牛副流感病毒3型间接ELISA检测方法的建立与初步应用

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ClassifiedIndex：Code：10224Confidential（yes/no）：noNO.：140920883DissertationfortheProfessionalMasterDegreeEstablishmentandPreliminaryApplicationofanIndirectELISAfortheDetectionofAntibodyAgainstBovineParainfluenzaVirusType3Candidate：YangJianleSupervisor：Vice-Prof.LiJieResearcherHeHongbinDegreeCategory：MasterofEngineeringCollege：CollegeoflifescienceResearchField：BiologicalengineeringStudyMode：full-timeHarbinChinaJune2016 目录目录摘要.....................................................................................................................................................I英文摘要..........................................................................................................................................III1引言................................................................................................................................................11.1研究目的与意义....................................................................................................................11.2文献综述.................................................................................................................................21.2.1BPIV3病原学..................................................................................................................21.2.2BPIV3流行病学.............................................................................................................61.2.3BPIV3诊断......................................................................................................................61.3研究内容.................................................................................................................................81.4技术路线.................................................................................................................................92材料与方法..................................................................................................................................102.1试验材料..............................................................................................................................102.1.1重组菌、病毒、血清及临床样品.............................................................................102.1.2主要试剂.......................................................................................................................102.1.3主要仪器和设备..........................................................................................................102.2试验方法..............................................................................................................................102.2.1抗原表位区域的筛选..................................................................................................102.2.2目的基因的克隆...........................................................................................................112.2.3重组原核表达载体pET28a（+）-NP-HN的构建与鉴定....................................142.2.4融合蛋白NP-HN的诱导表达...................................................................................142.2.5融合蛋白NP-HN可溶性分析...................................................................................152.2.6融合蛋白NP-HN的纯化、鉴定及浓度测定..........................................................152.2.7多克隆抗体的制备与检测.........................................................................................152.2.8间接ELISA检测方法的建立与优化.......................................................................162.2.9临床样品检测...............................................................................................................173结果与分析..................................................................................................................................183.1抗原表位区的筛选..............................................................................................................183.2NP-HN基因的PCR扩增...................................................................................................183.3克隆载体pEASY-T1-NP-HN酶切鉴定...........................................................................193.4表达载体pET28a（+）-NP-HN的鉴定.........................................................................203.5融合蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化...................................................................203.6融合蛋白NP-HN的鉴定...................................................................................................213.7多克隆抗体的制备与检测.................................................................................................223.7.1多克隆抗体效价测定..................................................................................................22I 东北农业大学工程硕士学位论文3.7.2多克隆抗体特异性的检测.......................................................................................223.7.3Westernblot检测多克隆抗体.....................................................................................223.8间接ELISA工作条件的优化...........................................................................................233.8.1包被抗原及一抗的最佳稀释浓度.............................................................................233.8.2抗原包被的最佳条件的确定.....................................................................................243.8.3最适封闭液及封闭时间的选择.................................................................................243.8.4最佳二抗浓度的选择..................................................................................................253.8.5最佳显色时间的选择..................................................................................................253.8.6BPIV3间接ELISA判定标准.....................................................................................263.8.7特异性试验...................................................................................................................263.8.8敏感性试验...................................................................................................................273.8.9重复性试验...................................................................................................................273.8.10符合率试验.................................................................................................................283.9临床样品检测......................................................................................................................284讨论..............................................................................................................................................304.1目的基因的选择..................................................................................