牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测

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分类号S858.23学校代码10129UDC636.09学号2015202160022牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测BiologicalcharacteristicsandpathogenicgenedetectionofBovineserotypeAPasteurellamultocida申请人：梁禄学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物学与免疫学指导教师：刘大程教授合作导师：成子强教授论文提交日期：二〇一八年六月 摘要本研究对一株在田间分离的牛源多杀性巴氏杆菌的生物学特征和致病特征进行研究。研究先对菌株进行了分离，通过形态学观察、16SrRNA及种特异性引物PCR对菌种进行鉴定，并用PCR法检测其血清型；利用纸片琼脂扩散法及昆明鼠接种测定耐药性及半数致死量LD50；利用PCR法测定该多杀性巴氏杆菌内的常见毒力基因的分布，并对接种的4-6周龄昆明鼠进行病理组织学观察，分析毒力基因与病症的关系。试验为分离株毒力的判断和疾病的治疗提供依据，同时为致病机理的揭示提供资料。试验结果表明:1．本次分离到的菌株为血清型A型多杀性巴氏杆菌。2．分离菌的LD50为25.85CFU/mL，为强毒菌株；分离株对克林霉素、新霉素、青霉素、磺胺异恶唑、替考拉宁具有耐药性（R），对克拉霉素、红霉素呈中介状态（I），对其余25种抗生素均敏感（S）。3．病变器官组织学结果显示其主要病变为肺泡充血、炎性渗出，脾脏淋巴细胞减少及巨噬细胞增多，肝细胞及肾小管上皮细胞广泛性坏死等病变。4．对分离株的毒力基因分布进行了测定，共检测7大类23种常见毒力基因，其中检测到6大类19种，包括黏附因子基因（ptfA，fimA，hsf-2，pfhA，tadD），铁离子摄取基因（exbB，exbD，tonB，hgbA，Fur），唾液酸基因（nanH），透明质酸酶基因（pmHAS），外膜蛋白基因（ompA，ompH，oma87，plpB）以及超氧化物歧化酶基因（sodA，sodC，tbpA）。关键词：A型多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；生物学特性；毒力基因；致病性 BiologicalcharacteristicsandpathogenicgenedetectionofBovineserotypeAPasteurellamultocidaAbstractInthisstudy,thebiologicalcharacteristicsandpathogeniccharacteristicsofabovinePasteurellamultocidaisolatedinthefieldwerestudied.Morphologicalobservation,16SrRNAandspecificprimerPCRwereusedtoidentifythestrainsofPasteurellamultocida,andtheserotypewasdetectedbyPCR,whichistounderstandtheclassificationcharacteristicsofthestrain.ThedrugresistanceandLD50weredeterminedbydiscagardiffusionmethodandanimalinoculation.ThedistributionofthecommonvirulencegenesinthePasteurellamultocidawasmeasuredbyPCR,andthehistopathologicalobservationoftheinoculatedanimalswascarriedout.Therelationshipbetweenthevirulencegeneandthediseasewasanalyzed,andthebasicinformationwasprovidedfortherevelationofthepathogenicmechanism.Theexperimentalresultsshowthat:1.TheisolateswerePasteurellamultocidaserotypeA.2.Themedianlethaldose,LD50ofisolatedbacteriawas25.85CFU/mL,whichwasstrongvirulencestrain.Theisolateswereresistanttoclindamycin,neomycin,penicillin,sulfaisoxazoleandteicoplanin,andweremoderatelysensitivetoclarithromycinanderythromycin,andweresensitivetotheother25antibiotics.3.Thepathologicalresultsshowedthatthemainpathologicalchangeswerealveolarhyperemia,inflammatoryexudation,spleenlymphocytedecreaseandmacrophageincrease,andhepatocyteandrenaltubularepithelialcellnecrosis.4.Thedistributionofvirulencegenesoftheisolateswasmeasuredand7kindsof23commonvirulencegenesweredetected.Amongthem,19virulencegenesweredetectedin6majorcategories,includingtheadhesionfactorgene(ptfA,fimA,hsf-2,pfhA,tadD),theironuptakegene(exbB,exbD,tonB,hgbA,Fur),thesialicacidgene(nanH),hyaluronidasegene(pmHAS),outermembraneproteingene(ompA,ompH,oma87,plpB)andsuperoxidedismutasegene(sodA,sodC,tbpA).Keywords:SerotypeAPasteurellamultocida；IsolationandIdentification；Biologicalcharacteristics；Virulencegenes；PathogenicityDirectedby:Prof.LIUDachengApplicantforMaster’sDegree:LIANGLu(PreventiveVeterinaryMedicine)(CollegeofVeterinaryMedicine.InnerMongoliaAgriculturalUniversity.Hohhot010018,China) 目录1引言............................................................11.1多杀性巴氏杆菌的生物学特性..................................11.1.1形态及染色特征..........................................11.1.2生长要求和培养特性......................................11.1.3血清型分型..............................................11.1.4抵抗力..................................................21.1.5流行病学特点............................................21.1.6致病性..................................................21.1.7致病机制................................................31.2牛源多杀性巴氏杆菌的危害及国内流行情况......................31.3多杀性巴氏杆菌毒力因子的研究进展............................31.3.1荚膜....................................................41.3.2脂多糖（LPS）...........................................41.3.3菌毛与黏附素............................................41.3.4外膜蛋白................................................51.3.5铁调节外膜蛋白（铁离子摄取相关蛋白）....................51.3.6皮肤坏死因子............................................51.3.7唾液酸与透明质酸酶......................................61.3.8超氧化物歧化酶..........................................61.4多杀性巴氏杆菌检测方法的研究进展............................61.4.1细菌的种特异性PCR鉴定法................................71.4.2多杀性巴氏杆菌分子生物学特性的研究方法..................71.5研究目的和意义..............................................92细菌的分离纯化与菌种鉴定.......................................102.1试验材料...................................................102.1.1病料来源...............................................102.1.2试验试剂及仪器设备.....................................102.2试验方法...................................................112.2.1病料采集及细菌的分离纯化...............................112.2.2分离菌株的微生物鉴定...................................112.2.3细菌16SrRNA的PCR鉴定................................122.2.4多杀性巴氏杆菌种特异性基因的PCR鉴定...................142.2.5多杀性巴氏杆菌血清型的PCR鉴定.........................15 