.14-A134.57±2.1454.10±2.84a**A246.91±2.1437.70±2.84cA356.79±2.1424.59±2.84dB157.41±1.8523.77±2.46dB258.02±2.1422.95±2.84dB357.41±1.8523.77±2.46dB470.37±0.006.56±0.00eA2BI43.21±2.1442.62±2.84bcA2B242.47±1.8643.61±2.48bcA2B339.51±4.2847.54±5.68abA2B438.27±5.6649.18±7.51abA3BI35.80±2.1452.46±2.84aA3B238.27±4.2849.18±5.68abA3B343.21±2.1442.62±2.84bcA3B439.51±2.1447.54±2.84ab*纳米几丁质水悬浮液NCS（0.001%，0.003%，0.009%，0.018%，w/v）分别为不同浓度的纳米几丁质，单独处理种子，分别记作B1，B2，B3，B4。戊唑醇（60mg/L）作为阳性对照，也作为复配使用的化学杀菌剂，设置3个药种比1:1000，1:1500，1:2000ml/g种子，分别记作A1，A2，A3。4个不同浓度的纳米几丁质水悬浮液分别与3个浓度的药剂复配后拌种，分别对应记作AnBm。**值以三次重复的均值±标准差标注，显著差异性（p<0.05）以小写字母标注。*FoursuspensionsofNCs(0.001,0.003,0.009,0.018%,w/v)weremarkedasB1,B2,B3,B4,respectively.Threeseeddressingratiosoftebuconazole(1:1000,1:1500,1:2000,dosage/seed,mL/g)weremarkedrespectivelyasA1,A2,A3.AnBmrepresentsthemixtureofNCsandtebuconazole.DIwaterservedasacontrol.Eachtreatmentwascarriedoutintriplicate.**Valuesrepresentmean±S.D.oftriplicatemeasurementsfromoneofthreeindependentexperiments,significantdifferencesmarkedwithlowercaseletter(p<0.05).38 由表17可见，B1，B2，B3，即0.001%，0.003%，0.009%w/vNCS，单独处理对小麦茎基腐病的防治效果分别为23.77%，22.95%，23.77%，此防病效果与化学药剂戊唑醇1:2000拌种处理A3组的防效24.59%相当，且没有显著性差异。而B4组（0.018%w/vNCS）防病效果相对较差，只有6.56%，显著低于其他各药剂。同时纳米几丁质与化学药剂戊唑醇复配对防治小麦茎基腐病显示出协同效应。A2B3，A2B4处理组对小麦茎基腐病的防治效果分别为47.54%，49.18%，显著高于单独A2组防效37.70%（p<0.05），A3B1，A3B2，A3B3，A3B4处理组对小麦茎基腐病的防治效果分别为52.46%，49.18%，42.62%，47.54%，加纳米几丁质的复配处理组的防效均显著高于单独A3组防效24.59%（p<0.05）。综上所述，纳米几丁质作为拌种剂来与戊唑醇复配对防治小麦茎基腐病显示出较好的协同效应。4.4.2纳米几丁质喷施-温室试验对防治小麦茎基腐病的防病效果纳米几丁质也可作为喷雾处理小麦幼苗，试验中检测了不同浓度纳米几丁质喷施小麦对小麦茎基腐病的防治效果，而且每个浓度分别测定了喷施纳米几丁质1次和喷施3次的处理，P-组均为喷施三次。由表18可见，P-NCS-0.0025%，P-NCS-0.005%，NCS-0.0025%，NCS-0.001%各处理组对小麦茎基腐病具有较好的防病效果，分别为39.71%，26.47%，24.64%，24.64%。而且试验发现，P-组同浓度纳米几丁质喷雾处理3次比喷雾处理1次效果更好，可对比P-NCS-0.0025%与NCS-0.0025%，P-NCS-0.005%与NCS-0.005%得到。