................................304.2NP-HN融合蛋白的原核表达.............................................................................................304.3多克隆抗体的制备..............................................................................................................314.4间接ELISA方法的建立....................................................................................................315结论..............................................................................................................................................33致谢...................................................................................................................................................34参考文献..........................................................................................................................................35附录...................................................................................................................................................42攻读硕士学位期间发表的学术论文............................................................................................43II CONTENTSCONTENTSAbstractinChinese..........................................................................................................................IAbstractinEnglish........................................................................................................................III1.Introduction..................................................................................................................................11.1Researchpurposeandmeaning..............................................................................................11.2Reviewoftheliterature..........................................................................................................21.2.1BPIV3etiology................................................................................................................21.2.2EpidemiologyofBPIV3..................................................................................................61.2.3DiagnosticmethodsofBPIV3........................................................................................61.3Studycontent...........................................................................................................................81.4Technologyroadmap..............................................................................................................92.MaterialsandMethods.............................................................................................................102.1ExperimentalMaterials........................................................................................................102.1.1Recombinantbacteria,virus,serumandclinicalsamples.........................................102.1.2Mainreagents.................................................................................................................102.1.3MainInstrumentsandequipmen..................................................................................102.2Experimentalmethods..........................................................................................................102.2.1Screeningofepitoperegion..........................................................................................102.2.2Purposegeneclone........................................................................................................112.2.3EstablishmentandidentificationofRecombinantofpET28a（+）-NP-HN.........142.2.4InductionofNP-HNfusionproteinexpressing..........................................................142.2.5SolubleanalysisofNP-HNfusionprotein..................................................................152.2.6Purification,identificationandconcentrationmeasurementofNP-HNprotein......152.2.7Preparationanddetectionofpolyclonalantibodies...................................................152.2.8EstablishmentandoptimizationofiELISAdetectionmethods................................162.2.9Clinicalsampletesting..................................................................................................173.Resultsanalysis..........................................................................................................................183.1Screeningofepitoperegion.................................................................................................183.2PCRamplificationofNP-HNgene.....................................................................................183.3ThedigestionresultsofpEASY-T1-NP-HN......................................................................193.4TheEstablishmentandIdentificationofpET28a（+）-NP-HN.....................................203.5Theinductionexpressing,solubleanalysisandpurificationofNP-HNprotein.............203.6TheidentificationofNP-HNfusionprotein......................................................................213.7Thepreparationanddetectionofpolyclonalantibodies...................................................223.7.1TiterdetectionofpolyclonalantibodybyiELISA.....................................................22III 东北农业大学工程硕士学位论文3.7.2Specificdetectionofpolyclonalantibodies................................................................223.7.3ThedetectionofpolyclonalantibodiesbyWesternblot...........................................223.8OptimizationofiELISAworkingconditions.....................................................................233.8.1Determinationoftheoptimumconcentrationofantigenandserum........................233.8.2Theresultoftheconditionforcoatingofantigen.......................................................243.8.3Selectionoftheoptimalclosedandtime....................................................................243.8.4Determinationofoptimalconcentrationofthesecondantibodies...........................253.8.5TheselectionoftheoptimalChromogenictime........................................................253.8.6DeterminationofjudgmentstandardofBPIV3iELISA...........................................263.8.7Theresultofspecificitytest.........................................................................................263.8.8Theresultofsensitivitytest.........................................................................................273.8.9Theresultofrepeatabilityassay..................................................................................273.8.10Theresultofconformanceassay................................................................