《鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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辽宁师范大学硕士学位论文摘要鸟巢蕨（Aspleniumnidus）属于巢蕨属（NeottopterisJ.Sm.），珊瑚豆（Solanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter）属于茄属（SolanumL.），二者具有较高的食用、药用、净化及美化价值。笔者调查发现，鸟巢蕨和珊瑚豆均易发生叶斑病，严重时整株死亡。因此，查明病因，对症下药迫在眉睫。本文对鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌进行分离鉴定，研究其生物学特性，筛选鸟巢蕨和珊瑚豆的内生拮抗菌，检测农药和拮抗菌对病原菌的抑菌效果，结果如下：1.鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌鉴定：分离的4株致病真菌分别为P1-芸苔链格孢（Alternariabrassicae）和P2-交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）、B17-胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和B19-橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）。2.鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌的生物学特性：四种病原菌生长的最适温度均为25℃，光照对他们菌丝生长影响不大，但全黑暗更有利于产孢。（1）P1-芸苔链格孢（A.brassicae）：最适pH值为6；95%和35%的湿度分别利于菌丝生长和产孢；最适碳源和氮源为乳糖和酵母膏，MgSO4利于菌丝生长、NaH2PO4利于产孢，吲哚乙酸利于菌丝生长，但抑制其产孢。P2-交互枝顶孢（A.alternatum）：pH=5时利于菌丝生长，pH=8时适宜产孢；95%和55%的湿度分别利于菌丝生长和产孢；蔗糖和果糖是菌丝生长和产孢的最佳碳源，KNO3、NaH2PO4和吲哚丁酸利于菌丝生长而蛋白胨、K2HPO4和维生素B1适宜产孢。（2）B17-胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）：pH=6适宜菌丝生长、pH值=7适宜产孢；最适湿度为95%；最适碳源和氮源为果糖、乳糖和牛肉膏、酵母膏，NaH2PO4和维生素B6适宜菌丝生长，K2HPO4和维生素B1适宜产孢。B19-橘斑链格孢（A.citrimacularis）：pH=5利于菌丝生长、pH=8利于产孢；最适湿度为95%；最适碳源和氮源为木糖和酵母膏、蛋白胨；CaCl2和吲哚乙酸适宜菌丝生长，NaH2PO4和维生素B1适宜产孢。3.拮抗菌和化学药剂对四种叶斑病病原菌的抑菌效果:经鉴定，对峙法从珊瑚豆中筛选的内生拮抗菌B18-B和B19-B分别为泛菌属细菌（Pantoeaspp）和肺炎克雷伯菌臭鼻亚种（Klebsiellapneumoniasspozaenae）。抑菌试验结果表明，B19-B和环状芽孢杆菌的抑菌效果较好。B19-B对病原菌B17的抑菌率高达68.4%；B19-B和环状芽孢杆菌对病原菌B19的抑菌率分别为62.7%和63.3%；环状芽孢杆菌对病原菌P1的抑菌率为76%。四种农药对四种病原菌均有抑菌作用，其中苯醚甲环唑对四种病原菌的抑菌效果最好。200μg/ml浓度的苯醚甲环唑对B17和B19的抑菌率高达93.9%和95.6%。关键词：鸟巢蕨；珊瑚豆；叶斑病；拮抗菌；抑菌效果I 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究StudyonpathogenidentificationandbiologicalcharacteristicsoftheleafspotsofAspleniumnidusandSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)BitterAbstractAspleniumnidusbelongstoNeottopterisJ.Sm..Solanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)BitterbelongstoSolanumL..Allinonewithgoodediblevalue,medicinalvalue,purifiedvalueandornamentalvalue.Wheninvestigatingflowerdiseases,theauthorfoundthatAspleniumnidusandSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitterareeasytobeinfectedwithpathogen.Whattheworse,itwilldamagewholeplant.Thus,itisextremelyurgentforustodeterminetheetiology.ThispapershowstheidentificationofpathogenofleafspotonAspleniumnidusandSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter,studiesthebiologicalcharacteristicsoffourpathogens,screenstheendophyticantagonisticbacteriumandteststheantibacterialeffectofantagonisticbacteriumandpesticidesonpathogens.Theresultsareasfollows:1.TheidentificationofpathogenofleafspotonAspleniumnidusandSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter:FourpathogenicfungiareAlternariabrassicae(P1),Acremoniumalternatum(P2)andColletotrichumgloeosporioides(B17),Alternariacitrimacularis(B19).2.ThebiologicalcharacteristicsoffourpathogensofAspleniumnidusandSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter:Theoptimumtemperatureformyceliaandsporesgrowthis25℃.Myceliagrowthisnotaffectedbylight,buttotaldarknessisgoodforsporulation.（1）P1(Alternariabrassicae):TheoptimumpHvalueis6.Theoptimumhumidityformyceliagrowthis95%,theoptimumhumidityforsporulationis35%.Theoptimumcarbonandnitrogensourcearerespectivelylactoseandyeastextract.MgSO4andNaH2PO4arerespectivelygoodformyceliagrowthandsporulation.Indoleaceticacidisgoodformyceliagrowth,butitwouldinhibitsporulation.P2(Acremoniumalternatum):TheoptimumpHvalueformyceliagrowthis5andpH=8isgoodforsporulation.Theoptimumhumidityformyceliagrowthis95%,theoptimumhumidityforsporulationis55%.Sucroseandfructosearerespectivelytheoptimumcarbonsourceformyceliagrowthandsporulation.KNO3,NaH2PO4andindolebutyricacidaregoodformyceliagrowthandpeptone,K2HPO4andVB1aregoodforsporulation.（2）B17(Colletotrichumgloeosporioides):whenpHvalueis6,themyceliagrowthrateisthefastest.WhenpHvalueis7,thesporesproductionisthemost.Theoptimumhumidityis95%.Theoptimumcarbonsourcesarefructoseandlactose.Theoptimumnitrogensourceisbeefextractandyeastextract.NaH2PO4andVB6aregoodII 辽宁师范大学硕士学位论文formyceliagrowth.K2HPO4andVB1aregoodforsporulation.B19(Alternariacitrimacularis):whenpHvalueis5,themyceliagrowthrateisthefastest.WhenpHvalueis8,thesporesproductionisthemost.Theoptimumhumidityis95%.Theoptimumcarbonsourcesisxylose.Theoptimumnitrogensourceareyeastextractandpeptone.CaCl2andindoleaceticacidaregoodformyceliagrowth.NaH2PO4andVB1aregoodforsporulation.3.Theantibacterialeffectsofantagonisticbacteriumandpesticidesonpathogensofleafspot:Afteridentifying,theauthorfoundthattheendophyticantagonisticbacterium,B18-BandB19-B,separatedfromSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)BitterwererespectivelyPantoeasppandKlebsiellapneumoniasspozaenae.TheresultsofbacteriostatictestshowthatB19-Bandbacilluscirculanshavethebestantimicrobialeffect.TheinhibitoryrateofB19-BonB17isupto68.4%.TheinhibitoryratesofB19-BandbacilluscirculansonB19arerespectively62.7%and63.3%.TheinhibitoryrateofbacilluscirculansonP1is76%.Thefourpesticideshavedifferentantibacterialeffectsonfourkindsofpathogens.Thereinto,thedifenoconazoleisthebest.Whentheconcentrationofdifenoconazoleis200μg/ml,theinhibitoryratesonB17andB19arerespectivelyupto93.9%and95.6%.Keywords:Aspleniumnidus;Solanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter;leafspot;antagonisticbacterium;antibacterialeffectIII 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究目录摘要.....................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................II引言.....................................................................................................................................11文献综述.................................................................................................................................21.1鸟巢蕨...........................................................................................................................21.1.1鸟巢蕨的植物学性状.......................................................................................21.1.2鸟巢蕨的应用价值...........................................................................................21.2珊瑚豆..........................................................................................................................41.2.1珊瑚豆的植物学性状.......................................................................................41.2.2珊瑚豆的应用价值...........................................................................................51.3鸟巢蕨与珊瑚豆叶斑病病原菌..................................................................................61.3.1链格孢属真菌...................................................