表18纳米几丁质作喷雾与戊唑醇复配对防治小麦茎基腐病的防病效果Table18EffectsofNCSasspayingagentoninhibitionofwheatcrownrot处理组*病情指数防病效果（%）CK63.89±4.81--NCS-0.001%46.29±1.6127.54±2.51c**NCS-0.0025%48.15±1.6124.64±2.51cNCS-0.005%59.26±3.207.25±5.02efNCS-0.01%56.48±1.6011.59±2.51deP-Control62.96±4.25--P-NCS-0.001%52.78±5.5616.18±8.83dP-NCS-0.0025%37.96±1.6139.71±2.55bP-NCS-0.005%46.30±4.2426.47±6.74cP-NCS-0.01%52.78±2.7816.18±4.42dF32.41±4.4649.27±6.99a*纳米几丁质水悬浮液NCS（0.001%，0.0025%，0.005%，0.01%，w/v）4个不同浓度分别记作NCS-0.001%,NCS-0.0025%,NCS-0.005%,NCS-0.01%；咯菌腈（25mg/L，药种比1:1000）作为药剂对照，记作F。设计了1次喷雾处理和3次喷雾处理（标记为P-组），两组分别设置单独的空白对照（去离子水对照），记为CK，P-CK。**值以三次重复的均值±标准差标注，显著差异性（p<0.05）以小写字母标注。*Fouraqueoussuspensionsof(0.001,0.0025,0.005,0.01%,w/v)ofnanochitinweremarkedrespectivelyasNC0.001%,NC0.0025%,NC0.005%,NC0.01%P-ControlisDIWaterasthecontrolofPgroup(3timesspaying);ControlisDIWaterasthecontrolofanothergroup(onetimespaying);F:chemicalfungicidesFludioxonil:1:1500(dosage/seed,mL/g)of25mg/LFludioxonilbySyngentaCompany;**Valuesrepresentmean±S.D.oftriplicatemeasurementsfromoneofthreeindependentexperiments,significantdifferencesmarkedwithlowercaseletter(p<0.05).39 4.5纳米几丁质对小麦几种防御酶系活性的影响4.5.1纳米几丁质对小麦叶片中POD活性的影响图16分别是检测纳米几丁质对小麦叶中POD酶活性影响的实验。记录了0.003%NCS处理，F.pseudograminearum接种处理以及去离子水空白对照3个处理组小麦叶片中POD酶活性随时间变化表。3个图表均可看到，接种F组的POD酶活性会在8小时左右显著上升，并保持高活性，而0.003%NCS处理并没有显著提高POD酶活性，相反比CK还有所下降。图16纳米几丁质对小麦叶中POD酶活性影响Figure16EffectsofNCSonPODactivityofwheat4.5.2纳米几丁质对小麦叶片中CAT活性的影响图17记录了0.003%NCS处理，F.pseudograminearum接种处理，0.003%NCS加F.pseudograminearum接种处理以及去离子水空白对照4个处理组小麦叶片中CAT酶活性随时间变化趋势。接种处理后0-30小时内，CK组，F组，F-NC组CAT酶活性相当且都大于NC组；30-72小时，CK组CAT酶活性高于其他各组。CK1,600F1,400NC）1,200F-NC鲜重1,000800(U/g600活性400CAT200001020304050607080取样时间/h图17纳米几丁质对小麦叶中CAT酶活性影响Figure17EffectsofNCSonCATactivityofwheat40 4.5.3纳米几丁质对小麦叶片中SOD活性的影响图19记录了0.003%NCS处理，F.pseudograminearum接种处理，0.003%NCS加F.pseudograminearum接种处理以及去离子水空白对照4个处理组小麦叶片中SOD酶活性随时间变化趋势。接种处理后24-68小时，F组，0.003%NCS组的SOD酶活性显著高于其他两组。CK270F240NC210）F-NC180鲜重150U/g120（90活性60SOD30001020304050607080取样时间/h图18纳米几丁质对小麦叶中SOD酶活性影响Figure18EffectsofNCSonSODactivityofwheat4.5.4纳米几丁质对小麦叶片中PPO活性的影响CK80F70NC60F-NC)50鲜重40/(U/g30活性20PPO10001020304050607080取样时间/h图19纳米几丁质对小麦叶中PPO酶活性影响Figure19EffectsofNCSonPPOactivityofwheat图19是检测纳米几丁质对小麦叶中PPO酶活性影响的3次实验。记录了0.003%NCS处41 理，F.pseudograminearum接种处理，0.003%NCS加F.pseudograminearum接种处理以及去离子水空白对照4个处理组小麦叶片中PPO酶活性随时间变化表。