猪支原体肺炎双抗体夹心elisa方法的建立

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1、猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立毛春玲陈欣王静秦立鑫/哈药集团生物疫苗有限公司猪肺炎支原体（MPS）是由猪支原体肺炎（Mhp）引起的猪地方流行性肺炎，该病是一种接触性慢性呼吸道传染病。猪只感染后会降低饲料转化率，影响生长发育，并引起其他病毒及细菌的继发感染。该病流行于世界各地，对养猪产业造成了严重的经济损失。（1）由猪肺炎支原体所引起的猪气喘病普遍存在于养殖业发达的国家，该病一直以来是困扰我国养殖业发展的重要疾病。据统计，2010年我国生猪出栏近6亿头，90％以上养殖基地和规模化养猪场都存在着感染猪肺炎支原体的风险，国内该病的感染率可高达80%，是造成我国养猪

2、业经济损失的猪重要传染病之一。由于本病同其他引起猪呼吸道的疾病表现出极为相似的临床症状,并可与猪蓝耳病病毒（Prrs）、猪圆环病毒2型（PCV2),胸膜肺炎放线杆菌（APP）等混合感染，并伴随混合感染和继发感染,增加了临床诊断的难度。目前MhPs的诊断方法主要有：病原分离培养，间接血凝抑制（IHA）、补体结合试验（CFT）、PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)等方法(4)。病毒分离耗时长：PCR、IHA、CFT、LAMP等方法对操作条件及人员有很高的要求，并且费用较高，均不适合在现地推广。针对现地中检测Mhp的情况，我们开展了建立双抗体夹心ELISA检测Mhp的研究，

3、以抗Mhp的兔多抗为捕获抗体，抗MhPs的单克隆抗体3D6为检测抗体，建立了具备较好的敏感性、特异性及重复性的双抗体夹心ELISA方法。一、材料与实验方法1.抗体制备。抗Mhp的单抗3D6及抗Mhp的兔多抗由哈药集团生物疫苗有限公司保存。将保存的单抗3D6及抗Mhp的兔多抗分别用GE公司的ProteinG和ProteinA试剂盒进行抗体纯化，并用BCAProteinAssaykit对抗体浓度进行测定。按照测定结果，将单抗3D6用PBS的浓度调节为3ug/ml,用pH9.6的碳酸盐溶液调节抗MhPS的兔多抗的浓度为5ug/ml。2.双抗体夹心ELISA实验方法。（1）将用

4、pH9.6的碳酸盐溶液稀释后的抗MhP兔多抗包被，每孔加入100μl,置4℃过夜，弃去孔中液体。（2）含0.5%Tin。（3）加入待检测样品和不含病毒的空白对照，37℃孵育1h。（4）弃去孔中液体，用含0.5%Tin。（5）加入调节好浓度的抗PRRSV的N蛋白的单抗3D6加入孔中，3ug/ml，每孔100ul，37℃孵育1h。（6）弃去孔中液体，用含0.5%Tin。(7)加入酶标抗鼠抗体，37℃孵育40min。（8）弃去孔中液体，用含0.5%Tin。（9）加入TMB(四甲基联苯胺)显色液，每孔100ul，置37℃避光放置15min。最后加入2mol/l的H2SO4终止反

5、应，测定OD450值。四、结果判断根据对30份Mhp阴性血清的结果，其均值为0.098，标准差为0.014，得到其阴阳界限值为0.14，因此取OD450≥0.2作为阳性的判定标准。五、PCR检测方法1.DNA提取。（1）取200mg待测样品，放到1.5mlEP管中。（2）将待测样品12000rpm离心2min。（3）沉淀物加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。（4）加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。（5）加入等

6、体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4～5min,将上清转入一只新管中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。（6）沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇。2.PCR。（1）25ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心。Template1ul/3ul、Primer11ul、Primer21ul、2×Master12.5ul、ddH2O补至25ul(9.5ul/7.5ul)。Primer1序列为5’-CCCCCATCCATGAAACCTATTAAAATACCTCTAATTCCT-3’Primer2序列为5’-CCCAAGCTTTTT

7、AAATATTTTTAATTGCATCTGATAAAT-3’（2）PCR循环:①95℃5min、②94℃30s、③53℃60s、④72℃60s(从第2步开始循环30～35个循环)、⑤72℃7min、⑥4℃PCR结束后-20℃保存或置于冰上开始电泳，目的片段大小为948bp。五、实验方法评价1.敏感性试验。将CCU检测为1*107.0的Mhp的阳性样品进行梯度稀释，检出的最低浓度定为该方法的灵敏度。2.重复性及特异性试验。应用该方法对20份阳性病料及10份阴性病料及5份Mhp菌液培养物进行重复，每次间隔时间为一周，共进行6次重复，结果均无差