................................................61.3.2刺盘孢属真菌...................................................................................................71.3.3枝顶孢属真菌...................................................................................................71.4本研究的内容、目的及意义......................................................................................71.4.1研究内容...........................................................................................................71.4.2研究目的及意义...............................................................................................82鸟巢蕨与珊瑚豆叶斑病病原菌的分离纯化与鉴定..............................................................92.1实验材料与方法..........................................................................................................92.1.1实验材料...........................................................................................................92.1.2实验方法............................................................................................................92.2实验结果与分析........................................................................................................122.2.1病害症状.........................................................................................................122.2.2菌株的单斑分离率.........................................................................................132.2.3分离菌株的致病性检测..................................................................................142.2.4分离菌株的鉴定.............................................................................................162.3结论与讨论................................................................................................................232.3.1结论.................................................................................................................232.3.2讨论.................................................................................................................243鸟巢蕨与珊瑚豆叶斑病病原菌的生物学特性研究...........................................................253.1材料与方法................................................................................................................253.1.1实验材料.........................................................................................................253.1.2实验方法.........................................................................................................253.2结果与分析................................................................................................................273.2.1温度对病原菌菌丝生长、产孢量的影响.....................................................273.2.2pH值对病原菌菌丝生长、产孢量的影响....................................................283.2.3湿度对病原菌菌丝生长、产孢量的影响.....................................................283.2.4光照对病原菌菌丝生长、产孢量的影响.....................................................293.2.5营养素对病原菌菌丝生长、产孢量的影响.................................................303.2.6病原菌的生长曲线.........................................................................................343.3结论与讨论................................................................................................................35IV 辽宁师范大学硕士学位论文3.3.1结论.................................................................................................................353.3.2讨论.................................................................................................................364拮抗菌和化学药剂对两种叶斑病病原菌的抑菌试验.......................................................374.1材料与方法................................................................................................................374.1.1实验材料.........................................................................................................374.1.2实验方法.........................................................................................................374.2结果与分析................................................................................................................394.2.1鸟巢蕨与珊瑚豆内生拮抗菌的初筛结果.....................................................394.2.2珊瑚豆内生拮抗菌的鉴定.............................................................................394.2.3拮抗菌对病原菌的抑菌效果.........................................................................414.2.4化学药剂的抑菌效果.....................................................................................464.3结论与讨论................................................................................................................504.3.1结论.................................................................................................................504.3.2讨论.................................................................................................................50结论...................................................................................................................................53参考文献...................................................................................................................................55附录A鸟巢蕨与珊瑚豆叶斑病病原菌的测序结果...............................................................59攻读硕士学位期间发表学术论文情况...................................................................................61致谢...................................................................................................................................62V 辽宁师范大学硕士学位论文引言鸟巢蕨（Aspleniumnidus），又称巢蕨、山苏花、王冠蕨，属于铁角蕨科（Aspleniaceae）巢蕨属（NeottopterisJ.Sm.），是一种集食用、药用、净化、美化于一身的具有巨大开发价值的蕨类植物。笔者在进行花卉病害调查时发现，鸟巢蕨易发生叶斑病，感病植株叶片变黄、枯萎、死亡，严重影响了净化美化效果。目前国内对鸟巢蕨的研究报道主要集中在营养成分的分析、食用、药用、环境监测、组织培养技术、空气净化等方面。病害调查中还发现，同一栽培环境下的珊瑚豆（Solanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter）也易发生叶斑病，初始症状与鸟巢蕨相似。珊瑚豆属于茄科（Solanaceae）茄属（SolanumL.）常绿性小灌木，别名也叫红珊瑚、冬珊瑚、季节果、吉庆果、野辣椒等，具有观赏及药用价值。同一栽培环境下，两个不同种的植物都产生相同症状的叶斑病，二者叶斑病的病原菌是否相同？是何菌种？前人鲜有研究报道，有必要查明。当今时代，人们越发注重生活质量，室内观赏花卉更青睐于那些同时具有美化、净化作用的植物。像鸟巢蕨和珊瑚豆这样集药用、食用、美化净化等多种用途于一身的植物，越发会引起人们的兴趣，其栽培面积定会逐渐增加，田间生产及室内养护中的病害问题难以回避，有必要未雨绸缪，加以病原菌鉴定及防治研究。本文对鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌进行了形态学、分子生物学鉴定及其生物学特性研究；同时，进行病原拮抗菌的筛选及药剂试验。旨为鸟巢蕨和珊瑚豆在栽培生产中的叶斑病防治提供理论依据，为生物农药研发提供理论基础。1 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究1文献综述1.1鸟巢蕨1.1.1鸟巢蕨的植物学性状鸟巢蕨（Aspleniumnidus），又称巢蕨、山苏花[1]、王冠蕨，隶属于铁角蕨科（Aspleniaceae）巢蕨属（NeottopterisJ.Sm.），多年生的附生性阴生草本植物。株高80-100cm，根状茎，直立，短粗、木质，粗约2cm。叶柄短，长约2-7cm，暗棕色或禾秆色；叶片形状为阔披针形，长约75-98cm，尖端渐尖，中间部分最宽处约为6.5-8.5cm，向下渐渐变得狭长并且下延，叶边呈全缘，狭边软骨质，干后略微反卷。叶片上、下面均可见隆起主脉；小脉在叶片两面均稍微隆起，斜展，平行，分叉或单一。叶革质，干后浅棕色或棕绿色，叶片两面均平滑无毛；叶子向外簇生，中间形成空“漏斗”状，外观形似“鸟巢”，故称之为鸟巢蕨[2]（图1.1）。图1鸟巢蕨Fig.1.1Aspleniumnidus1.1.2鸟巢蕨的应用价值2 辽宁师范大学硕士学位论文（1）观赏价值鸟巢蕨原生于澳大利亚东部、亚洲东南部、印度和非洲东部、印度尼西亚等地，野生于温暖潮湿的林荫地带，我国热带地区分布广泛。近年来，因其植株叶片美观已成为人们竞相购买的观赏植物。鸟巢蕨株型饱满、叶片繁茂、颜色葱绿光亮，呈现出一片生机盎然的景象，在观叶植物中可谓是一枝独秀，尤其是人工培植的盆栽型小型植株，无论是悬挂亦或是摆放于卧室、书房、客厅以及会议室等地，均别具热带风情，落落大方；植于室外假山或热带园林树木之下的大型植株，野味浓郁，为热带园艺锦上添花。