................283.9Thedetectionofclinicalsample..........................................................................................284.Discussion....................................................................................................................................304.1Selectionofpurposegene....................................................................................................304.2TheprokaryoticexpressionofNP-HN...............................................................................304.3Thepreparationofpolyclonalantibodies...........................................................................314.4EstablishmentofNP-HNiELISA........................................................................................315.Conclusion..................................................................................................................................33Acknowledgement..........................................................................................................................34Reference.........................................................................................................................................35Appendix.........................................................................................................................................42PaperspublishedintheperiodofPh.M.education................................................................43IV 摘要摘要牛副流感病毒3型（Bovineparainfluenzavirustype3，BPIV3）为单股负链有囊膜的RNA病毒，是引起牛呼吸道综合征（Bovinerespiratorydiseasecomplex，BRDC）的重要病原之一，主要引起牛的上呼吸道感染，称为牛副流行性感冒（Parainfluenzabovum），以支气管炎、肺炎等呼吸道症状为主要特征，严重者甚至能引起流产，给养牛业带来了巨大的损失。目前国内针对BPIV3的研究尚处于起步阶段，还没有特别有效的BPIV3商品化检测试剂盒，鉴于BPIV3强大的传播能力和巨大的危害性，建立一种方便准确的BPIV3检测方法迫在眉睫。研究发现，BPIV3的NP蛋白是BPIV3中含量最高的蛋白之一，高度保守，其上存在3个主要抗原表位，有2个分布在C端。HN蛋白是表面抗原，在进化过程中高度保守。HN和NP蛋白，都具有很好的作为检测抗原的能力。将NP蛋白和HN蛋白抗原表位基因串联表达，作为检测抗原，在原理上可以放大检测效果。本实验根据BPIV3SD2014株NP蛋白和HN蛋白的氨基酸序列，应用Lasergene软件分别对这两个蛋白的序列进行分析，同时查阅文献报道，最终确定NP蛋白的C端388aa~515aa，HN蛋白的C端355aa~572aa为优势抗原区。将选定的NP和HN蛋白抗原表位通过重叠延伸PCR方法串联（命名为NP-HN），构建pET28a（+）-NP-HN原核表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达该串联蛋白，将表达出的蛋白命名为NP-HN融合蛋白。以融合的NP-HN蛋白作为包被抗原，建立了BPIV3间接ELISA诊断方法。本实验具体研究内容及结果如下：1.通过重叠延伸PCR扩增技术，成功获得NP-HN截短串联基因，并将其连接至pET28a（+）载体，成功构建了原核重组表达载体pET-28a（+）-NP-HN。将该质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）形成阳性转化子，经IPTG诱导，成功表达了大小为44kDa的NP-HN融合蛋白。2.利用Ni-NTA亲和层析方法纯化NP-HN融合蛋白，纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE验证其有较高纯度。纯化后的蛋白经Western-blot检测，结果证明NP-HN融合蛋白能识别BPIV3阳性血清。利用PierceBCA蛋白定量分析试剂盒对纯化的NP-HN蛋白进行浓度测定，其蛋白浓度为900µg/ml。3.将纯化的NP-HN蛋白免疫3只新西兰白兔，制备了血清效价为1:32000的多克隆抗体。利用此多克隆抗体，分别对BPIV3、BVDV和IBRV全病毒进行ELISA检测，结果显示此多克隆抗体能与BPIV3发生反应，与BVDV和IBRV不发生反应，表明纯化的NP-HN蛋白具有良好的免疫反应性和免疫特异性。制备的多克隆抗体经westernblot检测，结果显示全病毒的NP和HN蛋白能与多克隆抗体结合，这也间接说明融合蛋白NP-HN可以作为间接ELISA方法的检测抗原。4.BPIV3间接ELISA诊断方法的建立利用纯化后的NP-HN融合蛋白作为包被抗原，建立BPIV3间接ELISA检测方法。利用标准的阳性血清和阴性血清优化反应条件，确立最适反应条件：抗原包被浓度4µg/ml，37℃包被1h后4℃包被过夜；封闭液为20%马血清，37℃封闭1.5h；血清稀释度为1:50，37℃孵I 东北农业大学工程硕士学位论文育1h；兔抗牛HRP稀释度为1:4000，37℃孵育1h；TMB显色液作用时间10min，1MH2SO4终止，用酶标仪测定OD450nm。确定该ELISA检测方法的判定标准为：将待测样品OD450nm≥0.30定为阳性，OD450nm＜0.30定为阴性。包被的重组融合蛋白NP-HN与牛病毒性腹泻粘膜病病毒和牛传染性鼻气管炎病毒无交叉反应，批间和批内重复性试验的变异系数小于8%。用所建立间接ELISA诊断方法与血清中和试验比较，总体总符合率为96.67%；与美国爱德士BPIV3间接ELISA试剂盒比较，总体符合率为95.56%。5.临本样本的检测利用所建立的BPIV3间接ELISA诊断方法对采自山东、辽宁和天津的3个奶牛场的270份临床血清样本进行检测，总的阳性率为82.59%，表明上述牛场存在BPIV3的感染与流行。关键词：牛副流感病毒3型；NP-HN基因；原核表达；多克隆抗体；ELISA检测方法II AbstractEstablishmentandPreliminaryApplicationofanIndirectELISAfortheDetectionofAntibodyAgainstBovineParainfluenzaVirusType3AbstractBovineparainfluenzavirustype3（BPIV3）isanenveloped,non-segmented,negative-sense,single-strandedRNAvirus,andcancausebovinerespiratorysyndrome（BRDC）withotherpathogen.Itmainlycauseupperrespiratoryinfectionsofadultcattleandcalvesandthemainclinicalfeaturesisbronchitis,pneumoniaandotherrespiratorysymptoms,theseriousanimalevencancausemiscarriage.Ithasbroughthugelossesincattleindustry.Atpresent,theresearchofBPIV3isstillpoorinChina.Thereisanotparticularlyeffectivecommercializationdetectionkit,andconsideringthepowerfulcommunicatingabilityandgreatharmofBPIV3,itisimminenttoestablishaconvenient,accuratedetectionmethodofBPIV3.ThestudyfoundthatNPproteinofBPIV3isoneofthehighestconcentrationproteinsinBPIV3anditishighlyconserved,therearethreemajorepitopesonit,twolocatedofthemintheC-terminus.HNproteinisasurfaceantigenandhighlyconservedduringevolution.TheHNandNPproteinshaveagoodabilitytodetectantigen.UsingtheepitopegenesofHNandNPproteininseries,asadetectionantigen,canamplifydetectioninbetterprinciple.Inthisstudy,weanalyzedaminoacidsequencingoftheNPandHNproteinofSD2014BPIV3byLasergenesoftwareandcombiningliterature.Thedominantantigenicregion,thatC-terminal388aa~515aaofNPproteinandC-terminal355aa~572aaofHNprotein,wasdetermined.SelecteNPandHNproteinepitopeandmakeitinseries（namedNP-HN）.pET28a（+）-NP-HNvectorofprokaryoticexpressionwasconstructed.WeoptimizedtheELISAreactionconditionsusingtheNP-HNrecombinantproteinascoatingantigen,andestablishedaniELISAmethodtospecificallydetectthepositiveserumofBPIV3.FurthertheiELISAmethodwascomparedwithvirusneutralizationtestandimportedELISAkits,respectively.Thespecificcontentandresultsareasfollows:1.ThisstudysuccessfullyclonedtruncatedNP-HNgeneandcreatedpET28a（+）-NP-HNprokaryoticexpressionplasmid,andtheplasmidwassuccessfullytransformedintoE.coliBL21（DE3）,IPTGinducedtheBL21theresultshowsthatthetargetprotein（NP-HNfusionprotein）wasabundantlyexpressed,andthesizeis44kDa.2.Culturelargenumbersofrecombinantbacteriaandinducetogetabundancetargetprotein,applicationHis-tagnickelcolumnaffinitychromatographypurifiedprotein.HigherverifypurityofIII 