图19可见24小时后0.003%NCS的PPO酶活性逐渐升高，高于CK组，并保持高活性到56小时；F-NC组在32-68小时期间PPO酶活性较高。4.5.5纳米几丁质对小麦叶片中PAL活性的影响图20是检测纳米几丁质对小麦叶中PAL酶活性影响实验。记录了0.003%NCS处理，F.pseudograminearum接种处理以及去离子水空白对照3个处理组小麦叶片中PAL酶活性随时间变化表。图20处理后4-24小时内F组，0.003%NCS组的PAL酶活性显著高于空白对照CK组。图20纳米几丁质对小麦叶中PAL酶活性影响Figure20EffectsofNCSonPALactivityofwheat4.5.6纳米几丁质对小麦叶片中β-1，3葡聚糖酶活性的影响CK390F)360NC鲜重330F-NC300/(mg/h/g270活性240210-1,3-GA180β01020304050607080取样时间/h图21纳米几丁质对小麦叶中β-1，3-葡聚糖酶活性影响1；同图16Figure21EffectsofNCSonβ-1，3-GAactivityofwheat1图21是检测纳米几丁质对小麦叶中β-1，3-GA酶活性影响实验。记录了0.003%NCS处理，F.pseudograminearum接种处理，0.003%NCS加F.pseudograminearum接种处理以及去离子水空白对照4个处理组小麦叶片中β-1,3-GA酶活性随时间变化表。由以上图看不出四组或者三组处理间的变化趋势。42 5结论与讨论5.1结论本研究以小麦为模式植物，探索了一种新型生物纳米材料⎯纳米几丁质对小麦真菌病害抑制作用及其机理的初步分析，具体包括：纳米几丁质水悬浮液的实验室合成与表征；纳米几丁质水悬浮液对6种植物病原真菌的室内毒理测定；纳米几丁质与杀菌剂复配使用对小麦苗期株高，干重，以及叶片中叶绿素含量的影响；纳米几丁质和常用杀菌剂抗小麦茎基腐病的协同增效作用；纳米几丁质对小麦叶片中防御酶影响。以期为纳米几丁质在农业上的应用奠定基础。主要结果如下：⑴本研究对酸解法进行了一系列的优化和探索后得到了一种制备纳米几丁质的实用方法，可制得粒度均一、结构稳定、生物活性显著的纳米几丁质晶体水悬浮液。以α-几丁质为原料，采用酸解法制备纳米几丁质，适合于纳米几丁质类新农药的开发，此法操作方便，成本低，制备出的纳米颗粒粒径小且均一，利于大规模工业化生产。⑵纳米几丁质水悬浮液对6种植物病原真菌的室内毒理测定得到：0.03%，0.003%，0.001%（w/v）浓度的纳米几丁质水悬浮液对F.pseudograminearum和F.graminearum的菌丝生长均有明显的抑制作用；六种浓度梯度0.00005%，0.0001%，0.0005%，0.001%，0.002%，0.006%(w/v)纳米几丁质水悬浮液对辣椒疫霉菌，辣椒炭疽菌和小麦立枯丝核菌的菌丝生长均有一定的抑制作用，不同浓度的处理间抑制率无显著性差异；0.03%，0.003%，0.001%（w/v）浓度的纳米几丁质水悬浮液对F.pseudograminearum和F.graminearum的分生孢子产量有明显的抑制作用；纳米几丁质（0.0003%NCS）对G.graminisvar.tritici有相对较好的抑制效果，抑制率大约为22.10%。纳米几丁质与咯菌腈对小麦全蚀病病菌离体活性的具有协同效应，可以在维持药效的基础上使药剂的使用量减半。⑶关于纳米几丁质对小麦幼苗生理活性影响，综合来看：纳米几丁质单独处理小麦种子，对小麦株高生长没有明显影响；0.001%，0.009%，0.018%(w/v)NCS单独处理的小麦干物质量显著高于空白对照组和B2组（0.003%NCS）；NCS复配处理中，A1组各浓度纳米几丁质与戊唑醇1:1000复配处理只显示出比单独戊唑醇1:1000植株增高生长。0.001%，0.003%，0.009%，w/v，NCS与戊唑醇A2的混配处理的小麦以综合来看，相比与A2对照来看，纳米几丁复配处理的小麦苗茎秆粗壮叶片浓绿，更加健壮，而A2对照叶片枝叶稍显细弱，叶片有些黄绿。A2B4处理组显著高于其他各个处理，但是小麦枝叶纤细泛黄，没有其他几组小麦综合生长状态好。A3B1处理的小麦苗也显示出矮状的效果；0.003%，0.009%w/vNCS单独处理的小麦理组的Chlorophylla和Chlorophyllb以及总叶绿素含量均明显高于空白对照组，且与CK具有极显著差异；43 0.001%，0.003%，0.009%w/v纳米几丁质水悬浮液以种衣剂的方式与戊唑醇A2复配使用，均可以显著提高小麦苗期叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量；而0.0018%w/v纳米几丁质水悬浮液则相反的明显降低了小麦苗期叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量。