鸟巢蕨的花语是富贵、吉祥，清香常绿。因此，作为节日、生日等礼品花卉，朋友间乔迁等贺礼，都是一种不错选择，深受人们的青睐。08年奥运会，鸟巢蕨作为主要场景布置植物，出现在开幕式会场、奥运场馆、宾馆等地，为场景布置增添别样风情。（2）食用价值鸟巢蕨具有食用价值，在台湾地区他是一道家喻户晓的名品佳肴，经常出现在家庭及餐馆的餐桌上，深受广大食客的喜爱。徐诗涛[3]等曾分析过鸟巢蕨的营养成分，其结果显示：鸟巢蕨的蛋白质、脂肪含量均高于西芹、韭菜、夏菠菜、蕹菜、生菜、大葱、油麦菜；总糖量略高于生菜，但均低于其它6种蔬菜；鸟巢蕨含有18种氨基酸，除了必需氨基酸外，还含有谷氨酸等药用氨基酸；富含9种矿物元素以及丰富的维生素，其中维生素A的含量尤其高。维生素A对视觉维持、生殖、骨组织生长、机体免疫有重要影响作用[4]，可以维持消化道粘膜的完整性[5]，同时也可以防治新生儿疾病[6]。因此，无论是直接食用，还是提取成分，鸟巢蕨都是一个不错的选择。鸟巢蕨营养成分之丰富，含量之高，使其食用价值受到越来越多的关注，价格随之上涨。清远市等地就曾引进并种植鸟巢蕨，使得鸟巢蕨的种植面积不断扩大，为农民朋友带来更高的效益，成为广大种植户致富的“新宠”[7]。（3）药用价值鸟巢蕨是一种全草都具有药用价值的植物，其药用价值体现在强筋健骨、活血化瘀、促进骨细胞增长、加快骨折愈合[8]等方面。印度西部高止地区有使用鸟巢蕨治疗疾病的传统，如感冒、发烧、胸痛、咳嗽[9,10]。其味苦，性温，可入肾、肝二经，既可煎汤内服，又可捣敷外用，安全无副作用。药用成分全，药效广谱[11]。陈庆玉[8]等曾研究了鸟巢蕨水提取液对体外培养的成骨细胞增殖及分化作用的影响，探讨其促进骨折愈合以及防治骨质疏松的机制，发现适宜浓度的鸟巢蕨水提取液可以促进兔成骨细胞的增值分化。TahirMM[12]（2014年）首次报道了鸟巢蕨因其体内含有抗病毒活性物质萜烯、生物碱和酚类物质而具有抗病毒活性能力，且抗病毒能力的选择指数高。（4）生态价值鸟巢蕨是一种有效的自然空气清新器。作为常绿性，拥有繁茂叶片的观叶植物，室内环境下盆栽型鸟巢蕨可以通过光合作用，大量的吸收二氧化碳，释放氧气，使室内空3 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究气变得清新自然，在家就能享受到大自然的味道。对于刚刚装修完的房子，室内会充斥的甲醛等有害气体，这些气体不但对人的眼、鼻等器官有刺激作用，长期吸入还会出现身体不适，如头痛、乏力、头晕、恶心、呕吐、眼痛、胸闷、嗓子痛、心悸、体重减轻、失眠、记忆力减退以及植物神经紊乱等症状，此时摆放几盆鸟巢蕨，可以大大的吸收甲醛等有害气体，还您一个清新、安全、温暖的家。国内外已报道过鸟巢蕨的净化作用。SuYM[13]等（2015年）研究证明，鸟巢蕨能高效地去除二氧化碳和甲醛，降低温度，增加相对湿度；刘娜[14]的研究表明，同五彩竹芋、凤梨、朱蕉相比，鸟巢蕨对甲醛的吸收效果为最好。室外人工培植的鸟巢蕨，可利用自身独特的结构-“鸟巢”来“收集”落叶和鸟粪等，使其转化成供自身生长的肥料。鸟巢蕨也可净化污、废水，在潜流人工湿地生境中生长良好，既可作为人工湿地植物，处理畜禽养殖废水[15]，可吸附去除畜禽养殖废水中的污染物，无需特殊管理及反复栽培，栽培成本和运行费用低、效果好[16]。野生鸟巢蕨丰富了热带雨林的生物多样性，增加了热带雨林的结构层次，作为指示植物监测气候和环境变化，为动植物提供栖息地或共生环境，调节雨林的循环，对环境的适应性较强，是热带雨林的重要组成部分，是理想的微生境研究对象[17,18]。1.2珊瑚豆1.2.1珊瑚豆的植物学性状珊瑚豆（Solanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter），别名玉珊瑚、冬珊瑚、珊瑚子、寿星果、看枣，属于茄科（Solanaceae）茄属（SolanumL.）植物，是珊瑚樱的主要变种。直立有分枝，高约0.3-1.5m，小型灌木，小枝幼时有树枝状簇绒毛，后慢慢脱落。叶片大小不相等，互生，为椭圆状披针形，长约2-5cm或稍长，宽约1-1.5厘米或稍宽，叶边全缘，叶面光滑无毛，叶片尖端钝或短尖，基部楔形并向下延成短柄，叶片下面沿脉常常有树枝状簇绒毛，叶下中脉凸出，中脉两侧有侧脉，每侧有4-7条明显侧脉；叶柄长约2-5mm，幼时被树枝状簇绒毛，后慢慢脱落。花序短，单生或蝎尾状，腋生，1-3朵；花小,萼绿色,花冠白色，总花梗短小，几近于无，长约5mm；子房接近圆形，直径约为1.5mm。球状浆果，单生，珊瑚红色或桔黄色，直径约1-2cm；种子扁而平，直径约3mm。开花4-7月，8-12月浆果成熟[19]（图1.2）。4 辽宁师范大学硕士学位论文图1.2珊瑚豆Fig.1.2Solanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter1.2.2珊瑚豆的应用价值（1）观赏价值珊瑚豆即可庭院栽植又可室内摆放，具有观赏价值。他虽然花小但花期长，又因其浆果成熟后，挂于枝头红艳艳，在绿叶的衬托下，极为美丽诱人，是花卉市场中常见的上等观果植物。入冬时节，天气寒冷，万物凋谢，但珊瑚豆的浆果却可以长时间停留于枝头并过冬。在我国南方，室外过冬的珊瑚豆，为银装冬季增一抹红色；在北方，盆栽的珊瑚豆为单调的室内陈设添一抹生机。近年来，随着物质生活水平的提高，人们逐渐将目光放在精神生活及文化修养上，花卉装点室内，营造清新舒适的空间已是人们的共识，珊瑚豆作为上等观果植物备受人们的青睐。（2）药用价值珊瑚豆全株都有毒，具有药用价值。中国中药资源志要[20]中提到，珊瑚豆全株可用于治疗风湿肿痛、水肿；其果实可用于杀虫。珊瑚豆性温，味咸而微苦，具有止痛的功效。张为胜[21]等（2013年）研究表明，鲜珊瑚豆全株都可作为治疗肿瘤药物的原材料，其全株、茎叶、果实等提取物对人肺源腺癌细胞SPCA-1、人肝癌细胞系HepG2和人慢性髓系白血病细胞K562的增殖均有抑制作用，且对Κ562细胞的抑制效果最为明显。5 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究珊瑚豆分布广泛，原产自巴西，在我国多为庭院栽培以及盆栽，在风景区内也可常见[22]。（3）生态价值作为生态系统中自养生物，珊瑚豆可吸收二氧化碳，释放氧气，野生状态下可为小型动植物提供栖息地，丰富森林层次结构，室内栽培可净化环境。珊瑚豆还可抗、耐重金属，可作为修复重金属污染土壤的备选植物。邹春萍[23]等研究了25种观赏植物的重金属富集特性，发现珊瑚豆在Cd-Pb-Cu复合污染土壤中可以正常生长，未有明显的中毒现象，且对Cd的地下富集系数大于1。因此，在污染土壤的植物修复中，可将珊瑚豆作为处理重金属Cd的有效植物。1.3鸟巢蕨与珊瑚豆叶斑病病原菌1.3.1链格孢属真菌链格孢属（Alternaria）真菌寄主范围非常广泛，是重要的植物病原菌。例如：链格孢菌（Alternariaalternate）能侵染核桃[24]、红橘[25]、番茄[26]，鸭梨链格孢（AlternariayaliinficiensR.G.Roberts）能侵染枣[27]，苹果链格孢(Alternariamali)可侵染苹果[28]，豆链格孢（Alternariaazukiae）可侵染甘草[29]，细极链格孢(Alternariatenuissima)可侵染三叶木通[30]，等等，诸如此类病害的报道有很多，这些真菌侵染寄主可导致被侵植物发生叶斑病，严重时可致植株死亡，使农作物的质量和产量降低，甚至绝产。链格孢属真菌可产生毒素，有的毒素对人和动物有毒害作用，其毒性作用包括基因毒性、致癌性、诱变性等。链格孢霉毒素是链格孢属真菌产生的多种代谢产物，大致可以分为四类：二苯并吡喃酮衍生物(dibenzopyronederivatives)、细交链孢菌酮酸(tetramicacid)、苝衍生物(perylenederivatives)以及一系列长链氨基多元醇的丙三羧酸酯类化合物(tricarballylicesters)[31]。刘桂亭[32]就互隔交链孢霉，即链格孢菌对大鼠前胃和食管乳头状瘤的诱发进行了首次报导；90年代初，又先后报导过AOH和AME对人淋巴细胞DNA[33]和大鼠不同器官细胞DNA的损伤[34]，以及对人胚肺2BS细胞的诱变性[35]，TeA[36]和ALT[37]可以抑制NIH/3T3细胞的细胞增殖；ATX-Ⅰ和ATX-Ⅲ会导致肿瘤的发生[38]。AAL毒素的结构相似于二氢神经鞘氨醇，破坏生物体内神经鞘脂类物质的均衡，从而引起健康问题[39]。某些链格孢属真菌的次生代谢产物对微生物有毒害作用，以此可应用于生物防治。王现坤[40]等从侧柏中分离获得的有拮抗作用的内生真菌中，链格孢属为优势属；而在随后对链格孢属真菌J46的研究中发现，J46发酵液具有除草活性[41]，而将化学药剂与链格孢属真菌J77的代谢产物按比例混合，可以制成内生菌典型制剂[42]。李荣金[43]发现，百日草链格孢菌可以产生使叶组织细胞膜透性上升的胞外毒素，增进抗氧化酶活性，增强膜脂过氧化，并且其毒性在一定范围内具有选择作用特性，它可侵害加拿大一枝黄花6 辽宁师范大学硕士学位论文(Solidagocanadensis)、苍耳(Xanthiumsibiricum)、小飞蓬(Conyzacanadensis)、紫茎泽兰(Eupatoxiunadenophorum)等菊科以及其它农田、园林和草坪杂草，有被开发为菊科杂草除草剂的潜力。1.3.2刺盘孢属真菌刺盘孢属又名毛盘孢属、炭疽菌属（colletotrichumgenera），是真菌门(Eumycophyta)、半知菌亚门（Deuteromycotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、黑盘孢目(Melanoconiales)、黑盘孢科（Melanconiaceae）下的一个属。该属真菌寄主范围广泛，可引发多种农作物的炭疽病，侵染农作物的花、茎、叶、果实。如胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和毁灭炭疽菌（Colletotrichumdestructivum）引发的红掌炭疽病，使翠绿欲滴的叶片枯萎，鲜艳华丽的花腐烂，不再活力四射，失去经济与观赏价值[44]；胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）是诱发多种植物炭疽病的主要致病菌，如柑橘感染炭疽菌后，轻则有少量病斑生成，重则落叶落果，产量及质量下降，采后果实易腐烂，不易储藏[45]；黑线炭疽菌（Colletotrichumdematium）是肿节风炭疽病的致病菌[46]，可侵染茎、叶，影响光合作用，有效成分降低，严重者失去药用价值、不宜入药。1.3.3枝顶孢属真菌枝顶孢属（Acremoniumsp.）真菌分布广泛，营腐生、植物寄生，自生[47]。近年来，对植物内生菌的研究形成一股热潮，学者们对其报导此起彼伏，而广泛分布的内生枝顶孢属真菌首当其冲，如张秀环[48]等对白木香两株内生枝顶孢属真菌的挥发油进行提取，并分析了挥发油的成分；郭志凯[49]等对臂形草内生真菌菌株HND5进行了分离、初步鉴定以及抗性评价，发现此株枝顶孢属真菌对芒果炭疽菌、香蕉枯萎病等致病菌均具有拮抗作用；AuerS[50]等的研究表明，植物内生交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）可以通过诱导抗性作为生防制剂加以利用。在真菌多样性的研究中，枝顶孢属真菌也多次出现[51-53]，是地区和植物内生真菌多样性中的优势菌之一。枝顶孢属真菌并不都是有益真菌，某些菌株也会侵染农作物，使之染病。例如，康晓慧[54]曾分离出双孢蘑菇的病原菌，经鉴定为点枝顶孢菌（AcremoniumstrictumW.Gams）和半裸镰刀菌（Fusariumsemitectum）。交互枝顶孢（Acremonium.alternatum）可以引起沉香枝顶孢茎枯病[55]。枝顶孢属真菌也可以感染人类皮肤，陈慧敏[56]曾在丘疹、脓疱、肿块、破溃伴局部瘙痒皮肤出分离出枝顶孢霉。1.4本研究的内容、目的及意义1.4.1研究内容（1）鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌的分离与鉴定（2）鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌的生物学特性研究7 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究（3）鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原拮抗菌的筛选及抑菌试验1.4.2研究目的及意义鸟巢蕨（A.nidus）叶片美观，除了具有观赏及净化功能外，还具有食用和药用价值。他在绿化美化环境的同时，对甲醛、苯、甲苯等具有一定的吸附作用[57,58]；除基本的营养外，富含氨基酸、矿质元素等[3]，并具有强筋健骨、活血化瘀、促进骨细胞增长、加快骨折愈合[8]，治疗感冒、发烧、胸痛、咳嗽等[9,10]作用。珊瑚豆果期长并果实鲜艳，是绿化美化环境常见的观果植物，他除了具有观赏价值外，也具有药用和生态价值。鸟巢蕨和珊瑚豆作为集多种价值于一身的植物，仅靠野生量是满足不了人们日益增长的物质和精神文化需求的，因此，大面积种植栽培势在必行。当下，对于鸟巢蕨和珊瑚豆人们给予了一定关注，例如，营养成分分析[3]、食用、药用[8-10]、环境监测[59]、栽培技术[60-62]、空气净化[57，58]等，但有关他们在生产栽培中所发生的叶斑病及病原菌等问题的研究，国内外鲜有报道。笔者实地考察发现，室内观赏用的鸟巢蕨和珊瑚豆，虽然他们不属于同科植物，但他们都容易发生叶斑病。二者叶斑病的病原菌是否相同？是何菌种？前人少有研究，有必要查明。随着时代的发展，人们越发注重生活质量，室内观赏花卉更青睐于那些同时具有美化、净化作用的植物。像鸟巢蕨和珊瑚豆这样集药用、食用、美化净化等多种用途于一身的植物，越发会引起人们的兴趣，其栽培面积定会逐渐增加，田间生产及室内养护中的病害问题难以回避，有必要未雨绸缪，加以病原菌鉴定及防治研究。本文对鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌进行形态学、分子生物学鉴定及其生物学特性研究；同时，进行病原拮抗菌的筛选及药剂试验。旨为鸟巢蕨和珊瑚豆在栽培生产中的叶斑病防治提供理论依据，为生物农药研发提供理论基础。8 辽宁师范大学硕士学位论文2鸟巢蕨与珊瑚豆叶斑病病原菌的分离纯化与鉴定鸟巢蕨和珊瑚豆的价值多元化，逐渐成为人们生活中的“宠儿”，仅靠野生量是满足不了人们日益增长的物质和精神文化需求的，具有广阔的大面积种植栽培前景。笔者在进行花卉病害调查时发现，鸟巢蕨和珊瑚豆均易发生叶斑病，导致叶片变黄、枯萎，严重时整个植株枯萎死亡。但二者叶斑病的病原菌是否相同？是何菌种？前人少有研究。因此，有必要查明病因，有针对性的防治与治疗叶斑病，尽可能的减少化学药剂的大量使用，减轻化学药剂对环境的污染；或研发生防制剂，做到未雨绸缪。2.1实验材料与方法2.1.1实验材料（1）病源：于辽宁省大连市西郊生物园采集鸟巢蕨和珊瑚豆发病植株的感病叶片，同时采集健康植株叶片为对照。（2）培养基：使用马铃薯琼脂培养基（PDA）：马铃薯（200g）、琼脂（20g）、葡糖糖（18g）、蒸馏水定容1000ml。