2.3试验结果...................................................172.3.1分离菌株的形态观察结果.................................172.3.2细菌16SrRNA基因引物PCR鉴定结果......................182.3.3多杀性巴氏杆菌种特异性及血清型引物PCR鉴定结果.........182.4讨论.......................................................193药物敏感性试验及半数致死量LD50的测定...........................213.1试验材料...................................................213.1.1药敏试验及半数致死量测定的菌株来源.....................213.1.2培养基.................................................213.1.3药敏片.................................................213.1.4试验动物...............................................213.2试验方法...................................................213.2.1药敏试验...............................................213.2.2菌悬液的制备...........................................213.2.3动物致病力试验.........................................223.3试验结果...................................................223.3.1药敏试验结果...........................................223.3.2半数致死量试验结果.....................................233.4讨论.......................................................244毒力基因的检测与病理组织学观察.................................264.1试验材料...................................................264.1.1毒力因子检测的基因组DNA来源...........................264.1.2试验动物...............................................264.1.3试验试剂及试验仪器.....................................264.2试验方法...................................................274.2.1多杀性巴氏杆菌毒力基因的PCR检测.......................274.2.2昆明鼠接种多杀性巴氏杆菌临床症状及病理组织学观察.......294.3试验结果...................................................304.3.1毒力基因PCR检测结果...................................304.3.2小鼠临床症状及病理组织学观察结果.......................314.4讨论.......................................................335结论...........................................................35致谢..............................................................36参考文献..........................................................37作者简介..........................................................46 插图与附表清单1图1多杀性巴氏杆菌菌落形态图..........................................182图2多杀性巴氏杆菌菌体形态图..........................................183图3多杀性巴氏杆菌种特异性基因及荚膜分型PCR电泳图....................204图4多杀性巴氏杆菌毒力基因电泳图......................................315图5肺脏病理组织学观察H.E400×......................................326图6脾脏病理组织学观察H.E100×......................................327图7脾脏组织病理学观察H.E400×......................................328图8肝脏组织病理学观察H.E400×......................................329图9肾脏组织病理学观察H.E400×......................................3310图10心脏组织病理学观察H.E200×......................................331表1试验试剂及主要仪器设备............................................102表216SrRNA基因PCR反应体系（25μL）...............................133表3多杀性巴氏杆菌复合荚膜血清型PCR分型中的寡核苷酸序列..............154表4多杀性巴氏杆菌对30种抗生素的药敏检测.............................225表514d内不同浓度多杀性巴氏杆菌菌液接种组小鼠的死亡率统计............236表6试验试剂及主要仪器设备............................................267表7多杀性巴氏杆菌毒力相关基因检测引物................................27 缩略语表英文缩写英文全称中文全称bpbasepair碱基对CFUcolonyformingunits菌落形成单位DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸EDTAethylenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸ggram克G-Gram-negative革兰氏阴性hhour小时Lliter升LBLuria-BertaniMediumLB培养基LD50fiftypercentlethaldose半数致死量LPSlipopolysaccharide脂多糖mgmilligram毫克minminute分钟mLmilliliter毫升MLSTmultilocussequencetyping多位点序列分型NANutrientAgar营养琼脂培养基NBNutrientBroth营养肉汤培养基PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PFGEPulsed-fieldgelelectrophoresis脉冲场凝胶电泳PMPasteurellamultocida多杀性巴氏杆菌PMTPasteurellamultocidatoxin多杀巴氏杆菌毒素REARestrictionendonucleaseanalysis限制性内切分析RFLPsRestrictionFragmentLengthPolymorphisms限制性片段长度多态性r/minroundperminute转/分钟SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠secsecond秒钟SPFSpecificpathogenfree无特定病原体Trishydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷μgmicrogram微克μLmicroliter微升 内蒙古农业大学硕士学位论文11引言1.1多杀性巴氏杆菌的生物学特性多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae）的多杀性巴氏杆菌属（Pasteurella），是一种通常生活在多种动物上扁桃体及气管的条件致病菌。1.1.1形态及染色特征P.multocida是一种两端钝圆的短杆菌或球杆菌，大小为0.25-0.4μm×0.5-2.5μm，但禽P.multocida比猪P.multocida的菌体略大。不形成芽孢，无鞭毛，不运动，革兰氏染色阴性，病料涂片做瑞氏染色或美兰染色，镜检菌体可见典型的两极着色，但经过多次传代或培养时间较长的菌液涂片镜检，菌体两级着色不清晰。经由动物接种复壮后分离的强毒菌株荚膜较厚，用印度墨汁染色后，镜下观察可见清晰的荚膜，但从自然病例中分离的病原菌经过人工多次传代后，菌株荚膜逐渐消失，毒力减弱。部分P.multocida表面长有周菌毛。有些从猪萎缩性鼻炎病例分离到的产毒P.multocida大部分具有类似纤毛的构造，与大肠埃希氏菌的纤毛类似。1.1.2生长要求和培养特性P.multocida属于需氧或兼性厌氧菌。对营养要求严格。在普通培养基上生长状况不佳，不能在麦康凯培养基中生长。在加入血液、血清的的LB培养基中生长状态良好。最适生长温度为37℃，最适pH值7.2-7.4。该菌在哥伦比亚血琼脂平板上37℃培养24h，形成清亮、淡灰白色的露珠状小菌落，直径约1mm，黏稠，湿润，菌落不产生溶血环。根据P.multocida不同类型的菌株在琼脂培养基上生形成的菌落形态可将其分为黏液型（M）、光滑型（S）和粗糙型（R），其中M型和S型能够产生荚膜。1.1.3血清型分型根据抗原成分，P.multocida可以分成多个血清型。用被动血凝试验对特异性荚[1]膜抗原（K抗原）分类，可分为A、B、D、E、F五种血清型；用琼脂扩散试验对[2]菌体脂多糖（LPS）抗原进行分类，则可分为16个血清型。荚膜抗原具有不同的性质，A型菌株的荚膜主要由透明质酸构成，而B型和E型的荚膜则主要是酸性多糖，其中A、D型荚膜抗原为半抗原。我国目前畜禽中流行的P.multocida主要是A、B、[3-5]D三种血清型。F型数量较少，主要在猪和兔中有发现，而E型在我国没有分布。[6]A型P.multocida是引起牛呼吸道疾病综合症的一种重要病原，而B型则引起牛的[7]出血性败血症。A、B型P.multocida能引起猪肺疫，A型可引起禽霍乱。1 2牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测1.1.4抵抗力P.multocida抵抗力不强。在无菌水或生理盐水中迅速死亡。在阳光下暴晒10min，在56℃加热15min，或60℃加热10min，菌体死亡。在粪肥中存活期长达1个月，[8]而埋入地下的病死动物尸体，经4个月仍可检出活菌的存在。在干燥空气中2-3d可死亡。3%福尔马林、10%石灰乳或0.5%-1%氢氧化钠等经5分钟可杀死该菌。对青霉素、链霉素、四环素、土霉素、磺胺类等抗菌药物敏感。1.1.5流行病学特点对于已经感染的动物，P.multocida可分布于其全身各处组织器官、体液以及分泌物、排泄物中。病原菌可以附着在健康的动物上呼吸道和扁桃体表面而不导致发病，但当动物经过长途运输或饲养环境较差时，由于寒冷、潮湿、环境和气温剧烈变化，[9]使畜禽抵抗力下降从而发病；而环境中的噪音、光线等外界刺激产生的压力还会导[10]致发病率和致死率上升。动物发病后，在体内繁殖的病原体毒力明显增强，产生更强的致病力，菌体随着动物的分泌物、粪尿等排到体外，污染畜禽饲料和饮用水，还可通过呼吸道进行传播。还有少数患病动物不会出现全身性感染，病原体仅出现在组织器官的局部病灶中。1.1.6致病性P.multocida对多种畜禽、野生动物及人类都具有致病性。P.multocida主要导致鸡、鸭、鹅等家禽，奶牛、水牛、猪、羊等家畜及兔等发病较多，该菌在世界范围内均有分布。P.multocida能引起小反刍兽的呼吸道疾病。Zamri-Saad等在1996年的试验中以山羊为模型对不同血清型的P.multocida进行了病理学观察，指出D型P.[11][12][15]multocida可以导致山羊严重的呼吸道疾病。野生动物，如鹿、马、骆驼、驴、[14][13][16][17]犬类、猫科和水貂等也可以感染P.multocida。禽类中鸡、鸭、火鸡属于易[18][19]感动物，鹅、鸽等其他禽类也有发病。该菌能在鸡、鸭、鹅等禽类中引起禽霍乱[20][21]。人的感染主要是由于猫、狗抓伤咬伤引起的蜂窝性组织炎和淋巴腺炎症，有些[22][23]感染者表现为关节出血、骨髓炎，手术中操作不当也会引起P.multocida的感染，[24]还有少数患者是通过呼吸道感染。P.multocida还会对人造成全身性感染，可以引[25][26][27]起脑膜炎和心膜炎，罕见的还会引起坏死性筋膜炎，尤其是免疫系统受损的[28][29]病人或免疫力低下的老人。P.multocida可以引起猪肺疫和猪萎缩性鼻炎。猪肺疫一般是由非产毒P.multocida引起的。产毒P.multocida主要引起猪传染性萎缩性鼻[30]炎。P.multocida可以引起以肺部炎症、急性肠炎以及全身内脏器官出血为特征的[31]牛出血性败血症，该病呈地方流行性，并能对养牛业构成一定的威胁。