牛轮状病毒固相竞争ELISA及双抗体夹心ELISA方法的建立与应用

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学校代码：分类号：学号：密级：公开黑龍夂皇乂李硕士学位论文牛轮状病毒固相竞争及双抗体夹心方法的建立与应用研究生：张佳昕指导教师：崔玉东教授于力研究员专业领域)：兽医学申请学位类别：兽医硕士所在学院：动物科技学院中国大庆 U10223Classifiedcode：niversitycode：：： 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果,也不包含为获得黒龙江八一农垦大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名日期年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使周学位论文的规定,即学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式在不同刊物上发表,传播学位论文的全部或部分内容。保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研宄生签名日期：年(月日 摘要牛轮状病毒(,)是引起新生犊牛腹泻的主要病原之一,感染多发生在月龄以内,引起腹泻的严重程度差别很大,包括无症状感染、温和的自限性腹泻以及伴有严重脱水和电解质失衡的重度腹泻。危害主要表现在饲料利用率下降、治疗成本增加、生长率的降低以及不同程度的死亡而造成的经济损失。为建立感染牛血清抗体的固相竞争()检测方法,本研究选取共享型单克隆抗体()为检测抗体,兔抗多克隆抗体为包被抗体。结果表明：检测血清最佳稀释倍数为,为反应的临界值。敏感性试验检测份抗体阳性血清,其中份为阳性,敏感性为。与病毒中和试验()、间接、商品化试剂盒的符合率均高于。批内和批间重复试验的变异系数均小于,表明所建立的有良好的重复性。统计每次检测的阴、阳性对照血清的值,绘制质控图,监测试验中每次血清检测的准确性和可控性,结果表明检测结果准确可控。该方法的建立为抗体的检测提供了有效的技术手段。为建立的快速检测方法,本研究以兔抗多克隆抗体为包被抗体、针对蛋白的型为检测抗体。敏感性试验结果显示,建立的方法最低可以检出病毒。特异性试验结果显示,该方法与牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛细小病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒型、牛腹泻粘膜病病毒以及阿卡斑病病毒均无交叉反应。组内和组间的变异系数均小于,表明重复性良好。符合性试验结果表明,该方法与方法、商品化试剂盒的符合率达。本研究建立的双抗体夹心方法可用于的规模化检测,为的病原流行病学调查提供了技术手段。关键词固相竞争；抗体检测；双抗体夹心；抗原检测I AbstractBovinerotavirus(BRV)isoneofthemajorpathogenscausingdiarrheaamongcalves.BRVisoneofthemajorpathogenscausingdiarrheadiseasesamongcalvesunder1monthofage.Theclinicalsymptomsofcalvesinfectedthebovinerotavirusincludedepression,loseappetite,diarrhea,severedehydration,acidpoisoning,andevendeath.ToestablishrapidprotocolforantibodyanainstBRV,anewSolid-phasecompetitionELISA(SPCE)wasdevelopedusingtheG6/G10genotypemonoclonalantibody(MAb)andpurifiedpolyclonalantibodyagainstVP6proteinasdetectorandcaptureantibody,respectively.Theresultsshowedthatwhenexaminingtestsearat1:8dilutionwithacut-offpointof40.32percentageinhibition(PI)ofreaction,therewasnooverlapbetweenthepositiveandnegativeseraintheSPCE.ThespecificityofSPCEwas96.8%andthesensitivityofSPCEwas96.8%.ThecoincidencerateoftheSPCE,VNT,indirectELISAandcommercialELISAKitwerehigherthan96%.Thecoefficientofvariabilityofwithin-runandbetween-runswerelessthan9%.ThewithinlaboratoryvariationoftheSPCEwhentestedthecontrolsampleswasverysmall.Toestablishrapidprotocolforbovinerotavirus(BRV)detection,aDoubleAntibodySandwichELISAforBRVwasdevelopedusingtheG6/G10genotypemonoclonalantibody(MAb)andpurifiedpolyclonalantibodyagainstVP6proteinasdetectorandcaptureantibody,4.2respectively.Thelimitdetectionofthisassaywascapablefordetectionof10TCID50BRV,4.86whereasthedetectionlimitofthecommercialELISAKitandRT-PCRwas10and3.3610TCID50BRV,respectively.TheDoubleAntibodySandwichELISAwasspecificfordetectionofBRV,butnocrossreactionwithbovineenterovirus,bovinereoviruses,bovineparvovirus,bovineinfectiousrhinotuacheitisvirus,bovineparainfluenzavirustype3,bovineviraldiarrheavirusandakabanevirus.Thecoefficientvariabilityofintra-assayandinter-assaywerelessthan10%,indicatingthattherepeatabilityofthisDoubleAntibodySandwichELISAforBRVwasreproductive.ThecoincidencerateoftheDoubleAntibodySandwichELISA,RT-PCRandcommercialELISAKitwere100%.ThesedatademonstratedthattheDoubleAntibodySandwichELISAestablishedinthisstudyprovideausefultoolfordiagnosisofBRVinfectionincattle.II Keywords:Solid–III 目录摘要附录英文缩略表前言轮状病毒概述轮状病毒的基本特征轮状病毒感染及其危害轮状病感染的诊断牛轮状病毒感染的病原学、疫苗及诊断技术研究进展本研究的目的与意义材料和方法实验材料试验方法结果单克隆抗体的纯化及标记多克隆抗体的纯化牛轮状病毒抗体固相竞争检测方法的建立双抗体夹心检测方法的建立与应用讨论牛轮状病毒病原学及血清学诊断方法的研究现状以单克隆抗体为基础的轮状病毒抗原及抗体检测方法的优势固相竞争方法的建立与应用双抗体夹心方法的建立与应用致谢附录各种培养液及溶液的配制IV 附录英文缩略表英文缩写英文全称中文全称日小时分钟联苯二胺聚丙烯酰胺凝胶电泳酶联免疫吸附试验曲线下面积毫升抑制百分率牛轮状病毒轮状病毒酶联免疫吸附试验每分钟转数μ微升高糖培养基磷酸盐缓冲液光密度值辣根过氧化物酶曲线下面积单克隆抗体固相竞争聚乙二醇半数组织培养感染量V VNTVirusneutralisationtest病毒中和试验间接免疫荧光试验开放性阅读框非编码区十二烷基磺酸钠免疫球蛋白四甲基联苯胺电镜法氨基酸聚合酶链式反应二乙氨基—乙基葡萄糖凝胶VI 1前言轮状病毒概述轮状病毒(,)是呼肠孤病毒科()、轮状病毒属()的成员,有个不同的群(～)。群轮状病毒是各种幼龄动物腹泻的主要病原之一,在世界范围内广泛流行。轮状病毒是最早在动物体内被鉴定的与胃肠炎有关的病原体,所引起腹泻的严重程度差异很大,可表现为隐性带毒、中等程度的自限性腹泻以及伴有严重脱水和电解质紊乱的重度腹泻。在发展中国家,轮状病毒引起的婴幼儿腹泻的死亡率较高；而在发达国家,尽管其死亡率不高,但是因此而产生的公共卫生压力也是巨大的。轮状病毒引起幼龄动物腹泻的危害主要体现在治疗成本的增加、生长率的降低以及一定的死亡率,因此导致巨大的经济损失。轮状病毒的基本特征分类轮状病毒属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属的成员,包含个不同的群(～),其中、和群轮状病毒均可感染人和动物,但是最常发生的是群轮状病毒感染,因此群轮状病毒是众多学者研究的重点,而、、和群轮状病毒目前发现只能感染动物。根据内衣壳蛋白抗原性的不同,群轮状病毒又被分为四个亚群,自然界流行的群轮状病毒主要是Ⅰ亚群。根据其两个主要衣壳蛋白和的差别,采用二元的分型体系,可将轮状病毒分为不同的型和型。