（3）药品与试剂：DNA提取和PCR所用试剂如DNAMarker（DL2000）、dNTP、TaqDNA聚合酶、buffer等购买于大连TaKaRa公司；引物（its1和its4）由上海生工合成。（4）仪器：超净工作台（YJ-875）、光学显微镜（OLYMPUS，CX21）、立式压力蒸汽灭菌器（YM100Z）、恒温培养箱（HH.B11）、PCR仪（GeneAMP9700）、凝胶成像系统（GDS8000）、冷冻离心机、电泳仪、剪刀、镊子等等。2.1.2实验方法1.病原菌的分离与纯化（1）病原菌的分离：单斑分离法[63]分离菌株。首先，剪切数块病组织，每块病组织大约5mm×5mm大小，剪切位置为病健交接处。在无菌操作台中，将病组织依次浸入无菌水、75%酒精、无菌水、75%酒精、无菌水、0.5%次氯酸钠、无菌水进行表面消毒，时长为1min-2min，无菌滤纸吸干病组织表面水分后，将病组织置于PDA培养基中，每皿放置3-4块，标明日期编号后置于28℃恒温培养箱中培养。计算单斑分离率。（2）病原菌的纯化：分离菌培养3-4d后，在超净台中，以无菌接种针挑取菌丝尖端，放至另一个PDA培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养，重复操作直至菌种纯化。2.病原菌的致病性检测依据科赫法则进行试验。采摘鸟巢蕨和珊瑚豆的健康叶片，进行表面消毒，以针刺法进行接种。以灭菌针头针刺叶片形成创伤，以直径为6mm的无菌打孔器在培养7d的9 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究分离菌平板上打孔，并将菌饼有菌的一面接种于健康叶片创口处，28℃恒温培养箱中保湿培养，24h后移除菌饼，继续保湿培养，以接种培养基饼为空白对照（大小与菌饼相同）[64]。每次处理并接种叶子5片，重复3次，一周后观察叶片发病情况。待叶片发病后，计算发病率，采用单斑分离法重新分离病原菌，观察二次分离菌株的菌落和孢子形态，与接种菌株进行比较，确定致病性。3.病原菌的鉴定（1）病原菌的形态学鉴定：依据科赫法则检测了分离菌株具有致病性以后，将活化后的致病菌重新接种PDA培养基，恒温箱中培养5-7d后，肉眼观察菌落形态，光镜下观察菌丝及孢子形态，依据菌落正反面颜色，有无轮纹，分生孢子的大小、形状、有无孢子梗以及膈膜等等，进行形态学鉴定[65]。（2）病原菌的分子生物学鉴定：1）钢珠法[66]提取致病菌DNA。①培养7d后，刮取致病菌菌丝（黄豆粒大小），置于2ml的无菌离心管内，灼烧钢珠，待钢珠冷却后加入离心管中（2粒，直径5mm），用移液枪吸取120%SDS500μl加入离心管中，盖紧管盖，置于FastMill上，快速振荡10min；②移液枪吸取250μl3M乙酸钠溶液加入离心管中并混匀，-20℃下静置30min；③加入提前配制且4℃密封保存的苯酚氯仿异戊醇（25:24:1）750μl，混匀后置于4℃离心机中，12000r/min离心5min，弃沉淀，吸取上清液至新离心管中；④移液枪吸取600μl异戊醇，置于上清液中混匀，静置30min后置于4℃离心机中，12000r/min离心5min，弃上清液；⑤向沉淀中加入100%无水乙醇100μl，混匀静置1min后置于4℃离心机中，12000r/min离心10min，弃上清液；⑥向沉淀中加入100%无水乙醇100μl，混匀后置于4℃离心机中，12000r/min离心5min，弃上清液；⑦向沉淀中加入75%的冰冷乙醇100μl，混匀后置于4℃离心机中，12000r/min离心5min，弃上清液；⑧向沉淀中加入超纯水30μl，混匀后置于4℃离心机中，5000r/min离心2min，置于超净台中自然风干；⑨加入适量TE溶解DNA，-20℃保存待用。2）DNA质量的检测：采用琼脂糖凝胶电泳法。①制胶：向锥形瓶中加入30ml0.5×TBE缓冲液，天平称取0.3g琼脂糖，混于缓冲液中，微波炉加热融化制成1%凝胶后，冷却至50-60℃左右，加入0.3μlGoldView充分混匀，切忌过度摇晃，将凝胶倒入制胶器中，冷却约30min，待凝固后，取出梳子和挡板，将胶板放入电泳槽中待用，加入0.5×TBE缓冲液至刚好淹没胶板；10 辽宁师范大学硕士学位论文②加样：以移液枪吸取4μlDNA样品，2μl6×loadingbuffer，混匀后加入点样孔，DL2000DNAMarker5μl加入一端点样孔；③电泳：在100V、500mA条件下恒压电泳30min；④分析电泳图像：将电泳后的凝胶置于GDS8000UVP凝胶成像系统仪中，拍照分析电泳图像。3）致病菌rDNA-ITS区的PCR扩增：选用上海生工生物工程公司合成的真菌通用引物ITS1和ITS4。引物序列如下：ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)PCR反应总体积为50μl，反应体系如表2.1所示。表2.1PCR反应体系（50μl）Table2.1PCRreactionsystem（50μl）组分用量（μl）ddH2O37.510×PCRBuffer5dNTPMixture4引物ITS11引物ITS41DNA1Taq酶0.5PCR程序：预变性94℃5min变性94℃1min退火53℃1min35个循环延伸72℃1min延伸72℃5min保存4℃PCR扩增后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。4）致病菌rDNA-ITS区的DNA测序：将PCR产物送至上海生工生物工程公司进行DNA测序。5）构建系统发育树：将测得的rDNA-ITS区域的DNA序列递交NCBI网站进行blast比对，MEGA5.0软件分析DNA序列，邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。11 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究2.2实验结果与分析2.2.1病害症状（1）鸟巢蕨叶斑病症状：叶片发病初期，染病部位发黄，随着病情加重，病斑颜色由黄渐渐加深至深褐色，最终干枯、穿孔，病健交接处有明显的黄色晕圈。随着病斑的逐渐扩大，整片叶子枯萎，病斑分布没有规律性，叶脉、叶片边缘等部位均可见病斑（见图2.1）。图2.1鸟巢蕨叶斑病症状Fig.2.1LeafspotofAspleniumnidus（2）珊瑚豆叶斑病症状：发病初期症状与鸟巢蕨相似，感病部位出现明显的退绿变黄症状，形状不规则，变黄部位面积会逐渐增大，随着感病时间的推移，黄色部位会逐渐加深至深褐色，伴有枯萎，叶尖和叶片边缘最易出现枯萎现象，叶柄与叶脉处也会出现病斑，多数为穿孔性病斑。病健交接处有明显的黄色晕圈（见图2.2）。12 辽宁师范大学硕士学位论文图2.2珊瑚豆叶斑病病症Fig.2.2LeafspotofSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter2.2.2菌株的单斑分离率（1）鸟巢蕨：采用单斑分离法，从发病的鸟巢蕨感病组织中共分离出5株真菌，分别命名为P1、P2、P3、P4和P5，其单斑分离率各为29.5%、25%、4.5%、12.5%和8.3%（如图2.3）。其中菌株P1和P2分离率较高，初步认为二者可能是该叶斑病的致病菌。（2）珊瑚豆：从发病的珊瑚豆感病组织中共分离出3株真菌，分别命名为B17、B19和B22，其单斑分离率分别为4.17%、66.67%和4.17%，如图2.4所示。其中菌株B19的分离率较高，初步认为是该叶斑病的主要致病菌。13 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究图2.3鸟巢蕨分离菌株的单斑分离率Fig.2.3SinglespotseparationrateoftheisolatedstrainsinAspleniumnidus图2.4珊瑚豆分离菌株的单斑分离率Fig.2.4SinglespotseparationrateoftheisolatedstrainsinSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter2.2.3分离菌株的致病性检测（1）鸟巢蕨：以针刺法分别接种5株真菌后，调查发病率。结果是：P1和P2可使鸟巢蕨健康叶片发病，发病率分别是75%和66.7%，而接种P3、P4和P5的叶片未见发病（见表2.1和图2.5）；将P1和P2进行混合菌株接种处理后，其发病率是77.8%。（2）珊瑚豆：以针刺法分别接种3株真菌后，B17和B19可使珊瑚豆的健康叶片发病，二者发病率均为83.3%，而接种B22的健康叶片未见发病（见表2.1和2.6）；又将接种发病的2株菌B17和B19进行混合菌株接种处理，其发病率是100%。对鸟巢蕨和珊瑚豆的发病叶片再进行单斑分离，发现二次分离菌与接种菌的菌落及14 辽宁师范大学硕士学位论文分生孢子形态一致。由此可以认为：P1和P2是鸟巢蕨叶斑病的致病菌，B17和B19是珊瑚豆叶斑病的致病菌。表2.2分离菌株侵染试验Table2.2Theinfectedexperimentoftheisolatedstrains鸟巢蕨病斑分离株珊瑚豆病斑分离株菌株P1P2P3P4P5P1+P2B17B19B22B17+B19发病率（%）7566.700077.883.383.30100图2.5分离菌株接种发病的鸟巢蕨叶片（A为接种P1的病叶，B为接种P2的病叶，C为对照）Fig.2.5TheinfectedleavesofAspleniumnidus15 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究图2.6分离菌株接种发病的珊瑚豆叶片（A为接种B17的病叶，B为接种B19的病叶，C为对照）Fig.2.6TheinfectedleavesofSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter2.2.4分离菌株的鉴定（1）形态学鉴定结果①鸟巢蕨叶斑病的分离菌株P1：28℃、PDA培养基培养5d后，菌落正面为灰白色，有轮纹，反面为墨绿色至黑色，菌落外缘菌丝为白色，菌丝呈绒毛状放射性生长，菌落表面湿润，菌丝褐色至灰褐色（见图2.7A）；分生孢子倒棒状或手雷状，浅褐色至褐色，单生或2-3个串生，有横隔与纵膈，分生孢子梗簇生或单生，分生孢子大小约130-156.5×6.0-8.5μm（见图2.8A）。P2：28℃、PDA培养基培养7d后，菌落正面为白色至淡粉色，无轮纹，菌丝生长缓慢，初期紧凑而湿润，菌丝细并透明，匍匐生长，反面为淡粉黄色（见图2.7B）；分生孢子为透明，单细胞、聚成团状，倒卵圆形或圆柱状，分生孢子大小约4.2-5.0×1.5-2.0μm（见图2.8B）。②珊瑚豆叶斑病的分离菌株B17：28℃、PDA培养基培养7d后，几乎长满全皿，菌落正面为白色，无轮纹褶皱，菌丝呈绒毛状放射性密集生长，菌落表面干燥，反面为淡粉黄色，后期偶尔可见黑色圆点散步生长（见图2.7C）；分生孢子梗无色，分生孢子无色、圆柱状或棒状，大小7.0-19.5×3.5-5.5μm（见图2.9C）。16 辽宁师范大学硕士学位论文B19：28℃、PDA培养基培养6d后，菌落正面为墨绿色，有轮纹，菌丝呈绒毛状放射性生长，菌落表面湿润，反面为黑色（见图2.7D）；分生孢子浅褐色至中度褐色，长椭圆形或卵圆形，具横隔和纵膈，分生孢子链长，少则6-10个，多则10-18个串生，孢子链有短侧链，分生孢子大小13.0-41.5×7.5-12.5μm（见图2.9D）。17 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究图2.7病原菌菌落形态（A为P1菌落正反面，B为P2菌落正反面，C为B17菌落正反面，D为B19菌落正反面）Fig.2.7Colonymorphologyofthepathogen18 辽宁师范大学硕士学位论文图2.8病原菌菌丝及分生孢子形态（A为P1菌丝及孢子，B为P2菌丝及孢子）Fig.2.8Pathogenhyphaeandsporemorphology19 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究图2.9病原菌菌丝及分生孢子形态（C为B17菌丝及孢子，D为B19菌丝及孢子）Fig.2.9Pathogenhyphaeandsporemorphology依据分离菌株的形态结构，结合真菌鉴定分类手册[73]，对病原菌进行鉴定，其鉴定结果为：P1和B19同为半知菌亚门（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢目（Hyphomycetales）、暗色菌科（Dematiaceae）、链格孢属（Alternaria）的真菌，但所属种不同，P1为芸苔链格孢（Alternariabrassicae），而B19为橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）；P2为半知菌亚门（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丛梗孢目（Moniliales）、淡色菌科（Moniliaceae）、枝顶孢属（Acremoniumsp.）的交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）；B17为半知菌亚门（Deuteromycotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、黑盘孢目（Melanoconiales）、黑盘孢科（Melanconiaceae）、炭疽菌属的（colletotrichumgenera）胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）。20 辽宁师范大学硕士学位论文（2）分离菌株的分子生物学鉴定①致病菌rDNA-ITS区的DNA测序：四种致病菌P1、P2、B17和B19的DNA，以真菌通用引物ITS1和ITS4经PCR扩增后，电泳检测PCR扩增产物，600bp左右处可见明显特异性条带（见图2.10），说明DNA纯度及浓度较高。将剩余扩增产物送至上海生工进行DNA序列测定，测序结果显示，P1序列长度为535，P2序列长度为548，B17长度为533，B19长度为536（见附录I）。MB17P1P2B19M图2.10鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌的rDNA扩增图Fig.2.10TherDNAelectrophoresisresultsoftheleafspotpathogenofAspleniumnidusandSolanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter②鉴定结果：将4种病原菌rDNA-ITS区域的DNA序列测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，其结果显示P1与芸苔链格孢（Alternariabrassicae）[JX290140.1]的相似度为99%，所得分值最大，为966；P2与交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）[KF225143.1]的相似度为99%，所得分值最大，为992；B17与胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）[AB981196.1]的相似度为99%，所得分值最大，为963；B19与橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）[JX418334.1]的相似度为99%，所得分值为957。