东北农业大学工程硕士学位论文thepurifiedproteinbySDS-PAGE.WeusewesternblottoanalysistheNP-HNfusionprotein,theresultshowsthatthepurifiedproteincanrecognizeBPIV3positiveserum.ThepurifiedNP-HNproteinisdetectedbyPierceBCAproteinquantitationKit,theproteinconcentrationis900μg/ml.3.UsingpurifiedNP-HNproteinimmunizeNewZealandwhiterabbitsforthreetimestogetpolyclonalantibodiesthatserumtiteris1:32000.UsingthispolyclonalantibodytotestBPIV3,BVDVandIBRVfullvirusbyELISArespectivelyandtheresultsshowedthatpolyclonalantibodiescanreactwithBPIV3,butnotwithBVDVandIBRV,theresultsuggestedthepurifiedNP-HNproteinhasgoodimmuneresponseandspecificity.ThepolyclonalantibodywasdetectedbywesternblotresultsshowedthattheNPandHNproteinoffullvirusiscapabletobindwithpolyclonalantibodies.ItalsoindirectlydescribedthatfusionproteinNP-HNepitopeshasnotchangedduringexpressionandpurificationprocess,andhasbiologicalactivitythatcanbeusedasadetectingantigenofindirectELISAmethod.4.EstablishmentofanindirectELISAforthedetectionofantibodyagainstBPIV3TakingthepurifiedrecombinantNP-HNproteinasantigen,weestablishedindirectELISAmethodfordetectingBPIV3antibody.Tovalidatetheassays,theELISAwasperformedwithstandardpositiveandnegativeseraofBPIV3.ModifiedreactionconditionofELISA:Antigenconcentrationwas4ug/mlandshouldbecoatedovernightat4℃;Blockingsolutionwas20%horseserum,andshouldclosurefor1.5h;Serumdilutionof1:50,incubationtimefor1h;Rabbitanti-bovine-HRPdilutionof1:4000,theincubationtimefor1h;TMBcolorationfor10min,1MH2SO4terminatedthereaction,thenusemicroplatereadertodeterminedOD450nm.Thecriterionofthisstudyisthatthetiterlessthan0.3arenegative,greaterthan0.3ispositive.TheNP-HNproteinhadnocrossreactionwithpositiveserumofbovineviraldiarrheavirusandinfectiousbovinerhinotracheitisvirus.Thecoefficientsofvariationforintraandinter-assaywerelowerthan8%.FurthertheiELISAmethodwascomparedwithvirusneutralizationtestandimportedELISAkits,respectively.ThetotalcoincidenceratewithvirusneutralizationtestandimportedELISAkitwere96.67%and95.56%.5.Thetotalpositiverateof270clinicalserumsamplesfromShandong,Liaoning,andTianjinwas82.59%.IndicatingthatthereisinfectionandepidemicofBPIV3abovecattlefield.KeyWords:Bovineparainfluenzavirustype3;NP-HN;prokaryoticexpression;polyclonalantibodies;ELISAdetectionmethodCandidate:YangJianleSupervisor:Vice-Prof.LiJieResearcherHeHongbinSpeciality:BiologicalengineeringIV 引言1引言1.1研究目的与意义牛副流感病毒3型（Bovineparainfluenzavirustype3，BPIV3）是引起牛上呼吸道疾病的主要病原之一，能与其他病毒混合感染引起急性呼吸道疾病。因其感染牛常发病于牛的运输过程中，故又称“运输热”，以支气管炎、肺炎等呼吸道症状为主要特征，严重者甚至能引起流产。近年来，随着我国养牛业和出口贸易的不断发展，BPIV3造成的经济损失越来越严重，已经广泛得到人们的关注和重视。BPIV3可通过空气-飞沫经呼吸道而感染，具有易感染且流行范围极广等特点，自1959年Reisinger等第一次从美国一头患有“运输热”的犊牛的鼻涕液中分离出来此病毒开始，目前世界很多国家都陆续分离到该病毒。目前，国内尚无针对BPIV3特异方便有效的检测方法，国外的试剂盒也存在各种问题，研究表明不同地域BPIV3分离株存在变异现象，其次因为国外试剂盒价格比较昂贵，大范围检测成本高。目前实验室常用的诊断方法主要包括病毒分离培养、免疫学方法和分子生物学方法等。由于病毒的分离培养检出率低，并且对实验条件和操作人员的技能要求较高；分子生物学方法易出现假阳性，同时对试验的仪器设备依赖程度高；免疫学方法中的血凝与血凝抑制试验、病毒中和试验以及免疫荧光与免疫组化试验更倾向于BPIV3的科学研究，这些方法在规模化牧场大批量流调筛查中均受到限制，而ELISA方法目前在临床大规模流行病学调查中愈来愈受到青睐。间接ELISA方法具有快速敏感而且易于操作，适合大批量样本检测，成本也相对低廉等特点，是人们普遍接受且深受欢迎的的诊断方法。因此，针对BPIV3建立一种特异且准确的间接ELISA检测方法，成为当务之急。近期研究发现，BPIV3的核蛋白（NP）高度保守，其上存在3个主要抗原表位，有2个分布在C端。血凝素和神经氨酸酶蛋白（HN）是病毒抗原，在病毒进化过程中高度保守。HN和NP蛋白都具有很好的作为检测抗原的能力。本研究针对NP蛋白和HN蛋白，通过筛选主要抗原表位区并对其串联后原核表达，理论上放大该蛋白与相应抗体反应的敏感性，以此蛋白为包被抗原建立了BPIV3间接ELISA检测方法，具有成为良好的检测试剂盒潜质，有望为BPIV3的临床诊断和流行病学调查提供了参考和技术保障。1 东北农业大学工程硕士学位论文1.2文献综述1.2.1BPIV3病原学1.2.1.1BPIV3分类地位与分型BPIV3属于副黏病毒科病毒家族，有一个典型的负链RNA病毒结构。BPIV3最开始分离到时，因其引起的症状与流感病毒类似，将其归类于正粘病毒，后来鉴于BPIV3与其他流感病毒具有不的同理化性质和生物学性质，将其归于单股负链病毒目、副粘病毒科、副粘病毒亚科、呼吸道病毒属[1]。呼吸道病毒属的其他成员包括人副流感病毒1（Humanparainfluenzavirustype1，HPIV1），人副流感病毒3（Humanparainfluenzavirustype3，HPIV3）和仙台病毒（Sendaivirus，SeV）[2]。其中，BPIV3和HPIV3的主要蛋白氨基酸序列之间有着很高的相似度，其中NP（84%），P（56%），L（84%），M（89%），F（78.5%），HN（74.6%）[3]。2008年，Horwood等通过分子进化树分析等手段，发现4株澳大利亚BPIV3分离株与以前报道的BPIV3分离株存在一定的差异，将其命名为基因B型（BPIV3b），以前报道的分离株命名为基因A型（BPIV3a）[4]。2011年，我国科学家在我国山东发现新的基因型（SD0835），与以往的BPIV3分离株不同，命名为BPIV3基因C型[5]。1.2.1.2BPIV3基本生物学特征BPIV3和其他PIV一样，其病毒粒子直径为150~300nm，浮力密度为1.197g/cm3，沉降系数为42s和分子量大小为4.5×103KDa[6]。BPIV3是负链RNA病毒，基因组既在5′端即没有帽子结构，又在3′端没有polyA尾巴。但是在其基因组3′端非编码区有一段长度大约为55nt左右的系列，称为前导序列（1eadersequence）。5′端有一段长度约为44~171nt的非编码区系列，叫作尾随序列（Trailersequence）。BPIV3的引导序列和尾随序列，被普遍认为是作为顺式作用原件，在病毒RNA的复制和转录过程中起着极为重要的作用。在对BPIV3进行研究中，有一个原则普遍存在，即基因组RNA链的核苷酸数目必须能被6整除，即核苷酸数目为6n（n为自然数），这个原则称为“六碱基原则”[7,8]，核衣壳结构很严谨，每个核蛋白严格的与6个碱基结合。在每个基因的起始区和终止区都有一段称作“genestart”和“geneend”的保守序列，其作为重要的的转录调控信号调控着mRNAs的启动和终止。BPIV3的基因图谱如1-1[9]所示。2 引言图1-1BPIV3基因组结构示意图（不按比例）Fig.1-1SchematicofgenomeorganizationofBPIV3（nottoscale）BPIV3是由约15456个核苷酸组成6个基因的不分节段的单链RNA（3′-N-P-M-F-HN-L-5′），病毒编码9种共同蛋白。分别为NP/N（核衣壳蛋白）、P（磷蛋白）、L（大分子蛋白）、M（基质蛋白）、F（融合蛋白）、HN（血凝素和神经氨酸酶）以及V蛋白、C蛋白、D蛋白。其中V蛋白、C蛋白、D蛋白为非结构蛋白。结构蛋白大致分为两类，一类为内部蛋白，包括NP、P、L蛋白；另一类为外部蛋白，包括M、F、HN蛋白。牛副流感病毒结构模式图如图1-2[10]。图1-2副流感病毒结构简图Fig.1-2SketchpictureofparainfluenzavirusNP蛋白：NP蛋白是BPIV3中含量最高的蛋白质之一，同时NP蛋白基因邻近病毒基因3 东北农业大学工程硕士学位论文组RNA的3′末端前导序列，是BPIV3最先翻译的蛋白。NP蛋白由489~553个氨基酸（aa）组成，预测其蛋白分子量在53~58kDa之间。NP蛋白作为一种结构蛋白，高度保守。BPIV3的NP蛋白的N末端区域与病毒RNA的衣壳化有关，NP蛋白同L蛋白、P蛋白一起，与病毒基因组相互作用，形成具有螺旋结构的核衣壳。这种螺旋结构中具有多方面的作用，其中包括免受核酸酶消化、使末端RNA片段对齐建立一个有功能的3′端启动子和在转录与复制过程中使P蛋白和L蛋白相互作用，在病毒的组装过程中与M蛋白结合[11]。核衣壳的每一圈螺旋，其NP蛋白大约结合连续的6个碱基和13个亚基[12]。但每个螺旋的结合的NP蛋白亚基的数量和螺距存在着细微的差别[13]。BPIV3和仙台病毒的NP蛋白类似，N蛋白在感染细胞的过程中至少以两种形式存在，第一种形式是在核衣壳结构上与RNA紧密相关[2]；第二种是未装配可溶的形式，称作N0，被证明与P蛋白有关，这种形式在其他一些副粘病毒中也存在，如仙台病毒[14]，猴副流感病毒5型（SV5）[15]和人副流感病毒3型[16]等。P蛋白：BPIV3的P蛋白为其RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RDRP）的其中一个亚基，在病毒生长周期中与NP蛋白等多种蛋白相互作用，且对病毒RNA的合成起着至关重要的作用。副粘病毒的P蛋白含有约为400~600aa，副流感病毒3型的P蛋白约含596个氨基酸，分子量大小在50kDa左右。P蛋白在其N端区域内丝氨酸和苏氨酸残基发生大量的磷酸化。辅助蛋白大部分是由P基因重叠的开放阅读框架编码产生的，通过一个被称为RNA编辑或选择翻译的过程起始转录。这些辅助蛋白在病毒形态发生、RNA合成和制病机理上起着重要的作用。P蛋白独特的羧基和氨基端作为聚合酶辅助因子起着重要的作用，在预测的所有副粘病毒二级结构中，羧基端聚合酶辅助因子模板是保守的。N末端被认为作为一个分子伴侣促进与未装备的氨基结合，防止氨基的聚合及非病毒RNA不受控制的衣壳化。P蛋白作为多聚体发挥作用，其中仙台病毒的P蛋白是四聚体[17,18]。M蛋白：M蛋白是病毒粒子中含量最丰富的蛋白质，其包含341~375氨基酸残基，分子量在38.5~41.5kDa之间。在病毒粒子的结构和感染过程中起着重要的作用。在中性pH下，其净电荷是在14~17之间，使得其蛋白质显示碱性。M蛋白作为BPIV3的结构蛋白之一，在病毒包膜和核心之间，发挥着重要作用。在病毒粒子感染过程中，它能将病毒基因组吸引至细胞膜部位，并快速形成包膜帮助病毒的出芽释放[19]。M蛋白尽管没有足够长度的跨膜区域去穿透脂质双分子层结构，但M蛋白的某些疏水型的区域能与包膜相连接[20]。M蛋白在病毒的形成的过程中，发挥着核心作用，协调与HN、F等蛋白一起共同组装病毒粒子[21,22,23,24]。L蛋白：L蛋白位于基因组中启动子远端区域，在病毒颗粒中含量很少，一个副粘病毒中大约只有50拷贝的L蛋白。它是RDRP的一个亚基。L蛋白大约包含2200个氨基酸，分子量大小为220~250kDa。甲基化、聚合、5'末端封闭及3'端多腺苷酸化等过程中所需要的所有酶发挥活性都离不开L蛋白[25]。L蛋白和P蛋白联合起来形成有活性的病毒聚合酶复合体，其能够识别螺旋N-RNA模板[26]。BPIV3的L蛋白具有保守的结构域、模板识别结构、ATP结合位点和与其他呼吸道病毒属类似的聚合位点。F蛋白：BPIV3的F蛋白是由540个氨基酸组成的I型整合膜蛋白。在中性pH的条件下，F蛋白以融合蛋白的形式在病毒包膜和宿主细胞质膜之间调控病毒的穿入。BPIV3的SF/Ka株与910N株不同，在3'非翻译区域少了14个碱基[27]。病毒开始合成的F蛋白是一个无活性4 引言前体（F0），F0必须经过水解切割才能形成有活性的融合蛋白，从而具有生物学功能。产生的活性融合蛋白是由二硫键连接的F1和F2多肽组成。这种水解切割是十分有必要的[28,29]，其能使子代病毒具有感染性。对某些病毒来说，F0的切割水解是其是否具有感染性和致病性的一个关键和至关重要的决定因素。副粘病毒的F蛋白N末端区域具有切割信号序列，在切割位点有一个或多元碱基残基。具有多元碱基切割位点的F蛋白切割在细胞内由弗氏蛋白酶参与完成；而在切割位点只有一个碱基的F蛋白必须在细胞表面被表达，并结合到释放病毒颗粒，然后可通过加入外源性蛋白酶分裂激活。F蛋白的C端有一个疏水性跨膜区域，具有锚定蛋白进入膜的作用，留下一个大约20~40残基的较短的胞质尾巴。HN蛋白：HN蛋白是一个由565~582个氨基酸组成的II型跨膜蛋白，包含一个氨基末端胞质尾区，单一的氨基末端跨膜域和一个支持羧基端球型头结构的膜近侧柄状区域。球状头部结构包括受体结合和酶活性区域[30]。BPIV3的HN基因全长1888nt，有一个单独的开放阅读框，共翻译572个aa。HN蛋白是位于病毒粒子的表面[31]，是病毒主要的中和反应和保护性抗原。HN蛋白糖基化位点在不同型的BPIV3中数量波动很大，甚至是同型病毒的不同毒株间也会有差别，这可能是病毒逃避宿主免疫监测的一种策略。HN蛋白的第193号氨基酸对病毒尤为重要，其发生改变会对病毒产生巨大的影响，如改变病毒介导融合活性、神经氨酸苷酶的活性和血细胞凝集活性[32]。BPIV3的SK217分离株和SF/Ka分离株毒力的不同与第193号氨基酸有着很重要的关系[33]。HN蛋白是一种高度保守的蛋白，其可促进F的融合细胞的作用、诱导产生中和抗体。其氨基端，与神经氨酸酶活性有关。HN蛋白的羧基端，与唾液酸结合有关[34]，能介导吸附。HN蛋白含有6个抗原表位[35]，又能产生中和抗体，被广泛应用于疫苗研究和病毒检测。V、C和D蛋白：V、C和D蛋白是非结构蛋白，由P基因通过不同的翻译机制形成不同mRNA，进而翻译形成的不同蛋白质。