年,等提出了有关轮状病毒命名和分类的新方法,该研究通过对大量不同轮状病毒毒株的各个基因节段进行序列比对分析,从而界定每个基因节段对应的核苷酸序列同源性的临界值。对于、、、和和、、、、、基因节段而言,属于同一型别的最低核苷酸同源性分别为、、、、和、、、、、、根据此标准又提出了轮状病毒毒株的如下命名方法：,大写字母顺序分别代表以下基因节段,代表所命名毒株相应的基因型。根据此分类标准,一个新分离毒株的基因型很容易被确定,同时可确定分离株的遗传进化地位、分离株各个基因节段的来源、是否存在种间基因重排和跨种传播。年的研究显示,已经有个型、个型、个型、个型、个型、个型、1 14个型、个型、个型、个型和个型被鉴定。和蛋白是轮状病毒的外衣壳蛋白、也是免疫优势蛋白,在天然免疫及特异性免疫双重压力下极易变异；同时,不同轮状病毒感染同一宿主时,易发生基因节段重排而产生新的毒株,导致新的型和型轮状病毒不断出现。年,通过轮状病毒的分子流行病学调查发现,有个血清亚型和个血清亚型存在。截止年的研究显示,至少有个血清亚型和个血清亚型轮状病毒被鉴定。形态和理化特性成熟的轮状病毒粒子无囊膜,呈正二十面体对称,直径约,由外衣壳蛋白、内衣壳蛋白和核心蛋白组成。在电镜下观察,轮状病毒的中央为一电子致密的六角形核心,直径在～之间；构成病毒内衣壳的是在其芯髓周围的电子透明层,自内向外呈辐射状排列；其外衣壳是由外周的一层光滑薄膜构成,壳粒清晰可见。未经胰酶处理的病毒培养物,在病毒粒子的表面还可以看到长度大约为～的表面纤突(),且每个纤突的远端顶部都有一个膨大的结节(图)。在细胞培养物和粪便标本中均存在三种形式的病毒粒子,即具有双层衣壳的完整病毒粒子(完全型或光滑型,型),该病毒粒子具有感染性；单层衣壳的病毒粒子(粗糙型,型),该病毒粒子没有外衣壳,无感染性；不成熟的病毒粒子,为只有空衣壳的病毒样颗粒。对于轮状病毒的超微结构有多种假设,三维结构模型是目前公认的轮状病毒粒子超微结构模型,是由等用图像处理电子显微摄像技术发现的。此模型认为成熟的病毒粒子为的面体对称,外衣壳由个和个二聚体形成的纤突组成,内衣壳由个三聚体组成,排成的晶格状,最里面的芯髓由个双股和与其结合的结构蛋白、和组成。轮状病毒具有较强的抵抗力,对、温度、化学物和消毒剂均有耐受性,乙醚和氯仿处理、反复冻融、超声波不会对其造成破坏。粪便样本中的病毒在℃可耐受℃～℃时可耐受～个月。但,等促溶剂以及、硫氯酸钾等可使病毒粒子变为单衣壳,并使其芯髓部分的密度发生改变,从而使病毒聚合酶丧失活性,失去感染力。对外衣壳糖蛋白的研究发现,钙离子是维护病毒粒子稳定的重要元素,不同的毒株所需的钙离子浓度也不同。轮状病毒的病毒粒子在粪便标本和细胞培养物中均以三种形式存在。双衣壳病毒颗粒即完整的病毒粒子,具有感染性；单衣壳病毒和不成熟的空衣壳病毒颗粒均没有外衣壳,无感染性。2 图轮状病毒粒子模式图细胞培养尽管最初分离的几个轮状病毒如猴的株、牛的株和株都易在细胞培养中增殖,但用胎肠器官培养以及胎肠单层细胞等许多原代细胞或传代细胞系分离和增殖病毒时,都不易成功,或不易传代。目前,除群轮状病毒外,其他群的许多毒株迄今未能适应细胞培养。群轮状病毒的分离成功率为～,最初通过易感动物来分离和复制病毒是分离获得轮状病毒较为有效的方法。黄旭雯等的研究发现,在细胞培养时添加μ胰蛋白酶和的鸡血清可提高哺乳动物轮状病毒的复制力。随着敏感细胞系恒河猴肾传代细胞的采用,己先后成功地分离出多种适应于细胞培养的动物轮状病毒株。目前常用的细胞系有人克隆细胞、人肝细胞、非洲绿猴肾细胞系和原代非洲绿猴肾细胞系。为了使轮状病毒能在细胞培养中稳定传代,通常需要用胰蛋白酶处理,并且在维持液中不加血清。原因可能是轮状病毒的复制需要通过胞浆膜直接进入胞浆,这种穿入依赖于蛋白,而蛋白需要通过胰蛋白酶裂解成和才能发挥其功能。这种机制与流感病毒和副流感病毒相似,都需要病毒囊膜蛋白的裂解,从而使病毒具有感染力。基因组结构轮状病毒包含个双股节段,群轮状病毒总基因组的核苷酸长度约为,各节段的核苷酸长度从至不等。在聚丙烯凝胶电泳()上的图谱可分为个区段,图谱最上边的也就是泳动最慢的条带定义为第基因节段,以下以此类推是第基因节段。对群轮状病毒而言,个双股节段的电3 泳图谱呈现明显的个区段,第一区段由个较大的节段构成；第二区段由两个中等的节段构成；第三节段由三个较小的节段构成；第四节段由两个最小的节段构成,呈排列(图)。轮状病毒第个基因节段均只有一个开放式阅读框,而第个基因节段有两个开放式阅读框。根据规则,除第、和基因节段外,轮状病毒基因节段的第一个启动子均为强启动子。轮状病毒的具有的帽子结构,而无尾。因此在复制过程中,除可直接翻译为蛋白质,还可以起到模板作用,合成负链,从而进一步合成双链。不同轮状病毒毒株的同源基因,其端和端的非编码区均是高度保守的,而开放阅读框的序列差异较大。开放阅读框功能是编码合成相应的蛋白,而非编码区的功能还不很清楚,可能是结合蛋白的靶标序列,与基因组的包装、合成和表达有关。序列比较分析表明,不同轮状病毒毒株的基因组序列之间差异较大,由于存在明显的“漂移”和“转变”现象,导致轮状病毒新血清型的频繁出现。当两个不同的轮状病毒毒株同时侵袭宿主细胞时,病毒毒株的基因节段之间相互作用,在转录复制过程中发生交换、交叉或重排,从而引起病毒的变异。图群轮状病毒的电泳图(侯美茹等,)病毒蛋白及其功能轮状病毒的节段双股共编码种蛋白,分别是种结构蛋白(,,,)(图)和种非结构蛋白(,)。、和是病毒的核心蛋白,由第、、节段编码,决定了病毒的结构和功能；与免疫相关的主要是内衣壳蛋白、外衣壳结构蛋白和。4 内衣壳蛋白由第节段编码,外衣壳蛋白是由第节段编码,外衣壳蛋白的编码基因根据毒株的不同略有差异,一般是第、或第节段编码。轮状病毒的病毒颗粒包含内层、中间层和外层三层结构,内层由、和结构蛋白以及节段构成,其中、和个节段为内层的核心,包裹于核心外侧；中间层由蛋白组成；外层由中和抗原和血凝素抗原组成。蛋白由个氨基酸组成,分子量为,是一种偏碱性的疏水蛋白。占病毒蛋白总量的,因此蛋白可能在病毒的结构构成上不是十分重要,目前一般认为蛋白可能是病毒依赖的聚合酶,在病毒复制中发挥重要作用。蛋白由个氨基酸组成,分子量为,占其蛋白总量的。其主要功能是组装病毒粒子,能与病毒核酸形成蛋白复合物。又是病毒亚群的特异性抗原,能够刺激机体产生抗体。蛋白由个氨基酸组成,分子量为,占病毒蛋白总量的,在病毒粒子结构蛋白中其含量最少。主要参与轮状病毒的复制和转录,是成熟所必需的。蛋白由个氨基酸组成,分子量为,占病毒蛋白总量的,是一种中和抗原,一般认为是轮状病毒的中和抗原,可以在机体自然感染时产生中和抗体,根据抗原性不同,可将轮状病毒分为不同的血清型(型)。对蛋白水解酶敏感,在胰蛋白酶作用下可裂解为两条长度不等的肽段和,其中由个氨基酸构成,能吸附宿主细胞；由个氨基酸构成,主要与病毒穿入宿主细胞有关。蛋白由个氨基酸组成,分子量为,占病毒蛋白总量的,是轮状病毒粒子中含量最多的蛋白。它是主要的诊断抗原,且大多数抗原表位的功能依赖于三聚体结构的构象,根据抗原性可将轮状病毒分为个不同的群和个亚群(、。是一种联低聚甘露糖糖蛋白,含有一个糖基化位点,和构成了轮状病毒的外衣壳。由个氨基酸组成,分子量为,占病毒蛋白总量的,是轮状病毒中含量第二多的结构蛋白。是轮状病毒的主要中和抗原,决定了病毒的血清型(型),因此,蛋白一直是轮状病毒研究中的热点。二硫键是维持空间构象、使其具有中和活性的重要因素,在检测中,许多具有中和活性的单克隆抗体不能与变性的蛋白发生反应；等人发现通过变性的凝胶回收纯化的蛋白免疫小鼠,不能够诱导产生具有中和活性的多抗血清。5 这些研究均表明,蛋白的中和活性必须要有空间构象来维持,而蛋白的糖基化可能不是形成中和表位的主要因素。等对不同轮状病毒的基因序列进行分析发现,编码基因含有的个高变区段,在相同血清型的不同毒株之间是高度保守的,但在不同血清型之间变化较大,利用单克隆抗体识别表位分析表明,高变区参与中和抗原位点的形成,且编码基因上有个区域分别编码中和抗原决定簇、和。区在～位氨基酸()之间,区在～之间,区位于～之间。由于的抗原决定簇多是构象性的,空间型复杂,排列规律不明显,给轮状病毒亚单位疫苗的研制带来了困难。种非结构蛋白都是与病毒相结合的蛋白质,与病毒基因组复制、合成和表达有关。蛋白在不同毒株大小不同,分子量约为,属于金属蛋白,主要出现在病毒感染早期的细胞内,该蛋白可与病毒结合,与病毒的复制和致病性有关。蛋白分子量,存在于感染细胞胞浆内的病毒复制区域,该蛋白除了可以对的二级结构进行修饰；还可以通过与病毒聚合酶复合体协同,从而更有效的复制轮状病毒。近年来发现在病毒复制区内可将另一种非结构蛋白磷酸化,并和构成病毒颗粒,形成前病毒体,在病毒复制晚期,通过复制中介体,将和分离出来。值得一提的是,在群轮状病毒中高度保守,可诱导机体产生持续性抗体,是血清学调查的理想检测抗原。蛋白分子量为,一般认为它与正链的补充有关。蛋白分子量为,该蛋白与病毒外衣壳装配和病毒内质网出芽有关,可作为在胞浆中未成熟病毒的受体,是病毒的肠毒素。的～被认为是肠毒素的活性区域,这部分肽链可使上皮细胞分泌增强从而导致腹泻。最近发现,蛋白可分成不同的基因型,可能发展为轮状病毒疫苗的候选蛋白。始终存在于原质体中,可能起到骨架作用。是胞浆内的磷蛋白,与病毒的复制有关。在病毒感染后即可合成,其分子量因磷酸化程度的不同从、或～不等,磷酸化水平决定与的结合。该蛋白与宿主细胞和病毒蛋白的合成以及蛋白的磷酸化相关。6 图轮状病毒三维结构图(崔晓辰等,)轮状病毒感染及其危害流行和分布轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿及幼龄动物病毒性腹泻、肠炎的重要病原体,同时可以引起成人及成年动物腹泻,发病高峰在秋季。世界各地的研究报告表明,在发展中国家和发达国家,人轮状病毒腹泻的发生率为～。据统计,全球每年约有万名岁以下儿童死于轮状病毒腹泻,大部分发生在发展中国家；在发达国家,引起的死亡数虽比发展中国家少,但是由此产生的公共卫生压力也是巨大的。仅在美国,每年约有万名岁以下儿童感染轮状病毒,名儿童死亡,万名儿童住院,同时要有万名内科大夫为此而工作,每年在轮状病毒方面要耗费近十亿美元的财政开支。在世界范围内广泛流行的人轮状病毒主要有种、血清型组合即,,」,。