而试验动物[32]中，小白鼠对该菌较为敏感，常被作为哺乳动物的研究模型。2 内蒙古农业大学硕士学位论文31.1.7致病机制P.multocida所导致疾病的症状可分为三类：呼吸道疾病综合征、出血性败血症和局部损伤性症状。呼吸道疾病综合征最常见于反刍动物。病原菌进入动物的细支气管甚至肺泡，从而引起呼吸系统疾病。由于细支气管黏膜及肺泡壁对致病菌及其产生的致病因子抵御能力较差，引起炎性感染后，病原菌伴随着炎症的发展由最初的发病部位扩散至整个肺脏，也可以经间质结缔组织及其周围的血管、淋巴管散播，引起肺脏出现大面积的[32]纤维素性渗出，或局部的浆液性渗出。P.multocida可以引起畜禽的败血症，但致病机制尚未研究清楚。当病原菌经由损伤的皮肤及粘膜进入体内时，就能很快通过淋巴循环进入到血液当中并很快扩散至全身，引起菌血症后，可在数小时内诱发败血症，并最终导致动物死亡。细菌荚膜中含有的内毒素可以引起感染动物的实质器官病变和全身浆膜、黏膜出血；也可发生严重的浆膜性炎性反应，引起局部组织水肿，病情进一步发展，可导致动物呼吸困难，甚至窒息；由于局部组织坏死及细菌内毒素全身性作用，导致机体器官功能紊乱，最[33]终导致死亡，因此荚膜在败血症的发生中起到了十分关键的作用。1.2牛源多杀性巴氏杆菌的危害及国内流行情况巴氏杆菌病是由P.multocida引起的多种动物和人的重要共患传染病的总称。动物巴氏杆菌病的急性型常以败血症和出血性炎症为主要特征。姜志刚[34]等研究报道，06年以来，国内黑龙江、内蒙古、天津、山东、广东、广西、甘肃、河北等多地牛群中发现由A型多杀巴氏杆菌引起的纤维素性化脓性肺炎，并且在长途运输或饲养条件突然改变会造成牛群呈100%发病，死亡率10%-40%，导致年轻病牛发育迟缓、多数预后不良，危害严重，并且该文献中的流行病学调查显示，中国多地采集的牛纤维素性化脓性肺炎病料中均检出A型多杀巴氏杆菌，阳性检出[35]率为86.36%。魏玉明等在河西走廊地区采集死亡牛病料56份，其中52份检出P.[36]multocida。康立超等在新疆牦牛养殖场的病死牛体内也分离到了6株P.multocida。2014年，云南省某牛场大面积发病，数头牛死亡，经诊断为P.multocida引起的牛出[37]血性败血症。可见牛源P.multocida在国内分布范围较为广，且在患病牛群中的检出率较高。1.3多杀性巴氏杆菌毒力因子的研究进展P.multocida在宿主体内的定植和致病主要由其中所携带的毒力因子引起的，毒力因子的研究对于揭示P.multocida的致病机制有一定的帮助。同时，随着对不同分型的P.multocida进行基因组测序分析，研究者对P.multocida的认识更加深入，发现了一些潜在毒力因子的同时，也产生了一系列关于P.multocida分子病原学方面的问3 4牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测[38]题，这些问题受到广泛关注。P.multocida具有抗原多样性及宿主广泛性的特征，这些特征都给疫苗的制备带来了许多难题，而对于毒力因子的研究有助于疫苗的开发，因为一部分毒力因子被用作抗原蛋白来研制疫苗。1.3.1荚膜细菌合成后分泌到菌体以外的粘液性多糖物质或多肽类物质称之为荚膜。荚膜在细菌的生存过程中起到很多作用：如黏附、抵抗吞噬、抗溶菌酶、抗补体等作用，且在缺乏营养物质的环境中其可作为营养物质被菌体吸收。P.multocida经荚膜分型可分成A、B、D、E、F型血清型。其中A、D、F型血清型的荚膜组成比较相似，包括透明质酸、肝素和软骨素。荚膜作为一种毒力因子，在P.multocida的发病机理中占有重要地位。产生荚膜的菌株跟荚膜缺失的菌株相比，具有更强的致病力。荚膜缺失的变异菌株对接种动物的致病力明显减弱，更有甚者未[39]表现出致病性，且菌株不会在接种动物体内生长繁殖。转座子插入牛P.multocida的透明质酸合成酶基因中，在小鼠模型中的毒力减弱。研究报道A型P.multocida荚[40]膜缺失变异株毒力丢失，但给小鼠接种后的菌株恢复荚膜表型，并重新获得致病力。荚膜对于P.multocida来说是一种重要免疫逃避因子，其抗吞噬作用受其存在和厚度的影响。中性粒细胞和单核细胞的吞噬作用可受P.multocida的荚膜多糖影响而失效。在小鼠模型中，P.multocida的荚膜缺失株相比较野生型菌株更容易被巨噬细[41]胞所吞噬，而后者明显表现出较强的抗吞噬作用。1.3.2脂多糖（LPS）LPS的成分是类脂多糖，为G-细菌细胞壁最外层物质，亦为G-细菌内毒素的主要组成成分。P.multocida的LPS都具有类似的结构和性质，可诱导典型的内毒素性[42][43]休克，且含高度保守的内部核和可变的外部轴。在P.multocida的致病过程中，LPS发挥了重要作用。动物机体内广泛的血管变化及死亡可由经过纯化的LPS引起。P.multocida在机体内繁殖及致病的过程中，需要具有完整结构的LPS参与。应用信号标签诱变技术，使庚糖基转移酶基因插入失活而使菌株毒力弱化，在接种的小鼠和鸡体内需要补充额外的庚糖才能正常合成脂多[44]糖。1.3.3菌毛与黏附素黏附作为病原体感染宿主过程中的首要条件，而黏附素则是一种潜在的毒力因子，不同类型的细胞、组织或器官可以结合不同的P.multocida的黏附素，反映了菌株宿主的亲嗜性、致病性的不同，同时也反映了血清型的差异。菌毛在细菌黏附的过程中具有一定的作用，如A型P.multocida的菌毛能够黏附4 内蒙古农业大学硕士学位论文5在黏膜上皮细胞表面。P.multocidaA、B、D血清型的菌毛属于IV型，其能黏附在宿[45]主细胞表面，该型菌毛与毒力相关，P.multocida的基因组中包含多个黏附相关基因，如ptfA、flp1、flp2、fimA、hsf-1、hsf-2等编码菌毛相关蛋白基因[46]。1.3.4外膜蛋白P.multocida的主要外膜蛋白为ompH。ompH是暴露在外侧且序列较为保守的孔[46]蛋白，并已经作为研制疫苗的一种抗原蛋白。特异性的ompH单克隆抗体对小鼠进[47]行被动免疫时，可以使小鼠具有抵抗P.multocida的攻毒的能力。对鸟类注射特异[48]性ompH蛋白后，使其能够产生保护性免疫反应，从而能够抵抗同源菌株的攻毒。P.multocida与宿主细胞外基质蛋白的结合能力，主要表现是该菌可以黏附纤连蛋白和IX胶原，可能具有黏附功能的蛋白包括ompA、oma87、tbp（转运结合蛋白）等。P.multocida的ompA与ompH在结构上具有一定类似性，都是表面暴露的，具有免疫原性的保守外膜蛋白。ompA基因的产物作为一种外膜蛋白及黏附因子，主要是提供细胞外膜与肽聚糖之间的物理链接，对细胞膜的结构稳定性方面起到了重要作用。它通过与肝素或者纤连蛋白的结合介导多杀巴氏杆菌与宿主细胞的相互作用，因[49]此可以作为一种能够决定感染机体的重要入侵生物分子。ompA的同源蛋白在大肠埃希氏菌等其他细菌中也作为重要的黏附素。P.multocida的ompA能够结合到牛的[50]肾脏细胞上，并作用于细胞外基质分子纤连蛋白和肝素。1.3.5铁调节外膜蛋白（铁离子摄取相关蛋白）铁离子的摄取是细菌生存的最基本条件之一，因为细菌毒力作用的强弱与体内游离的铁离子的水平相关，多杀巴氏杆菌具有多重机制来进行铁离子的摄取。针对Pm70基因组序列分析表明，在其基因组中有超过2.5%的基因编码涉及铁离子获得和摄取[51]的相关蛋白。巴氏杆菌科和奈瑟氏球菌科的铁离子转运蛋白受体通常由两个吸附受体tbpA和tbpB构成，但是牛源P.multocida的铁离子转运蛋白受体仅仅由其中一种吸附受体[52]tbpA组成。铁离子摄取蛋白在疾病发生发展的过程中起到一定作用，exbB、exbD、tonB或hgbA中的任意一种蛋白的失活都会使A型P.multocida对小鼠的致病力减弱[53]。exbB、exbD和tonB构成tonB转运复合体，为铁离子的转运提供能量，而从宿主[46]蛋白中获得铁离子的过程中，hgbA作为血红素吸附蛋白来起作用。1.3.6皮肤坏死因子皮肤坏死因子，即多杀性巴氏杆菌毒素（PMT），主要是由D型P.multocida产生的外毒素，部分A型P.multocida也可以产生，可以导致猪萎缩性鼻炎。该毒素是一种分子量为146kDa的不耐热蛋白质，由toxA基因编码，70℃加热30min，或甲5 6牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测[54][55]醛、胰酶等处理可使毒素失去活性。1.3.7唾液酸与透明质酸酶唾液酸和透明质酸酶作为潜在的毒力因子分布在部分P.multocida中。当A型P.multocida缺乏唾液酸（nanB、nanH）、透明质酸酶（pmHAS）或其他激活因子时，毒力下降，在上呼吸道中存在但不致病[56]。[57]2000年，Mizan等将唾液酸酶基因nanH和nanB基因成功的从禽源P.multocida中克隆出来，虽然两种唾液酸酶在结构上存在差异，但两种酶都能够利用2’,3’-唾液酸乳糖，而只有nanB能够完全利用2’,6’-唾液酸乳糖，可能由于两种酶在特性上有所[58][59]不同，反而增强了P.multocida在宿主体内的代谢能力。Steenbergen等的试验结果进一步表明唾液酸的代谢过程与P.multocida的致病机理相关，且证明，相比分解唾液酸的能力，P.multocida吸收唾液酸的能力在对小鼠的毒性作用中起到更大的作用。据文献报道，有相当部分的P.multocida产生细胞外荚膜成分透明质酸，该毒力因子使得病原菌能够逃避宿主的免疫系统，更容易致病。研究发现A型P.multocida[60][61]产生透明质酸合成酶pmHAS，而D型的合成酶为pmHS1。1.3.8超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶由蛋白质和金属离子组成，存在于部分微生物体内。有研究报道指出，除个别菌株外，A、D型P.multocida普遍含有sodA、sodC、tbpA等超氧化物歧化酶基因[56]。该酶可以使超氧阴离子自由基发生歧化。Korshunov[62]等研究指出，pH值较高（>7.5）时，超氧化物缓慢的透过脂质体膜，pH值较低（<7.5）时，超氧化物可以快速透过脂质体膜；当周质中缺乏超氧化物歧化酶的大肠杆菌突变体在pH值低于6.5的环境中，胞质中的延胡索酸B被破坏，而将其置于高pH环境下或使用能产生超氧化物歧化酶的菌株时，损伤降至最低。在同是G-的P.multocida中，该酶主要用于抵御外界不良环境，针对自由基、强氧化酶等可对其细胞膜上的脂质体分子、外分泌蛋白及胞内DNA分子造成直接破坏的分子具有较强的抵抗能力。当P.multocida被巨噬细胞或单核细胞吞噬后，特别是吞噬体与溶酶体融合后，pH较低的情况下，可抵抗胞内酶对菌体的消化作用，使其具有较强的抗氧化性，并能在胞内存活。1.4多杀性巴氏杆菌检测方法的研究进展自从LouisPasteur发现P.multocida以来，研究者们从免疫学、宿主特异性、毒力及发病机制等诸多方面对P.multocida进行了大量研究，但进展受到当时技术条件的限制，包括分子功能、疫苗研发在内的多个领域都是空白，直到近期技术进步及分6 内蒙古农业大学硕士学位论文7[63]子生物学迅速发展，研究者们对P.multocida的才有了更深入的认识。1881年第一次发现P.multocida，鉴定工作仅限于实验室的分离和纯化及通过形态学观察、糖类发酵鉴定和血清学检测等基本方法对P.multocida的表型进行鉴定。但在传统生物学鉴定方法在使用的过程当中，培养条件等外界环境因素以及传代数等内在因素会影响[64]P.multocida的部分表型的表达，从而使鉴定结果不稳定、不准确。近年来，随着分子生物学技术的发展，对于P.multocida的研究已经从表型进一步深入到基因、蛋白等分子水平上。1.4.1细菌的种特异性PCR鉴定法从1985年KaryB.Mullis发明聚合酶链式反应（PCR）技术后，极大的推动了现[65]代生物学的发展，作为快速并具有特异性的检测手段，PCR技术在临床应用中的地位逐渐凸显出来。利用细菌16SrRNA基因通用引物进行PCR，测序后，将结果放入数据库中进行比对，通过序列的近似程度，判断可能的细菌种类。16SrRNA基因是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，其可变区与恒定区序列交错排列。恒定区在各种细菌中基本保持不变，而可变区因不同的细菌，不同的科属种而不同，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，16SrRNA序列分析技术的基本原理是利用核糖体基因[66]序列设计通用引物，从微生物基因组DNA中扩增出16SrRNA的基因片段，通过克隆测序、探针杂交、酶切片段多态性分析等方法获得16SrRNA序列信息，再与16SrRNA基因数据库中的序列数据进行同源比对及分析，确定其在进化树中的位置，从[67]而鉴定样本中可能存在的细菌种类。