⑷NCS与化学杀菌剂抗小麦茎基腐病的协同增效作用:不管是作为拌种剂还是喷雾处理，纳米几丁质与戊唑醇复配对防治小麦茎基腐病显示出较好的协同效应；0.001%，0.003%，0.009%w/vNCS，单独处理对小麦茎基腐病的防治效果分别为23.77%，22.95%，23.77%，与A3相当；P-NCS-0.0025%，P-NCS-0.005%，NCS-0.0025%，NCS-0.001%各处理组对小麦茎基腐病具有较好的防病效果，分别为39.71%，26.47%，24.64%，24.64%，且同浓度纳米几丁质喷雾处理3次比喷雾处理1次效果更好。⑸0.003%NCS纳米几丁质可以诱导小麦叶片中在处理后24-68小时，提高SOD酶活性；处理后24-56小时0.003%NCS处理组的PPO酶活性逐渐升高，高于CK组，F-NC组在32-68小时期间PPO酶活性较高；处理后4-24小时内0.003%NCS组的PAL酶活性显著高于空白对照CK组。这些初步的机理分析的结果暗示纳米几丁质可能通过激发植物自身的抗性，抵抗病原物的侵染。5.2讨论近年来，纳米壳聚糖和纳米几丁质的抗真菌活性引起了研究学者们的广泛关注[146-151]。BhaskaraReddy[91]报道使用2-8mg/mL壳聚糖可以显著降低禾谷镰刀菌对小麦种子的侵染程度。在我们以前的研究中，我们发现纳米几丁质与化学杀菌剂复配来防治烟草根腐病具有较好的协同作用，并且可以保护辣椒种子免受真菌污染并促进种子萌发[108,152]。在本研究中，我们发现纳米几丁质能显著抑制小麦茎基腐病病原菌F.pseudograminearum，F.graminearum和还有小麦全蚀病病菌G.graminisvar.tritici的菌丝的生长。特别是在0.0003％-0.003％w/v浓度范围的纳米几丁质处理抗菌性能越好，这也与我们前期研究保持一致[108,152]。并且，在对小麦全蚀菌的室内毒理测定中，纳米几丁质显示出了与硅噻菌胺和咯菌腈复配的协同效应，能有效减少杀菌剂的使用剂量。目前关于纳米几丁质对病原真菌的作用方式尚不明确。壳聚糖的生物化学功能使其对多种微生物都有很好的抑制作用[153-155]。这可能是壳聚糖在和真菌接触时，在真菌细胞表面残留下了携带负电荷的大分子，导致真菌细胞内电解质和蛋白质的渗漏[156]，从而诱导了植物体内一系列的防御反应[157]。Ing等人提出，壳聚糖纳米粒子对真菌的抑制机制是通过将纳米粒子扩散到真菌细胞中，随后抑制DNA或RNA的合成，导致细胞的直接死亡[146]。小麦茎基腐病和小麦全蚀病是世界性范围内重要的小麦病害，特别硬质小麦，假禾谷镰刀菌敏感且表现出早衰症状[9,158,159]。据报道，接种4周后小麦植株出现幼苗死亡和冠状褐变，发病率超过90％[9]。在本研究中，供试作物矮抗58是一种多穗小麦，易受冠状腐烂和44 全部病害的侵袭。当接种0.75%（w/w）F.pseudograminearum小米扩繁菌种于土壤中时，对照病害指数达到75.31，戊唑醇处理，戊唑醇1：1500和1：2000浓度下病情指数分别为46.91和56.79，防病效果分别为37.7％和24.59％。目前，防治小麦茎基腐病主要采取以农业措施和药剂防治相结合的防治策略，同时也在不断加强抗病品种筛选和培育、生物防治等研究工作进展[22]。纳米几丁质作为一种新型生物纳米材料，我们之前的研究表明它具有促进种子萌发和植株生长，增加小麦产量提高品质的生物活性，具有潜在的诱导烟草抗病性的优良性能[108,117,152]。该研究得到不管是作为拌种剂还是喷雾处理，纳米几丁质与戊唑醇复配对防治小麦茎基腐病显示出较好的协同效应，并且显示低浓度0.001%-0.009%（w/v）的NCS相比于较高浓度NCS显示出较高的活性。这是因为纳米材料对微生物具有低剂量依赖效应[108]。据报道，几丁质可以通过影响细胞表面的受体并启动分子水平的信号转导来引发植物抗性系统[90,160]。此外，我们也探究得到纳米几丁质可以增加小麦苗期植株干重积累，提高叶片叶绿素含量，NCS可提高小麦叶片中SOD酶活性，PPO活性以及PAL酶活。NCS通过增加气孔导度，细胞间CO2浓度和蒸腾速率来提高净光合速率，增加干物质量积累。这表明NCS将显著提高植物抗干热和抗倒伏性能。这些初步的机理分析的结果暗示纳米几丁质可能通过激发植物自身的抗性，抵抗病原物的侵染。前人的一些研究表明，几丁质及其衍生物的生物活性是由其阳离子特性和低分子量，影响作物体内营养元素调控等决定的。例如，EI-Tanahy等[161]研究表明，几丁质、壳聚糖及二者的衍生物可以诱导矿物质积累和相关酶活性的增加。