对我国轮转病毒引起的幼儿腹泻调查显示,成都、上海、长春以及北京地区的检出率分别为、、和。苏州各地标本检出率在～之间。国内有关轮状病毒腹泻病的流行病学资料仍在积累当中,目前调查报告显示血清型为婴幼儿轮状病毒腹泻的优势型,以型流行最为广泛。猪轮状病毒感染主要是引起仔猪腹泻,该病在世界范围内普遍存在,～日龄仔猪感染后发病率可超过,死亡率高～,可引起严重的经济损失。年,在7 英国猪场中暴发了急性腹泻,随后该病迅速蔓延至欧洲及其他国家,并于年在韩国、菲律宾和泰国发生流行。年,李国平等对我国仔猪轮状病毒调查,发现～日龄仔猪、日龄到断奶的仔猪、断奶后的仔猪轮转病毒阳性率分别为～、～、～。自年来,该病在我国呈现地方性流行,危害十分严重,对我国养猪业造成了严重的经济损失。据报道,美国断奶仔猪感染猪轮状病毒阳性率为,病死率为；在英国,猪场中～周龄仔猪的轮状病毒性腹泻发病率超过,死亡率为～；等对位于印度地区的份猪血清样品进行了间接检测,其中轮状病毒的阳性率最高为。对各大洲仔猪分离毒株的分析表明,猪轮状病毒大多数属于两种基因型即类型基因型和类型基因型。牛轮状病毒感染引起的新生犊牛腹泻约占牛场腹泻的多发于～日龄犊牛。病毒感染后易继发细菌和冠状病毒的混合感染,导致犊牛死亡率提高,康复犊牛生产性能下降,造成严重的经济损失。对牛群中的腹泻样本进行检测,目前流行的牛轮状病毒有个型、、、、、)和个型、、、、)。其中,和型是牛轮状病毒的主要血清型,约占。对我国牛群中轮状病毒的基因型进行检测表明,目前我国流行的牛轮状病毒是型和型。临床症状轮状病毒感染引起的腹泻是一种世界性传染病。据初步统计,全世界幼儿发生的肠炎至少有是由轮状病毒引起的。其主要感染小肠上皮细胞,从而造成细胞损伤,引起腹泻。该病多发生在寒冷干燥的季节,来自英国、北美、日本、南非、澳大利亚及芬兰等国的研究均反映出该病在冬季的流行。突然的环境改变也可导致本病的流行,年孟加拉国的洪水过后由轮状病毒导致腹泻的比例明显上升。病程一般为天,病初精神沉郁,不愿活动,食欲不振,体温正常,除非伴有大肠杆菌和沙门氏菌感染时会升高。随后出现呕吐和腹泻,腹泻是本病的主要症状,粪便呈水样,淡黄色,有时混有粘液和血液,病程严重的牲畜会出现脱水症状。腹泻发作后食欲废绝,如果腹泻持续,体重可减少～。如继发其他疾病,使病情恶化,引起死亡。该病对犊牛的危害较大,主要表现为脱水、眼凹陷、四肢无力、卧地、心脏衰竭而死亡。病理变化8 对病畜解剖,在小肠的后至处的肠壁变薄,通透性增大,呈半透明状,小肠内部气味腥臭含有大量的黄色絮状物、绒毛轻度充血水肿；镜下观察,上皮细胞广泛空泡状变性,顶部大量脂滴样结构,小肠胃壁内含白色的的物体,盲肠和结肠肿大,内有褐色不溶物。致病机理轮状病毒通过粪口或口口途径传播,主要感染小肠下处,病毒经口感染,进入小肠定植并使其绒毛缩短变平、柱状上皮细胞死亡。蛋白与小肠绒毛受体的作用是轮状病毒感染的主要分子机制。目前认为轮状病毒的感染与浓度有关,轮状病毒通过受体介导的依赖细胞的内吞作用进入细胞,当轮状病毒通过内吞作用进入细胞时,流向细胞质,当内吞小泡中浓度低于维持稳定所需要的浓度时,病毒外衣壳脱落,病毒随着内吞小泡进入胞质。也有研究证明轮状病毒的非结构蛋白可以引发动物腹泻,其原因可能是及肠神经系统()等共同作用的结果,内存在大量的分布于肠肌神经从内的神经元,而是一种重要的胃肠神经递质,调节胃肠的生理功能。机体感染轮状病毒后,病毒粒子及同时作用于绒毛上皮细胞,激活肠粘膜中的,导致大量生成,促使肠粘膜分泌大量的水和氯离子,从而导致腹泻。当机体感染轮状病毒时,被认为是导致水和氯离子分泌的关键因素。危害患病的幼儿及幼龄动物是轮状病毒的主要传染源,其传播途径为口口或粪口途径,自然界中多种动物都可感染本病,如绵羊、山羊、幼驹、鹿、兔、小鼠等,因此若有一种动物体内存在该病毒,则可造成大规模的传播,给本病的防治带来一定的困难。在发达国家,轮状病毒引起的死亡数虽比发展中国家少,但是由此产生的公共卫生压力也是巨大的。在全世界范围内,腹泻是岁以下儿童死亡的第二大因素,其中是因感染轮状病毒据报道由轮状病毒引起的腹泻患儿～月龄占。近年来发现,轮状病毒感染还可诱发其他疾病,如引起全身的病毒血症、无热惊厥等。轮状病毒感染可降低饲料的利用率,造成严重的经济损失。以发达国家为例,美国断奶仔猪轮状病毒感染阳性率为,病死率为；在英国,～周龄仔猪的轮状病毒性腹泻发病率超过,死亡率为～；在发展中国家,等对位于印度地区的猪血清样品检测,轮状病毒的抗体阳性率为。该病毒常与猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒等混合感染而加重病情,造成巨大的经济损失。9 牛轮状病毒是引起犊牛腹泻的主要病毒性因素,约占犊牛腹泻病例的。牛轮状病毒感染的危害主要表现在饲料利用率下降、治疗成本增加、生长率的降低以及不同程度的死亡率,可造成严重的经济损失。由轮状病毒引起的日龄以内犊牛腹泻最为常见,发病率高达～,死亡率可高达。美国养牛业因牛的腹泻疾病而引起的经济损失占畜禽业产值的～,而牛轮状病毒是引起美国牛群腹泻的主要病原。虽然牛群中牛轮状病毒血清抗体广泛存在,但抗体水平高低不等,抗体水平较高的母牛可通过母源抗体保护犊牛,但是抗体水平较低的母牛其母源抗体不足以对犊牛提供保护,且不同基因型牛轮状病毒之间不能完全交叉保护,这就给牛轮状病毒的防控带来一定难度。轮状病感染的诊断轮状病毒感染一般可通过流行病学、临床症状、组织病理变化等对该病进行初步诊断；也可以通过一些实验室手段病原学诊断和血清学诊断进行确诊。病原学诊断轮状病毒的常规方法有电镜观察、免疫荧光、病毒核酸电泳法、、双抗体夹心等方法；血清学诊断轮状病毒的常规方法有中和试验(),固相竞争。轮状病毒感染的病原学诊断电镜观察年德国科学家研制出厂世界上第一台透射式电子显微镜,随着科学技术的发展电镜的分辨力和放大倍率也随之提高。利用该项技术已成功地检测出猪传染性胃肠炎病毒、犬细小病毒、西方型马脑炎病毒等,并于年首次观察到轮状病毒。电镜是确定各种病毒形态结构最有效的工具。史月明将一株猪轮状病毒分离株在恒河猴肾细胞系上传代,通过电镜技术,对其进行了鉴定,证明该病毒为典型的猪轮状病毒。据报道,每毫升粪汁标本中含有个病毒粒子时,仔细观察可能看到病毒粒子；每毫升标本内含个病毒粒子时,一般都能获得阳性电镜结果；每毫升标本中的病毒粒子超过个时,极易做出诊断。放射免疫沉淀等应用放射免疫技术检测粪标本中的轮状病毒抗原,已成功地用于临床标本。先用兔抗轮状病毒抗体包被聚苯乙烯小管,随后加入倍稀释粪汁在离心沉淀后吸取的上清液,冲洗后加入豚鼠抗轮状病毒抗体,感作并冲洗后,加入标记的兔抗豚鼠抗体。10 1.4.1.3病毒核酸电泳法．等人首先利用病毒核酸电泳法对人轮状病毒进行检测。倪亚伟年采用的方法对已分离出的四株进行鉴定均在电泳图上呈现出牛轮状病毒典型的条带；年常继涛等利用方法对我国内蒙古、黑龙江、新疆、北京、安徽等地腹泻犊牛的粪便样品进行调查,该方法可有效地从临床腹泻粪便样品中检测出轮状病毒核酸,其敏感性接近于；年付新成等从犊牛腹泻粪便样品中提取病毒经检测后有个样品电泳条带呈现∶∶∶分布证明组牛轮状病毒在牛群中的存在。作为牛轮状病毒鉴定方法之一具有特异性强操作简单等优点,但病毒的易降解导致假阴性结果出现。该方法可直接检测轮状病毒的感染,并能同时鉴定出病毒基因组的电泳型,是进行轮状病毒病原流行病学研究的最常见方法。通常将病料或感染的培养物冻融处理后,经差速离心、蔗糖密度梯度离心制备病毒样品后,从轮状病毒中提取经聚丙烯酰胺凝胶电泳(),银染后,根据病毒节段的数目及图示即可做出判断。免疫荧光技术采集发病动物的粪便或空肠和回肠的柱状上皮,压片后,预冷的无水乙醇固定,用轮状病毒荧光抗体染色,置荧光显微镜下观察。通常在接种后即可在看到病毒抗原；在病毒抗原含量最多；接种后很难找到阳性荧光细胞。赵庆欢利用免疫荧光法快速检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒外壳蛋白。边亚娟利用所研制的抗猪轮状病毒蛋白单克隆抗体进行间接免疫荧光法,结果显示对猪轮状病毒检测具有很高的特异性。反转录聚合酶链式反应等根据轮状病毒和上保守区域的基因序列,合成一对特异性引物,通过反转录后在体外扩增,建立了一种诊断牛轮状病毒的方法。等利用方法确定了猪轮状病毒的基因型,为轮状病毒毒株的进化分析关系和追踪疫源建立了基础；常继涛等设计多条特异性引物,采用半巢式多重的方法对我国部分地区腹泻犊牛的粪便样品进行鉴定,并首次分离获得型牛轮状病毒,命名为。该方法灵敏性高、特异性强是一种高通量的检测方法,不但可以检测活病毒核酸、还能检测灭活的核酸片段。双抗体夹心11 双抗体夹心又称抗原捕获,常用于抗原的检测,其原理是将己知抗体加入板形成固相载体；加入受检标本与固相载体结合,形成固相免疫复合物；再加入酶标抗体,使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合,彻底洗涤未结合的酶标抗体,此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。因双抗体夹心敏感性高,特异性好等原因,世界卫生组织腹泻控制中心于年公布的“急性肠道传染病实验手册”中将其列为诊断轮状病毒腹泻的常规检查方法。抗轮状病毒单克隆抗体的研制使双抗体夹心法的灵敏度大大提高,若将检测单抗进行过氧化物酶标记,则可以将受检标本和酶标抗体一起孵育,作一步检测,更节省时间。国内外均已有商品化的人轮状病毒抗原试剂盒。新型诊断技术随着分子生物学技术的快速发展,近年来产生了很多新型诊断技术。包括,吴奇英针对猪轮状病毒基因设计了一对荧光定量特异性引物建立了检测群猪轮转病毒的荧光定量；胶体金技术,崔晓辰利用抗猪轮转病毒蛋白的单克隆抗体为探针制备了检测猪轮转病毒的胶体金免疫层析纸条；环介导,王滔采用环介导技术扩增轮状病毒特异性基因,建立了一种快色检测轮状病毒的方法。核酸探针技术、免疫层析快速检测试纸条、基因芯片技术等。这些新技术不但灵敏而且简便,适用于大规模的检测。轮状病毒的血清学诊断间接间接的原理是,将已知抗原吸附于固相载体,孵育后洗去未吸附的抗原；随后加入含有特异性抗体的被检血清,孵育洗涤后；加入酶标抗同种球蛋白,感作后再经洗涤；加入酶底物,底物被分解,出现颜色变化,即显色变得愈深,样品中抗体含量越多。