构建的系统发育树如图2.11、图2.12、图2.13和图2.14。分子生物学鉴定及形态学鉴定结果表明，鸟巢蕨叶斑病的病原菌有2种，分别是芸苔链格孢（Alternariabrassicae）和交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）；珊瑚豆叶斑病的病原菌也有2种，分别是胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和橘斑链格21 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究孢（Alternariacitrimacularis）。图2.11病原菌P1的系统发育树Fig.2.11PhylogenetictreeofP1图2.12病原菌P2的系统发育树Fig.2.12PhylogenetictreeofP222 辽宁师范大学硕士学位论文图2.13病原菌B17的系统发育树Fig.2.13PhylogenetictreeofB17图2.14病原菌B19的系统发育树Fig.2.14PhylogenetictreeofB192.3结论与讨论2.3.1结论依据单斑分离法和侵染试验证明，从鸟巢蕨叶斑病感病叶片中共分离出5株真菌，其中有2株为致病菌，命名为P1和P2，单斑分离率分别为29.5%和25%；从珊瑚豆叶斑病感病叶片中共分离出3株真菌，其中有2株为致病菌，命名为B17和B19，单斑分离率分别为4.17%和66.67%。分子生物学与形态学的鉴定结果表明：P1为芸苔链格孢23 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究（Alternariabrassicae），P2为交互枝顶孢（Acremoniumalternatum），B17为胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides），B19为橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）。2.3.2讨论植物生长过程中，细菌、真菌都可以侵染叶片，导致叶斑病的发生，所以关于植物叶斑病的研究报道有很多，但对于鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定研究鲜有报道。本文采用形态学和分子生物学鉴定法，查明了引起鸟巢蕨叶斑病的病原菌是芸苔链格孢（A.brassicae）和交互枝顶孢（A.alternatum），引起珊瑚豆叶斑病的病原菌是胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和橘斑链格孢（A.citrimacularis）。链格孢属真菌的寄主范围很广，相关研究报道有很多，芸苔链格孢（A.brassicae）作为链格孢属下的一个种，是多种植物的致病菌，例如SahaS[67]等曾报道芸苔链格孢（A.brassicae）可侵染十字花科花椰菜。关于交互枝顶孢（A.alternatum），有看似矛盾的研究结果，它对植物既有致病性也有诱导抗性的作用。它可引起沉香枝顶孢茎枯病[55]，但内生的交互枝顶孢（A.alternatum）又可作为生防制剂加以应用[50]；Kasselaki,AM[68]等曾研究了交互枝顶孢（A.alternatum）拮抗温室番茄白粉病的作用机理，发现热杀死后的孢子会释放出诱导寄主产生抗性的物质，因此可将交互枝顶孢（A.alternatum）作为生防制剂加以利用。胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）是农作物炭疽病的主要致病菌之一，其寄主范围很广，无特异专一性，如番木瓜科(Caricaceae)番木瓜属(CaricaL.)的番木瓜（CaricapapayaL.）[69]、茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)的辣椒（CapsicumannuumL.）[70]、藜科（Chenopodiaceae）碱蓬属（Suaeda）的辽宁碱蓬（SuaedaliaotungensisKitag.）[71]、忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属（LoniceraLinn.)的金银花（Lonicerajaponica）[72]等等，其可侵染植物的果实、叶片等，造成果实的腐烂、叶片乃至整株植株枯萎。橘斑链格孢（A.citrimacularis）可造成柑橘果实腐烂[73]，侵染茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)的珊瑚豆（Solanumpseudo-capsicumvardiflorum(Vell.)Bitter）为首次发现。虽然两种植物叶斑病的致病菌不是同种，但芸苔链格孢（A.brassicae）和橘斑链格孢（A.citrimacularis）同属链格孢属，因此，导致两种寄主叶片的初期症状相似，这可能与致病菌同为一个属的菌种有关。本实验中，胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）的单斑分离率与橘斑链格孢（A.citrimacularis）相比较低，但其致病率很高，其原因可能是橘斑链格孢（A.citrimacularis）为主要致病菌，而胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）为次要致病菌。24 辽宁师范大学硕士学位论文3鸟巢蕨与珊瑚豆叶斑病病原菌的生物学特性研究植物病害的发生、发展除了与病原菌有关外，环境因素对病原菌的生长繁殖、传播及寄主病情的发展有重要影响。适宜的环境条件有利于病原菌的生长和繁殖，环境条件的变化也会影响病原菌的侵染力、致病力以及病害的蔓延程度。本研究经分子生物学以及形态学鉴定结果表明，引起鸟巢蕨叶斑病的病原菌有2种，分别是芸苔链格孢（Alternariabrassicae）和交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）；珊瑚豆叶斑病的病原菌也有2种，分别是胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）。这四种菌对环境条件的影响反应即生物学特性如何有必要查明，以便分析病原菌的适应性、抗逆性及致病力，为两种植物叶斑病的防治提供依据。3.1材料与方法3.1.1实验材料（1）供试菌：P1（芸苔链格孢Alternariabrassicae）、P2（交互枝顶孢Acremoniumalternatum）、B17（胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides）和B19（橘斑链格孢Alternariacitrimacularis），由本实验分离鉴定。（2）培养基：①萨氏（Sabouraud's）培养基：蛋白胨（10g）、琼脂（20g）、麦芽糖（40g）、蒸馏水定容至1000ml。②无氮基础培养基：蔗糖（20g）、KH2PO3（3g）、MgSO4（1.5g）、琼脂（20g）、维生素B1（10mg）、维生素B2（10mg）、蒸馏水定容至1000ml。③无碳基础培养基：蛋白胨（3g）、KH2PO3（3g）、MgSO4（1.5g）、琼脂（20g）、维生素B1（10mg）、维生素B2（10mg）、蒸馏水定容至1000ml。④PDA（马铃薯琼脂培养基）：马铃薯（200g）、琼脂（20g）、葡糖糖（18g）、蒸馏水定容1000ml。（3）药品与试剂：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉、D-木糖、麦芽糖、蛋白胨、KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4、牛肉膏、酵母膏、尿素、维生素B1、维生素B2、吲哚乙酸、维生素B6、吲哚丁酸、萘乙酸、K2HPO4、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、NaH2PO4、CaCl2、HCl、NaOH等，均为国产分析纯。（4）仪器：超净工作台（YJ-875）、立式压力蒸汽灭菌器（YM100Z）、恒温培养箱（HH.B11）、光学显微镜（OLYMPUS，CX21）、水浴锅、湿度计等。3.1.2实验方法25 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究（1）温度对病原菌菌丝生长、产孢量的影响配制PDA培养基、灭菌、倒平板；以直径为8mm的无菌打孔器在活化好的病原菌平板上打孔，以接种铲将菌饼移至凝固至常温的PDA平板中央，于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃下暗培养；培养4d后用游标卡尺以十字交叉法测菌落直径；培养7d后以5ml无菌水洗脱每皿的孢子，混匀后以血球计数板在显微镜下计数，测定产孢量，每处理重复三次。（2）pH值对病原菌菌丝生长、产孢量的影响配制PDA培养基，以1mol/LNaOH溶液和1mol/LHCl溶液调节PDA培养基的pH值，pH值分别为4、5、6、7、8、9、10，灭菌、倒平板；以打孔器（8mm）取菌饼并以接种铲将其移至PDA平板中央，25℃暗培养；培养4d后用游标卡尺以十字交叉法测菌落直径，培养7d后以血球计数板计数产孢量，三次重复。（3）湿度对病原菌菌丝生长、产孢量的影响湿度调节采用小容器空气湿度调节法[71]，相对湿度分别为35%、55%、75%、95%。PDA培养基配制与接种方法、菌落及孢子检测方法与上述相同，三次重复。（4）光照对病原菌菌丝生长、产孢量的影响采用全黑暗（24D）、全光照（24L）与光暗交替（12L/12D）三种处理25℃下培养供试菌。PDA培养基配制、接种及菌落、孢子检测方法与上述相同，三次重复。（5）营养素对病原菌菌丝生长、产孢量的影响①不同碳源对病原菌的影响：配制无碳培养基，分别向无碳培养基中加入不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉、D-木糖、麦芽糖），以无碳培养基为对照。②不同氮源对病原菌的影响：配制无氮培养基，分别向无氮培养基中加入不同氮源（蛋白胨、KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4、牛肉膏、酵母膏、尿素），以无氮培养基为对照。③不同无机盐对病原菌的影响：配制萨氏（Sabouraud's）培养基，分别向萨氏（Sabouraud's）培养基中加入不同无机盐（K2HPO4、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、NaH2PO4、CaCl2），以萨氏（Sabouraud's）培养基为对照。④不同生长因子对病原菌的影响：配制萨氏（Sabouraud's）培养基，分别向萨氏（Sabouraud's）培养基中加入不同生长因子（维生素B1、维生素B2、吲哚乙酸、维生素B6、吲哚丁酸、萘乙酸），以萨氏（Sabouraud's）培养基为对照。将上述不同营养素的培养基灭菌后倒平板，以打孔器取菌饼、以接种铲将其移至平板中央，25℃培养；培养4d后用游标卡尺以十字交叉法测菌落直径；培养7d后以血球计数板计数产孢量；三次重复。26 辽宁师范大学硕士学位论文（6）病原菌生长曲线的测定使用PDA培养基，以打孔器打孔、接种铲取菌饼接种，25℃下黑暗培养，每天用游标卡尺以十字交叉法测菌落直径，以血球计数板计数产孢量，三次重复。3.2结果与分析3.2.1温度对病原菌菌丝生长、产孢量的影响温度对病原菌影响的检测结果表明，四种病原菌在5℃时菌丝均停止生长且不产孢，在10-35℃的温度范围内菌丝均可正常生长；B17、B19、P2在10-35℃的温度范围内可正常产孢，但当温度超过30℃后P1无法产孢；四种菌的最适温度均为25℃，此温度下菌落直径与产孢量均最大（见表3.1和表3.2）。表3.1温度对B17和B19菌丝生长和产孢量的影响Table3.1EffectsoftemperatureonmycelialgrowthandsporulationquantityofB17andB19B17B19温度4d菌落直径7d产孢量4d菌落直径7d产孢量（℃）（cm）（×106个/ml）（cm）（×106个/ml）50a0a0a0a100.840b0.17a1.431b0.17a152.352c0.90b2.619c4.15ab203.997d1.50c4.007d8.24b256.269e2.48d4.522e104c305.043f2.18d3.495f8.18b352.764g1.25bc2.089g0.15a注1）：字母a-g表示0.05水平下各数据间的差异显著性（下同）。表3.2温度对P1和P2菌丝生长和产孢量的影响Table3.2EffectsoftemperatureonmycelialgrowthandsporulationquantityofP1andP2P1P2温度4d菌落直径7d产孢量4d菌落直径7d产孢量（℃）（cm）（×106个/ml）（cm）（×106个/ml）50a0a0a0a101.885b0.01a0.892b0.09a153.009c0.15ab1.368c0.12a204.133d0.69c1.720d1.25a254.661e1.00bc1.930d60b303.048c0a1.334c8.48c351.257f0a1.072b7.33c27 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究3.2.2pH值对病原菌菌丝生长、产孢量的影响表3.3和表3.4数据显示，四种病原菌在pH为4-10之间均能正常生长，但P1在pH=4时无法产孢。当pH=6时，B17和P1的菌落直径最大，生长速率最快；pH=5时，B19和P2的菌落直径最大，生长速率最快；B17的适宜产孢pH值为7，B19和P2的适宜产孢pH值为8，但此时二者的生长速率明显下降，P1的适宜产孢pH值为6。由此可以看出，相比碱性环境，四种病原菌更适宜在偏酸性环境下生长。