在P.multocida的检测中，可以使用特殊的PCR方法来检测混合培养物样本或临[68]床获得的样本。Lee等人于1998年发展出特异性引物PCR法鉴定P.multocida，对于P.multocida表现出较高的灵敏性，且不需要使用杂交技术。该技术是建立在对P.multocida特异性DNA序列KMT1扩增的基础之上的。1.4.2多杀性巴氏杆菌分子生物学特性的研究方法过去很长一段时间，研究者利用镜下观察、生化反应、血清学反应等方法对P.multocida的表型分类进行研究，但是，这些方法为P.multocida特性的研究及流行病学研究所提供的鉴定分类依据并不充足，比如，由于多数表型与巴氏杆菌极其相似导[69]致溶血性曼氏杆菌归于巴氏杆菌属，之前称为溶血性巴氏杆菌。在细菌病、病毒病控制和预防过程中，准确区分表型近似的微生物在流行病学的研究中具有重要地位，尤其对于疫苗的制备和使用。以DNA检测为基础的各种技术想要发展，并拓展可应用范围，就必须能够证明以此为基础的方法能够克服表型的限制，同时精确地区分那些表型近似的菌种、菌株。在过去，有时特异性的基因组学技术会替代传统的分类学7 8牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测[70]方法，以鉴别特定病原菌。起初，因为利用分子生物学对病原菌特性进行鉴定时所用到的仪器、试剂和耗材等较为昂贵，检测成本高，而用人工操作替代机器又较为复杂，难以普及，所以很少有实验室能采取这类方法进行检测并承担由此带来的巨大开[71]支。但近些年随着科学技术的快速进步，分子生物学技术的使用成本大幅下降，世界范围内该类技术正不断普及。限制性内切分析（REA）该方法对细菌的流行病学调查，在巴氏杆菌的研究中有着较为广泛的应用。该方法的可重复性较好，相比于那些可能因为表型变化而导致检测敏感性降低和特异性变差的传统分型方法，REA表现更加稳定。REA可以单独使用，也可联合核糖体分型技术共同使用，进一步提高检测的准确性。用REA对P.multocida菌株进行DNA指纹分析的限制性内切酶主要有BamHI、EcoRI、HhaI和HpaII等，其中HhaI和HapII酶切后给出的条带信息量较大，并且容易区别。Wilson[69]等发现，对P.multocida参考血清型菌株进行限制性内切酶酶切分析，在部分情况下具有很高的鉴别能力，其中16个血清型B菌株经过HhaI酶处理后，可以产生清晰[72]的指纹图谱。但是在鸟源P.multocida中，用HhaI限制性内切酶进行REA没有发现高的鉴别能力，在分析血清型E的分离株时，13个E：2菌株中仅产生了一个特异性的HhaI图谱。在用HpaII酶切技术产生的图谱表现差异较小，说明P.multocida的全面鉴别需要多重REA分析参与。此外，美国广泛应用的M9禽霍乱弱毒疫苗和CU[73]禽霍乱弱毒疫苗的安全性和有效性评价都有REA的成功运用。不过，REA也存在缺点，产生的图谱条带较为复杂，而且条带难以肉眼直接进行分辨。核糖体分型（Ribotyping）核糖体分型的方法与REA类似，都需要用限制性内切酶对核糖体序列进行酶切，使用凝胶电泳分离酶切后的核糖体序列片段。但是与REA不同的是，核糖体分型技术还会使用Southern印迹法和标记DNA探针法来降低限制性图谱的复杂性，从而提高细菌基因组限制性片段长度多态性（RFLPs），并且不需要借助计算机图像分析，核糖体RNA序列具有高度的保守性，在细菌细胞RNA总量中占据很大部分，因为核糖体RNA在不同菌株和菌种拷贝的数量和基因组的位置不同，特异于核糖体RNA基因序列的DNA探针可以用于核糖体操纵子或周围区域以[74][75]实现对该段序列的RFLPs的检测，从而鉴定不同种类的菌株。核糖体分型方法[76]结合REA法已经成功地用于检测和鉴定禽源和猪源P.multocida分离株。对引起牛出血性败血症的P.multocida，核糖体分型技术能够比FAGE法鉴定出更多种类的P.[77]multocida菌株及相似的菌种。不过，Townsend等发现核糖体分型技术在单独使用时，有时会产生与鉴定结果不一致的情况，因此在出现此类情况时，核糖体分型技术与其它基因型检测方法配合使用，能够提高特定类型P.multocida的检出率。脉冲场凝胶电泳分析（PFGE）PFGE是在分子层面研究流行病学的指纹方法中的标准方法。它可用于分离大分子DNA，通常用来分离大小在10Kb到10Mb的DNA分子。PFGE作为一种以染色体为检测样品检测生物多型性的方法，既没有REA8 内蒙古农业大学硕士学位论文9技术的复杂性，也不像核糖体分型技术那样受制于基因多样性的限制。在细菌的鉴定、[77]分型方面，与传统方法相比，PFGE方法表现出更高的准确性。Townsend等表明利用PFGE技术能对引起牛出血性败血症的血清型相似的P.multocida分离株进行区分[78]鉴别。Gunarwardana等在鸟源P.multocida鉴定的研究过程中强调了PFGE在流行病学中地位。虽然，与基因组重复序列PCR（REP-PCR）技术相比，PFGE方法表现出具有更强的鉴别能力。但是，与REP-PCR一类的不用依靠专业设备完成检测过程的方法相比，PFGE技术收到专业仪器使用限制，而不能更为广泛的应用。PCR指纹（PCRfingerprinting）虽然用PCR指纹技术对P.multocida分离株进行鉴定的研究报道相对较多，如：随机引物PCR（AP-PCR）能够有效地鉴定来源于[79]猪呼吸道和火鸡的P.multocida分离株，但是，Hopkings等采用放射性标记来提高检测的敏感度时，发现会受到实验室技术本身的限制。32P-dCTP标记方法通过对菌体基因组中富含胞嘧啶的进行标记而提高对扩增片段的检测的灵敏性，但与此同时降低了检测A/T碱基扩增引物的灵敏度，虽然这一问题并没有影响到对鸟源P.multocida分离菌株的鉴定。REA法重复性好，检测灵敏度高，但分析结果较为复杂，需要借助计算机的分析计算，不过随着计算机技术和生物信息学的进一步发展，该方法显现出良好的应用前景。核糖体分型技术虽然将结果的复杂性降低，但由于检测过程中需要采用DNA探[75]针，限制其使用范围。同样的，PFGE方法也需要专业设备来进行检测，限制其应用的范围。相比较而言，PCR方法有更大的优势，不仅检测简便快捷，有更广泛是使用空间，而且PCR仪体积小巧，便于携带和运输，能在现场进行快速诊断和鉴定分析，所以该方法具有更为广泛的适用范围，并符合检测的准确度要求。1.5研究目的和意义A型P.multocida能引起牛的呼吸道疾病综合征，根据文献报道，到目前A型P.multocida已经在国内三分之一以上省份有所分布，且由于该菌属于条件致病菌，部分动物只携带不发病，不能引起足够的重视，而该菌致病的机理尚不明确，存在潜[80]在的发病风险，有一定的研究价值。另有研究发现，该菌可以在不同宿主之间发生[81-84]种间传播，使得该病的潜在发病风险进一步增加。更为重要的是，实验室在山东某肉牛养殖基地的患病肉牛呼吸道中分离到A型多杀巴氏杆菌，该菌株引起病牛出现严重的呼吸道症状，发病率85%，病情较重的出现采食困难，消瘦，并引起急性死亡，死亡率为2%，多数呈慢性经过，经久不愈。由于该病发病率较高，又是一种呼吸道传染疾病，一旦爆发流行，将会造成巨大的经济损失。因此，对该菌进行生物学鉴定和毒力基因的分子生物学检测，并以昆明鼠为病理模型，对该菌的毒力及病理变化进行详细研究，为以后的预防工作及致病机制的揭示提供基础资料和技术支持。9 10牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测2细菌的分离纯化与菌种鉴定2.1试验材料2.1.1病料来源2017年2月山东省泰安市某肉牛养殖场突然发病的青年牛。该牛临床表现为咳嗽，呼吸困难，鼻液带脓，下痢，消瘦，病情反复。病程持续3个月左右，前期经多位当地兽医诊治，使用多种抗生素联合治疗均不能治愈。2.1.2试验试剂及仪器设备表1试验试剂及主要仪器设备Table1Experimentalreagentsandinstruments产品Item经销商Distributor试剂ReagentLB培养基青岛高科园海博生物技术有限公司NA培养基青岛高科园海博生物技术有限公司NB培养基青岛高科园海博生物技术有限公司脑心浸液琼脂培养基青岛高科园海博生物技术有限公司哥伦比亚血琼脂平板青岛高科园海博生物技术有限公司麦康凯培养基青岛高科园海博生物技术有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒天根生化科技（北京）有限公司DL2000marker天根生化科技（北京）有限公司革兰氏染色液北京索莱宝科技有限公司瑞氏-吉姆萨染色液北京索莱宝科技有限公司TrisBase、EDTA北京索莱宝科技有限公司2×TaqPCRMasterMix宝生物工程（大连）有限公司RegularAgaroseG-10上海百晶生物科技有限公司SuperGelRed苏州宇恒生物科技有限公司冰乙酸、氢氧化钠、天津市凯通化学试剂有限公司仪器设备InstrumentEppendorf5430R低温高速离心机艾本德（上海）国际贸易有限公司EppendorfMastercyclerPCR仪艾本德（上海）国际贸易有限公司spectrophotometer紫外分光光度计天根生化科技（北京）有限公司Transilluminator切胶仪天根生化科技（北京）有限公司金属浴锅天根生化科技（北京）有限公司10 内蒙古农业大学硕士学位论文11电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司2.2试验方法2.2.1病料采集及细菌的分离纯化无菌采集发病牛场的病牛的肺、心、肝等组织及鼻液、胸腔积液等分泌液体，分别接种于NA培养基、哥伦比亚血琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基中，分别放置于普通培养箱和厌氧罐中，37℃条件下培养18h-24h后，观察生长情况，涂片镜检，挑取单个菌落，接种于哥伦比亚血琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基，进行二次纯化，再用含有5%胎牛血清的NB培养基扩大培养，将部分菌液分装在若干2.5mL离心管中，每管1mL，并加入等体积80%甘油，混匀后置于-80℃，冷冻保存，其余菌液4℃保存待用。2.2.2分离菌株的微生物鉴定2.2.2.1分离菌株菌落的形态观察将纯化后的菌株利用平板划线法接种到哥伦比亚血琼脂培养基、普通LB培养基、及麦康凯培养基中，置于恒温培养箱37℃培养48h，观察菌落的形态特征。2.2.2.2分离菌株的革兰氏染色及瑞氏吉姆萨染色革兰氏染色按照北京索莱宝科技有限公司生产的革兰氏染液说明书进行，具体步骤如下：（1）涂片固定：菌液涂片时不可过于浓厚，这样不利于后期观察，涂片，干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，防止液滴沸腾，以载玻片不烫手为宜。（2）初染：在玻片表面涂有菌液的部位滴加结晶紫后，染色1min，水洗。（3）媒染：在同一部位滴加碘液后染色1min，水洗（4）脱色：滴加95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色20-60sec，水洗，吸取水分。（5）复染：滴加番红后，染色1min，水洗（6）吸干水分后，镜检观察。瑞氏吉姆萨染色按照北京索莱宝科技有限公司生产的瑞氏-吉姆萨染色液说明书进行，具体步骤如下：（1）取菌液涂成厚薄适宜的涂片、自然晾干，固定。（2）滴加瑞氏-吉姆萨染色液2-3滴覆盖整个标本涂片，染1-2min。（3）滴加等量的超纯水，轻轻晃动玻片，与瑞氏吉-姆萨染色液充分混匀，染色3-5min。11 12牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测（4）水洗、吸干、镜检。2.2.3细菌16SrRNA的PCR鉴定2.2.3.1分离菌株基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取按照天根生化科技（北京）有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，具体步骤如下：（1）根据菌液浓度，取细菌培养液1-5mL，加入5mL离心管中，10000r/min离心1min，将菌体与培养液分开，尽量吸净上清。（2）将200μL缓冲液GA加入除去上清的菌体沉淀中，涡旋振荡使菌体再次悬浮，并尽量将结块震碎。