曹竹婷等人,利用密度梯度离心纯化的牛轮状病毒作为包被抗原,建立了一种可以检测牛轮状病毒抗体的间接；时洪艳等人,将原核表达的猪轮状病毒纯化后作为包被抗原,建立了一种检测猪轮状病毒抗体的间接诊断方法；李鑫等人利用间接方法,对我国不同地区牛群中群轮状病毒的感染和流行情况进行调查,发现我国牛群中牛轮状病毒抗体的阳性率高达,这为我国牛轮状病毒腹泻疾病的防制提供了重要的依据。病毒中和实验(,)12 病毒中和试验是检测血清中轮状病毒抗体的一种方法,是轮状病毒血清型鉴定的主要方法,很多实验室采用该方法评价疫苗的免疫效力和动物免疫水平。其原理是依据血清中特异性抗体与病毒相互作用,使病毒失去吸附细胞的能力,丧失对敏感细胞的感染力,最终根据细胞产生病变的情况来判断结果。的优点是结果准确,缺点是耗时长,观察病变主观因素较大,受实验材料的影响大,并且对试验条件要求较高,需要在生物安全柜中进行。固相竞争(,)当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。该方法的原理为：先包被病毒的特异性抗体,再结合预先滴定的病毒抗原,形成固相载体。同时加入待检样品和等量的检测抗体于板中,使其共同竞争结合固相载体上的抗原位点。若待检样品中含有特异性抗体,则可与检测抗体竞争结合固相抗原,使检测抗体不能与固相抗原结合,反之亦然。其敏感性好、特异性高、实验操作简便,而且没有被检样品动物种属的限制,可广泛用于血清样品的高通量检测。牛轮状病毒感染的病原学、疫苗及诊断技术研究进展牛轮状病毒(,)最初于年由等在美国阿拉斯加一农场犊牛腹泻病例中分离获得。最初这个病毒被称为新生犊牛腹泻病毒()、内布拉斯加犊牛腹泻病毒()、呼肠孤样病毒()或呼肠孤病毒样病原()直到年国际病毒命名委员将其正式命名为轮状病毒,并且将内布拉斯加犊牛腹泻病毒()确定为标准毒株。随后引起新生犊牛腹泻的轮状病毒的研究迅速展开,欧、美各国以及澳大利亚、新西兰和日本等地都发现了轮状病毒引起的犊牛腹泻。在世界范围内,牛轮状病毒是引起犊牛腹泻的主要病毒性因素,约占犊牛腹泻病例的,日龄以内犊牛最为易感,发病率可高达～,死亡率依是否有产毒素性大肠杆菌和冠状病毒混合感染而变化很大,牛轮状病毒感染的危害主要表现在饲料利用率下降、治疗成本增加以及不同程度的死亡率,可造成严重的经济损失。在我国,年福建牧医所从水牛、黄牛的腹泻粪便中用电镜和免疫电镜检出轮状病毒,确认了牛轮状病毒在我国的存在。和是牛轮状病毒流行的主要基因型,约占牛轮状病毒流行的；近年来、以及等新型毒株也在牛群中分离获得。在中国,我们对全国养牛业比较发达的省市进行病原流行病学调查,发现牛轮状病毒引起的腹泻也较为严重；应用结合序列分析对13 我国流行毒株进行分型鉴定,确定我国牛群中流行的毒株为和型,目前尚无其他型牛轮状病毒在我国牛群中流行的报道。牛轮状病毒经粪口途径传播,改善公共卫生条件并不能有效控制轮状病毒感染的传播,且治疗轮状病毒引起的腹泻病尚无特效药,因此发展安全有效的疫苗来控制轮状病毒腹泻病受到全球的一致重视。毒株最初分离于美国,分离毒株对犊牛具有致病力,后来的相关研究将其传代致弱,用于牛轮状病毒疫苗。该减毒株于年被批准生产,作为新生犊牛轮状病毒减毒疫苗,实际应用中,可口服接种新生犊牛,也可以肌肉注射接种怀孕母牛,这是目前世界范围内唯一被商品化的牛轮状病毒疫苗。但是,我国引进的毒株究竟是强毒株还是疫苗毒株的背景资料并不清楚,所以无法将毒株作为疫苗毒株。张俭伟等将牛轮状病毒(株)进行甲醛灭活并分别制备油乳佐剂疫苗和铝胶佐剂疫苗,对距产前个月、个月的孕牛接种疫苗,检测到在产后母牛乳汁和犊牛血清中均存在特异性和。张冠群等利用大肠杆菌表达系统表达获得了牛轮状病毒蛋白,并将该蛋白免疫小鼠,发现其具有较好的免疫原性和诱导中和抗体的能力。常继涛等将亲本株和基因重配株联合应用,制成了能够涵盖牛轮状病毒主要血清型和的二价减毒活疫苗,该疫苗接种新生犊牛后,两个减毒株均能刺激机体产生较高水平的血清抗轮状病毒和抗体,也可以产生中等水平的同型血清中和抗体。随着诊断和检测技术的不断进步,牛轮状病毒的病原学和血清学检测方法也变得多种多样。血清学检测方法主要用于血清流行病学调查、筛选牛轮状病毒阴性动物以及疫苗的免疫评价。目前,牛轮状病毒的血清学检测方法主要包括病毒中和试验、间接及固相竞争。病毒中和试验,操作繁琐,需要在专门的实验室进行,不利于大规模的应用。间接检测方法操作简便、敏感性高,适用于牛轮状病毒抗体的大规模检测,年曹竹婷等优化了检测血清中牛轮状病毒抗体的间接的最佳条件及判定标准,使该方法具有更高的特异性、灵敏度,适用于对牛轮状病毒特异性抗体的动态监测和批量检测,但该方法需大量纯化抗原,成本较高,不利于商品化；张怡婷等运用表达的大小为重组蛋白建立的间接,其敏感性较琼脂扩散试验高万倍,进一步说明间接方法简单、快速且灵敏,适用于对牛轮状病毒特异性抗体的动态监测和批量检测。基于单克隆抗体的固相竞争,因其特异性高,敏感性好,操作方便的特点,已广泛用于各种病毒血清抗体的检测。但是,目前尚无牛轮状病毒固相竞争方法的建立与应用。14 牛轮状病毒病原学的检测主要用于病毒基因型的确定以及疾病流行趋势的调查等。目前病原学检测方法主要包括,电子显微镜、方法、病毒核酸电泳法,方法。电子显微镜观察,因其极高的放大倍数,使病毒粒子的形态结构显现清晰,因此在牛轮状病毒的检测中应用广泛；年,吴城等利用直接电镜和免疫电镜在水牛、黄牛的腹泻粪便样本中,发现了直径～的具有双层衣壳的牛轮状病毒粒子,确认了牛轮状病毒在我国的存在；栾婧婧等通过电镜从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株牛轮状病毒,系统地观察了病毒在宿主细胞的形态结构、为牛轮状病毒的鉴定提供了依据；该方法操作简便,但敏感性低,易和呼肠孤病毒混淆,需要专门设备,不适宜大规模样品的检测。方法,是近年来发展起来的轮状病毒检测及分型方法,特异性好、敏感性高,是目前用于轮状病毒检测较为理想的方法；等根据轮状病毒和上保守区域的基因序列,合成一对特异性引物,通过反转录后在体外扩增,建立了一种诊断牛轮状病毒的方法；付新成等利用病毒核酸电泳法检测腹泻病牛粪便样品,首次在江西证明了引起牛腹泻的牛轮状病毒的存在；王洁清利用牛轮状病毒的基因间高保守区域设计引物,可从感染牛轮状病毒细胞培养物和粪便样品中检测出轮状病毒的存在。病毒核酸电泳法,不仅可以直接检测轮状病毒的感染,还可以鉴定出病毒基因组的电泳型,张艳玲等从犊牛腹泻粪便样品中提取病毒经病毒核酸电泳检测后发现有个样品电泳条带呈现∶∶∶分布证明组牛轮状病毒在牛群中的存在。检测方法,无需昂贵的仪器设备,将双抗体夹心列为诊断轮状病毒的标准方法,侯美茹等利用纯化的多克隆抗体建立了一种可以快速检测牛轮状病毒的双抗体夹心方法；刘纯荣等利用方法对四川省腹泻耗牛粪便样品进行诊断,证实牛轮状病毒是导致该地区发生腹泻的主要病原。本研究的目的与意义近年来,我国养牛业发展迅速,随着养殖规模的扩大,各种疾病的发生和流行也不断增加,目前腹泻己经成为牛场常见的一种疾病,且以轮状病毒所引起的犊牛腹泻最为严重。这不仅给养牛业造成巨大的经济损失,而且也影响到犊牛的生长发育和成年后的泌乳性能。轮状病毒的血清型众多,毒株间差异较大,这就给诊断和防制带来一定困难。建立可靠的血清学检测技术和精确的轮状病毒抗原检测方法,是世界各国探索有效防治轮状病毒腹泻的基本前提和关键所在。15 目前,最常用的检测牛轮状病毒抗体的技术手段是病毒中和试验、间接和固相竞争。其中病毒中和试验是最经典的方法,但是需要动用活病毒,只能在专门的生物安全柜中进行,而且检测的工作量大,方法敏感性低,不适用于高通量检测；间接虽然操作简便,但是非特异性高,存在一定的假阳性率,其稳定性受纯化的包被抗原影响；固相竞争保留了间接操作简便的优点,而且提高了检测方法的特异性和稳定性,敏感性优于病毒中和试验,有良好的开发前景。由于单克隆抗体只与抗原分子上某一抗原决定簇结合,所以利用单抗为检测抗体可以增加检测方法的特异性；多克隆抗体可与多个抗原决定簇结合,作为包被抗体,可加强捕获抗原的能力。本研究利用了固相竞争、单克隆抗体和多克隆抗体的优点,选择一株针对、型的单克隆抗体为检测抗体,针对蛋白的多克隆抗体为包被抗体,从而建立一种可以快速检测牛轮状病毒抗体的固相竞争方法,该方法适用于牛轮状病毒抗体阴性动物的筛选,指导免疫计划的制定,为牛轮状病毒疫苗的评价提供技术手段。目前,牛轮状病毒病原学检测的常用方法主要有电镜技术、方法、核酸电泳法,这些方法普遍存在不易操作,耗时长,难以用于高通量的检测缺点。年公布的“急性肠道传染病实验手册”中将双抗体夹心列为诊断轮状病毒腹泻的常规检查方法。因此建立一种适于现地检测牛轮状病毒的双抗体夹心方法是十分必要的。本实验利用标记的共享型单克隆抗体为检测抗体,多克隆抗体为捕获抗体,建立一种能快速检测牛轮状病毒的双抗体夹心方法,为我国牛轮状病毒感染和流行的检测、实验室诊断和抗原检测试剂盒的研制奠定基础。16 2材料和方法实验材料毒株、细胞系、实验动物细胞、杂交瘤细胞株、型、牛肠道病毒()、牛呼肠孤病毒()、牛细小病毒()、阿卡班病毒()、多克隆抗体血清均由本实验室保存；牛传染性鼻气管炎病毒()、牛副流感病毒型()、牛腹泻粘膜病病毒()由薛飞研究员提供；雌性小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。主要试剂与药品高糖培养基和胎牛血清均为公司的产品；抗体亚类试剂盒购自公司；购自天根生化科技(北京)有限公司；、标记用辣根过氧化物酶()购自公司；羊抗鼠、羊抗鼠购自公司；购自公司；化学试剂均为分析纯试剂；商品化轮状病毒检测试剂盒购自博卡生物技术有限公司、商品化检测牛轮状病毒抗体酶联免疫分析试剂盒(双抗原夹心)购自上海瑞齐生物科技有限公司；酶标板(,高亲和性)。主要仪器和设备高速台式冷冻离心机(公司)、超速离心机(公司)、超速离心机(美国公司)、高速离心机(美国公司)；多功能酶标仪(奥地利公司)；型电热恒温水浴锅；二氧化碳培养箱；生物二级安全柜(美国公司)；各规格移液器；荧光倒置显微镜(公司)、稳压稳流电泳仪公司、垂直蛋白电泳仪公司、半干电转仪公司；型仪(公司)；型旋涡混合器(姜堰市新康医疗器有限公司)；荧光倒置显微镜(公司)；小型超纯水仪(德国公司)。