表3.3pH值对B17和B19菌丝生长和产孢量的影响Table3.3EffectsofpHonmycelialgrowthandsporulationquantityofB17andB19B17B19pH4d菌落直径7d产孢量4d菌落直径7d产孢量（cm）（×106个/ml）（cm）（×106个/ml）43.755a0.14a3.139a0.10a56.269b0.88ab4.522b2.50bcf66.325b1.50bc4.356c2.75bc75.887c2.67d4.241d4.75d85.634d1.75ce4.000e5.63e95.284e1.45be3.894f3.00bc104.907f1.33be3.495g1.69bf表3.4pH值对P1和P2菌丝生长和产孢量的影响Table3.4EffectsofpHonmycelialgrowthandsporulationquantityofP1andP2P1P2pH4d菌落直径7d产孢量4d菌落直径7d产孢量（cm）（×105个/ml）（cm）（×107个/ml）43.762a0a1.160a0.05a54.661b4.00bc1.930b2.53a64.735b6.00bc1.900b6.00b74.014c4.00bd1.887b9.20c83.693a3.00d1.887b15.20d93.386d3.00d1.874b13.60d103.276d1.00a1.761c8.60bc3.2.3湿度对病原菌菌丝生长、产孢量的影响表3.5和表3.6表明，四种病原菌在相对湿度为35%-95%环境下均可正常生长并产28 辽宁师范大学硕士学位论文孢；除B19外，湿度对其他三种病原菌菌落生长的影响无显著性差异、对P1和P2产孢量的影响也无显著性差异；当湿度达到95%时，B17和B19的生长速率最快，菌落直径最大，产孢量最多，此时P1和P2的生长速率同样最快，但二者最适产孢湿度分别为35%和55%。表3.5湿度对B17和B19菌丝生长和产孢量的影响Table3.5EffectsofhumidityonmycelialgrowthandsporulationquantityofB17andB19B17B19湿度4d菌落直径7d产孢量4d菌落直径7d产孢量（%）（cm）（×105个/ml）（cm）（×105个/ml）354.332a0.67a4.218a2.47a554.398a1.00a4.258a2.73a754.502a1.27a4.144a5.50a954.518a4.50b4.553b23.00b表3.6湿度对P1和P2菌丝生长和产孢量的影响Table3.6EffectsofhumidityonmycelialgrowthandsporulationquantityofP1andP2P1P2湿度4d菌落直径7d产孢量4d菌落直径7d产孢量（%）（cm）（×105个/ml）（cm）（×107个/ml）354.063a1.13a1.635a0.72a553.754a0.60a1.786a2.00a753.697a1.00a1.714a1.87a954.306a1.00a1.847a1.93a3.2.4光照对病原菌菌丝生长、产孢量的影响由表3.7和表3.8可以看出，光照对四种病原菌菌落生长的影响无显著性差异，但对产孢量的影响差异显著，并且这种显著性差异在B17和P2上表现的尤为明显。全黑暗条件下，B17的产孢量约为全光照和光暗交替条件下产孢量的20倍、P2产孢量为全光照和光暗交替条件下产孢量的80倍和115倍，四种病原菌均在全黑暗条件下产孢最多，说明全黑暗条件更有利于四种病原菌产孢。29 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究表3.7光照对B17和B19菌丝生长和产孢量的影响Table3.7EffectsoflightonmycelialgrowthandsporulationquantityofB17andB19B17B19光照4d菌落直径7d产孢量4d菌落直径7d产孢量（cm）（×104个/ml）（cm）（×106个/ml）12L/12D4.084a9.02a4.124a0.59a24L3.953a8.99a4.164a5.87b24D3.997a218b4.007a8.24c表3.8光照对P1和P2菌丝生长和产孢量的影响Table3.8EffectsoflightonmycelialgrowthandsporulationquantityofP1andP2P1P2光照4d菌落直径7d产孢量4d菌落直径7d产孢量（cm）（×105个/ml）（cm）（×106个/ml）12L/12D4.155a3.49a1.730a0.59a24L4.356a3.86a1.682a0.83a24D4.133a6.92b1.720a68b3.2.5营养素对病原菌菌丝生长、产孢量的影响（1）碳源的影响：由图3.1和图3.2可以看出，不同的碳源对病原菌B17、B19、P1有不同的影响，但不同碳源对P2的菌丝生长以及P1的产孢量影响不大；B17对果糖有很好的利用效果，菌丝生长较快，但乳糖对B17产孢量的促进效果较好；B19对D-木糖的利用效果较好，此时菌丝生长较快、产孢量较多；P1在乳糖培养基上菌丝生长较好，在麦芽糖培养基上产孢量最大；P2在蔗糖培养基上菌丝生长速率较快、在D-果糖培养基上利于产孢。四种病原菌在无碳培养基上均可生长但长势不旺，菌落松散、菌丝色白、产孢量低。30 辽宁师范大学硕士学位论文碳源图3.1碳源对B17、B19、P1和P2菌丝生长的影响Fig.3.1EffectsofdifferentcarbonsourceonmycelialgrowthofB17,B19,P1andP2碳源图3.2碳源对B17、B19、P1和P2产孢量的影响Fig.3.2EffectsofdifferentcarbonsourceonsporulationquantityofB17,B19,P1andP2（2）氮源的影响：在酵母膏培养基（酵母膏为氮源）上，B17、B19、P1的菌丝生长速率较快、菌落直径大，而P2在KNO3培养基（KNO3为氮源）上生长速率较快；四种病原菌在不同氮源培养基上的产孢情况不同，在对照培养基和以（NH4）2SO4培养基（（NH4）2SO4为氮源）上四者均不能产孢，B17在牛肉膏培养基（牛肉膏为氮源）上产孢量较多，B19和P2在蛋白胨培养基（蛋白胨为氮源）上产孢量较多，而P1则产孢量极低，每视野下观察到的孢子数屈指可数。四种病原菌在对照培养基上均可生长，但长势不旺，菌丝松散、色白（图3.3和图3.4）。31 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究氮源图3.3氮源对B17、B19、P1和P2菌丝生长的影响Fig.3.3EffectsofdifferentnitrogensourceonmycelialgrowthofB17,B19,P1andP2氮源图3.4氮源对B17、B19、P1和P2产孢量的影响Fig.3.4EffectsofdifferentnitrogencarbonsourceonsporulationquantityofB17,B19,P1andP2（3）无机盐的影响：四种病原菌在对照培养基以及含不同无机盐的培养基上均可生长，但对不同无机盐的利用情况不同；B17在含NaH2PO4的培养基上菌丝生长最快，其次排序为FeSO4、CaCl2，而K2HPO4、ZnSO4和MgSO4会不同程度的抑制B17的菌丝生长；B19在含CaCl2的培养基上菌丝生长最快，其次是NaH2PO4，其余无机盐会不同程度的抑制B19的菌丝生长；P1在含MgSO4的培养基上菌丝生长最快，其次是K2HPO4和NaH2PO4，其余无机盐会不同程度的抑制P1的菌丝生长；P2在含NaH2PO4的培养基32 辽宁师范大学硕士学位论文上菌丝生长最快，其次是K2HPO4、MgSO4、FeSO4、CaCl2，菌丝在含ZnSO4的培养基上长势最差，几乎不生长。B17和P2的产孢量在含K2HPO4的培养基上最大，分别为3.9×107和6.4×107；B19和P1的产孢量在含NaH62PO4的培养基上最大，分别为9.5×10和2.5×106，P1在其他无机盐培养基上产孢极低（图3.5和图3.6）。无机盐图3.5无机盐对B17、B19、P1和P2菌丝生长的影响Fig.3.5EffectsofdifferentinorganicsaltonmycelialgrowthofB17,B19,P1andP2无机盐图3.6无机盐对B17、B19、P1和P2产孢量的影响Fig.3.6EffectsofdifferentinorganicsaltonsporulationquantityofB17,B19,P1andP2（4）生长因子的影响：试验结果表明，四种病原菌在含不同生长因子的培养基上均可正常生长并产孢，但是效果各不相同。维生素B6促进B17菌丝生长的效果最好，其次是维生素B2，而维生素B1、吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸会不同程度的抑制B1733 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究菌丝生长；B19和P1的菌丝在吲哚乙酸培养基上生长速率最快，而吲哚丁酸和萘乙酸会抑制B19的菌丝生长，萘乙酸、维生素B6、吲哚丁酸和维生素B2会抑制P1的菌丝生长；六种生长因子对P2菌丝生长均有不同程度的促进作用，P2在吲哚丁酸培养基上菌丝生长最快。B17、B19和P2在维生素B1培养基上产孢量最大，分别为3.05×106、4.25×106和1.49×107；P1在此类培养基上产孢量极低且差异性显著（图3.7和图3.8）。生长因子图3.7生长因子对B17、B19、P1和P2菌丝生长的影响Fig.3.7EffectsofdifferentgrowthfactoronmycelialgrowthofB17,B19,P1andP2生长因子图3.8生长因子对B17、B19、P1和P2产孢量的影响Fig.3.8EffectsofdifferentgrowthfactoronsporulationquantityofB17,B19,P1andP23.2.6病原菌的生长曲线34 辽宁师范大学硕士学位论文由图3.9可见，四种菌比较，B17长势较旺盛，P2长势弱，B19和P1生长曲线类似、长势中等；四种菌均在3-4d时生长速率较快，随后增速平缓。时间/d图3.9病原菌B17、B19、P1和P2的生长曲线Fig.3.9GrowthcurveofB17,B19,P1andP23.3结论与讨论3.3.1结论（1）P1-芸苔链格孢（Alternariabrassicae）：产孢和菌丝生长最适温度均为25℃，最适pH值=6；95%湿度利于菌丝生长，而35%的湿度适宜产孢；光照对菌丝生长速率的影响不大，但黑暗更利于产孢；最适碳源和氮源分别为乳糖、酵母膏，MgSO4利于菌丝生长、NaH2PO4利于产孢，吲哚乙酸利于菌丝生长，但抑制其产孢。（2）P2-交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）：产孢和菌丝生长最适温度均为25℃；pH=5时利于菌丝生长，pH=8时适宜产孢；95%的湿度利于菌丝生长，55%的湿度适宜产孢；光照对菌丝生长速率的影响不大，但全黑暗更利于产孢；蔗糖和果糖是菌丝生长和产孢的最佳碳源，KNO3和NaH2PO4、吲哚丁酸利于菌丝生长，而蛋白胨和K2HPO4、维生素B1适宜产孢。（3）B17-胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）：产孢和菌丝生长最适温度均为25℃；pH值=6时菌丝生长最快、pH值=7时产孢量最大；湿度为95%时，最适于菌丝生长和产孢；光照对菌丝生长速率的影响不大，但是全黑暗更利于产孢；最适碳源和氮源分别为果糖和乳糖、牛肉膏和酵母膏，NaH2PO4和维生素B6适宜菌丝生长、K2HPO4和维生素B1适宜产孢。35 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究（4）B19-橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）：产孢和菌丝生长最适温度均为25℃；pH值=5时利于菌丝生长、而pH为8利于产孢；95%的湿度利于菌丝生长和产孢；光照对菌丝生长的影响不大，但全黑暗更利于产孢；最适碳源和氮源分别为木糖、酵母膏和蛋白胨；菌丝生长最适无机盐为CaCl2，而产孢最适为NaH2PO4；菌丝生长最适生长因子为吲哚乙酸，而产孢最适为维生素B1。3.3.2讨论植物病害的发生不单单与病原菌的种类有关，环境条件也是一项必不可少的因素，包括温度、pH值、相对湿度、光照等等，适宜的环境条件会促进病原菌的生长，加重植物病情。因此，查明环境对病原菌的影响，有利于发现病原菌抗性的薄弱环节、营造不利于病原菌生长繁殖的环境条件，找到最佳防治时期，以减轻病害的发生及蔓延。本研究查明，引起珊瑚豆叶斑病的病原菌是胶孢炭疽菌（B17）和橘斑链格孢（B19），两种菌的生物学特性比较结果表明，B17和B19均喜湿，喜黑暗，在10-35℃下均能生长并产孢，但低温条件下B19的产孢量更大，适宜pH值的范围广，因此认为B19更能适应低温、酸碱性复杂的环境，抗逆性强于B17。引起鸟巢蕨叶斑病的病原菌是芸苔链格孢（P1）和交互枝顶孢（P2），两种菌的生物学特性比较结果表明，P1和P2同样喜湿，喜黑暗，但在同等条件下，P1的生长速率明显快于P2；P1的最适pH值为6，而P2为8时产孢量最大；P1的适宜产孢湿度为35%，而P2的为55%。由此认为P1较P2更适宜偏酸、干燥的环境，抗逆性较强。因此，在花卉日常的栽培管理过程中，尽量避免大湿阴暗环境，营造不利于病原菌生长繁殖的环境条件。从氮源对病原菌的影响来看，四种菌在不同氮源培养基上的产孢情况不同，在无氮源和以（NH4）2SO4为氮源的培养基上四种菌均生长不良及不能产孢；从无机盐对病原菌的影响来看，四种菌对不同无机盐的利用情况不同，ZnSO4和FeSO4等盐类会不同程度的抑制菌丝生长和产孢量。因此，栽培生长中可多使用（NH4）2SO4类氮肥和ZnSO4、FeSO4类微量元素肥料，以抑制病原菌生长和产孢，减轻病情。36 辽宁师范大学硕士学位论文4拮抗菌和化学药剂对两种叶斑病病原菌的抑菌试验4.1材料与方法4.1.1实验材料（1）供试菌：鸟巢蕨叶斑病病原菌P1-芸苔链格孢（Alternariabrassicae）和P2-交互枝顶孢（Acremoniumalternatum），珊瑚豆叶斑病病原菌B17-胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和B19-橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）。四种菌均由本实验分离鉴定。（2）拮抗菌：蜡状芽孢杆菌(BacilluscereusFrankland)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、枯草芽孢杆菌(Bacillusstutilis)、珊瑚豆内生拮抗菌B18-B和B19-B（分离获得）。几种菌均由本实验室分离鉴定。（3）培养基：PDA（马铃薯琼脂培养基）：马铃薯（200g）、琼脂（20g）、葡糖糖（18g）、蒸馏水定容1000ml。LB固态培养基：胰蛋白胨（10g）、酵母提取物（5g）、NaCl（10g）、琼脂（15g）、pH=7.0、去离子水定容至1000ml。LB液态培养基：胰蛋白胨（10g）、酵母提取物（5g）、NaCl（10g）、pH=7.0、去离子水定容至1000ml。（4）农药：70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(江苏龙灯化学有限公司)，10%苯醚甲环唑（陕西恒田化工有限公司），50%多菌灵可湿性粉剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)，80%代森锰锌可湿性粉剂(美国仙农有限公司)。