（3）向离心管中加入20μL蛋白酶K（ProteinaseK）溶液，加样时枪头插入液面以下，振荡混匀。（4）向离心管中加入220μL缓冲液GB，涡旋振荡15sec，70℃水浴放置10min，隔一段时间上下颠倒几次，充分反应，待溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。（5）向离心管中加入220μL无水乙醇，充分振荡15sec，此时管中可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。（6）将上一步所得的溶液和絮状沉淀全部加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），吸附柱一次加入最大体积为600μL，液体过多，可分两次加入，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（7）将500μL缓冲液GD加入吸附柱CB3中，12000r/min离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（8）将600μL漂洗液PW加入吸附柱CB3中，12000r/min离心30sec，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB3放入收集管中。（9）重复操作步骤（8），将蛋白彻底去除。（10）将吸附柱CB3放入收集管中，12000r/min离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液PW，防止漂洗液对后期实验产生影响。（11）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μLddH2O，室温放置2-5min，12000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。为确保最终的体积大于75μL，使DNA充分溶解，可再向吸附膜上滴加ddH2O，离心。12 内蒙古农业大学硕士学位论文132.2.3.216SrRNA基因片段的扩增2.2.3.2.1引物用于扩增细菌16SrRNA基因片段的通用引物，由华大基因（北京）有限公司合成。序列如下：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’2.2.3.2.2PCR反应体系：表216SrRNA基因PCR反应体系（25μL）Table216SrRNAgenePCRreactionsystem(25μL)名称体积（μL）2×TaqPCRMasterMix12.5ddH2O10.5上、下游引物各0.5模版1.02.2.3.2.3PCR反应程序95℃预变性5min；以95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min40sec为一个循环，共30个循环，72℃延伸5min。4℃短时间保存。2.2.3.2.4PCR反应产物的鉴定将PCR产物用含有1/10000SuperGelRed的15g/L琼脂糖凝胶电泳检测，用DL2000marker标记片段大小，在1×TAE电压为5V/cm电泳液中，当指示条带到达胶2/3处时，通过凝胶成像系统观察PCR产物出现的条带，在紫外透照仪下迅速切取含有目的基因片段大小的凝胶条带，将其放入1.5mL离心管中，按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的方法对目的基因片段进行回收。将纯化后的产物送华大基因（北京）有限公司进行测序。2.2.3.2.5目的片段胶回收（1）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，以激活吸附柱，倒掉收集管中的废液，将其重新放回收集管中。（2）在紫外成像仪下，将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离13 14牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测心管中，标注名称，并称量重量。（3）向胶块中加入等体积PN，使胶块浸没在液体中，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，胶块无法完全溶解时，可再向其中滴加PN。（4）将上一步所得溶液全部加入吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000r/min离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。（5）将600μL漂洗液PW加入吸附柱CA2中，12000r/min离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中，（6）重复操作步骤（5），以保证去除所有杂质。（7）将吸附柱CA2放回收集管中，12000r/min离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。（8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000r/min离心2min收集DNA溶液，最终体积以50-100μL为宜注：回收得到的DNA片段用紫外分光光度计检测浓度。OD260/OD280比值在1.7-1.9。2.2.4多杀性巴氏杆菌种特异性基因的PCR鉴定由于16SrRNAPCR鉴定在部分情况下，仅能鉴定到种属，为进一步确认菌种鉴定结果，利用种特异性基因进行PCR鉴定。根据文献报道的P.multocida种特异性基[85][86]因KMT1序列设计特异性引物。2.2.4.1分离菌株基因组DNA的提取同2.2.3.1。2.2.4.2种特异性基因片段的扩增2.2.4.2.1引物用于扩增P.multocida高度保守序列KMT1基因片段的引物，由华大基因（北京）有限公司合成。序列如下：KMT1T7：5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’KMT1SP6：5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’14 内蒙古农业大学硕士学位论文152.2.4.2.2PCR反应体系：反应体系同表2（Table2）。2.2.4.2.3PCR反应程序95℃预变性5min；以95℃变性30sec，55℃退火40sec，72℃延伸1min为一个循环，共30个循环，72℃延伸5min。4℃短时间保存。2.2.4.2.4PCR反应产物的鉴定将PCR产物用含有1/10000SuperGelRed的20g/L琼脂糖凝胶电泳检测，用DL1000marker标记片段大小，在1×TAE电压为5V/cm电泳液中，当指示条带到达胶2/3处时，通过凝胶成像系统观察PCR产物出现的条带，在紫外透照仪下迅速切取含有目的基因片段大小的凝胶条带，将其放入1.5mL离心管中，按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的方法对目的基因片段进行回收。将纯化后的产物送华大基因（北京）有限公司进行测序。2.2.4.2.5目的片段胶回收同2.2.3.2.5。2.2.5多杀性巴氏杆菌血清型的PCR鉴定[87]根据文献报道的5种血清型PCR鉴定方法对该菌的血清型进行鉴定。2.2.5.1分离菌株基因组DNA的提取同2.2.3.1。2.2.5.2血清型基因片段的扩增2.2.5.2.1引物表3（Table3）引物由华大基因（北京）有限公司合成。表3多杀性巴氏杆菌复合荚膜血清型PCR分型中的寡核苷酸序列Table3SequencesoftheoligonucleotidesusedinPasteurellamultocidamultiplexcapsularPCRtypingassay血清扩增片段长型基因名称序列（5’→3’）度（bp）位置Sero-GeneNameSequence(5’→3’)AmpliconPositiongroupsize(bp)15 16牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测AhyaD-CAPA-TGCCAAAATCGCAGTCAG10448846-hyaCFWD8863aCAPA-TTGCCATCATTGTCAGTG9890-REV9873BbcbDCAPB-CATTTATCCAAGCTCCACC76013621-FWD13603bCAPB-GCCCGAGAGTTTCAATCC12863-REV12880DdcbFCAPD-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC6573142-FWD3165cCAPD-CATCTACCCACTCAACCATATCAG3789-REV3766EecbJCAPE-TCCGCAGAAAATTATTGACTC5114387-FWD4408dCAPE-GCTTGCTGCTTGATTTTGTC4899-REV4881FfcbDCAPF-AATCGGAGAACGCAGAAATCAG8512881-FWD2896eCAPF-TTCCGCCGTCAATTACTCTG3733-REV3714aThesesequencesmatchthecodingstrandoftheserogroupAcapgenewithGenBankaccessionnumberAF067175bThesesequencesmatchthecodingstrandoftheserogroupBcapgenewithGenBankaccessionnumberAF169324.cThesesequencesmatchthecodingstrandoftheserogroupDcapgenewithGenBankaccessionnumberAF302465.dThesesequencesmatchthecodingstrandoftheserogroupEcapgenewithGenBankaccessionnumberAF302466.eThesesequencesmatchthecodingstrandoftheserogroupFcapgenewithGenBankaccessionnumberAF302467.注：a与此序列相匹配的血清群Acap基因的编码链在GenBank中的序列号为AF067175。b与此序列相匹配的血清群Bcap基因的编码链在GenBank中的序列号为AF169324。c与此序列相匹配的血清群Dcap基因的编码链在GenBank中的序列号为AF302465。d与此序列相匹配的血清群Ecap基因的编码链在GenBank中的序列号为AF302466。e与此序列相匹配的血清群Fcap基因的编码链在GenBank中的序列号为AF302467。2.2.5.2.2PCR反应体系反应体系同2.2.3.2.2。16 内蒙古农业大学硕士学位论文172.2.5.2.3PCR反应程序反应程序同2.2.4.2.3。2.2.5.2.4PCR反应产物的鉴定将PCR产物用含有1/10000SuperGelRed的20g/L琼脂糖凝胶电泳检测，用DL1000marker标记片段大小，在1×TAE电压为5V/cm电泳液中，当指示条带到达胶2/3处时，通过凝胶成像系统观察PCR产物出现的条带，在紫外透照仪下迅速切取含有目的基因片段大小的凝胶条带，将其放入1.5mL离心管中，按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的方法对目的基因片段进行回收。将纯化后的产物送华大基因（北京）有限公司进行测序。2.2.5.2.5目的片段胶回收胶回收步骤同2.2.3.2.5。2.3试验结果2.3.1分离菌株的形态观察结果分离菌株接种于哥伦比亚血琼脂培养基中，37℃培养24-48h，形成圆形、淡灰色、光滑而粘稠、边缘整齐的水滴状小菌落，生长旺盛，无溶血现象（图1）。在普通LB培养基中生长不良，菌落细小。在麦康凯培养基中，则完全不生长。病料直接涂片用瑞氏吉姆萨染色镜检，可在镜下观察到典型的两极浓染的短杆菌（图2）。对少量液体培养物进行革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性菌，单个存在或呈双排排列的菌体。