血清样品份牛血清于～年期间采自黑龙江省双城、尚志、阿城、甘南,内蒙古自治区海拉尔、扎兰屯等地。采用间接免疫荧光和病毒中和试验筛选牛轮状病毒抗体阳性和阴性血清。17 2.2试验方法牛轮状病毒的培养将牛轮状病毒株事先用的胰酶处理,接种于长满单层的细胞,待出现的细胞病变()后收获病毒。将收获的病毒细胞培养液反复冻融三次；℃,离心,弃沉淀；于℃储存。牛轮状病毒抗原的提纯采用差速离心法对牛轮状病毒抗原进行纯化取上述处理好的细胞病毒上清,按、的量分别加入和,℃过夜搅拌。次日离心,℃,,,收集沉淀。沉淀用事先预冷的重悬。超速离心,℃,,；收集沉淀,用重悬。纯化的病毒抗原经蛋白质定量试剂盒()测定蛋白质浓度经进行纯度鉴定。经鉴定合格的病毒抗原可包被板,用于后期单克隆抗体效价的测定和牛轮状病毒抗体的检测。牛轮状病毒单克隆抗体的鉴定杂交瘤细胞培养上清及腹水效价的测定将杂交瘤细胞培养上清及腹水从开始分别进行系列稀释,用间接法测定抗体效价。同时设定阴性、阳性对照。的比值大于的上清和腹水所对应的最大稀释度为其效价。单克隆抗体型特异性鉴定用间接免疫荧光()方法检测单克隆抗体与、、、型轮状病毒分离株的反应性。将事先用胰酶处理的牛轮状病毒接种于长满单层的细胞,待出现时弃上清,用预冷的无水乙醇固定细胞,后甩弃液体。以待检单克隆抗体腹水为一抗,℃孵育,(含的)洗板次,每次；以羊抗鼠()为二抗,℃孵育,同上洗板。滴加甘油封板,置荧光显微镜下观察。同时以小鼠阴性、阳性血清做对照。相对亲和力常数的测定18 采用硫氰酸盐洗脱法对单克隆抗体的相对亲和力常数进行测定,操作步骤如下：纯化的牛轮状病毒℃过夜包被板,脱脂乳封闭(含脱脂乳的溶液)。用将待测单抗稀释至饱和浓度,μ孔,℃孵育,洗板次,每次。洗涤后加入不同浓度的溶液μ孔,进行洗脱,浓度依次为、、、、、、、、、和,室温静置,同上洗板。加入羊抗鼠(),μ孔,℃孵育,同上洗板。避光显色,终止反应,用酶标仪测定值。结果判定：经硫氰酸盐洗脱后值下降至未经硫氰酸盐洗脱的,所对应的浓度,即为该单克隆抗体相对亲和力常数,用表示。中和试验将待检样品置于℃水浴锅内,灭活,从开始做倍系列的稀释；预先牛轮状病毒与胰酶℃感作,将病毒稀释到；不同稀释度的待检样品与等体积的病毒稀释液混合,于℃感作；加入到事先长满细胞的孔细胞培养板中,μ孔,置于细胞培养箱中。同时设立阴、阳性对照,每天观察。抗体滴度可以按法以终点法计算待检样品的中和效价。()纯化的病毒抗原经电泳后,分别用于考马斯亮蓝染色和分析。()将凝胶中的牛轮状病毒蛋白通过转印仪转移至硝酸纤维膜(膜)上,电压,。转膜结束后,将膜置于的脱脂乳中室温封闭,洗三次；将膜置于封闭液稀释的单克隆抗体腹水中()室温慢摇孵育,洗涤次；再置于封闭液稀释的标记的羊抗鼠()室温慢摇孵育,洗涤次；使用底物显色液显色,出现条带后,立即用清水终止反应。单克隆抗体免疫球蛋白亚类的鉴定应用抗体亚类鉴定试剂盒(公司)鉴定单克隆抗体的亚类。具体方法：纯化的牛轮状病毒℃过夜包被板,脱脂乳封闭,以待检单克隆抗体为一抗,以试剂盒内提供的羊抗鼠、、、、、、λ、κ为二抗,避光显色,终止反应,用酶标仪测定值。单克隆抗体腹水的制备与单抗的提纯19 2.2.4.1腹水的制备取～周龄雌性小鼠,每只腹腔注射灭活的液体石蜡,一周后腹腔注射×个杂交瘤细胞,待一周左右小鼠腹部隆起,采集腹水,离心,收集上清,于℃保存备用。腹水的纯化()取腹水与的醋酸盐缓冲液混合,用玻璃棒搅拌均匀；在室温条件下逐滴加入μ辛酸,室温搅拌,于℃静置以上；,℃离心；过滤并除去沉淀；上清用调节值至。()在℃条件下,边搅拌变缓慢的滴加饱和硫酸铵至饱和度,冰浴搅拌,于℃静置以上；离心,弃上清,沉淀溶于的中。()将沉淀重悬液装入事先处理好的透析袋中,的℃透析天,每换一次液。()透析结束后,回收纯化的腹水,经蛋白质定量试剂盒()测定浓度,电泳进行纯度鉴定。()将较高浓度的腹水再经二乙胺基乙基葡萄糖凝胶()柱层析按说明书进一步纯化。纯化后收集腹水,并用测定浓度,电泳进行纯度鉴定。辣根过氧化物酶()标记单克隆抗体采用改良的过碘酸钠法对检测进行标记。具体操作步骤：取溶于的缓冲液中,搅拌均匀；加入新配置的溶液,混合均匀,℃,溶液颜色由橙色变为灰绿色。加入乙二醇溶液,室温避光,溶液颜色由灰绿色变为橙色。向其中加入含有纯化的抗体溶液,玻璃棒搅拌均匀,将溶液调制,并装入事先处理好的透析袋中,的碳酸盐缓冲液℃透析,每换一次液体。透析后加入新配置的溶液,混匀,℃静置。边搅拌边向溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液,混匀后,℃静置,离心；弃上清,用的溶液将沉淀重悬,装入事先处理好的透析袋中,于()℃透析过夜,每换一次液体。次日离心,弃去沉淀,即得酶标抗体。20 用直接方法检测所标记抗体的效价,抗体稀释倍,值达以上即为合格。将标记合格的抗体加入等量甘油并分装,于℃保存备用。多克隆抗体的纯化采用辛酸饱和硫酸铵法对多抗血清进行纯化,具体步骤见。纯化后的多抗用测定其浓度,经电泳进行纯度分析。固相竞争的术式和操作步骤固相竞争的术式固相竞争试验中,每一步均采用μ反应体系(除检测单抗和检测样品竞争结合抗原这一步反应体系为μ)。最佳使用浓度的确定分两步进行：首先,确定包被多抗及检测单抗的最佳使用浓度；其次,确定抗原的最佳使用浓度。具体操作：()利用方阵滴定法确定包被抗体(兔多抗)及检测抗体()的最佳使用浓度。包被液从连续倍倍比稀释纯化的多抗,横向加入板中,μ孔,℃包被过夜,次日用洗板；加入足量病毒抗原,μ孔,℃孵育,(洗板次,每次；加入稀释的检测单抗(,)纵向加入板中,μ孔,℃孵育,如上洗板；加入显色液,μ孔,避光显色,加入等量的终止反应,用酶标仪测定值。以值最高的一点所对应的包被多抗和检测单抗的稀释倍数为其最佳使用浓度。()利用以上确定的包被多抗和检测单抗的最佳使用浓度,采用抗原捕获方法确定试验中病毒抗原的最佳使用浓度。将包被多抗稀释到最佳浓度包被板,封闭后,将病毒抗原从、～倍比稀释加入板中,μ孔,℃孵育,洗板；加入上述已确定好的最佳使用浓度的检测单抗,μ孔,℃孵育,洗板；避光显色,终止反应,用酶标仪测定值。选取值最高的一点所对应的病毒抗原稀释倍数为其最佳使用浓度。各试剂的使用浓度经方阵滴定确定后,可用于固相竞争中。每批病毒抗原、包被抗体、检测抗体都要经方阵滴定法确定最佳使用浓度,方可用于。固相竞争操作步骤()碳酸盐包被液稀释多克隆抗体至最佳使用浓度,包被板,μ孔,℃包被过夜。次日取出板,甩弃板内液体,洗板次,每次。()用脱脂乳封闭板,μ孔,℃孵育,洗板。21 ()稀释病毒抗原至最佳使用浓度,μ孔,℃孵育,洗板。()稀释阴性对照血清至和,稀释阳性对照血清从开始倍比稀释至倍,待检血清用稀释至,μ孔,立即加入用稀释的检测单抗,μ孔,℃孵育。注意,此时板中反应体系为μ。()加入显色液,μ孔,避光显色,加入等量的终止反应,用酶标仪测定值。()通过检测已知阴阳性血清,计算抑制百分率(,)确定检测结果。计算公式：被检血清(或对照血清)值抑制百分率()病毒抗原对照平均值×对照的设立：每块检测板设有个阳性对照孔,阳性对照的值应随着稀释倍数的增加而增大,以显示系统的准确性；孔设为阴性对照；孔设为抗原对照；孔设为空白对照。间接的术式和操作步骤()碳酸盐缓冲液稀释纯化的牛轮状病毒,μ孔,℃包被过夜,洗板；脱脂乳,μ孔,℃封闭,洗板。()加入待检测血清样品(),μ孔,℃孵育,洗板。()加入标记山羊抗牛(),μ孔,℃孵育,洗板。()加入显色液,μ孔,避光显色,加入等量的终止反应,用酶标仪测定值。双抗体夹心抗原检测方法的术式和操作步骤双抗体夹心抗原检测方法的术式利用方阵滴定法确定包被多抗(兔多抗)及检测抗体(单克隆抗体)的最佳使用浓度,具体操作步骤见。各试剂的使用浓度经方阵滴定确定后,可用于双抗体夹心中。双抗体夹心抗原检测方法的操作步骤碳酸盐缓冲液稀释多克隆抗体至最佳使用浓度,μ孔,℃包被过夜,洗板次,每次；的脱脂乳封闭酶标板,μ孔,℃孵育,同上22 洗板；加入待检样品和阴、阳性对照,μ孔,℃孵育,洗涤方法同上；加入用稀释的检测单克隆抗体,μ孔,℃孵育,洗涤方法同上；底物显色μ孔,室温避光；加入μ孔终止反应,用酶标仪测定值。取粪便样品,用稀释成μ悬液,采用常规法提取总,并用(、)引物进行扩增。23 3结果单克隆抗体的纯化及标记制备单克隆抗体腹水,经辛酸饱和硫酸铵方法对单克隆抗体进行初步纯化,电泳结果显示,单克隆抗体获得了较高的纯度,经测定单克隆抗体浓度为。初提后的单克隆抗体再经离子交换层析进一步纯化,利用间接测定其效价为：。用改良的过碘酸钠法对单克隆抗体进行标记。利用抗体亚类试剂盒鉴定,表明单克隆抗体是κ型。经硫氰酸盐洗脱法测定,单克隆抗体的相对亲和力常数为。检测中,单克隆抗体腹水只与、型毒株呈阳性反应,而与、型轮状病毒不反应,单克隆抗体与表明为牛轮状病毒共享型单克隆抗体。多克隆抗体的纯化经辛酸饱和硫酸铵方法对多克隆抗体进行纯化,电泳结果显示,多抗获得了较高的纯度。经测定多抗的浓度。经间接测定,纯化后的多抗效价为：。牛轮状病毒抗体固相竞争检测方法的建立各试剂最佳使用浓度的确定本研究应利用兔抗多抗和单克隆抗体建立固相竞争()方法。以兔抗多抗为包被抗体,标记的共享型单克隆抗体为检测抗体,采用方阵滴定法确立方法中包被多抗和检测单抗的最佳使用浓度,利用双抗体夹心对病毒抗原的最佳使用浓度,进行术式的确立。结果显示,兔抗多抗的最佳使用浓度每孔,检测单克隆抗体的最佳使用浓度稀释,牛轮状病毒病毒抗原()使用浓度为。固相竞争临界值的确定对份阳性血清样品和份阴性血清样品分别进行和倍稀释,用已建立的方法检测,统计反应的值,确定血清的最佳稀释倍数。如图所示,24 血清样品和稀释时,阴、阳性血清样品的值无交叉。选取份血清样品分别作将和稀释,统计反应值,用以确定方法样品的最佳稀释度和临界值,计算所得的值应用软件绘制()曲线,计算指数(指数：敏感性特异性),并选择指数最大的切点为临界值。如图及表所示,两个稀释度曲线下面积()均大于,表示诊断结果均合格。但因稀释更节省血清、利于操作,故本实验将血清最佳稀释倍数定为。