（5）器具：超净工作台（YJ-875）、恒温培养箱（HH.B11）、立式压力蒸汽灭菌器（YM100Z）、全自动微生物检定仪（VITEK2-30）、摇床、研钵、镊子、酒精灯、剪刀等。4.1.2实验方法1.拮抗菌对两种叶斑病病原菌的抑菌试验（1）鸟巢蕨与珊瑚豆内生拮抗菌的初筛与分离纯化1）无菌水冲洗鸟巢蕨和珊瑚豆健康叶片，无菌滤纸吸干叶片表面水分后，在无菌操作台中，将健康叶片依次浸入无菌水、75%酒精、无菌水、75%酒精、无菌水、0.5%次氯酸钠、无菌水进行表面消毒，时长为1min-2min，无菌滤纸吸干健康叶片表面水分后，分别置于无菌研钵中，加入适量无菌水充分研磨后，静置30-60min。2）配制马铃薯琼脂培养基、灭菌、倒平板，并用移液枪吸取叶片研磨上清液混于37 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究平板中，每皿加入2ml上清液，待平板凝固后，置于28℃恒温培养箱中培养，分离各种内生菌。3）以打孔器打孔、无菌接种铲取四种病原菌菌饼接种于平板中央，以接种环挑取内生菌接种于病原菌菌饼周围，于28℃恒温培养箱中培养，观察抑菌圈的大小。4）配制LB固态培养基、灭菌、倒平板，划线法纯化初步筛选出来的拮抗菌，保存备用。（2）内生拮抗菌的鉴定：采用全自动微生物鉴定仪（VITEK2-30）鉴定内生拮抗菌。1）鉴定前准备：将分离纯化的内生拮抗菌进行革兰氏染色，区分阳性菌和阴性菌。2）全自动微生物鉴定仪鉴定：①以无菌移液枪吸取3mlNaCl溶液（0.45%）于无菌试管中，并将试管置于电子比浊计内，以无菌棉签沾取适量待测内生拮抗菌于NaCl溶液中，配成浊度为0.5-0.63Mac的菌悬液。②根据革兰氏染色结果选择鉴定卡，将恢复至室温的鉴定卡依次放置在卡架上，输样管插入比浊度为0.5-0.63Mac的菌悬液中并做好标记，置于仪器填充仓内，设置参数，待填充完后，将卡架置入装载仓内进行读卡以及最终读取结果。（3）拮抗菌的抑菌试验：采用五点对峙法[74]。配制PDA培养基、灭菌、倒平板；在活化好的病原菌平板上打孔（直径8mm），将菌饼接种于PDA平板中央，以菌饼为中心，在半径为2.5cm左右的圆周上，以无菌接种针等距接种从鸟巢蕨和珊瑚豆中筛选得到的内生拮抗菌以及实验室保留菌种，以不接种拮抗菌的为对照组，标明日期编号后置于28℃恒温培养箱中培养4d，测量菌落直径（因P2生长速率慢，故测定7d菌落直径），计算抑菌率。抑菌率=（对照组菌落直径-实验组菌落直径）/对照组菌落直径×100%（4.1）2.农药对两种叶斑病病原菌的抑菌试验（1）以无菌水将农药配成有效浓度为80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml的溶液。（2）配制PDA培养基、灭菌，待温度降至50℃左右时，以无菌移液枪分别吸取2ml不同种类、不同浓度的药液，混匀、凝固、制平板；对照组加等量的无菌水。（3）以无菌打孔器在活化好的病原菌平板上打孔，并将菌饼接种于混有药剂和无菌水的PDA平板中央，标明日期编号后置于28℃恒温培养箱中培养4d，测量菌落直径，计算抑菌率。抑菌率=（对照组菌落直径-实验组菌落直径）（/对照组菌落直径-菌饼直径）×100%（4.2）38 辽宁师范大学硕士学位论文4.2结果与分析4.2.1鸟巢蕨与珊瑚豆内生拮抗菌的初筛结果试验结果表明，珊瑚豆内生菌中有两株细菌对病原菌有拮抗作用，分别命名为B18-B和B19-B；而鸟巢蕨中未分离到拮抗菌。B18-B对病原菌B19-橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）和P1-芸苔链格孢（Alternariabrassicae）有拮抗作用，B19-B对四种病原菌P1-芸苔链格孢（Alternariabrassicae）、P2-交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）、B17-胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和B19-橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）均具有拮抗作用（见图4.1）。图4.1内生拮抗菌初筛结果Fig.4.1Thepreliminaryscreeningresultsofendophyticantagonisticbacterium4.2.2珊瑚豆内生拮抗菌的鉴定珊瑚豆内生拮抗菌B18-B和B19-B均为革兰氏阴性杆菌。VITEK2的鉴定结果显示，B18-B为泛菌属细菌（Pantoeaspp），B19-B为肺炎克雷伯菌臭鼻亚种（Klebsiellapneumoniasspozaenae）（见图4.2和图4.3）。39 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究图4.2内生拮抗菌B18-B鉴定结果Fig4.2TheidentificationresultofB18-B40 辽宁师范大学硕士学位论文图4.3内生拮抗菌B19-B鉴定结果Fig4.3TheidentificationresultofB19-B4.2.3拮抗菌对病原菌的抑菌效果抑菌试验结果表明，珊瑚豆内生拮抗菌B18-B对病原菌B19-橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）和P1-芸苔链格孢（Alternariabrassicae）有拮抗作用，抑菌率分别为14.6%和73.6%。珊瑚豆内生拮抗菌B19-B、环状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对四种病原菌P1-芸苔链格孢（Alternariabrassicae）、P2-交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）、B17-胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和B19-橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）均具有拮抗作用。B19-B对四种病原菌的抑菌率分别是68.4%、62.7%、67.3%和24.6%；环状芽孢杆菌对四种病原菌的抑菌率分别是60.2%、63.3%、76.0%和17.3%；枯草芽孢杆菌对四种病原菌的抑菌率是53.5%、29.2%、33.3%和18.4%。苏云金芽孢杆菌和蜡状41 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究芽孢杆菌对四种病原菌均未有拮抗作用（见图4.4、图4.5、图4.6、图4.7、表4.1和表4.2）。四种拮抗菌比较而言，B19-B对B17的抑菌效果要强于其他三种拮抗菌；环状芽孢杆菌和B19-B对B19的抑菌效果较好；环状芽孢杆菌和B18-B对P1的抑菌效果较好；B19-B对P2的抑菌效果较好（见图4.8）。图4.4拮抗菌对病原菌的抑菌效果Fig4.4Theantibacterialeffectsofantagonisticbacterium42 辽宁师范大学硕士学位论文图4.5拮抗菌对病原菌的抑菌效果Fig4.5Theantibacterialeffectsofantagonisticbacterium43 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究图4.6拮抗菌对病原菌的抑菌效果Fig4.6Theantibacterialeffectsofantagonisticbacterium44 辽宁师范大学硕士学位论文图4.7拮抗菌对病原菌的抑菌效果Fig4.7Theantibacterialeffectsofantagonisticbacterium表4.1内生拮抗菌对病原菌的抑菌结果Table4.1ThebacteriostasisresultsofendophyticantagonisticbacteriumB18-BB19-B对照菌落病原菌菌落直径抑菌率菌落直径抑菌率直径（cm）（cm）（%）（cm）（%）B175.420--1.71468.4B193.6283.10014.61.35262.7P14.4841.18473.61.46867.3P23.090--2.32924.645 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究表4.2实验室保留菌种对病原菌的抑菌结果Table4.2Thebacteriostasisresultsoflaboratorystrains病对照菌蜡状芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌环状芽孢杆菌枯草芽孢杆菌原落直径菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌（cm）径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）B175.420----2.15660.22.51853.5B193.628----1.33063.32.56929.2P14.484----1.07876.02.98933.3P23.090----2.55617.32.52218.4图4.8四种拮抗菌对病原菌的抑菌效果比较Fig4.8Thebacteriostaticeffectoffourantagonisticbacterium4.2.4化学药剂的抑菌效果四种农药代森锰锌、多菌灵、甲基硫菌灵和苯醚甲环唑对四种病原菌P1-芸苔链格孢（Alternariabrassicae）、P2-交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）、B17-胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和B19-橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）均具有抑制作用，但抑菌效果不同（见表4.3、表4.4、表4.5和表4.6）。就四种农药比较而言，苯醚甲环唑对四种病原菌的抑菌效果最好，其次为代森锰锌；就浓度比较而言，有效浓度为200μg/ml的苯醚甲环唑对B17、B19和P2的抑菌率最高、效果最好，抑菌率分别高达93.9%、95.6%和71.55，300μg/ml的苯醚甲环唑对三者的抑菌率与200μg/ml的相差不大，有效浓度为300μg/ml的苯醚甲环唑对P1的抑菌率最高、效果最好，抑菌率高46 辽宁师范大学硕士学位论文达81.1%（见图4.9、图4.10、图4.11和图4.12）。表4.3苯醚甲环唑对病原菌的抑菌效果Table4.3Thebacteriostaticeffectofdifenoconazole对照80μg/ml100μg/ml200μg/ml300μg/ml病原菌落菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌直径径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）B175.3761.31588.71.41986.51.08093.91.09293.6B193.7161.21985.61.16687.40.92995.60.93995.2P13.6271.75266.31.71867.51.53973.91.33381.1P21.5551.29933.91.15053.61.01571.51.01671.4表4.4代森锰锌对病原菌的抑菌效果Table4.4Thebacteriostaticeffectofmancozeb对照80μg/ml100μg/ml200μg/ml300μg/ml病原菌落菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌直径径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）B175.3764.00330.03.91831.93.68936.93.22447.0B193.7162.68635.32.89028.32.44143.71.31082.5P13.6272.56937.43.16216.42.76530.51.91160.7P21.5551.38422.61.30832.71.33828.71.17150.9表4.5多菌灵对病原菌的抑菌效果Table4.5Thebacteriostaticeffectofcarbendazim对照80μg/ml100μg/ml200μg/ml300μg/ml病原菌落菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌直径径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）B175.3764.43020.74.59117.24.73614.04.76613.3B193.7163.41110.53.03423.43.15919.12.90627.8P13.6273.6240.13.28412.13.00422.03.26912.7P21.5551.45413.41.30732.81.41618.41.24840.747 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究表4.6甲基硫菌灵对病原菌的抑菌效果Table4.6Thebacteriostaticeffectofthiophanate-methyl对照80μg/ml100μg/ml200μg/ml300μg/ml病原菌落菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌落直抑菌菌直径径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）径（cm）率（%）B175.3764.83112.04.73414.04.67315.44.46220.0B193.7163.29214.53.41410.43.4389.53.28015.0P13.6273.5861.53.5781.73.5741.93.5383.1P21.5551.57.31.5125.71.4977.71.5184.9图4.9四种化学药剂对B17的抑菌效果比较Fig.4.9ThebacteriostaticeffectoffourchemicalagentsonB1748 辽宁师范大学硕士学位论文图4.10四种化学药剂对B19的抑菌效果比较Fig.4.10ThebacteriostaticeffectoffourchemicalagentsonB19图4.11四种化学药剂对P1的抑菌效果比较Fig.4.11ThebacteriostaticeffectoffourchemicalagentsonP149 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究图4.12四种化学药剂对P2的抑菌效果比较Fig.4.12ThebacteriostaticeffectoffourchemicalagentsonP24.3结论与讨论4.3.1结论经全自动微生物鉴定仪鉴定，从珊瑚豆中分离出的两种内生拮抗细菌B18-B和B19-B分别为泛菌属（Pantoeaspp）细菌和肺炎克雷伯菌臭鼻亚种（Klebsiellapneumoniasspozaenae），而鸟巢蕨中未分离出拮抗菌。