17 18牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测图2多杀性巴氏杆菌菌体形态图图1多杀性巴氏杆菌菌落形态图Fig.2MorphologicformofFig.1ColonialmorphologyofPasteurellamultocidaPasteurellamultocida瑞氏染色1000×（油镜）：呈两极浓染形成表面光滑、灰白色、露珠状菌落Wright'sstaining1000×(oil):twostageFormingsmooth,gray,dewdropshapedcoloniescoloring2.3.2细菌16SrRNA基因引物PCR鉴定结果以提取的菌株基因组DNA为模版，经过16SrRNA基因引物PCR扩增出1600bp左右的条带。将目的片段进行测序后，测序结果经NCBIBLAST，结果显示，该菌的16SrRNA与GenBank中的各血清型巴氏杆菌16SrRNA基因序列CP15573.1，CP15560.1，CP008918.1等序列的一致性均在99%以上。综合细菌形态特征及16SrRNA基因片段序列分析，确定纯化后的菌株为P.multocida，并将该菌命名为PM-SD1株。2.3.3多杀性巴氏杆菌种特异性及血清型引物PCR鉴定结果以提取纯化菌株的总DNA为模版，利用KMT1引物对目的基因进行扩增，PCR扩增产物电泳结果在400bp左右，与预期片段大小相符，基因测序结果经NCBIBLAST，与GenBank中kmt基因AY225345.1、AY225346.1序列的一致性在99%以上，确认该菌株为P.multocida。利用5对分型引物对目的基因进行PCR扩增。结果显示，本试验分离细菌仅hyaD-hyaC引物扩增处约1000bp的目的基因条带，与血清型A引物设计扩增长度相符，测序结果经NCBIBLAST符合hyaD-hyaC基因的序列，而其他4种血清型引物均无目的条带，由此判定分离的菌株为A型P.multocida（图3）。18 内蒙古农业大学硕士学位论文19MarkerKmtA1000bp1044bp700bp500bp400bp300bp460bp200bp100bp图3多杀性巴氏杆菌种特异性基因及荚膜分型PCR电泳图Fig.3StrainspecificgeneandcapsularclassificationPCRelectrophorogramofP.multocidaMarker：DL1000DNAMarkerKmt：Kmt基因A：hyaD-hyaC基因Marker：DL1000DNAMarkerKmt：KmtgeneA：hyaD-hyaCgene2.4讨论目前通用的P.multocida菌种鉴定方法仍采用菌体形态、生化反应等表型特征为标准的方法判断，但由于培养条件及基因变异等会影响部分表型特征，如两极着色的特点在不良的培养环境中会变得不清晰，不同P.multocida菌株的糖发酵试验的结果也常常不一致，这使得传统的鉴定分类方法在稳定性和可靠性上存在一定的问题，相对来讲，采用基因序列分析的方法对菌种进行鉴定，则不受环境、培养条件及个别基因变异的影响，能快速准确的对细菌的种类进行鉴定[75]。通过PCR法的扩增，可以得到大量特异性基因片段，再通过琼脂糖凝胶电泳的分离和基因测序技术，则可以知道扩增基因的序列，这就意味着，性状所对应的基因序列只要存在，即使受环境影响不能表达，也能通过PCR的方法检测出来，既保证了准确性、重复性，又克服了表型鉴定不稳定的缺点。本试验以16SrRNA基因、KMT1基因的PCR鉴定作为主要方法，并结合部分生物学特性的检测结果可证明，分离菌为P.multocida。而利用5种荚膜血清型基因进行PCR检测的结果表明，该P.multocida的荚膜血清型为A型。实验中分离到的菌株，从菌体形态、培养特征及种鉴定的结果来看，与之前报道的可引起牛出血性败血症的P.multocida一致，但荚膜血清型的鉴定结果却不同。06年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次报道国内出现牛源血清型A型P.multocida，而在此之前，国内牛[88]P.multocida病主要是由B型引起，主要引起的病症是出血性败血症。但该类血清型的牛源P.multocida的最初来源无文献报道，需要进一步全基因序列测定或利用MLST法，通过同源性比对，来探究可能的来源。对于P.multocida荚膜血清型的鉴定，本试验采用PCR法，主要根据不同血清型19 20牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测荚膜的主要成分对应的基因不同，利用不同引物对基因进行PCR扩增以检测其中含有的基因种类，从而判断其荚膜血清型。该方法优于传统的间接红细胞凝集试验，检测过程不需要A、B、D、E、F型荚膜所制备的抗体，使得该方法更易于广泛使用，且检测更加准确。20 内蒙古农业大学硕士学位论文213药物敏感性试验及半数致死量LD50的测定3.1试验材料3.1.1药敏试验及半数致死量测定的菌株来源从发病牛场采集病料分离鉴定的PM-SD1菌株。3.1.2培养基哥伦比亚血琼脂培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。3.1.3药敏片头孢他啶、头孢氨苄、头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南、头孢拉啶、头孢西丁、阿莫西林、克林霉素、氨曲南、阿奇霉素、氯霉素、新霉素、四环素、青霉素、头孢哌酮、庆大霉素、强力霉素、呋喃唑酮、氧氟沙星、万古霉素、多粘菌素B、克拉霉素、美洛西林、诺氟沙星、磺胺异恶唑、红霉素、哌拉西林、替考拉宁、拉氧头孢，以上30种含有不同种类抗生素的药敏片均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。3.1.4试验动物SPF级昆明小鼠4-6周龄，体重20-25g。SPF级昆明小鼠购自山东大学实验动物中心，实验动物使用和生产许可证号SCXK(鲁)2013-0009，实验动物饲养管理和使用过程符合《实验动物管理条例》和《关于贯彻<实验动物许可证管理办法（试行）>的暂行规定》。3.2试验方法3.2.1药敏试验将置于4℃保存待用的PM-SD1培养物用玻璃涂布珠均匀涂布于哥伦比亚血琼脂培养基上，每个平板加入100μL菌液，加盖放置5min。待平板吸收菌液后，用无菌镊子将药敏片紧贴于平板表面，药敏片纸袋接触平板就不能再次移动。纸片与平板内距离不少于15mm，两片药敏片之间相距不少于24mm。置于37℃培养箱，培养18-24h后观察结果，并用游标卡尺对抑菌圈进行反复测量，记录并计算均值，根据公司[89]给出的判断标准对该菌的耐药性进行判定。3.2.2菌悬液的制备取出一管-80℃加甘油保存的PM-SD1纯培养物，室温下放置5min，同时在无菌操作台中，将加入5%（v/v）胎牛血清的NB培养基分装到灭菌的试管中，再按照10%（v/v）的比例将已经融化的PM-SD1培养物加入试管中接种，塞上橡胶塞，置于摇床中，180r/min，37℃培养18-24h。用PBS溶液10倍浓度梯度稀释后，先在镜下21 22牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测进行细菌计数，经显微计数法计算，原液中细菌数量大于1×109CFU/mL，则菌液合格，再利用NB培养基对培养物进行活菌计数，用于半数致死量的计算，同时，将制备好的菌液立即用于接种试验动物。3.2.3动物致病力试验采用半数致死量评定PM-SD1菌株的致病性，取昆明鼠24只，随机分成4组，作为试验组，另取6只作为对照组。经检验合格后的菌液，用PBS溶液采用倍比稀释法稀释至1×10-8，根据文献中的半数致死量及预试验结果作为参考，用1×10-5至-8[90]1×10梯度稀释后的菌液分别对昆明小鼠进行腹腔注射，每只0.2mL。同时，另用6只小鼠腹腔注射无菌NB培养基为对照组。观察、记录发病及死亡情况至14d，对死亡小鼠立即进行剖检，取内脏器官进行细菌的分离鉴定，并根据Reed-Muench法计算PM-SD1菌株的半数致死量LD50。3.3试验结果3.3.1药敏试验结果由表4可见，PM-SD1菌株对30种抗生素中的5种具有耐药性（R），而对2种为中度敏感（I），其余23种均为敏感（S）。具体试验结果如表4所示。表4多杀性巴氏杆菌对30种抗生素的药敏检测Table4Antimicrobialsusceptibilitytestingof30kinksofantibioticsbyPasteurellamultocida抗生素抑菌圈直径（cm）药物敏感性AntimicrobialagentInhibitionzonediameter(cm)Sensitivity阿莫西林Amoxicillin3.2S阿齐霉素Azithromycin2.4S氨曲南Clindamycin3S多粘菌素BPolymixinB1.4S呋喃唑酮Furazolidone1.7S红霉素Erythromycin2I磺胺异恶唑Cotrimoxazole1.1R克拉霉素Clarithromycin1.7I克林霉素Clindamycin1.5R拉氧头孢Myoxalactam2.5S氯霉素Chloramphenicol3.2S美洛西林Mezlocillin3.4S22 内蒙古农业大学硕士学位论文23诺氟沙星Norfloxacin3S哌拉西林Piperacillin3.2S强力霉素Doxycycline1.9S青霉素GBenzylpenicillin1.3R庆大霉素Gentamycin1.8S四环素Achromycin2.4S替考拉宁Teicoplanin1.2R头孢氨苄Cefalexin2.6S头孢吡肟Cefepime3S头孢拉定Cefradine2.8S头孢哌酮Cefoperazone3.2S头孢曲松ftriaxone3.2S头孢他啶Eftazidime2.9S头孢西叮Cefoxitin3S万古霉素Vancomycin1.7S新霉素Neomycin1.7R亚胺培南Imiperem3S氧氟沙星Ofloxacin2.8SNotes:S：Susceptibility；I：Moderate；R：Resistance注：S：敏感；I：中介；R：耐药；3.3.2半数致死量试验结果昆明鼠腹腔注射不同梯度浓度菌液后，所有试验组小鼠均出现被毛逆立、精神萎靡、食欲废绝、呼吸急促等症状，14d内小鼠的死亡情况如表5所示。表514d内不同浓度多杀性巴氏杆菌菌液接种组小鼠的死亡率统计Table5ThemortalitystatisticsofmiceinoculatedwithdifferentconcentrationofPasteurellamultocidainfourteendays各组名称Groupname对照组试验组1试验组2试验组3试验组4ControlTestgroup1Testgroup2Testgroup3Testgroup4group菌液浓度（cfu/mL)012000120012012Bacterialconcentration23 24牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测(cfu/mL)总计死亡数04552Totalmortality存活数62114Numberofsurvivals死亡率067%83%83%33%Mortalityrate对用于试验动物接种的PM-SD1菌株的培养物进行活菌计数后的结果为1.2×109CFU/mL。根据表中数据及菌液浓度，按照参考文献[91]中的方法计算出LD50=25.85CFU/mL，参照文献[92][93]中，小于100CFU/mL即为强毒株的判定标准，则可判定PM-SD1菌株为强毒菌株。从死亡小鼠的各个器官中分离出的细菌，经鉴定均为P.multocida。3.4讨论测定PM-SD1菌株的耐药谱，为动物的临床用药提供技术支持，同时，为检测PM-SD1是否产生了新的耐药性，而选取30种不同种类的抗生素进行药物敏感性试验。本试验利用纸片琼脂扩散法（K-B法）对PM-SD1菌株的耐药性进行了检测。试验结果表明，PM-SD1菌株对克林霉素、新霉素、青霉素、磺胺异恶唑、替考拉宁具有耐药性（R），对克拉霉素、红霉素呈中介状态（I），对耐药性检测中的其他抗生素均敏感（S）。该菌的耐药谱与文献中查到的其他P.multocida的耐药谱进行对比，[94][95]结果文献中提及的抗生素的耐药性与检测结果中的耐药性相同。由于耐药基因的作用导致核糖体靶位的改变，促使该菌对大环内酯类抗生素（克拉霉素、红霉素）产[97]生耐药性，而中介状态，则是抗生素与靶点结合能力降低的表现。克林霉素为代表的林可胺类抗生素的抗菌谱较窄，主要针对金黄色葡萄球菌和厌氧菌感染，P.multocida属于需氧或兼性厌氧菌，同时与对大环内酯类产生耐药性的机理相同，可形成多重耐药性[98]。β-内酰胺酶水解青霉素分子内的β-内酰胺环导致青霉素失去抗菌活性[99]。