通常地，由P基因产生多种不同mRNA涉及两种机制，一种是选择起始，C蛋白家族就是以这种机制从一个选择翻译起始密码子产生的；第二种机制是在特定的位置插入一些G核甘酸作为假模板，被称为mRNA编辑点，V蛋白和D蛋白是由此种机制产生的。V、C和D蛋白被认为在呼吸道病毒感染细胞过程中，可以抑制干扰素α/β。V蛋白在病毒复制过程中起着重要的作用[36]，用作负调节以抑制RNA的合成[37,38]，并与细胞蛋白的相互作用来抑制宿主细胞的抗病毒反应[39,40]。BPIV3在V蛋白已显示靶向黑素瘤分化抗原五型（melanomadifferentiationantigen-5，MDA5），但对用于阻断IFN-β激活信号的RIG-I没有靶向作用。D蛋白在病毒生长周期中的作用至今尚未完全清晰，但BPIV3的D蛋白不会在病毒感染细胞过程中阻止I型细胞干扰素的合成[41]，至于D蛋白的其它的作用，需要进一步的研究。C蛋白是较小的基本的多肽，可能参与在病毒生长周期，具有调控病毒RNA的合成，促进病毒感染细胞的作用[42]，促进病毒从感染细胞中释放[43,44]。BPIV3的C蛋白可能通过MDA5或RIG-I介导的信号抑制双链RNA合成，在一定水平上刺激IFN-β的产生[41]。现有的证据表明，V蛋白和C蛋白参与抑制I型干扰素，但BPIV3的V蛋白和C蛋白是否通过靶向JAK-STAT途径成员阻断β干扰素仍然需要进一步研究。5 东北农业大学工程硕士学位论文1.2.2BPIV3流行病学BPIV3遍布全球，一年四季都能发病。在温带气候，BPIV3的感染和发病常见于秋季和冬季[45-46]。一般是动物在受到恶劣的环境或者与其他病毒一起协同发病，研究表明环境因子，包括牛舍通风不佳，多尘和牛群密度过大，长途运输等情况下，与BPIV3相关的呼吸道疾病发病率明显增高[47]。BPIV3常和牛疱疹病毒I型（Bovineherpesvirus-1，BHV-1）、牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrhoeavirus，BVDV）、牛呼吸道合胞体病毒（Bovinerespiratorysyncytialvirus，BRSV）等一起，引起牛呼吸道综合征（Bovinerespiratorydiseasecomplex，BRDC）。当牛感染BPIV3时，可能会使溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛支原体等常见病原趁虚而入，引发其呼吸道疾病，甚至是肺炎，提高病牛死亡率。通常，患病牛鼻涕液中的BPIV3病原至少在3个小时内是稳定并且具有感染性的，在低温的环境下能大大地加强其致病力和传染性[48]。在易感动物之间，BPIV3主要通过呼吸道途径传播，其可能通过吸入参杂着患病动物的鼻涕液、飞沫，眼睛分泌物等的气溶胶，从而感染BPIV3。BPIV3有分布范围广，感染物种多等特点。BPIV3能感染很多动物，可以跨物种感染人、羊和非人类灵长动物[49-57]。与HPIV3不同，BPIV3发生在人与人之间的感染很少。BPIV3感染的犊牛和羔羊等一般不表现出临床症状，但是也有可能表现为严重的呼吸道疾病及肺炎。血清学调查发现，牛血清中BPIV3病毒抗体非常普遍，本病毒广泛分布于世界各地。BPIV3可通过空气-飞沫经呼吸道而感染，具有易感染且流行范围极广等特点，自1959年Reisinger等第一次从美国一头患有“运输热”的犊牛的鼻涕液中分离出来此病毒开始，世界很多国家都陆续分离到该病毒[58]。我国自2008年首次从黑龙江[59]和山东[60]分别分离到BPIV3，2009年又在内蒙古[61]报道分离到BPIV3，目前报道我国12个省份总的抗体阳性率为77.6%[62]，说明该病毒已经在我国大部分地区流行，国外报道BPIV3流行率最高可以达到90%[63]。在巴西法尤姆省，墨西哥的尤卡坦州和科利马，土耳其的马尔马拉，挪威，伊朗的沙赫尔库尔德市马什哈德，爱尔兰[64-68]，以及中国的黑龙江、辽宁、新疆、云南、贵州、广西、河北、山东、河南、江西、福建、内蒙古、吉林、山西等地，在牛的血清中都检测到BPIV3抗体的存在[69,70]。1.2.3BPIV3诊断1.2.3.1病毒的分离与鉴定病毒分离培养对实验条件和操作人员要求较高，同时分离病料的体外保存条件和时间也很关键。目前BPIV3易感细胞主要为牛的原代细胞、MDBK、Vero、Hela和Hep-2细胞等。采集病牛的鼻拭子或气管粘膜、肺部病变组织，接种上述易感细胞即可。BPIV3CPE早期经常引起细胞变大、变圆，局部细胞开始融合，晚期出现大面积融合，呈拉网状，细胞最后融合坏死并脱落。对分离获得的病毒可以进一步做免疫学与分子生物学的鉴定。6 引言1.2.3.2常规RT-PCRRT-PCR方法具有反应快速、灵敏度和特异性高，对失活的病原也能进行检测等优点，是目前传染性疾病进行实验室诊断的主要方法之一。国内外学者主要针对BPIV3的HN和NP基因建立了相应的RT-PCR检测方法。我国学者刘鹏[71]与刘晓乐[72]分别以BPIV3NP基因为靶基因设计引物，建立了BPIV3RT-PCR检测方法。Rodrigo根据BPIV3的HN基因保守区域设计引物，建立了扩增片段大小为1009bp检测方法，该方法能检测到下限为95pg的cDNA[73]。1.2.3.3多重RT-PCR由多种病原混合感染引起的牛呼吸道综合征（BRDC）给世界养牛业造成巨大经济损失，因此非常有必要针对BRDC病原建立多重RT-PCR，这样既节约成本，又提高病原检测的效率。我国研究者刘晓乐[74]和王嵩[75]分别建立了BPIV3与BVDV、BPIV3与BRSV的双重RT-PCR方法。郭利[76]于2014年建立了BRDC相关病毒BPIV3、BVDV、IBRV和BRSV的四重PCR检测方法。1.2.3.4实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR相对于常规PCR有很多优点，其敏感性高、特异性和重复性强，并且结果无需凝胶电泳，从样本处理到结果得出仅需3h。所以可以满足对大规模爆发的疫情做出快速准确的诊断，目前已广泛应用于多种病原体的快速检测。董秀梅等[77]2014年根据BPIV3膜蛋白M基因设计引物与探针，以体外转录法制备的cDNA标准品为模板建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法，结果显示灵敏性可最低检测17.6copies/μl。将定量与多重PCR结合，研究者[78]2011年首次报道应用多重定量PCR检测BRDC病原（BPIV3、BVDV和IBRV），同时也是首次应用实时荧光定量PCR检测BPIV3。随后Thonur等[79]也建立了BPIV3、BRSV和IBRV多重定量PCR诊断技术。1.2.3.5环介导逆转录等温核酸扩增技术（RT-LAMP）RT-LAMP方法不需要特殊的仪器设备，扩增反应一般在65℃1h内完成，扩增产物多，通常肉眼或比浊仪即可判定结果，灵敏度和特异性高，非常适合疾病现场的病原检测。师新川等[80]针对BPIV3的N基因设计并筛选了一套RT-LAMP引物，建立BPIV3特异性检测的RT-LAMP方法。该方法比RT-PCR敏感度更高，最低检出量可达0.069fg/μl，该方法可用于BPIV3的实验室检测和临床初步诊断。1.2.3.6血凝与血凝抑制试验血凝及血凝抑制试验具有简单、快捷、成本低等优点，常用来检测病毒。刘鹏等[81]对分离毒株进行血凝及血凝抑制试验，待测样本的血凝素效价为1:256，应用参考株的阳性血清进行血凝抑制试验，结果为阳性。Zhu等[5]在我国山东分离的4株BPIV3，血凝滴定效价在1:32~1:128之间。7 东北农业大学工程硕士学位论文1.2.3.7病毒中和试验病毒中和试验是经典的鉴定BPIV3的血清学检测方法，许多新建立的方法都需以该方法作为标准进行比较。但是，该方法操作复杂，试验周期长，这些弊端限制了其在临床上的快速诊断。霍志云等[69]对我国吉林、内蒙古和山西3个省区的BPIV3进行血清学调查，结果显示BPIV3阳性率为91.08%。王海勇等[70]对我国黑龙江等12个省份的血清样本进行病毒中和试验，发现BPIV3总的阳性率为77.6%。1.2.3.8免疫荧光与免疫组化试验这两种方法都是利用抗原抗体特异性反应原理，通过荧光标记的抗体，在荧光显微镜下直接观察结果。免疫荧光是以病料涂片或细胞病变液为检测对象，免疫组化是以患病动物易感的特异性组织为检测对象，定位和定性是其最大的优势。在研究BPIV3对小鼠与豚鼠的致病性时，其鼻腔与气管分泌物可应用免疫荧光进行定性检测，而鼻甲、气管、肺组织等可通过免疫组织化学方法进行BPIV3的定位。1.2.3.9酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA可以检测抗体和抗原，该方法不仅快速敏感而且操作简单，适合大批量样本检测，目前已被广泛应用于大规模的流行病学调查。ELISA为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，自从1971年被瑞典和荷兰学者提出，一直备受生物领域和化学领域关注。在生物学领域，ELISA广泛应用于测定液体样本中的蛋白、抗体或激素。目前ELISA主要包括四种方法:直接法、间接法、双抗夹心法以及竞争法。这四种方法各有优缺点：直接法操作简单，不需要二抗从而避免交互反应，但其一抗都必须用酶标记，一抗各种各样，不能满足每个一抗都能用酶标记，且不可能大量推广，费用过高；间接法二抗可以加强信号，一级抗体因为不用加酶标记，故可保留一抗较多的免疫反应性，但其可能发生交互反应；双抗夹心法灵敏度和专一性都很高，抗原也无需事先纯化，但抗原必须拥有至少两个抗体结合位点；竞争法可使用于比较不纯的样本，而且数据再现性较高，但是其整体的敏感性较差。目前针对BPIV3所建立的ELISA检测方法，主要是间接ELISA。间接ELISA拥有着快捷方便、灵敏度高、成本相对较低等优点，深为人们所接受。我国学者分别以BPIV3的NP蛋白[82]和HN蛋白[83]为抗原建立了相应的间接ELISA检测方法，有很高的灵敏度和准确度。国外学者也建立了BRDC多病原检测的多重ELISA方法，其在省时、省力、节省成本方面具有很好的应用前景[84]。1.3研究内容本实验研究内容主要分五个方面：（1）克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a（+）-NP-HN；（2）NP-HN重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定；（3）利用NP-HN重组蛋白免疫动物获得多克隆抗体，通过多克隆抗体与BPIV3全病毒8 引言的ELiSA和Westernblot实验验证NP-HN重组蛋白的免疫反应性和特异性；（4）BPIV3间接ELISA方法的建立及优化；（5）利用建立的BPIV3间接ELISA方法进行临床样本的检测。1.4技术路线引物设计NP-HN基克隆间标准对照阴、阳血清的准接构建重组表达质粒EpET28a（+）-NP-HNL试验牛血清的准I转化BL21（DE3）并诱导表SA方目的蛋白NP-HN的纯化法与检测的间接ELISA判定标准的建目的蛋白NP-HN浓度测立抗原包被浓度的确间接ELISA工作条件优化与VNT和国外试剂盒比图1-3本研究的技术路线Fig.1-3Thetechnicalrouteofthisstudy9 东北农业大学工程硕士学位论文2材料与方法2.1试验材料2.1.1重组菌、病毒、血清及临床样品pET28a（+）原核表达载体，BPIV3SD2014分离株（CGMCC9992），BPIV3抗体阳性血清和阴性血清，牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BovineViralDiarrheaVirus，BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（InfectiousBovineRhinotracheitisVirus，IBRV）阳性血清均为山东省农业科学院奶牛中心疾病研究实验室保存。270份临床血清样本分别采自山东省、辽宁省和天津市的3个奶牛场。2.1.2主要试剂LATaq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶HindIII和BamHI、DNAMarker均购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）、pEASY-T1Simple载体、BluePlusⅡProteinMarker（14KDa-100KDa）购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取及胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Ni-NTA蛋白纯化系统为Qiagen公司产品；马血清购自Invitrogen公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、山羊抗牛和山羊抗兔IgG均购自Sigma公司；PierceBCA蛋白定量分析试剂盒购自ThermoScientific公司；Parainfluenza-3Virus（PI3）AntibodyTestKit（P00652-2，批号4148）购自美国爱德士，其它生化试剂均为国产分析纯；4只体重2~3kg的新西兰雄性白兔，由山东省农业科学院种兔实验站提供。2.1.3主要仪器和设备本实验的主要仪器设备参照本实验室朱彤论文[85]。2.2试验方法2.2.1抗原表位区域的筛选根据本实验室分离测序的BPIV3SD2014分离株的NP基因和HN基因序列，运用Lasergene7.1版软件中的Protean程序，分别对NP基因和HN基因阅读框区域进行主要抗原表位筛选。10 材料与方法2.2.2目的基因的克隆2.2.2.1引物合成根据GeneBank上已经发表的BPIV3序列并结合本实验室已经获得的BPIV3基因序列，使用Premier5.0软件设计2对扩增特异性引物，见表2-1，送至华大基因科技有限公司合成。稀释成10μmol/L，-20℃保存。基因扩增模式图如图2-1。表2-1引物序列Table2-1Sequencesofprimer序列位置引物名称序列（5′-3′）产物大小SequenceTheprimerSquence（5′-3′）ProductsizepositionNP-BamHI-FCGCggatccATGCAGGAGGCCAAGCAGAGTTTGAAG1269-1292GCTTCCACCTCCTCCGCTTCCACCACCTCCGCTT1634-1655NP-G4S-R390bpCCACCGCCACCGTTACTTCCGAATGCGCTGAACGGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGTGGAAGCGGAHN-G4S-F7880-7901GGAGGTGGAAGCTGTCCAGGCAAAACACAGAGAG657bpHN-HindⅢ-RCCCaagcttTTAACTACAGTTCTTTGGAATTTCT8534-8512注：小写字母为限制性内切酶位点，加粗部分为45nt的G4S多肽核苷酸序列。