根据结果中各个切点的敏感性及特异性结果,计算指数为,所对应的切点为,所以最终确定为最佳临界值,确定的可疑区间为之间。图对份阴性血清和份阳性血清的频率分布图25 图检测血清分析表检测不同稀释度血清曲线下的面积渐近置信区间血清稀释度标准误渐进上限下限在非参数假设下零假设：实面积固相竞争的敏感性用检测已知阳性血清份,其中份为阳性,敏感性为对份牛轮状病毒阳性血清用、及间接同时检测,比较三种检测方法的敏感性。结果如表所示,、及间接的敏感性分别为、和。表、、间接检测抗体的敏感性比较阳性血清样品间接份敏感性26 3.3.5固相竞争检测的符合率应用、间接、商品化检测抗体试剂盒及方法检测阴、阳性血清共计份。结果如表所示,、间接、商品化试剂盒及方法的阳性率分别为()、()、()和()；与间接、商品化试剂盒及方法的符合率分别为、和。结果表明,我们建立的与其他检测方法的符合率良好。表、间接、商品化试剂盒及检测抗体的符合率比较检测样品(份数)试剂盒间接阳性份份份份阴性份份份份阳性率与符合率固相竞争的重复性批内重复,应用同一批次制备的包被多抗、抗原、标记的检测抗体,在相同条件下用所建立的对份血清样品独立检测次,统计检测的值(表),计算的标准差为、变异系数为,表明批内重复性良好。27 表批内重复性试验血清编第一次第二次第三次血清编第一次第二次第三次号号()批间重复,用制备的不同批次包被多抗、抗原、标记的检测抗体,在相同条件下用对份血清样品独立检测次,统计反应的值(表),计算得标准差为,变异系数为,说明批间重复性良好。28 表批间重复性试验()()血清编号第一次第二次血清编号第一次第二次()为了分析方法的精确性和稳定性,分别记录每次检测结果中抗原对照的值、阳性对照和阴性对照的值,并计算其平均值()、标准差()和变异系数()。由表可知,抗原对照和阳性对照的变异系数均在以内,说明其变异程度符合要求。而阴性对照的变异系数大于,这一现象与的研究相符。表每次检测中标准对照统计结果检测板数抗原对照阳性对照()阴性对照()量(),29 3.3.7固相竞争的室内质量控制为了验证每一次检测结果的准确性和可信度,每一块检测板中都要加入阴、阳性对照血清,记录相应的值,应用软件进行指控分析。如图和所示,每一次检测的阴、阳性对照血清的值均在上下限(±)范围内,说明每次检验均合格有效。图牛轮状病毒抗体阴性对照血清质控图图牛轮状病毒抗体阳性对照血清质控图固相竞争方法的应用应用方法检测份血清样品,经检测份为阴性,阳性率为,阳性率较高的结果和以往的研究结果是相符的。为进一步评价检测方法的特异性和敏感性,本研究选取编号为、、、的头免疫接种型二价疫苗的新生犊牛的血清,30 同时采用、及间接检测其抗体的消长动态,结果用表示、间接用表示、以抗体效价表示,绘制相应的抗体消长曲线。结果如图所示,图为应用方法对不同时间点采集血清的检测结果；为应用间接方法对不同时间点采集血清的检测结果,为应用方法对不同时间点采集血清的检测结果。结果显示,接种后天开始产生抗体,天抗体达到最高水平。对、间接和三种方法检测抗体效价的动态曲线进行比较,显示具有一致的抗体变化趋势。图应用、间接和检测免疫牛的血清抗体动态变化,,双抗体夹心检测方法的建立与应用双抗体夹心各试剂最佳使用浓度的确定本研究应用兔多克隆抗体为包被抗体,以标记的单克隆抗体为检测抗体。经过方阵滴定,确定多克隆抗体最适包被浓度为每孔μ,最适稀释倍数为。双抗体夹心判定标准的确定按照已建立的双抗体夹心检测方法,随机选取份阴性样品进行检测,并计算平均值()和标准差()。根据统计学原理,当值,可以31 在可信度上判定为阳性,能够作为检测结果的判定标准。经多次重复试验,确定的判定标准为：为阳性,为阴性,介于～之间为可疑、需要重新检测。特异性实验如表所示,按照已建立的双抗体夹心方法对牛呼肠孤病毒()、牛细小病毒()、牛传染性鼻气管炎病毒()、牛副流感病毒型()、牛腹泻粘膜病病毒()以及阿卡斑病病毒()进行检测,均小于,表明本研究建立的双抗体夹心方法具有较高的特异性。表特异性试验敏感性试验将牛轮状病毒株细胞培养液()从开始做系列稀释,并用已建立的方法进行检测。结果显示,本研究建立的抗原捕获的病毒最低检出量为；商品化试剂盒的病毒最低检出量为(图)；方法的病毒最低检出量为(图)。结果表明,本研究建立的方法具有较高的敏感性,优于商品化试剂盒,但是低于方法。32 图敏感性试验结果(双抗体夹心与商品化试剂盒的敏感性比较的敏感性)重复性试验分别利用相同批次和不同批次包被的板,对两份不同稀释倍数的阳性样品分别进行次检测,利用统计学公式计算变异系数。结果如表所示,变异系数均小于,表明所建立的双抗体夹心方法具有较好的重复性。表组内和组间重复性试验结果病毒稀释倍数组内变异组间变异平均数变异系数平均数变异系数()()符合性试验应用本研究建立的双抗体夹心方法、商品化试剂盒、方法,同时对份牛腹泻粪便样品进行检测,结果如表所示,三种检测方法结果一致,符合率达。33 表双抗体夹心、、商品化试剂盒检测的符合率、双抗体夹心商品化试剂盒检测样品(份数)阳性样品(份数)阴性样品(份数)符合率双抗体夹心的初步应用采用、试剂盒和双抗体夹心对份牛粪便样品进行检测,结果如表所示,、试剂盒和双抗体夹心检测出的阳性率分别为、和。表、试剂盒、双抗体夹心对样品的检测检测方法(样品()试剂盒()双抗体夹心数)()阳性数阴性数阳性率34 4讨论牛轮状病毒病原学及血清学诊断方法的研究现状牛轮状病毒是引起犊牛腹泻的主要病原体之一,牛轮状病毒感染不但影响犊牛的生长发育和成年后的泌乳性能,还可以继发细菌和冠状病毒的感染,导致更高的死亡率,造成严重的经济损失,影响养牛业的发展。病原学及血清学诊断技术的研究,是牛轮状病毒综合防控技术体系研究的基础。由于轮状病毒血清型众多,而且不同血清型之间不能够完全交叉保护,因此病原流行病学调查是疫苗研究的重要依据。目前,可用于牛轮状病毒病原学检测的方法包括电子显微镜观察、病毒核酸电泳以及等,但是这些方法均存在操作费时、依赖实验室条件等缺点。方法,具有操作简便、省时、易于大规模检测等优点,可是,用于检测牛轮状病毒的标准化方法目前尚无报道。本研究利用标记的共享型单克隆抗体为检测抗体,多克隆抗体为捕获抗体,建立一种能快速检测牛轮状病毒的双抗体夹心方法,为我国牛轮状病毒感染和流行的检测、实验室诊断和抗原检测试剂盒的研制奠定了基础。牛轮状病毒抗体的血清学检测,对于牛轮状病毒抗体阴性动物筛选、疫苗评价及抗体动态分析等具有重要意义。目前,检测牛轮状病毒抗体的方法包括病毒中和试验和间接,但是病毒中和试验操作繁琐,敏感性较低,需要使用病毒,只能用专门的生物安全柜进行,这样就不利于现地大规模的检测；间接,虽然弥补了的一些不足,但是其特异性较低,易造成检测结果假阳性,而且方法的稳定性受病毒抗原纯度的影响。固相竞争被广泛应用于病毒血清抗体的检测。等人于年首次建立了竞争方法,该方法是将单克隆抗体和被检血清同时加入到事先制备好的板中,二者同时竞争结合板中的抗原,如标本中抗体含量越多,则结合在抗原上的检测抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应；该方法较操作简便,又弥补了间接的不足,赢得了广泛的认可,因此本研究利用了固相竞争的优点和单克隆抗体高度特异性的优势,建立一种可以快速检测牛轮状病毒抗体的固相竞争方法。该方法适用于牛轮状病毒抗体阴性动物的筛选,指导疫苗免疫程序的制定,评价牛轮状病毒疫苗的保护效果。35 4.2以单克隆抗体为基础的轮状病毒抗原及抗体检测方法的优势在诊断方法的研究中,检测方法的特异性、敏感性和有效性决定了其实用性。单克隆抗体只识别单一抗原决定簇,决定其具有高度的特异性；而且,单克隆抗体均质性好、易于标准化、可批量生产。因此,采用单克隆抗体建立诊断和检测方法,是一种必然的发展方向。等人利用牛轮状病毒的单克隆抗体建立一种方法,可特异性的检出人轮状病毒；崔晓晨等人利用猪轮状病毒的单克隆抗体建立了一种基于的胶体金方法；等应用单克隆抗体建立了一种可对进行直接分型的方法,并与中和试验做比较,发现建立的检测方法的分型率为、高于中和试验的,证实了该在感染的临床流行病学中的实用性；等人,利用群轮状病毒中和活性单克隆抗体建立了一种检测人轮状病毒的检测方法,特异性好、灵敏性高；何孔旺等应用基于单克隆抗体建立双抗夹心方法,检测犊牛腹泻粪便样品的符合率高达。可见,利用单克隆抗体建立诊断方法,已经成为检测轮状病毒的发展趋势。方法检测的是血清中能与检测抗体竞争结合的特异性抗体,本实验利用单克隆抗体特异性强这一特点,将其作为中的检测抗体,使检测方法更为敏感。据我们的研究,和是我国牛轮状病毒主要流行株,而本实验的检测单抗恰好是型共享单抗。将检测单克隆抗体进行标记,然后与被检血清竞争性结合病毒抗原,增加了的特异性,同时也节省了反应时间。在双抗体夹心中,本研究采用改良的过碘酸钠法对单克隆抗体进行标记,作为检测抗体,建立一种特异性检测牛轮状病毒的双抗体夹心方法,标记的单克隆抗体可以特异性与病毒抗原结合,省去孵育二抗的步骤,不仅降低了检测成本,也节省了反应时间,为现地大规模检测提供了方便。固相竞争方法的建立与应用随着我国养牛业的快速发展,各种疾病的发生和流行不断增加,腹泻己经成为牛场最常见的疾病,而且以轮状病毒所引起的犊牛腹泻最为严重。轮状病毒的血清型众多,毒株间差异较大,治疗轮状病毒引起的腹泻病尚无特效药,发展安全有效的疫苗来控制轮状病毒腹泻显得尤为重要。因此,建立一种可以快速检测牛轮状病毒抗体的竞争方法,36 对牛轮状病毒阴性动物的筛选,牛轮状病毒疫苗的评价具有重要的价值。基于双抗原夹心检测抗体的方法,其敏感性和稳定性依赖于每批纯化的抗原,缺点是易受到标本中多种物质的干扰而产生假阳性反应。多克隆抗体可以识别多个抗原表位,作为检测系统中的包被抗体可使检测系统达到更高的灵敏度；单克隆抗体具有特异性好、性质稳定、易于制备等优势而广泛应用于病毒疾病的诊断。本研究利用针对型的单克隆抗体和兔抗多抗建立了检测牛轮状病毒抗体的方法。多克隆抗体作为捕获抗体,有一定的广谱性,但因为多抗本身的原因,会产生非特异反应,而本实验的检测抗体是用标记的单克隆抗体,可最大程度地降低这种非特异性。在本研究中,牛轮状病毒抗体阴性血清样品的缺乏给方法的建立带来一定的困难,但是已有的阴性血清数量已能够确立方法的临界值。