新霉素属于氨基糖苷类抗生素，细菌产生的氨基糖苷类修饰酶，如氨基糖苷乙酰转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶等，可以对该类抗生素进行修饰，使其失活[100]。部分对磺胺类药物耐受菌通过改变代谢途径，使其生长代谢不需要对氨基苯甲酸，能[101]利用自身合成的叶酸，而不需要外源的对氨基苯甲酸。对昆明鼠腹腔注射分离菌悬液后，短时间内即出现个体死亡，且注射浓度较低，表明昆明鼠对于PM-SD1的致病力高度敏感。由于现有的文献中未涉及牛源P.multocida毒力强弱的判定标准，所以选择了猪源P.multocida的文献作为判定标准，24 内蒙古农业大学硕士学位论文25宿主同为哺乳动物，采用同种试验动物的情况下，半数致死量明显低于100CFU/mL，则可判定该菌株为强毒菌株。25 26牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测4毒力基因的检测与病理组织学观察4.1试验材料4.1.1毒力因子检测的基因组DNA来源分离菌株增菌后提取的总DNA4.1.2试验动物4-6周龄SPF级昆明鼠，20-25g。4.1.3试验试剂及试验仪器表6试验试剂及主要仪器设备Table6Experimentalreagentsandinstruments产品Item经销商Distributor试剂ReagentNB培养基青岛高科园海博生物技术有限公司哥伦比亚血琼脂平板青岛高科园海博生物技术有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒天根生化科技（北京）有限公司DL1000marker天根生化科技（北京）有限公司TrisBase、EDTA北京索莱宝科技有限公司2×TaqPCRMasterMix宝生物工程（大连）有限公司RegularAgaroseG-10上海百晶生物科技有限公司SuperGelRed苏州宇恒生物科技有限公司冰乙酸、氢氧化钠、天津市凯通化学试剂有限公司仪器设备InstrumentThermo全自动切片系统赛默飞世尔科技（中国）有限公司Eppendorf5430R低温高速离心机艾本德（上海）国际贸易有限公司EppendorfMastercyclerPCR仪艾本德（上海）国际贸易有限公司spectrophotometer紫外分光光度计天根生化科技（北京）有限公司Transilluminator切胶仪天根生化科技（北京）有限公司金属浴锅天根生化科技（北京）有限公司电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司26 内蒙古农业大学硕士学位论文274.2试验方法4.2.1多杀性巴氏杆菌毒力基因的PCR检测4.2.1.1分离菌株基因组DNA的提取同2.2.3.14.2.1.2毒力基因片段的扩增4.2.1.2.1引物用于扩增P.multocida常见毒力基因片段的引物，由华大基因（北京）有限公司合成。根据参考文献对23种毒力基因的引物进行设计，毒力基因种类包括黏附因子基因（ptfA，fimA，hsf-1，hsf-2，pfhA，tadD），毒素基因（toxA），铁离子摄取基因（exbB，exbD，tonB，hgbA，hgbB，Fur），唾液酸基因（nanB，nanH），透明质酸酶基因（pmHAS），外膜蛋白基因（ompA，omph，oma87，plpB）以及超氧化物歧化酶基因（sodA，sodC，[56]tbpA）。序列如下表：表7多杀性巴氏杆菌毒力相关基因检测引物Table7Primersusedforthedetectionofvirulence-associatedgenesinstainsofPasteurellamultocida名称引物序列（5’→3’）扩增片段大小（bp）退火温度（℃）NameSequence(5’→3’)Ampliconsize(bp)Annealingtemp()℃ptfATGTGGAATTCAGCATTTTAGTGTGTC48855TCATGAATTCTTATGCGCAAAATCCTGCTGGfimACCATCGGATCTAAACGACCTA86655AGTATTAGTTCCTGCGGGTGhsf-1TTGAGTCGGCTGTAGAGTTCG65454ACTCTTTAGCAGTGGGGACAACCTChsf-2ACCGCAACCATGCTCTTAC43354TGACTGACATCGGCGGTACpfhATTCAGAGGGATCAATCTTCG28655AACTCCAGTTGGTTTGTCGtadDTCTACCCATTCTCAGCAAGGC41655ATCATTTCGGGCATTCACC27 28牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测toxACTTAGATGAGCGACAAGG86455GAATGCCACACCTCTATAGsodATACCAGAATTAGGCTACGC36155GAAACGGGTTGCTGCCGCTtbpATTGGTTGGAAACGGTAAAGC72854TAACGTGTACGGAAAAGCCCsodCAGTTAGTAGCGGGGTTGGCA23655TGGTGCTGGGTGATCATCATGnanBCATTGCACCTAACACCTCT55555GGACACTGATTGCCCTGAAnanHGTGGGAACGGGAATTGTGA28755ACATGCCAAGTTTGCCCTAompACGCATAGCACTCAAGTTTCTCC20155CATAAACAGATTGACCGAAACGompHCGCGTATGAAGGTTTAGGT43855TTTAGATTGTGCGTAGTCAAComa87GGCAGCGAGCAACAGATAACG83855TGTTCGTCAAATGTCGGGTGAplpBTTTGGTGGTGCGTATGTCTTCT28255AGTCACTTTAGATTGTGCGTAGpmHASTCAATGTTTGCGATAGTCCGTTAG43054TGGCGAATGATCGGTGATAGAexbBTTGGCTTGTGATTGAACGC28355TGCAGGAATGGCGACTAAAexbDCGTTCTGATTACAGCCTCTT24755AACGAAATCTTGGAAACTGGtonBCGACGGTGAAACCTGAGCCA26155CCGAGCGATAAGCATTGACThgbATCAACGGCAGATAATCAGGG26755GCGGGAATGCTGAAGATAAGFurGTTTACCGTGTATTAGACCA24455CATTACTACATTTGCCATAChgbBACCGCGTTGGAATTATGATTG78855CATTGAGTACGGCTTGACAT28 内蒙古农业大学硕士学位论文294.2.1.2.2PCR反应体系：反应体系同表2（Table2）。4.2.1.2.3PCR反应程序95℃预变性5min；以95℃变性30sec，退火温度参照表7，退火时间30sec，72℃延伸延伸1min为一个循环，共30个循环，72℃延伸5min。4℃短时间保存。4.2.1.2.4PCR反应产物的鉴定将PCR产物用含有1/10000SuperGelRed的15g/L琼脂糖凝胶电泳检测，用DL1000marker标记片段大小，在1×TAE电压为5V/cm电泳液中，当指示条带到达胶2/3处时，通过凝胶成像系统观察PCR产物出现的条带，在紫外透照仪下迅速切取含有目的基因片段大小的凝胶条带，将其放入1.5mL离心管中，按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的方法对目的基因片段进行回收。将纯化后的产物送华大基因（北京）有限公司进行测序。4.2.1.2.5目的片段胶回收胶回收步骤同2.2.3.2.5。4.2.2昆明鼠接种多杀性巴氏杆菌临床症状及病理组织学观察4.2.2.1昆明鼠接种多杀性巴氏杆菌选取18只昆明鼠作为试验组，另取3只作为对照组，试验组每只小鼠通过后腿肌肉注射0.2mLPM-SD1培养物稀释液（PBS稀释），浓度为100LD50浓度，对照组每只小鼠则通过后腿肌肉注射0.2mLPBS。试验组分别于6、12、18、24、48、72h随机取三只小鼠进行病理组织学试验。4.2.2.2病理组织切片4.2.2.2.1取材固定对分别选取的小鼠进行剖杀，并立即取小鼠的心、肝、脾、肺、肾用10%福尔马林固定液固定，用于病理切片。固定时间24h以上。4.2.2.2.2脱水将固定好的组织进行适当修整后，经流水冲洗12-24h，然后用梯度酒精对组织块进行充分的脱水，具体流程如下：70%酒精（12h）→80%酒精（2h）→85%酒精（1h）→90%酒精（1h）→95%酒精（1h）→无水乙醇I（45min）→无水乙醇II（45min）→缓冲液（无水乙醇与29 30牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测二甲苯1：1混合）（15-45min）。4.2.2.2.3透明用二甲苯对脱水后的组织块进行透明，第一次透明10min，第二次透明10min。4.2.2.2.4浸蜡、包埋将透明好的组织块放入60℃融化的蜡（熔点：54-56℃）中，2-4h。将石蜡包埋框中注满融化的石蜡，将组织块放入包埋框中展平，待蜡块冷却后，取下蜡块，进行适当的修整。4.2.2.2.5切片及展片将修好的蜡块用切片机切成4μm薄片。将切下的蜡片放在载玻片上，滴加一滴70%酒精，放入45℃的水中，展平后立即用载玻片垂直插入液面，取出蜡片，并37℃烘干24h。4.2.2.2.6HE染色脱蜡→水化→染色→封片。4.3试验结果4.3.1毒力基因PCR检测结果对23种毒力基因的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图4，对目的条带进行切胶、测序，测序结果经NCBIBLAST验证，最终确认该菌株中含有以下毒力基因：ptfA、fimA、hasf-2、pfhA、tadD、sodA、tbpA、sodC、nanH、ompA、ompH、oma87、plpB、pmHAS、exbB、exbD、tonB、hgbA、Fur。30 内蒙古农业大学硕士学位论文31MarkerptfAfimAhsf-1hsf-2pfhAtadDtoxAsodAtbpAsodCnanBnanH1000bp700bp500bp400bp300bp200bp100bpMarkerompAompHoma87plpBpmHASexbBexbDtonBhgbAFurhgbB1000bp700bp500bp400bp300bp200bp100bp图4多杀性巴氏杆菌毒力基因电泳图Fig.4ElectrophorogramofthevirulencegeneofP.multocidaMarker：DL1000DNAMarker4.3.2小鼠临床症状及病理组织学观察结果4.3.2.1小鼠的临床症状观察结果小鼠接种PM-SD1后，出现明显的呼吸急促，精神沉郁，厌食，畏寒等临床症状，后期眼内出现大量分泌物以至眼睑粘连。4.3.2.2小鼠的组织病理学观察结果感染PM-SD1的小鼠组织切片结果显示，肺脏可见肺泡壁毛细血管扩张充血、中性粒细胞及淋巴细胞浸润，浆液性渗出，肺脏边缘实变（图5）；脾脏白髓中淋巴细胞减少，部分淋巴细胞进入红髓（图6），红髓中出现大量巨噬细胞和多核巨细胞（图7）；肝细胞索结构紊乱，肝细胞坏死（图8）；肾小管上皮细胞坏死，部分脱落（图9）；病情较重的小鼠出现心包炎，心脏外膜有中性粒细胞浸润（图10）。31 32牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测图5肺脏病理组织学观察H.E400×图6脾脏病理组织学观察H.E100×Fig.5HistopathologicalFig.6HistopathologicalobservationoflungH.E400×observationofspleenH.E100×肺脏充血、中性粒细胞及淋巴细胞浸润，白髓中淋巴细胞减少，部分淋巴细胞进入红髓浆液性渗出，肺脏边缘实变Lymphocytosisintheredpulp,Lungcongestion,neutrophilandlymphopeniainthewhitepulplymphocyteinfiltration,serouseffusion,consolidationoflungedge图7脾脏组织病理学观察H.E400×图8肝脏组织病理学观察H.E400×Fig.7HistopathologicalFig.8HistopathologicalobservationofspleenH.E100×observationofliverH.E400×脾脏出现大量巨噬细胞和多核巨细胞肝细胞索结构紊乱，肝细胞坏死AlargenumberofmacrophagesandDisorderofhepatocytes,multinucleatedgiantcellscellnecrosis32 内蒙古农业大学硕士学位论文33图9肾脏组织病理学观察H.E400×图10心脏组织病理学观察H.E200×Fig.9HistopathologicalFig.10HistopathologicalobservationofkidneyH.E400×observationofheartH.E200×肾小管上皮细胞坏死脱落心包炎，心脏外膜有中性粒细胞浸润RenaltubularepithelialcellPericarditis,cardiacadventitialnecrosisandsheddinginfiltrationofneutrophils4.4讨论从接种小鼠的病理学观察结果来看，肺脏、脾脏为主要的病变器官，肺脏的主要病变为炎性反应引起的充血及细胞病变引起的浆液性渗出，脾脏的主要病变是淋巴细胞显著减少，巨噬细胞、多核巨细胞增多，说明免疫细胞大量动员以杀死入侵的PM-SD1，但是否造成了免疫抑制，仍需试验进一步判断。