图2-1引物扩增示意图Fig.2-1Primersdiagram2.2.2.2BPIV3RNA提取及cDNA的合成提取BPIV3病毒总RNA的过程参照本实验室朱彤的论文[85]，将提取的RNA按照TransScriptⅡFirst－StrandcDNASynthesisSuper-Mix说明书进行反转录合成cDNA。按下列体系配制反应液，如表2-2。11 东北农业大学工程硕士学位论文表2-2反转录体系Tab.2-2Theamplificationsystemoftranscription成分体积（µL）TotalRNA115×ReactionBuffer4RnaseInhibitor1PrimeScriptRnase1RandomPrimer110mMdNTPMix2轻轻混匀，25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃灭火5min。2.2.2.3NP-HN基因扩增（1）目的基因的克隆以BPIV3cDNA为模板，NP-BamHI-F、NP-G4S-R为引物扩增NP基因；以BPIV3cDNA为模板，HN-G4S-F、HN-HindⅢ-R为引物扩增NP基因。然后以纯化后的NP和HN基因为模板，以NP-BamHI-F、HN-HindⅢ-RPCR为引物，扩增NP-HN基因。反应体系如表2-3：表2-3PCR反应体系Tab.2-3ThesolutionofPCRreaction成分用量（μL）10×PCRbuffer5.0dNTPMixture4.0Primer-F2.0Primer-R2.0template4.0rTaqenzyme（5Μ/µL）0.5ddH2O32.5total50.0注：扩增HN基因片段时，Primer-F和Primer-R为HN-G4S-F和HN-HindⅢ-R；扩增NP基因片段时，Primer-F和Primer-R为NP-BamHI-F和NP-G4S-R；扩增NP-HN基因时，Primer-F和Primer-R为NP-BamHI-F和HN-HindⅢ-R。将反应液加入离心管，混匀。置于PCR仪中，基本PCR反应条件如下：95℃预变性5min95℃变性30s55℃退火30s30个循环72℃延伸45s72℃终延伸10min12 材料与方法10℃终止反应（2）PCR扩增产物的纯化PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，110V，25min后，在紫外灯条件下回收含有预期条带的凝胶，并参照胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，用于接下来的实验。2.2.2.4克隆载体pEASY-T1-NP-HN的构建（1）连接反应将胶回收的PCR产物（NP-HN）与pEASY-T1Simple载体在室温下连接10min，连接体系如表2-4：表2-4NP-HN和pEASY-T1的连接体系Table2-4TheligatedreactionforNP-HNandpEASY-T1试剂使用量pEASY-T11μL回收产物4μLTotal5μL将回收的PCR产物和载体按照表2-4的使用量，轻轻的混合，然后在室温条件下连接10min后转化。（2）大肠杆菌的转化1）将连接产物与100μL刚刚解冻的DH5α感受态细胞在1.5mlEP管中轻轻混匀，置于冰上30min。2）42℃水浴锅中热激30s后，立即置于冰上2min。3）在超净工作加入600μL室温的LB液体培养基，200rpm、37℃孵育40min。4）取8μL500mMIPTG与40μL20mg/mlX-gal混合，均匀地涂在准备好含Amp抗性的平板上，37℃放置30min。5）将培养好的细菌5000rpm离心5min，弃500μL上清后重悬，待IPTG和X-gal被吸收后，将其铺板，培养过夜。（3）转化子的鉴定利用蓝白班筛选的方法，挑取平板上的白色菌落，命名为pEASY-T1-NP-HN，并将其接种于5mLAmp抗性LB液体培养基中，37℃200rpm/min过夜培养后，按照天根公司质粒提取试剂盒的说明书，提取质粒。对提取的质粒进行凝胶电泳，选取鉴定正确的质粒，利用BamHI和HindⅢ酶切鉴定，反应体系如表2-5。13 东北农业大学工程硕士学位论文表2-5pEASY-T1-NP-HN的双酶切体系Table2-5Thedouble-digestionreactionforpEASY-T1-NP-HN试剂使用量质粒10μLBamHI2μLHindIII2μL10×buffer2μLddH2O4μLTotal20μL置于酶切炉中37℃15min，取5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将酶切鉴定正确的质粒测序，并将测序结果与NCBI公布的序列进行BLAST比对。2.2.3重组原核表达载体pET28a（+）-NP-HN的构建与鉴定测序正确后，将pEASY-T1-NP-HN和原核表达载体pET28a（+）分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切体系参照表2-5，酶切15min后，分别回收目的片段，并将其进行连接，连接体系如表2-6。表2-6NP-HN和pET-28a（+）的连接体系Table2-6TheligatedreactionforNP-HNandpET-28a（+）试剂体积NP-HN6μLpET-28a（+）2μLT4DNA连接酶1μL10×Buffer1μLTotal10μL16℃连接过夜，将其连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞（DH5α），过夜培养后，挑选的阳性克隆菌落至含有卡那青霉素（Kan）的LB液体培养基中，扩增培养14~16h后，按照质粒小提试剂盒说明书，提取质粒。将琼脂糖凝胶电泳测定正确的质粒，命名为pET28a（+）-NP-HN。应用BamHI和HindIII进行双酶切鉴定。酶切体系参考表2-5；将酶切正确的质粒交送测序公司进行测序。2.2.4融合蛋白NP-HN的诱导表达将测定正确的pET28a（+）-NP-HN质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DE3（BL21），挑选菌落，将过夜培养的菌液按1:100比例接种于新鲜的含Kan的LB液体培养基中，200r/min、37℃摇菌至OD600nm值在0.6~0.8，加入终浓度1mM的IPTG，分别在25℃、30℃、37℃诱导14 材料与方法表达2~6h，SDS-PAGE检测分析诱导时间和诱导温度对蛋白表达量的影响。2.2.5融合蛋白NP-HN可溶性分析收集100ml诱导表达的菌液离心，菌体沉淀加入20mlPBS，超声破碎15min，12000r/min离心15min后分别收集上清和沉淀。沉淀中加入稀释成1倍的SDS溶液裂解后，与上清一起通过SDS-PAGE进行蛋白表达的可溶性分析。2.2.6融合蛋白NP-HN的纯化、鉴定及浓度测定2.2.6.1融合蛋白NP-HN的纯化具体过程过程参照本实验室朱彤的论文[85]。2.2.6.2融合蛋白NP-HN的鉴定将BPIV3NP-HN融合蛋白经SDS-PAGE电泳转膜后，以1:1000稀释的BPIV3阳性牛血清为一抗，1:2000稀释的辣根过氧化酶标记的山羊抗牛HRP为二抗，western检测检测纯化蛋白的特异性。具体过程参照本实验室朱彤的论文[85]。2.2.6.3融合蛋白浓度测定利用BCA蛋白定量分析试剂盒测定纯化后的蛋白浓度，具体操作参照其微孔板操作方案说明。2.2.7多克隆抗体的制备与检测2.2.7.1多克隆抗体的制备用pET28a（+）-NP-HN蛋白免疫4只3月龄雄性新西兰兔，第三次免疫一周后心脏取血。离心收集兔血清，-20℃保存。具体过程参照本实验室朱彤的论文[85]。2.2.7.2多克隆抗体效价的测定用pET28a（+）-NP-HN融合蛋白包被96孔ELISA反应板，倍比稀释不同浓度的兔血清作一抗，1:4000稀释的山羊抗兔HRP作二抗，TMB单组分显色液显色，测定反应液OD450nm值，计算制备的多克隆抗体效价。具体过程参照本实验室朱彤的论文[85]。2.2.7.3多克隆抗体特异性检测用牛副流感病毒3型（BPIV3）全病毒，牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）以适当倍数稀释包被96空板，按照ELISA操作方法检测制备的多克隆抗体的特异性。具体操作参照史鸿飞论文[86]。15 东北农业大学工程硕士学位论文2.2.7.4Westernblot检测多克隆抗体将BPIV3全病毒蛋白经SDS-PAGE转膜后，以1:2000稀释的兔血清为一抗，1:4000稀释的辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠HRP为二抗，western检测多克隆抗体的特异性。具体操作参照史鸿飞论文[86]。2.2.8间接ELISA检测方法的建立与优化2.2.8.1间接ELISA反应条件的优化采用方阵滴定法用包被液将NP-HN融合蛋白分别稀释至0.5~16μg/mL后包被96孔ELISA板，每孔100μL，确定最佳抗原包被浓度，以1:20~1:200倍比稀释BPIV3标准阳性与阴性血清度确定最佳一抗浓度，设置4℃过夜、37℃包被2h、37℃包被1h加4℃过夜和37℃包被2h加4℃过夜4种包被条件确定最佳包被条件，分别用5%脱脂奶粉（SkimMilk，SM）、10%马血清（HorseSerum，HoS）、20%马血清作为封闭液，37℃分别封闭60min、90min、120min进行最佳封闭液及封闭时间的确定。将兔抗牛IgG-HRP分别稀释2000、4000、8000、16000倍，确定最佳二抗稀释度。采用37℃避光分别显色5、10、15和20min确定最佳显色时间。以阳性血清和阴性血清分别测量的OD450nm的P/N值最大者作为ELISA最佳条件。2.2.8.2间接ELISA判定标准确立挑选实验室保存的35份BPIV3阴性血清（已经通过病毒中和试验和进口商品化BPIV3ELISA试剂盒检测），利用上述优化好的间接ELISA方法对其进行检测，测得其OD450nm，——计算其平均值抑制率X及标准差SD，则X+3SD为阳性和阴性血清的界限值。2.2.8.3特异性试验用优化好的间接ELISA方法分别对本实验室保存的BVDV、IBRV阳性血清进行检测（已经用BPIV3病毒中和试验验证BPIV3抗体阴性），以BPIV3标准阳性、阴性血清以及空白孔作为对照。2.2.8.4敏感性试验选取BPIV3阳性血清8份，分别按1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280的比例稀释，按照优化好的间接ELISA方法进行试验。2.2.8.5板内和板间重复性试验首先进行板内重复性试验，随机抽取BPIV3血清抗体效价不同的6份样本，每个样本3次重复，进行板内重复性试验，用同样的方法在不同时间包被ELISA板，进行板间重复性试验，分别计算变异系数，评估本方法的重复性。16 材料与方法2.2.8.6符合率试验（1）与病毒血清中和试验比较随机选取本实验室保存的BPIV3阴阳性血清样本30份，分别运用本研究建立的间接ELISA方法和血清中和试验进行比较检测，血清抗体效价≥2时判定为阳性，并计算这两种方法的符合率。（2）与进口试剂盒比较随机选取本实验室保存的BPIV3阴阳性血清样本90份，分别应用进口商品化BPIV3间接ELISA抗体检测试剂盒和本研究建立的间接ELISA方法进行检测，比较这两种方法的符合率。2.2.9临床样品检测运用本研究建立的BPIV3间接ELISA方法对2015年9~11月分别采自山东省、辽宁省及天津市3个奶牛场的270份临床血清样品进行抗体检测，并统计分析BPIV3抗体阳性率。17 东北农业大学工程硕士学位论文3结果与分析3.1抗原表位区的筛选以BPIV3SD2014株NP蛋白和HN蛋白的氨基酸序列为研究对象，运用软件分别对这两个蛋白进行分析，结合文献报道，最终确定NP蛋白的C端388aa~515aa，HN蛋白的C端355aa~572aa为优势抗原区，如图3-1。A：NP蛋白抗原表位分析；B：HN蛋白抗原表位分析图3-1BPIV3SD2014株NP蛋白和HN蛋白抗原表位区筛选Fig.3-1ThescreeningresultsofantigenepitopeareainNPproteinandHNprotein3.2NP-HN基因的PCR扩增提取标本中的RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板PCR扩增NP、HN片段，获得与目的片段大小一致的基因片段，大小分别为444bp、711bp（如图3-2a）。以HN、NP为模板PCR扩增NP-HN片段，得到与目的片段大小一致的片段，大小为1092bp（如图3-2b）。18 结果与分析abM：DL2000DNAMarker；1：NP基因扩增结果；2：HN基因扩增结果；3：NP-HN基因扩增结果图3-2NP-HN基因的扩增结果Fig.3-2PCRamplificationofNP-HN3.3克隆载体pEASY-T1-NP-HN酶切鉴定将重组克隆载体pEASY-T1-NP-HN经BamHI和HindIII双酶切鉴定在1092bp与3829bp左右获得条带，与NP-HN基因及pEASY-T1长度一致，如图3-3。M：DL10000DNAMarker；1：重组克隆载体pEASY-T1-NP-HN酶切结果图3-3重组克隆载体pEASY-T1-NP-HN的鉴定结果Fig.3-3theidentificationofrecombinantclonevector19 东北农业大学工程硕士学位论文3.4表达载体pET28a（+）-NP-HN的鉴定将重组质粒经BamHI和HindIII双酶切鉴定在1092bp与5369bp左右获得条带，与NP-HN基因及pET28a（+）长度一致，图3-4。M：DL10000DNAMarker；1：重组表达载体pET28a（+）-NP-HN酶切结果图3-4重组表达载体pET28a（+）-NP-HN的鉴定结果Fig3-4theidentificationofrecombinantexpressionvector3.5融合蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化阳性重组质粒pET28a（+）-NP-HN转化至BL21（DE3）表达菌株，经IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析，结果显示，与未诱导组相比NP-HN融合蛋白大量表达，且与预期蛋白大小相一致，蛋白表达量在6h时达到最大（如图3-5a）。