更为重要的是,本研究建立的方法的临界值的确定借助了曲线分析,该方法已广泛用于临床医学研究中,而在动物医学领域内应用甚少。本研究利用曲线确定临界值,同时还要参照阴、阳性两个群体对照,在保证敏感性和特异性的前提下,确定最佳临界值,在曲线上的两个折点对应的抑制率为可疑范围。一般情况,对于可疑区间的样品要重新检测,若重新检测后仍在可疑区间内,那么检测的结果应按照具体检测情况分析。如是检测未免疫动物的抗体,则判定为阴性；若用于疫病扑灭计划或国际贸易的检测,则应选取较低的临界值,而将其判为阳性。选取份牛轮状病毒抗体阳性血清,利用、及间接三种方法同时进行检测,比较三种方法的敏感性。其中,间接的敏感性最高,推测是牛血清样品中与包被抗原发生非特异性结合,从而造成假阳性；而试验受操作技术本身的影响,其敏感性相对较低。这样,我们建立的方法其敏感性低于间接、高于试验,是符合一般规律的。符合性试验结果表明,我们建立的方法与间接、以及商品化试剂盒均有较高的符合率,经过分析,不符合样品的值均在临界值附近。方法相对于间接而言能够充分利用单克隆抗体的特异性,可降低方法的非特异性,从而有效地降低检测结果的假阳性率。诊断方法的精确度是通过重复性试验确定。重复性试验结果显示,批间和批内重复的变异系数分别为和,表明我们建立的方法有较好的重复性。为了更加精确的分析的稳定性和每次检测的准确切,本研究对每次检测阴、阳性血清的和抗原对照的值进行检测,其变异系数分别为,,。以上实验数据表明本研究建立的方法的重复性良好。37 对份牛血清进行检测,份为阳性,阳性率达,这与以往的研究结果相符。同时,应用、和间接方法对头注射牛轮状病毒疫苗的犊牛进行抗体水平检测,并绘制抗体消长曲线。接种后天头牛开始产生抗体,天抗体达到最高水平。从抗体消长曲线可以看出,、和间接的抗体变化趋势相符,特别是和十分接近。这三种检测方法的结果均有高度的相关性,表明本研究建立的方法可用于现地牛血清的检测。双抗体夹心方法的建立与应用牛轮状病毒在世界范围内分布广,感染率高,对新生犊牛危害极大,经济损失严重。因此建立一种快速检测牛轮状病毒的方法,对牛轮状病毒的防控技术研究极为重要。双抗体夹心又称抗原捕获,该方法已被大量用于动物疫病的临床诊断。其基本原理是：将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体；加受检标本,标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物；加入酶标抗体,固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合；彻底洗涤未结合的酶标抗体,加底物显色,此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。目前国内外均已有商品化的人轮状病毒抗原试剂盒。基于单抗的牛轮状病毒抗原检测方法目前国内尚无报道,因此本研究建立了检测牛轮状病毒的双抗体夹心方法,该方法具有较好的特异性、敏感性及重复性,初步应用结果表明具有实用性,为开发牛轮状病毒抗原检测试剂盒奠定了基础。特异性好和敏感性高是对诊断方法的基本要求。本实验的检测单克隆抗体先采用辛酸饱和硫酸铵法进行纯化,再经(二乙基氨基乙基葡聚糖,简称)离子交换层析进一步纯化。是一种弱碱性阴离子交换剂,利用将的转变为后,在～的环境中其可吸附腹水中的酸性蛋白,而γ球蛋白则不能被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可获得纯化的。我们的结果表明,利用辛酸饱和硫酸铵法对单抗腹水进行粗提,粗提液进一步经过柱层析纯化,通过分析得到纯度较高的,采用改良的过碘酸钠法进行标记,因此不使用商品化的酶标二抗。这主要是考虑到,在一种诊断方法中,加入任何一个成分都可能影响检测方法的特异性,同时也可以减少操作步骤、缩短反应时间,便于临床应用。本实验的包被抗体多抗选取辛酸饱和硫酸铵发进行纯化,纯化后经分析,得到较高纯度的,使检测38 方法具有较高的特异性。本研究建立的双抗体夹心方法可用于检测细胞培养的病毒和临床样品,具有较高的敏感性、特异性和重复性。对细胞病毒的最低检出量为病毒,优于轮状病毒商品化试剂盒的病毒,但却低于的病毒。在后续试验中,我们将对方法进行优化,重新制备一批效价较高的腹水,从而提升该方法的敏感性。利用建立的双抗体夹心方法对牛呼肠孤病毒、牛细小病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒型、牛腹泻粘膜病病毒以及阿卡斑病病毒进行检测,结果值均低于,证明与这几种牛源病毒无交叉反应。应用所建立的双抗体夹心方法,对份样品进行检测,其中有份样品为牛轮状病毒阳性,阳性样品数量低于的份,高于试剂盒的份,这一结果也与三者的敏感性比较研究相符。通过对我国牛轮状病毒流行毒株进行分型鉴定,确定我国目前流行的牛轮状病毒主要是和型,而本研究使用的检测单克隆抗体针对型牛轮状病毒,可以特异性的检测出牛轮状病毒,为今后牛轮状病毒抗原检测试剂盒的开发奠定了基础。39 5结论本研究应用针对型牛轮状病毒的单克隆抗体和多抗建立了固相竞争,该方法有良好的特异性和敏感性,与病毒中和试验、间接、商品化试剂盒符合率均高于,批内、批间重复性试验显示变异系数分别为与,表明重复性良好,操作简便,适用于大规模的检测。本研究应用针对型牛轮状病毒的单克隆抗体和多抗建立了双抗体夹心,该方法可以检出牛轮状病毒,与,,,,无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数均小于,表明重复性良好。应用方法检测份血清样品,经检测份为阴性,阳性率为。同时,本研究选取头免疫接种型二价疫苗的新生犊牛的血清,同时采用、及间接检测其抗体的消长动态,并对三种检测方法的抗体效价曲线进行比较,结果显示三种检测方法显示具有相同的抗体变化趋势。采用、试剂盒和双抗体夹心对份牛粪便样品进行检测,结果显示,、试剂盒和双抗体夹心检测出阳性率分别为、和。40 参考文献41 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genotypes.InfectGenetEvol,2011.11(1):p.57-63.91.南晓伟牛组轮状病毒全基因的克隆与原核表达中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会中国广西南宁徐育云重庆北部地区婴幼儿轮状病毒感染的流行病学特征研究现代医药卫生茹维萍河南省轮状病毒基因组特征及血清型分布的研究中国卫生检验杂志47 104.赵锦铭小儿急性感染性胃肠炎轮状病毒感染的病原学研究中华实验和临床病毒学杂志孙利炜长春市儿童医院～年轮状病毒哨点监测分析中华流行病学杂志童志礼北京友谊医院～年轮状病毒哨点监测分析中华流行病学杂志田健美苏州地区岁以下儿童轮状病毒腹泻的临床流行病学研究小儿急救医学李国平仔猪轮状病毒的感染情况调查福建畜牧兽医周绪斌王新平轮状病毒致病性研究进展动物医学进展48 Lancet,1999.353(9160):p.1275.120.Tsunemitsu,H.,etal.,FirstdetectionofbovinegroupBrotavirusinJapanandsequenceofitsVP7gene.ArchVirol,1999.144(4):p.805-15.121.Grant,L.R.,etal.,Efficacyofapentavalenthuman-bovinereassortantrotavirusvaccineagainstrotavirusgastroenteritisamongAmericanIndianchildren.PediatrInfectDisJ,2012.31(2):p.184-8.122.Park,S.H.,etal.,MolecularcharacterizationofnovelG5bovinerotavirusstrains.JClinMicrobiol,2006.44(11):p.4101-12.123.Badaracco,A.,etal.,BovinerotavirusstrainscirculatinginbeefanddairyherdsinArgentinafrom2004to2010.VetMicrobiol,2012.158(3-4):p.394-9.124.Pisanelli,G.,etal.,DistributionofG(VP7)andP(VP4)genotypesinbuffalogroupArotavirusesisolatedinSouthernItaly.VetMicrobiol,2005.110(1-2):p.1-6.125.Reidy,N.,etal.,MolecularcharacterisationandanalysisofbovinerotavirusstrainscirculatinginIreland2002-2004.VetMicrobiol,2006.117(2-4):p.242-7.126.Rodriguez-Limas,W.A.,etal.,GenotypificationofbovinegroupArotavirusinMexico.Vaccine,2009.27(46):p.6411-4.127.LeBaron,C.W.,etal.,AnnualrotavirusepidemicpatternsinNorthAmerica.Resultsofa5-yearretrospectivesurveyof88centersinCanada,Mexico,andtheUnitedStates.RotavirusStudyGroup.JAMA,1990.264(8):p.983-8.128.何孔旺河南部分地区犊黄牛轮状病毒的分离培养及其血凝特性的研究畜牧与兽医常继涛我国部分地区牛轮状病毒的病原学调查及一株型牛轮状病毒的分离鉴定中国预防兽医学报陈军华轮状病毒感染乳鼠致病机制的实验研究第三军医大学学报49 S16.135.Zvizdic,S.,etal.,Clinicalcharacteristicsofrotavirusesdisease.BosnJBasicMedSci,2004.4(2):p.22-4.136.