肝脏、肾脏并没有明显的炎性细胞浸润，仅出现细胞坏死脱落，以血管为中心呈辐射状分布，说明血液中的毒素对这两个器官造成了一定的损害。致病菌对宿主的感染是一个复杂的过程，通常情况下，致病菌黏附在细胞表面，进而侵袭宿主的组织细胞。当致病菌成功逃避宿主的免疫系统，同时获得自身生长繁殖所需要的营养条件时，才能在宿主体内定植。其中，毒力因子对细菌的致病性及感染宿主在其体内存活繁殖的过程中都起到重要作用。因此对毒力因子的研究能够为P.multocida的防治提供科学依据，同时为P.multocida的致病机制的研究提供基础资料。本试验选取7大类23种毒力基因进行检测，在该菌中共检测并确认19种毒力基因，包括黏附因子基因（ptfA，fimA，hsf-2，pfhA，tadD），铁离子摄取基因（exbB，exbD，tonB，hgbA，Fur），唾液酸基因（nanH），透明质酸酶基因（pmHAS），外膜蛋白基因（ompA，ompH，oma87，plpB）以及超氧化物歧化酶基因（sodA，sodC，tbpA）。其中除毒素基因（toxA）这一大类没有检出，其他大类均有毒力基因分布。根据本试验结果，分析推测导致肉牛感染该菌发病后病程呈慢性经过且经久不愈的原因如下：33 34牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测首先，该菌的毒力较强与较多数量的毒力基因有关。从研究报道中可以看出，一方面，从屠宰的牛的肺中分离出的P.multocida也检测到毒力因子，而能引起更高肺炎发生率的菌株中检测出更多的种类的毒力因子，能说明毒力因子在诱发疾病中的重要作用，另一方面，在健康肺部有含毒力因子的P.multocida存在会导致早期感染或[56]者潜在感染。早期研究表明，毒力基因的存在与畜禽感染的结果具有很强的正相关[105]性。而本研究中的菌拥有较多的毒力基因，而该菌株的毒力较强，也从侧面证明这一结论。其次，该菌在较低浓度下依然能感染小鼠并致死，说明该菌具有较强毒力，并能以10CFU以下的起始数量在小鼠体内迅速繁殖。第一，经验证，本次试验分离到的菌株PM-SD1具有荚膜，这与抗吞噬作用有直接关系。A型P.multocida的荚膜主要由透明质酸、软骨素、肝素等成分组成。荚膜也是一种P.multocida的重要免疫逃避因子。在小鼠模型上，P.multocida的荚膜缺失会使其更容易被巨噬细胞吞噬，而野生[106]型P.multocida会表现出较强的抗吞噬作用。第二，从病理组织学观察的结果来看，[107]P.multocida可以对免疫系统造成损害。溶血素作为一种毒力因子，有研究证明B[108]型P.multocida分泌的溶血素对小鼠巨噬样细胞J774.2具有细胞毒性。从表现健康[109]的牛体内分离出的P.multocida所产生的蛋白酶能降低IgG的体外活性。第三，由于唾液酸基因（nanB），透明质酸酶基因（pmHAS），及多种铁离子摄取基因（exbB，exbD，tonB，hgbA，Fur）的存在，不仅使得该菌能充分利用机体内的各类营养物质，从而可以迅速繁殖，还能让细菌破坏机体的细胞外基质，从而接触并固着在细胞表面，甚至侵入细胞内，对细胞直接造成伤害。另外，该菌含有多种的外膜蛋白基因（ompA，ompH，oma87，plpB）以及黏附因子基因（ptfA，fimA，hsf-2，pfhA，tadD）共同决定细菌的定植部位，从而决定主要发病部位。不同种类的P.multocida的黏附因子能结合到不同类型的细胞、组织及器官[110]上，这反映出不同菌株对宿主、主要侵染部位与致病性的不同。另有文献报道，细菌表面黏附因子的存在通常可以与该菌的毒力相联系，在细菌的定植与繁殖中有着重[111]要作用。试验中该菌株能够定植于肺脏与脾脏，而无法迅速定植于肝脏和肾脏，说明鼠的肺脏、脾脏中的细胞表面有能与细菌中的黏附因子相作用。侵袭脾脏，导致免疫力减弱，更容易发病，而侵袭肺脏，使该菌更容易通过空气和饮水传播，从而感染更多的动物，使病情反复，不易治愈。综上所述，PM-SD1具有较强的毒力及病症久治不愈与毒力因子的分布直接相关。该菌含有的毒力因子数量较多，使宿主更容易发病；荚膜、溶血素、蛋白酶等可以帮助其抵抗宿主免疫系统的作用，透明质酸酶、铁离子摄取基因可以帮助其固着在宿主细胞上并获得繁殖所需的营养物质；外膜蛋白、黏附因子使该菌定植在肺脏、脾脏，不但使该菌更容易通过空气、饮水传播，同时降低了宿主的免疫力，更难治愈。34 内蒙古农业大学硕士学位论文355结论（1）本次分离到的菌株为多杀性巴氏杆菌，荚膜血清型为A型。（2）PM-SD1株对克林霉素、新霉素、青霉素、磺胺异恶唑、替考拉宁具有耐药性（R），对克拉霉素、红霉素呈中介状态（I），对其余25种所测抗生素均敏感（S）。（3）以昆明鼠为模型，PM-SD1菌株的半数致死量LD50为25.85CFU/mL，为强毒菌株。（4）病变器官组织学结果显示其主要病变为肺泡充血、炎性渗出，脾脏淋巴细胞减少及巨噬细胞增多，肝细胞及肾小管上皮细胞广泛性坏死等病变。（5）对PM-SD1的毒力基因分布进行了测定，共检测7大类23种常见毒力基因，其中检测到6大类19种，包括黏附因子基因（ptfA，fimA，hsf-2，pfhA，tadD），铁离子摄取基因（exbB，exbD，tonB，hgbA，Fur），唾液酸基因（nanH），透明质酸酶基因（pmHAS），外膜蛋白基因（ompA，ompH，oma87，plpB）以及超氧化物歧化酶基因（sodA，sodC，tbpA）。除毒素基因（toxA）以外，其余类别毒力基因均有分布。35 36牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究及致病基因检测致谢时光荏苒，我的硕士生涯已经接近尾声，在三年硕士研究生的求学生涯中，我的点滴进步和成长都与老师、同学、亲友的关心支持和帮助是分不开的，在此向他们表示由衷的感谢！首先，感谢我的恩师刘大程教授、成子强教授！我有幸在两位导师的指导下从事研究工作，两位导师不仅在学业上给予我耐心细致的指导和培养，同时也在生活上给予我无微不至的关怀。两位导师治学严谨，学识渊博，在科研道路上始终如一，使我受益良多，这些必将对我今后的学习、生活产生深远的影响。在此，谨向两位导师致以崇高的敬意和衷心的感谢，感谢他们对我的谆谆教诲与悉心培养！感谢实验室师姐郭鹏，师兄张立明、张政、张棋炜及同学杨晶晶在前期实验技术上的帮助，在外出采样中过程中的陪伴及生活上的关心。在我外派到山东农业大学分子病理实验室学习期间，感谢王桂花老师、李臣贵老师、黄立波老师在实验思路设计和结果分析探讨等方面给予的帮助和支持，感谢张利老师在学习、生活中的督促与关心。感谢分子病理实验室的周德方博士、李根博士、何书海博士、朱明君博士、杜旭升博士带给我科研思路上的碰撞和分子实验技术上的指导，感谢实验室所有硕士生同学带给我的鼓励和帮助，他们是：崔熙尧、王小满、王晓宇、云骜、刘杰、周静、贾梅玉、李玲、陈飞、高文博、张亚、庞宇、郑高颖、薛靖雯、袁世玉。感谢父母、爱人、亲戚朋友们对我学业的精神鼓励和物质支持，让我没有后顾之忧，安心完成学业。感谢所有关心帮助过我的人，祝你们一切顺利！36 内蒙古农业大学硕士学位论文37参考文献1CarterGR.SerologicalclassificationofPasteurellamultocida[J].TheVeterinaryRecord,1987,121(16):382-383.2RimlerRB,RebersPA,PhillipsM.LipopolysaccharidesoftheHeddlestonserotypesofPasteurellamultocida[J].AmericanJournalofVeterinaryResearch,1984,45(4):759-763.3彭忠,王庚,吴广敬,等.猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定[J].中国兽医科学,2015,45(09):943-951.4方超,李润成,魏榕,等.猪源荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、毒力基因检测与致病性研究[J].中国预防兽医学报,2017,39(03):210-214.5张娜,李书光,陈金龙,等.兔F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其致病性[J].中国兽医科学,2012,42(07):685-689.6LaurelJGL,VanE,MarkLA,etal.Singlepathogenchallengewithagentsofthebovinerespiratorydiseasecomplex[J].PLOSONE,2015,10(11):1371-1394.7吴范庚.我国多杀性巴氏杆菌血清学鉴定及交互免疫试验[J].中国兽医杂志,1997(08):14-15.8WilleM,McBurneyS,RobertsonGJ.Apelagicoutbreakofaviancholerainnorthamericangulls:scavengingasaprimarymechanismfortransmission[J].JournalofWildlifeDiseases,2016,52(4):793-802.9CipriánA,PijoanC,CruzT,etal.MycoplasmahyopneumoniaeincreasesthesusceptibilityofpigstoexperimentalPasteurellamultocidapneumonia[J].Canadianjournalofveterinaryresearch,1988,52(4):434-438.10HodgsonPD,AichP,StookeyJ,etal.Stresssignificantlyincreasesmortalityfollowingasecondarybacterialrespiratoryinfection[J].VeterinaryResearch,2012,43(1):139-142.11Zamri-SaadM,EffendyWM,MaswatiMA,etal.ThegoatasamodelforstudiesofpneumonicpasteurellosiscausedbyPasteurellamultocida[J].TheBritishVeterinaryJournal,1996,152(4):453-458.12CampbellGW,SainiG.Pasteurellamultocida-associatedsepticaemiainachitaldeer(Axisaxis)[J].AustralianVeterinaryJournal,1991,68(10):345.13Shirzad-AskiH,TabatabaeiM.MolecularcharacterizationofPasteurellamultocidaisolatesobtainedfrompoultry,ruminant,catsanddogsusingRAPDandREP-PCRanalysis[J].MolecularBiologyResearchCommunications,2016,5(3):123-132.14PedersenK,HammerAS,SorensenCM,etal.Usageofantimicrobialsandoccurrenceofantimicrobialresistanceamongbacteriafrommink[J].VeterinaryMicrobiology,37 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