可溶性分析表明，该融合蛋白可以以包涵体和可溶性蛋白两种形式表达（如图3-5b），但是因为包涵体蛋白没有活性，故采用Ni-NTA非变性条件下纯化具有天然空间构像的可溶性蛋白，经SDS-PAGE检测，在44KD处获得特异性条带（如图3-5c），经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度为900μg/ml。20 结果与分析abcM：蛋白Marker；1,2,3：pET28a-NP-HNBL21表达菌20℃、30℃、37℃诱导6h蛋白表达结果；4,5：pET28a-NP-HNBL21表达菌37℃诱导4h、2h时蛋白表达情况；6：超声波破碎后上清；7：超声波破碎后沉淀；8,9,10,11：融合蛋白NP-HN的纯化结果；图3-5pET28a-NP-HN蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化Fig.3-5pET28a-NP-HNinducingexpression,solubilityanalysis,andpurification3.6融合蛋白NP-HN的鉴定以BPIV3阳性牛血清为一抗，经Westernblot特异检测，融合蛋白在约44KD左右出现条带，如图3-6，说明该重组蛋白具有一定的特异性和反应原性。M：蛋白Marker；1:NP-HN蛋白；图3-6重组蛋白表达的Westernblot鉴定结果Fig.3-6westernblotanalysisoftherecombinantprotein21 东北农业大学工程硕士学位论文3.7多克隆抗体的制备与检测3.7.1多克隆抗体效价测定将纯化后的BPIV3NP-HN重组蛋白作为抗原包被96孔板后，用不同稀释倍数的兔血清作一抗，1:4000稀释的山羊抗兔HRP作二抗，反应测出的OD450nm值进行分析，阳性值-空白值/阴性值-空白值（P/N）>2时，抗血清稀释倍数为抗血清的效价，测得抗血清效价为1∶32000。表明纯化的NP-HN重组蛋白有很好的免疫反应性。具体结果如表3-1。表3-1间接ELISA检测多克隆抗体效价Table3-1ThedetectionofpolyclonalantibodybyiELISA稀释倍数1：5001:10001:20001:40001:80001:160001:320001:64000+1.6481.4581.2871.0960.8590.6540.3780.289—0.2840.2610.2440.2220.2180.2260.1780.167注：“+”代表阳性血清；“”代表阴性血清。3.7.2多克隆抗体特异性的检测用BPIV3、BVDV、IBRV全病毒，以合适的浓度包被96孔酶标板，并设置阴性和阳性对照，将制备的兔血清抗体做1：100稀释，1:4000稀释的山羊抗兔HRP作二抗，用间接ELISA检测。结果显示制备的多克隆抗体不与这BVDV和IBRV结合，与BPIV3能特异性结合，说明本试验制备的多抗具有良好的特异性。结果见表3-4。表3-2交叉反应试验Table3-2TheresultofcrossreactionBPIV3IBRVBVDV+（OD450nm1.9870.2430.2982.0120.201注：“+”为BPIV3病毒阳性血清，“-”BPIV病毒阴性血清。3.7.3Westernblot检测多克隆抗体将BPIV3全病毒SDS-PAGE转膜后，以制备的多克隆抗体为一抗，经Westernblot特异检测，融合蛋白在约57KDa和64KDa左右处出现两条带，与BPIV3完整的NP和HN蛋白大小相对应，如图3-7，说明制备的多克隆抗体能与BPIV3的NP和HN蛋白结合，表明制备的多克隆抗体具有一定的特异性和反应原性。22 结果与分析M：蛋白Marker；1:BPIV3全病毒；图3-7多克隆抗体的Westernblot鉴定结果Fig.3-7westernblotanalysisofthe3.8间接ELISA工作条件的优化3.8.1包被抗原及一抗的最佳稀释浓度ELISA方阵结果如表1，当包被的抗原浓度为4ug/ml，待测血清稀释为1：50时，P/N值最大，为8.667，此时阴性血清的OD450nm值小于0.2，阳性血清OD450nm值大于1。因此确定包被抗原的最佳浓度为4ug/ml，一抗待测血清的最佳稀释比为1：50。表3-3包被抗原及一抗血清的最佳稀释浓度Table3-3DeterminationoftheoptimumconcentrationofantigenandserumSerumTheconcentrationofcoatingantigen（µg/ml）dilution0.5124816+0.6210.8021.0091.4551.6161.9451:25-0.1200.1490.1610.1870.2030.357P/N5.1005.3836.2677.7817.9615.448+0.5980.6541.0021.3781.6021.8021:50-0.1440.1430.1540.1590.1880.304P/N4.1534.5736.5068.6678.5215.928+0.5870.7930.9561.0021.2961.8201:100-0.1160.1450.2080.1540.1900.292P/N5.0605.4694.5966.5066.8216.233+0.5060.6640.6060.8380.9641.0951:200-0.1020.0980.1210.1270.1990.429P/N4.9616.7765.0086.5984.8442.552注：“+”代表阳性血清；“”代表阴性血清。23 东北农业大学工程硕士学位论文3.8.2抗原包被的最佳条件的确定如图3-8，重组蛋白NP-HN在37℃包被1h加4℃过夜的条件下，P/N值最大，为8.171，说明在此包被条件下效果最好，且此时阳性血清OD450nm值大于1，阴性血清OD450nm值小于0.2，因此，将此条件定为最佳抗原包被条件。1.510816Positiveserum4Negativeserum0.5Se2P/Nrun00OD44℃12h37℃2h37℃1h+4℃12h37℃2h+4℃12h50nm图3-8抗原最佳包被条件的选择Fig.3-8Theresultoftheconditionforcoatingofantigen3.8.3最适封闭液及封闭时间的选择如表3-4，重组蛋白NP-HN以20%的马血清在37℃封闭90min时，P/N值最大，且此时阳性血清OD450nm值大于1，阴性血清OD450nm值小于0.2，因此，将此条件定为最佳抗原包被条件。表3-4最适抗原包被液和包被时间的选择Table3-4SelectionoftheoptimalclosedandtimeClosedClosedreagentstime（min）5%SM10%HoS20%HoS＋1.5841.6091.52360－0.1890.2040.173P/N8.3817.8878.803＋1.4681.5821.49890－0.1670.1800.149P/N8.7908.78910.054＋1.4451.4851.377120－0.1550.1690.150P/N9.3268.7879.180注：“+”代表阳性血清；“”代表阴性血清。24 结果与分析3.8.4最佳二抗浓度的选择如图3-9，当二抗（兔抗牛—HRP）稀释为1:4000时，P/N值最大，为8.051，且此时阳性血清OD450nm值大于1，阴性血清OD450nm值小于0.2，因此，将此条件定为最佳抗原包被条件。28.11.587.9Positiveserum17.8Negativeserum0.57.7P/NSe07.6ru1:20001：40001:80001:16000mOD图3-9二抗最佳浓度的选择4Fig.350-9Determinationofoptimalconcentrationofthesecondantibodiesnm3.8.5最佳显色时间的选择如图3-10，当加入TMB底物进行显色10min后，P/N值最大，为7.56，且此时阳性血清OD450nm值大于1，阴性血清OD450nm值小于0.2，因此，将此条件定为最佳抗原包被条件。281.57.5m17PositiveSerumNegative0.56.5P/NS06eru5min10min15min20minmOD450n图3-10最佳显色时间的选择Fig.3-10TheselectionoftheoptimalChromogenictime25 东北农业大学工程硕士学位论文3.8.6BPIV3间接ELISA判定标准—通过对35份BPIV3阴性血清检测，结果见图3-11，求得其OD450nm平均值X为0.207，标准差SD为0.0296，计算得阴阳性临界值为0.2958，为了便于判定，将待测样品OD450nm≥0.30定为阳性，OD450nm＜0.30定为阴性。图3-11阴性血清样本OD450nm值正态分布图Fig.3-11NormaldistributiondiagramofOD450nmvalueofnegativesamples3.8.7特异性试验对本实验室保存的BVDV和IBRV阳性血清用所建立的BPIV3间接ELISA方法检测，测得其OD450nm值均小于0.30，结果BPIV3抗体均为阴性，结果如表3-5。表3-5特异性试验结果Table3-5Theresultofspecificitytest样本PositiveserumofBVDVPositiveserumofIBRVItem12312345OD450nm0.1480.1870.1380.1780.1940.1560.1750.13626 结果与分析3.8.8敏感性试验将此8份血清按所建立的间接ELISA方法进行检测，按照评判标准，当血清稀释为1:1280时，依然呈阳性。结果见表3-6。表3-6敏感性试验结果Table3-6Theresultofsensitivitytest阳性血清稀释度样本号ThedilutionofpositiveserumItem1:101:201:401:801:1601:3201:6401:128011.8451.6121.3551.0090.8980.6930.5140.45621.8021.5801.6680.9561.0100.5570.4120.31331.8201.6021.2731.2230.9860.6570.4970.37641.7951.5961.2781.1080.9620.7120.4110.38851.5191.2981.0391.2200.9240.7510.5950.37561.7751.5641.2020.9390.6530.6460.5000.35671.7751.5761.2740.9540.7070.6620.4080.30781.8421.5411.1950.9310.6370.5430.4970.3293.8.9重复性试验通过板内重复性试验和板间重复性试验，对结果进行分析统计，结果见表3-7，板内重复性试验变异系数在1.89%~5.48%，板间重复性试验变异系数在3.25%~7.38%，均小于8%，证明了该间接ELISA方法具有良好的重复性。表3-7间接ELISA重复性试验Table3-7RepeatabilityassayforindirectELISA板内变异系数板间变异系数血清样本IntrabatchCV%InterbatchCV%Serumsamples平均数变异系数平均数变异系数——X±SDCV（%）X±SDCV（%）10.240±0.0062.401.581±0.0513.2521.581±0.0332.090.224±0.0125.3731.345±0.0251.890.250±0.0207.8341.643±0.0905.480.137±0.0107.2050.389±0.0061.470.957±0.0343.5461.844±0.0693.761.635±0.6093.7327 东北农业大学工程硕士学位论文3.8.10符合率试验3.8.10.1与病毒血清中和试验比较分别应用本研究建立的BPIV3iELISA方法和病毒中和试验对随机选取的30份血清样品进行检测，结果如表3-8所示，iELISA方法检测的阳性率90.00%（27/30），VNT检测阳性率为86.67%（26/30），两种方法的总符合率为96.67%（29/30）。表3-8与病毒中和试验的符合结果Table3-8TheresultsoftheconformancewithvirusneutralizationtestNP-HN-iELISAPositveNegativeTotalVNTPositve26026Negative134Total273303.8.10.2与进口试剂盒比较对选取的90份血清样本，分别应用美国爱德士BPIV3iELISA试剂盒和本研究建立的iELISA方法进行检测，结果如表3-9，本研究建立的iELISA方法检测的阳性率86.67%（78/90），进口iELISA试剂盒检测阳性率为88.89%（80/90），两种方法的总符合率为95.56%（86/90）。表3-9与进口ELISA试剂盒的符合结果Table3-9TheresultsoftheconformancewithimportediELISAkitNP-HN-iELISAPositveNegativeTotalImportedPositve77380iELISANegative1910Total7811903.9临床样品检测对采自山东省、辽宁省和天津市的270份血清进行了BPIV3间接ELISA检测，共有BPIV3阳性血清223份，其中，山东血清抗体阳性率为87.78%，辽宁血清抗体阳性率为84.44%，天津血清抗体阳性率为75.56%，血清抗体总的阳性率为82.59%（223/270），结果见表3-10，说明我国北方的这三个省份的奶牛场BPIV3已经普遍流行。28 结果与分析表3-10临床血清BPIV3抗体的间接ELISA检测Table3-10DetectionofclinicalseraantibodiesagainstBPIV3byindirectELISA血清样本数省份阳性个数阳性率（%）ThenumberofserumprovincesThenumberofpositivePositiverates（%）samples山东Shandong907987.78辽宁Liaoning907684.44天津Tianjin906875.5629 东北农业大学工程硕士学位论文4讨论BPIV3是引起牛呼吸道疾病综合征（BRDC）的重要病原之一，给养牛业带来了极大地损失。随着我国养牛业和出口贸易的不断发展，BPIV3造成的经济损失越来越严重。针对BPIV3，我国现阶段研究较少，缺乏高效的检测试剂盒。间接ELISA方法具有快速敏感而且操作简单，适合大批量样本检测等特点，十分适合作为检测试剂。因此，建立一种具有我国自主知识产权的检测BPIV3抗体的间接ELISA方法具有十分重要的意义。4.1目的基因的选择同为呼吸道病毒属的仙台病毒的NP蛋白免疫试验研究表明，NP蛋白可诱导很高的IgG抗体，特别是在病毒感染后期可以诱导保护性的免疫反应[87]。