欧巧群从轮状病毒感染腹泻患儿血液中检出轮状病毒中华传染病杂志严懿嘉猪传染性胃肠炎病毒呼吸道途径侵染后在体内的动态分布中国兽医学报王靓靓猪流行性腹泻的诊断与预防世界华人消化杂志史月明猪轮状病毒油乳剂灭活疫苗的制备及免疫性试验东北农业大学倪亚炜猪和牛轮状病毒的分离与鉴定病毒学报付新成聚丙烯酰胺电泳检测犊牛轮状病毒饲料广角赵庆欢免疫荧光法检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒外壳蛋白生物技术通讯边亚娟林长水猪轮状病毒重组蛋白多克隆抗体与单克隆抗体间接免疫荧光试验的比较畜牧与兽医50 simultaneousdetectionofbovinecoronavirusandgroupArotavirus.JVirolMethods,2010.169(2):p.375-9.152.Gouvea,V.,N.Santos,andC.TimenetskyMdo,IdentificationofbovineandporcinerotavirusGtypesbyPCR.JClinMicrobiol,1994.32(5):p.1338-40.153.deRougemont,A.,etal.,[SensitivityandspecificityoftheVIKIARota-Adenoimmuno-chromatographictest(bioMerieux)andtheELISAIDEIARotaviruskit(Dako)comparedtogenotyping].PatholBiol(Paris),2009.57(1):p.86-9.154.Kelkar,S.D.,DevelopmentofindigenousELISAforrotavirusdiagnosis&itscomparisonwithcommercialkit.IndianJMedRes,1993.97:p.93-101.155.Keswick,B.H.,etal.,Evaluationofacommercialenzymeimmunoassaykitforrotavirusdetection.DiagnMicrobiolInfectDis,1983.1(2):p.111-5.156.吴奇英猪轮状病毒荧光定量方法的建立及初步应用华中农业大学崔晓辰群轮状病毒单克隆抗体及免疫胶体金试纸条制备东北农业大学史喜菊环介导恒温扩增技术在动物病原检测中的应用动物医学进展曹竹婷检测牛轮状病毒抗体间接方法的建立中国预防兽医学报孙东波猪传染性胃肠炎病毒重组蛋白抗原间接抗体检测方法的建立中国预防兽医学报李鑫我国群牛轮状病毒感染的血清流行病学调查中国预防兽医学报李崇华动物轮状病毒病的研究进展兽医科技杂志51 ClinMicrobiol,1999.37(12):p.3879-82.168.Doan,Y.H.,etal.,Identificationbyfull-genomeanalysisofabovinerotavirustransmitteddirectlytoandcausingdiarrheainahumanchild.JClinMicrobiol,2013.51(1):p.182-9.169.Mukherjee,A.,etal.,DetectionofhumanG10rotavirusstrainswithsimilaritytobovineandbovine-likeequinestrainsfromuntypablesamples.InfectGenetEvol,2012.12(2):p.467-70.170.杨国峰周鹏王健伟轮状病毒疫苗研究进展及其转基因植物疫苗的开发前景生物技术通报张俭伟被动免疫预防犊牛轮状病毒感染的研究中国人兽共患病学报周晗表达猪轮状病毒与基因重组干酪乳杆菌的构建及免疫学评价东北农业大学常继涛牛轮状病毒病原流行病学调查、基因重配毒株的构建及二价减毒株的免疫原性评价中国农业科学院张怡婷牛轮状病毒蛋白间接检测方法的建立中国兽医科学吴城福建省牛流行性腹泻病原—牛轮状病毒的研究畜牧兽医学报栾婧婧新分离牛轮状病毒及其血清型的研究家畜生态学报王洁清牛轮状病毒检测和基于重组抗原检测血清抗体方法初步建立东北农业大学侯美如牛轮状病毒双抗体夹心检测方法的建立黑龙江八一农垦大学学报52 182.刘纯荣牦牛腹泻病原—轮状病毒的调查中国兽医科技53 致谢时光荏苒,转眼间在中国农业科学院哈尔滨兽医研所学习的两年时间即将结束,有美好的回忆,也有些许遗憾。值此毕业论文完成之际,特别感谢所有帮助、支持、关心过我的人。首先,衷心的感谢我的导师于力研究员,本论文从试验设计,到试验的开展,直至最后的论文撰写都是在您的帮助和指导下完成。两年的时光,转瞬即逝,感谢您在学习、工作和生活上给予我无私的关心和帮助。感谢我的导师崔玉东教授,您严谨的科研态度和爱岗敬业的精神,为我树立了学习的榜样,激励我在以后的科学道路上,不畏艰险,勇往直前感谢常继涛老师,感谢您对我实验上的细心指导,感谢您对我生活中的帮助,感谢您在我遇到困难时的教导和鼓励。感谢中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病创新团队的每一位老师、感谢您们在学习、生活中给予我的热情的帮助和无微不至的关怀,感谢你们对我实验上的指导,更要感谢您们在教我做学问的同时教导我如何更好的做人,再此特别感谢朱建英女士、韩宏军女士在我实验过程中提供的便利条件。感谢我的师兄,姜志刚、戴建、汤伟,谢谢你们对我学习上的指导,感谢我的师姐曹丽艳、孙静、周雪、杨轩、张丽萌谢谢你们对我生活上的照顾,祝你们今后工作顺利。感谢我的同窗们,希望考博的你们能考上理想的学府,工作的你们能事事顺心。感谢我的师妹宋满满硕士、魏玉华硕士,师弟王建男硕士,特别感谢刘丛硕士对我生活的照顾,魏玉华硕士和王建男硕士帮我办理的各种琐事。在此特别感谢一直以来关心、支持和帮助我的朋友们,是你们给我提供了学习和生活的良好环境,在我需要帮助的时候,是你们利用你们的宝贵时间帮我克服了重重困难最后我要感谢我的父母,哥哥张伟姐姐张佳宁你们的鼓励是我不断前进的动力,你们的教导更是我人生宝贵的财富,你们的健康是我最大心愿。我坚信我将更加成熟与坚强地面对今后的挑战。54 附录各种培养液及溶液的配制细胞培养使用溶液培养基的配制：取一包粉剂溶于超纯水中,加入待其完全溶解之后,调至液体呈桃红色,定容至,滤膜过滤除菌,分装成瓶,℃保存。完全培养液：培养基,加入胎牛血清,加入谷氨酰胺和双抗。℃保存。细胞冻存液：基础培养基、胎牛血清和以比例混合。胰蛋白酶·消化液胰蛋白酶()·加至过滤除菌,分装小瓶(每瓶),于℃保存。双抗青霉素×链霉素生理盐水加至过滤除菌。分装小瓶(每瓶)。于℃保存。谷氨酰胺(倍浓度)谷氨酰胺去离子水加至过滤除菌,分装小瓶(每瓶),于℃保存。维持液基础液谷氨酰胺()双抗()调值至。营养液：基础液、谷氨酰胺()、犊牛血清、双抗()适量调值至。细胞冻存液：基本培养基、胎牛血清和以∶∶的比例混合,密封于℃避光保存。与使用溶液丙烯酸胺：称取丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,加适量去离子水溶解后定容至,滤纸过滤,避光保存。()：溶于去离子水,用调节至,定容至。()：溶于去离子水,用调节至,55 定容至。过硫酸铵：过硫酸铵溶于去离子水中,注意该溶液要现用现配。：溶于去离子水中,加热溶解后定容至。电泳缓冲液(×)：去离子水中加入,甘氨酸,,溶解后定容至,室温保存,倍稀释使用。考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝,异丙醇,冰乙酸转印缓冲液：甘氨酸,,溶解于去离子水中,加入甲醇。底物显色液：()显色液中加入二氨基联苯胺约,约,μ,混匀溶解后立即用于显色。使用溶液包被液的碳酸盐缓冲液：称取,,溶解于去离子水中,定容至,调至。溶液：称取,,,,溶解于去离子水中,定容至,调至。洗涤液：中加入,充分混匀。封闭液：含脱脂乳的溶液。终止液：向去离子水中缓慢加入浓硫酸,充分搅拌混匀,备用。辛酸饱和硫酸铵纯化使用溶液饱和硫酸铵：取,加入去离子水,加热使其充分溶解,搅拌后趁热用滤纸过滤。待冷却后用浓氨水调至。醋酸缓冲液：液：无水溶解于去离子水中；液：冰醋酸μ加入到双蒸水中；量取液与液混合,并调至。磷酸缓冲液：,,去离子水定容至,调至。单克隆抗体离子交换层析发纯化缓冲液配置贮存液液：：·,加蒸馏水至；56 B液：·,加蒸馏水至；磷酸盐缓冲盐液配制贮存液液：：·,加蒸馏水至；液：·,加蒸馏水至；应用液：取液加液混合,再以生理盐水作倍稀释即成。缓冲液：,磷酸盐缓冲液()缓冲液配制将上述液取与液混合,再以蒸馏水对倍稀释即成。磷酸缓冲液：·,加水定容至。含磷酸缓冲液：·,加水至。的配置提前打开恒温水浴锅,使水温为°。称量加入纯水中,过滤除菌,将称量好的加到溶液中。将已配制好的溶液瓶放入水浴锅,当水浴锅内对照瓶内的水温达到℃后开始计时,每隔分钟摇动一次,小时后环化完毕,将溶液瓶提出水浴锅。苯酚氯仿异戊醇()配制方法：将·平衡苯酚与等体积的氯仿异戊醇()均匀混合后,移入棕色玻璃瓶中℃保存。注：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚氯仿异戊醇(。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离,而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。57 个人简历姓名：张佳昕性别：女民族：汉族籍贯：黑龙江出生年月：年月日婚姻状况：未婚教育背景黑龙江八一农垦大学动物科学技术学院动物医学专业获农学学士学位黑龙江八一农垦大学研究生学院兽医硕士学位该论文项目来源基金项目：国家科技计划：年月年月()在研期间参与的课题与发表的论文张佳昕,常继涛,崔玉东等牛轮状病毒抗原捕获方法的建立与应用中国预防兽医学报58