抑菌试验结果表明，珊瑚豆内生拮抗菌B19-B和环状芽孢杆菌的抑菌效果较好。珊瑚豆内生拮抗菌B19-B对病原菌B17的抑菌率高达68.4%；B19-B和环状芽孢杆菌对病原菌B19的抑菌率分别为62.7%和63.3%；环状芽孢杆菌对病原菌P1的抑菌率为76%。四种农药苯醚甲环唑、代森锰锌、多菌灵和甲基硫菌灵对鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌均有不同程度的抑菌效果，其中苯醚甲环唑的抑菌效果最好。200μg/ml浓度的苯醚甲环唑对B19和P2的抑菌率可高达95.6%和71.5%。4.3.2讨论20世纪70年代-80年代，生物农药逐渐走入人们的视野，随着技术的发展以及环保意识的提高，渐渐受到人们的重视，并以高选择性、高安全性以及低生态影响性等优点成为植保专家学者、工作者的重要研究课题之一。植物内生菌是指在健康植物体内生活的微生物。研究证明，内生菌不但积极地存在于植物体内，还具有多种生物活性，例如分泌生长素促进植物生长、固氮、溶磷、增强植株抗病抗逆性和对病虫害的防治等作50 辽宁师范大学硕士学位论文用[75]。人们已经意识到，植物内生菌这种互利共栖、和谐共生的生命形式，可能成为被未来生态型农业发展所利用的重要资源。尤其是从中筛选出来的病原拮抗菌，可用来制备生物农药，代替化学农药的使用，以高效、低毒、低残留等优势受到大力推广。本研究从珊瑚豆中分离出两种内生拮抗细菌B18-B和B19-B分别为泛菌属（Pantoeaspp）细菌和肺炎克雷伯菌臭鼻亚种（Klebsiellapneumoniasspozaenae）。抑菌试验结果表明，内生拮抗菌B18-B对病原菌P1（芸苔链格孢）有较高的抑制作用，抑菌效果高达73.6%；B19-B对病原菌B17（胶孢炭疽菌）、B19（橘斑链格孢）和P1（芸苔链格孢）抑菌率分别达到68.4%、62.7%和67.3%。胡春锦等人从甘蔗体内分离出一株固氮泛菌属细菌，该菌株可显著促进植物生长并可抗多种植物病原真菌，有望用于生产具有促生及抑制植物病害的固氮微生物菌剂和生物有机肥[75]。但是，B18-B（泛菌属细菌）和B19-B（肺炎克雷伯菌）都属于人体条件致病菌。B19-B（肺炎克雷伯菌臭鼻亚种）能引起慢性萎缩性鼻炎、泌尿系感染、败血症等，而有关其用于植物病原菌抑菌研究未见报道。基于此，二者的应用实践性还有待商榷。以枯草芽孢杆菌防止植物病害历史悠久[76]，大量试验表明，枯草芽孢杆菌能抑制多种植物病原菌以及病害，如串珠镰孢菌[77]、人参黑斑菌和锈腐菌[78]、采后板栗黑斑病[79]等。姬婧媛[80]等还发现，植物内生枯草芽孢杆菌对小麦全蚀病病菌有拮抗作用，采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术、快速蛋白液相色谱(FPLC)和酸沉淀分离鉴定植物内生枯草芽孢杆菌的抗真菌活性物质并研究其抑菌活性，其结果显示，抗菌活性物质之一抗菌肽Fengycins对小麦全蚀病菌菌丝生长抑制作用最强，同时造成菌丝细胞质外渗、细胞壁溃解、细胞畸形等。本试验中，枯草芽孢杆菌对四种病原菌均具有抑菌活性，尤其是对病原菌B17（胶孢炭疽菌）抑菌率高达53.5%。一直以来，人们对环状芽孢杆菌的研究中，基因克隆与表达以及发酵方面居多。近年来，环状芽孢杆菌作为植物病害的拮抗菌，正逐渐走入人们的视线。王美琴[81]等研究发现，番茄植株内生环状芽孢杆菌对番茄灰霉病菌具有抑制作用，且可诱导番茄果实产生抗病性。本试验发现，环状芽孢杆菌对四种病原菌均具有抑菌作用，对B17（胶孢炭疽菌）、B19（橘斑链格孢）和P1（芸苔链格孢）的抑菌率分别为60.2%、63.3%和76.0%，其抑菌效果好于枯草芽孢杆菌。余家楠[82]研究发现，环状芽孢杆菌对银杏叶斑病病原细极链格孢的抑菌率也很高，可达80.88%。由此可见，环状芽孢杆菌是一种很有开发价值的、可作为生物农药的优势菌种。因此，在生物防治实践中，对于由胶孢炭疽菌、橘斑链格孢、芸苔链格孢、交互枝顶孢引起的植物病害，可以施以枯草芽孢杆菌或环状芽孢杆菌制成的生物农药，既减少了化学药剂对环境的污染，避免抗药性的发生，同时又可以很好的达到防治效果。由四种化学药剂对病原菌的抑菌效果可以看出，苯甲丙环唑比多菌灵、代森锰锌和甲基硫菌灵的抑菌效果好。200μg/ml浓度的苯醚甲环唑对B19（橘斑链格孢）和P2（交51 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究互枝顶孢）的抑菌率可高达95.6%和71.5%；1000倍液的苯甲丙环唑对银杏叶斑病两种病原菌链格孢（Alternariaalternata）和细极链格孢（Alternariatenuissima）的抑菌率也分别高达75.79%和80.11%[82]。唐正合等[83]试验表明，丙环唑对水稻纹枯病菌的菌丝生长抑制作用很强，对水稻纹枯病可以起到很好的防治作用。因此，建议园林部门在鸟巢蕨和珊瑚豆等园林植物叶斑病的防治中，凡由胶孢炭疽菌、橘斑链格孢、芸苔链格孢、交互枝顶孢等病原菌引起的植物病害，以施用苯醚甲环唑为好。52 辽宁师范大学硕士学位论文结论1.鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌的鉴定：采用单斑分离法从染病叶片病斑处分离出4个菌株即P1、P2、B17和B19，依据科赫氏法则进行侵染试验，证明了他们均具有致病性；结合形态学与分子生物学两种方法最终确定，四种病原菌真菌为：芸苔链格孢（Alternariabrassicae）和交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）分别为鸟巢蕨叶斑病致病菌P1和P2；胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）分别为珊瑚豆叶斑病致病菌B17和B19。2.鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌生物学特性的研究：四种病原真菌的最适温度均为25℃，光照对他们的菌丝生长影响不大，但全黑暗更利于产孢。（1）B17-胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）：pH值为6时菌丝生长最快、pH值=7时产孢量最大；湿度为95%时，最适于菌丝生长和产孢；最适碳源为果糖和乳糖，最适氮源为酵母膏和牛肉膏，NaH2PO4适宜菌丝生长、K2HPO4适宜产孢，维生素B6适宜菌丝生长、维生素B1利于产孢。（2）B19-橘斑链格孢（Alternariacitrimacularis）：pH值为5时利于菌丝生长、而pH为8利于产孢；95%的湿度利于菌丝生长和产孢；最适碳源为木糖，最适氮源为酵母膏和蛋白胨；菌丝生长最适无机盐为CaCl2，而产孢最适为NaH2PO4；菌丝生长最适生长因子为吲哚乙酸，而产孢最适为维生素B1。（3）P1-芸苔链格孢（Alternariabrassicae）：菌丝生长和产孢最适pH值为6；95%湿度利于菌丝生长，而35%的湿度适宜产孢；最适碳源是乳糖，最适氮源为酵母膏，MgSO4利于菌丝生长、NaH2PO4利于产孢，吲哚乙酸利于菌丝生长，但抑制其产孢。（4）P2-交互枝顶孢（Acremoniumalternatum）：pH=5时利于菌丝生长，pH=8时适宜产孢；95%的湿度利于菌丝生长，55%的湿度适宜产孢；光照对菌丝生长速率影响不大，但全黑暗更利于产孢；蔗糖和果糖是菌丝生长和产孢的最佳碳源，KNO3利于菌丝生长而蛋白胨适宜产孢，NaH2PO4利于菌丝生长而K2HPO4适宜产孢，吲哚丁酸利于菌丝生长而维生素B1适宜产孢。3.拮抗菌和化学药剂对四种叶斑病病原菌的抑菌活性研究:珊瑚豆中筛选出两株内生拮抗菌B18-B和B19-B，分别为泛菌属细菌（Pantoeaspp）和肺炎克雷伯菌臭鼻亚种（Klebsiellapneumoniasspozaenae）。抑菌试验结果表明，珊瑚豆内生拮抗菌B19-B和环状芽孢杆菌的抑菌效果较好。珊瑚豆内生拮抗菌B19-B对病原菌B17的抑菌率高达68.4%；B19-B和环状芽孢杆菌对病原菌B19的抑菌率分别为62.7%和63.3%；环状芽孢杆菌对病原菌P1的抑菌率为76%。四种农药苯醚甲环唑、代森锰锌、多菌灵和甲基硫菌灵对鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病病原菌均有不同程度的抑菌效果，其中苯醚甲环唑的抑菌效果最好。200μg/ml浓度的苯醚53 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究甲环唑对B19和P2的抑菌率可高达95.6%和71.5%。54 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辽宁师范大学硕士学位论文附录A鸟巢蕨与珊瑚豆叶斑病病原菌的测序结果>P1rDNA-ITS碱基序列：ACCAGATCGTACCTGATCCGAGGTCAAAAGTTGAAAAAAAGGCTTAATGGATGCTAGACCTTTGCTGATAGAGAGTGCGACTTGTGCTGCGCTCCGAAACCAGTAGGCCGGCTGCCAATTACTTTAAGGCGAGTCTCCAGCAAAGCTAGAGACAAGACGCCCAACACCAAGCAAAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCTTTGGAATACCAAAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAATTATTAATTTGTTACTGACGCTGATTGCAATTACAAAAGGTTTATGTTTGTCCTAGTGGTGGGCGAACCCACCAAGGAAACAAGAAGTACGCAAAAGACAAGGGTGAATAATTCAGCAAGGCTGTAACCCCGAGAGGTTCCAGCCCGCCTTCATATTTGTGTAATGATCCCTCCGCAGGCCACCCTA>P2rDNA-ITS碱基序列：AGATTGGGAATTCTACCTGATCTGAGGTCAACCTTGAGAAGTGGGGGGTTTAACGGCGTGGTTCAACCGCTATCCTGCCGCGAGAGGTTTAATTACTGCACGGAGGAGTTCGCGAGGGAACCGCCACTGGATTTCAGGGCCAGCCGCCGCCAGGGGCAGGCTGATCCCCAACGCCAGGTCCCGCGAACGGGTCCTGAGGGTTGAAATGACGCTCAGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTTTGATTTATTTGCTTATGCCACTCAGAAATACACTAAAAGACAAGAGTTTGGAGCCTCCGGCGGACGCCTGGGTCCGGGCCGCGCGAACGCGCCCGGGGCGAGGCCGCCGAAGCAACAGTGGTAGGTTCACAATGGTTTGGGAGTTTTTACACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTCACCCTACGGAA>B17rDNA-ITS碱基序列：GGAGGGGTCTTCTACCTGATCCGAGGTCACCTTTGGAAAATTGGGGGTTTTACGGCAAGAGTCCCTCCGGATCCCAGTGCGAGACGTAAAGTTACTACGCAAAGGAGGCTCCGAGAGGGTCCGCCACTACCTTTGAGGGCCTACATCAGCTGTAGGGCCCCAACACCAAGCAGAGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTGATTATTTGCTTGTACCACTCAGAAGAAACGTCGTTAAATCAGAGTTTGGTTATCCTCCGGCGGGCGCCGACCCGCCCGGAGGCGGGAGGCCGGGAGGGTCGCGGAGACCCTACCCGCCGAAGCAACAGTTATAGGTATGTTCACAAAGGGTTGTAGAGCGTAAACTCAGTAATGATCCCTCCGCAGG>B19rDNA-ITS碱基序列：TAAATTGGATGCGTACCTGATCGAGGTCAAAGTTGAAAAAAAGGCTTAATGGATGCTAGACCTTTGCTGATAGAGAGTGCGACTTGTGCTGCGCTCCGAAACCAGTAGGCCGGCTGCCAATTACTTTAAGGCGAGTCTCCAGCAAAGCTAGAGACAAGACGCCCAACACCAAGCAAAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCTTTGGAA59 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究TACCAAAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAATTATTAATTTGTTACTGACGCTGATTGCAATTACAAAAGGTTTATGTTTGTCCTAGTGGTGGGCGAACCCACCAAGGAAACAAGAAGTACGCAAAAGACAAGGGTGAATAATTCAGCAAGGCTGTAACCCCGAGAGGTTCCAGCCCGCCTTCATATTTGTGTAATGATCCCTCCGCAGGCACCCCA60 辽宁师范大学硕士学位论文攻读硕士学位期间发表学术论文情况[1]姜华,鲍竹,王晶.药用观赏植物-鸟巢蕨叶斑病病原菌鉴定初报.辽宁师范大学学报，2016,39（1）：93-97.[2]俞家楠,杨策,鲍竹,等.拮抗菌和药剂对银杏病原菌的抑菌试验.天津农业科学，2015，21（4）：113-116.61 鸟巢蕨和珊瑚豆叶斑病的病原菌鉴定及生物学特性研究致谢时光荏苒，岁月如梭。转眼间，三年的研究生生活已近尾声。回望过去，幕幕往事却如电影一样，清晰的在眼前回放：入学时激动兴奋的心情、实验遇到瓶颈时的沮丧、与老师交流时的醍醐灌顶……对于这一切的一切，我有太多的不舍与感谢。首先，我要感谢我的导师--姜华老师，从论文的选题、方案设计，到论文的撰写，无一不是您细心关怀的结果，严谨的教学、科研态度，渊博的专业知识，平易近人的人格魅力，传授给我的不单是学业知识，还包含很多人生道理，您不但是我的学业指导老师，同时，也是我人生道路上的指引人，为我拨开眼前的迷雾，鼓励我勇敢的向前。其次，还要特别感谢吕国忠老师在实验上对我提供的帮助，感谢师姐邵璐、杨策、赵婷婷、罗苏平、吕雪鑫，感谢时东宁同学，感谢师妹李艳超、崔丽红，谢谢您们的帮助，使得本论文得以顺利完成。另外，我要感谢父母对于我每次选择的无条件支持，为我创造无忧的学习、生活环境，使我在实现梦想的道路上无后顾之忧。同时，谢谢我的室友乔瑞红、张馨元、陈秋月，因为有了你们，使得这三年的生活变得更加丰富多彩，为单调的学习生活调色，我们一起的欢声笑语将是我一生的财富。最后，感谢各位答辩老师在百忙之中抽时间对本论文的认真审阅以及提出的宝贵意见。62
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