也有以HN蛋白为包被抗原建立检测方法的报道[83]，这些都证明了NP蛋白和HN蛋白均具有良好的反应原性，可以作为建立诊断方法的抗原蛋白。本研究运用Lasergene7.1软件中的Protean程序，分别对NP蛋白和HN蛋白氨基酸序列进行主要抗原表位分析，分别选取NP蛋白的C端388aa~515aa和HN蛋白的C端355aa~572aa为优势抗原区，为了不影响两个蛋白的空间表位，我们通过G4S多肽Linker将他们串联表达，预表达蛋白的氨基酸序列与其他病毒Blast比较发现，无相似性，在理论上该串联基因特异性较好。本研究选择NP和HN抗原表位基因串联，在理论上会放大该融合蛋白与BPIV3阳性动物血清抗体反应的敏感性。本研究利用NP-HN融合蛋白做抗原建立的间接ELISA方法，当血清稀释1280倍时，检测结果依然呈阳性。这也验证了NP-HN融合蛋白有很好的作为检测抗原的潜质。4.2NP-HN融合蛋白的原核表达本实验选择pET表达系统。pET系统具有强大克隆表达重组蛋白的能力，在大肠埃希氏菌（E.coli）得到了广泛的应用，pET28a（+）系统是其中之一。pET28（+）载体具有噬菌体T7强启动子，其由T7RNA聚合酶诱导表达。连接到pET28（+）载体的目的基因，在充分诱导的条件下，可以大量利用细胞内的资源，从而得到高效的表达。pET28（+）载体N端携带有组氨酸标签，便于纯化。pET28（+）载体表达出空载体蛋白分子量小，对目的蛋白构象和免疫性影响小，表达出的蛋白比较适合作为检测抗原。原核表达系统中，IPTG的浓度、诱导温度、诱导时间都能影响目的蛋白的表达。PET28a（+）表达载体具有T7启动子和lac调控子，较高的IPTG起始浓度才能启动其有效表达，又因为IPTG对细菌有较高的毒副作用，本实验将IPTG的终浓度调为1mM。为了探索出最佳的诱导时间和诱导温度，本实验做了大量的研究。分别在20℃、30℃、37℃三个温度下对表达菌进行诱导表达，发现在37℃条件下，目的蛋白表达量要高于另两个温度下蛋白的表达量。可溶性分析也证明，在37℃条件下诱导，能产生可溶性的目的蛋白。分别对表达菌诱导2~6个小时，发现在诱导6小时时，蛋白表达量达到最高，而且也发现，在6小时之后，表30 讨论达蛋白量没有明显提高，故选定在37℃，诱导6h表达目的蛋白。本实验中，目的蛋白NP-HN以包涵体和可溶性两种形式表达，但包涵体蛋白无活性。ELISA实验需要有活性的蛋白作为抗原包被，故本实验选择在非变性条件下，纯化具有天然空间构像的可溶性蛋白。本实验采用镍离子（Ni2+）亲和层析方法纯化蛋白，利用Ni2+能够与His标签蛋白特异性结合，并且目的蛋白能够在适当缓冲液条件下洗脱，最终能将目的蛋白分离纯化出来的特点。针对蛋白纯化的过程中遇到的问题，做了很多尝试，也得到了一些启发。首先每一次平衡用到的缓冲液的pH值都必须很准确，在每次纯化前，都要重新测量一次缓冲液的pH值，防止因为长时间放置对pH值造成影响。其次，纯化蛋白的过程中一定要注意低温，最好在4℃的层析柜里进行。结合Ni-NTA后的蛋白应不低于6次，每次十分钟的漂洗，才能更为充分地洗掉杂蛋白。最后蛋白的洗脱过程中，发现有大量蛋白未洗脱下来，必须提高洗脱缓冲液中的咪唑浓度至600mM以上才能洗脱下来。4.3多克隆抗体的制备通过免疫血清学背景清晰的新西兰白兔制作多克隆抗体，得到血清效价为1:32000的多克隆抗体，证明了所纯化的NP-HN融合蛋白具有很好的免疫反应性。制备的多克隆抗体与BPIV3、BVDV和IBRV全病毒进行间接ELISA检测，结果显示制备的多克隆抗体与BPIV3能结合，但不与BVDV和IBRV结合，说明NP-HN融合蛋白能诱导机体产生针对BPIV3病毒的抗体，也从侧面说明所纯化出的NP-HN融合蛋白有活性，能作为检测抗原用于ELISA方法的建立。用BPIV3全病毒经SDS-PAGE跑胶转膜后，以兔血清为一抗，进行Westernblot检测，结果显示有两条带，且条带大小与NP和HN完整蛋白大小相仿，说明本实验纯化的蛋白有NP和HN蛋白的表位，这也就排除了表达的蛋白中只有HN和NP单个蛋白抗原表位未发生变化的情况，使实验结果更加具有说服性。4.4间接ELISA方法的建立建立间接ELISA方法时，需要用到标准的阴阳性血清。而BPIV3因为其传染能力强，流行范围广等特点，BPIV3抗体在牛体内广泛存在，选择标准的阴性血清显得很困难。本实验选取实验室保存的多份牛血清，通过两次国外标准试剂盒检测挑选出其中的阴性血清，再通过血清中和实验，多次验证选取的阴性血清是否含有BPIV3抗体。对标准阳性血清的选择，首先通过国外标准试剂盒选取结果判定明确的阳性血清，然后通过血清中和验证。在ELISA实验操作过程中，在向ELISA板中加入包被液、一抗血清、HRP二抗、显色液、终止液等时一定注意，尽量保证液体溅到孔壁上以防给最后造成结果误差。实验过程中发现，解冻完后的血清，其液体不均匀，为避免误差，在加入每种液体之前，一定要将其先混匀。对每次实验，都采取两次以上的重复，避免因为操作或者其他原因影响最后的结果。在加入显色液和终止液的过程中，动作要尽量快，不要因为前后时间过长影响实验结果。本研究在符合率试验时，分别与血清中和试验和国外标准试剂盒进行比较。血清中和试31 东北农业大学工程硕士学位论文验被认为是血清检测的金标准，与血清中和试验比较，较为直接的说明该检测方法的准确性；而在与国外标准试剂盒比较，更能说明本实验建立的间接ELISA方法商品化的价值。建立的ELISA方法与病毒中和试验和国外进口试剂盒有很高的符合率（96.67%和95.56%），表明本方法可用于BPIV3抗体的定性检测，并且具有作为一种优良试剂盒的潜质。32 结论5结论（1）利用两步PCR技术成功扩增出长度为1092bp的NP-HN目的基因。并利用基因重组技术，成功构建了重组原核表达质粒pET28a（+）-NP-HN并成功表达了分子量约为44kD的NP-HN融合蛋白，通过Ni-NTA纯化得到NP-HN重组蛋白。（2）利用纯化的融合蛋白NP-HN免疫新西兰白兔，制备了多克隆抗体。（3）应用NP-HN重组蛋白作为间接ELISA包被抗原，建立了BPIV3间接ELISA诊断方法。（4）利用建立的BPIV3间接ELISA诊断方法对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测，其总的阳性率为82.59%。33 东北农业大学工程硕士学位论文致谢光阴似箭，时间如梭，转眼间2年已经过去了，研究生的生活也临近尾声。在这两年期间，不仅学到了知识，掌握了一些实验技能，还学会了独立，学会了坚持，锻炼了与人沟通和解决实验和生活中遇到的问题的能力。更懂得了乐观不消沉，无论做什么事情，都要怀着一颗乐观的心，坚持的走下去，不消沉，总会成功；对待任何事情，都不要去抱怨，用平常心面对。首先，我要感谢我的导师何洪彬研究员和李杰副教授，感谢您们在这两年时间对我的帮助。从最初的实验选题到实验设计，一直到最后的论文的修改上，无论我有什么问题，您都会耐心的告诉我。您们对待工作的认认真真、尽心尽力；对待科研的一丝不苟；对待生活的乐观积极都一直影响和激励着我。其次，特别感谢山东省农科院王洪梅老师、赵贵民师兄、程凯慧师姐、郇延军师兄、宋玲玲师姐、朱彤师姐、沈付饶师姐在实验设计和专业技术上给予的莫大的帮助及生活上的关爱，感谢东北农业大学的张会师姐、王晓燕师姐的帮助，感谢王欣、刘天奇、李双、吴婷、王双、马南等同学的支持和鼓励。课题是由现代农业（奶牛）产业技术体系科学家岗位（Cars-37，何洪彬），山东省农业科学院重大成果培育项目（2015CGPY02）资助。本研究得到了山东省农业科学院奶牛研究中心的大力支持和帮助，在此表示衷心的感谢！同时诚挚感谢在百忙之中抽出时间评阅我论文的专家、学者！感谢东北农业大学生命科学学院、研究生学院的领导和老师们在我学习期间给予的热情支持和帮助。最后，我要感谢的我的父母，是你们无私的爱和奉献，让我有足够的信心和勇气去追求美好的生活。34 参考文献参考文献[1]King,A.M.Q.,Adams,M.J.,Carstens,E.B.andLefkowitz,E.J.（eds）（2012）VirusTaxonomy:ClassificationandNomenclatureofViruses:NinthReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses.ElsevierAcademicPress,SanDiego,California.[2]Karron,R.A.andCollins,P.L.（2007）Parainfluenzaviruses.In:Knipe,D.M.andHowley,P.M.（eds）FieldsVirology.LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,Pennsylvania.[3]BaillyJE,McAuliffeJM,SkiadopoulosMH,etal.Sequencedeterminationandmolecularanalysisoftwostrainsofbovineparainfluenzavirustype3thatareattenuatedforprimates.VirusGenes2000;20:173–82.[4]Horwood,P.F.,Gravel,J.L.andMahony,T.J.（2008）Identificationoftwodistinctbovineparainfluenzavirustype3genotypes.JournalofGeneralVirology89,1643–1648.[5]Zhu,Y.M.,Shi,H.F.,Gao,Y.R.,Xin,J.Q.,Liu,N.H.,Xiang,W.H.,Ren,X.G.,Feng,J.K.,Zhao,L.P.andXue,F.（2011）Isolationandgeneticcharacterizationofbovineparainfluenzavirustype3fromcattleinChina.VeterinaryMicrobiology149,446–451.[6]Shibuta,H.,Kanda,T.,Adachi,A.andYogo,Y.（1979）Characterizationofbovineparainfluenzavirustype3.MicrobiologyImmunology23,617–628.[7]Calain,P.andRoux,L.（1993）Theruleofsix,abasicfeatureforefficientreplicationofSendaivirusdefectiveinterferingRNA.JournalofVirology67,4822–4830.[8]Kolakofsky,D.,Roux,L.,Garcin,D.andRuigrok,R.W.（2005）ParamyxovirusmRNAediting,the‘ruleofsix’anderrorcatastrophe:ahypothesis.JournalofGeneralVirology86,1869–1877.[9]MolecularDiagnosis（ed.M.Munir）（2013）（M）；118-139.[10]Moscona,Anne.Entryofparainfluenzavirusintocellsasatargetforinterruptingchildhoodrespiratorydisease[J].2005,115,1688-1698.[11]Lamb,R.A.andParks,G.D.（2007）Paramyxoviridae.In:Knipe,D.M.andHowley,P.M.（eds）FieldsVirology.LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,Pennsylvania,pp.1449–1496.[12]Egelman,E.H.,Wu,S.S.,Amrein,M.,Portner,A.andMurti,G.（1989）TheSendaivirusnucleocapsidexistsinatleastfourdifferenthelicalstates.JournalofVirology63,2233–2243.[13]Bhella,D.,Ralph,A.,Murphy,L.B.andYeo,R.P.（2002）SignificantdifferencesinnucleocapsidmorphologywithintheParamyxoviridae.JournalofGeneralVirology83,1831–1839.[14]Horikami,S.M.,Curran,J.,Kolakofsky,D.andMoyer,S.A.（1992）ComplexesofSendaivirusNP-PandP-Lproteinsarerequiredfordefectiveinterferingparticlegenomereplication35 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东北农业大学工程硕士学位论文附录英文缩略词表英文缩写英文中文AcrAcryLamide丙烯酰胺KanKanamycin卡那霉素AmpAmpiciLLin氨苄青霉素ELISAEnzymeLinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验iELISAIndirectEnzymeLinkedimmunosorbentassay间接酶联免疫吸附试验E.coliEscherichiaColi大肠杆菌HRPHorseradish辣根过氧化物酶IPTGIsopropy-β-D-thiogaLactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷kbKilobase千碱基（对）kDkilodaLton千道尔顿LBLuria-bertinimediumLB培养基IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GPAGEPoLyacryLamidegeLeLectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠TMB3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine3,3',5,5'-四甲基联苯胺VNTvirusneutralizationtest病毒中和试验42 攻读硕士学位期间发表的学术论文攻读硕士学位期间发表的学术论文[1]沈付娆，杨建乐，赵贵民，等。牛冠状病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J]。中国兽医杂志，已接收。[2]杨建乐，赵贵民，侯佩丽，等。牛副流感病毒3型间接ELISA检测方法的建立与初步应用[J]。动物医学进展，已接收。43