据报道，钾可能影响小麦病菌全蚀生长，钾缺乏导致细胞结构和功能的破坏[162]。Xue等[117]报道，NCS可以促进体内钾的积累，当土壤中纳米几丁质的含量0.006g/kg时达到最大值。我们推测纳米几丁质发挥促生效应和减量增效的机制，可能是和低分子量的壳聚糖的作用机制相似，比如壳聚糖可以通过增加植物体内活性氧含量来诱导植物产生抗性[163]；通过结合细胞膜上的受体来调控基因的表达[164]；通过影响细胞表面受体激发分子水平上的信号传导[160]。基于纳米几丁质对小麦诱导抗性的机理研究，还将作为下一步深入探索研究的重点。纳米几丁质作为一种新型生物纳米材料在植物病害防治，农业害虫防治以及新型纳米农药研制领域都有广阔的研究前景。45 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Abstract:PRELIMINARYSTUDYONINHIBITORYEFFECTSOFNANOCHITINONSOIL-BORNEFUNGALDISEASESANDANTIFUNGALMECHANISMSupervisor:Prof.WangHezhongMasterCandidate:LiangRuiABSTRACTApplicationsofnanotechnologyandnanomaterialsinagricultureprovideanewstrategyandanalternativemethodsfordiseasespreventionandagriculturalsustainabledevelopment.Nanochitinextractedfromshrimporiginalchitinbyacidichydrolysisshowednanosizedwhiskerswithcationicnatureandhighbiologicalproperties.Nanochitinwhiskersuspension(NCS)possessespropertiesofnontoxicity,renewability,biocompatibility,biodegradability,highersurfacearea,crystallinityandpolycationicproperties,whichcouldbewidelyappliedinbiomedicine,nanocomposites,cosmetics,watertreatment,foods,andothers.However,nanochitinasacomprehensivebionanomaterialhasnotyetbeensystematicallystudiedinagricultureutilization.Thisstudyistoexploreantifungalactivitiesandmechanismofnanochitinwhiskersanditmixturesagainstwheatcrownrotandwheattake-all,andwillprovideatheoreticalbasisforapplicationsinagriculture.Themainrfindingswereasfollowing:1.Characterizationofnanochitinwhiskers:detainedbyacidichydrolysis,theparticleswerecrystallinerod-likewhiskersandwell-dispersedinaquoussolutionandshowedacolloidalsuspension.Theeffectivediametersof95%particlesthatmeasurebydynamiclightscatteringwereabout150nm,thezetapotentialwas+50.4mV,theconcentrationwas0.2-0.6%(w/v).2.AntifungalactivityofNCSinvitro:(1)0.03%,0.003%,0.001%，0.0003%(w/v)ofNCSshowedsignificantlyinhibitoryeffectsonmycelialgrowthofF.pseudograminearumandF.graminearum;(2)0.00005-0.006%(w/v)ofNCSshowedcertainlevelsofinhibitiononmycelialgrowthofPhytophthoracapsici,ColletotrichumcapsiciandRhizoctoniasolani;(3)0.03%,0.003%,0.001%(w/v)ofNCSshowedsignificantlyinhibitiononconidialformationofF.pseudograminearumandF.graminearum;(4)theinhibitoryrateof0.0003%NCSonG.graminisvar.triticiwasapproximate22.10%.ThemixtureofnanochitinwithfludioxonildemonstratedsynergisticeffectontheantifungalactivityofG.graminisvar.triticiandreachedsameefficacyunderthehalfdosageofchemicalfungicideasnanochitin57 individual.3.EffectsofNCSanditscombinationwithfungicidesonplantheight,dryweight,andchlorophyllcontentsinleavesduringseedlingstage:(1)nanochitinindividualasacoatingagenthadnosignificanteffectonplantheightofthewheatseedlings;(2)0.001%,0.009%,0.018%(w/v)ofNCSalonesignificantlyincreasedthebiomass(drymatter)ofwheat;(3)seedlingstreatedwith0.001%,0.003%,0.009%(w/v)ofNCSanditsmixedwithtebuconazoleA2,comparewithtreatmentsofA2andcontrol,showedgreener,morerobustandadwarfeffect;(4)bytreatedwith0.001%,0.003%,0.009%(w/v)ofNCSalone,thecontentsofchlorophyllaandchlorophyllbandthetotalchlorophyllofwheatseedlingsweresignificantlyhigherthanthoseoftheblankcontrolgroup,andweresignificantlydifferentfromthoseofCK,sameasthetreatmentsof0.003%,0.009%(w/v)NCSmixedwithA2.4.SynergisticeffectsofNCSwithchemicalsfungicides:Whetherasaseeddressingagentorasprayingtreatment,nanochitinwithtebuconazoleshowedagreatsynergisticeffectsinwheatcrownrotcontrol.5.EffectsofNCSondefensiveenzymeactivitiesinwheat:0.003%ofNCScouldincreaseSODenzymeactivity,PPOactivity,andPALenzymeactivityinwheatleavesatcertainperiodoftime.Inshort,nanochitinwhiskershaveagreatantifungalactivityonsoil-bornepathogenicfungi,especiallyinarangeofconcentrationsof0.001%to0.005%(w/v);nanochitinwhiskershaveastrongpotentialtoprotectwheatfromwheatcrownrotandtake-alldiseasesandreducetheuseofchemicalfungicidesinwheatplantations;nanochitincouldalsoincreasethebiomassaccumulation,improvethechlorophyllcontentofleaves,stimulatedefenseenzymeactivities,elicitplantdefensesystem.Theseresultssuggestedthatnanochitinhavegreatpotentialtocontrolfungaldiseasesbystimulatingresistancesystemofplant.Keywords：Nanochitin;Wheatcrownrotdisease;Fungalactivity;Synergisticeffect;Enzymeactivities58