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密级:学校代码:10075分类号：学号：20091389医学硕士学位论文酢浆草总提物对酒精性肝病的治疗作用学位申请人:谷丽伟指导教师:丁良教授学位类别:医学硕士学科专业:药理学授予单位:河北大学答辩日期:二○一二年六月 ClassifiedIndex:Code:10075U.D.C:NO:20091389ADissertationfortheDegreeofM.ScienceTheeffectionofOxaliscomiculataLonAlcoholicliverdiseaseinratsCandidate:GuLiweiSupervisor:Prof.DingLiangAcademicDegreeAppliedfor:MasterofMedicalSpecialty:PharmacologyUniversity:HebeiUniversityDateofOralExamination:June,2012 英文缩略词表英文缩略词表缩略词英文全称中文全称ALDalcoholicliverdisease酒精性肝病SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶MDAmalondialdehyde丙二醛ASTaspertateaminotransferase谷草转氨酶ALTalanineaminotransferase丙氨酸氨基转移酶AKPalkalinephosphatase碱性磷酸酶GGTgamma-glutamyltranspeptidase谷酰转肽酶ADHalcoholdehydrogenase乙醇脱氢酶ALDHaldehydedehydrogenase乙醛脱氢酶TNFtumornecrosisfactor肿瘤坏死因子NADnicotinamideadeninedinucleotide烟酰胺腺嘌呤二核苷酸mRNAmessengerribonucleicacid信使核糖核酸 摘要摘要目的：本研究利用灌胃酒精所致的酒精性肝病大鼠作为模型，研究酢浆草总提取物对酒精性肝病的治疗作用，并对其可能机制进行探讨。方法：健康清洁级雄性SD大鼠68只，随机分为5组，正常组20只，模型组，酢浆草中剂量组，酢浆草高剂量组和阳性药物对照组各12只。12周造模完成后，正常组处死10只，其余各组随机处死2只，其余大鼠灌胃给药，酢浆草中剂量组给予酢浆草总提取物3.5g/kg/d，酢浆草高剂量组给予酢浆草总提取物7.0g/kg/d，阳性药物对照组给予醋酸强的松0.9mg/kg/d，模型组给予等体积的生理盐水。实验期间，大鼠自由进食、饮水，18周处死大鼠，检测以下指标：称量大鼠体重，肝组织重量，比较体重变化和肝系数；检测肝功指标：AST、ALT、AKP、GGT，应用生化试剂盒检测SOD、MDA、ADH、ALDH,制作肝组织石蜡切片，进行HE染色，应用免疫组化检测TNF-a。结果:1.光镜下HE染色结果：12周造模结束后，正常组大鼠的肝组织未见明显病变，肝细胞形态规则，排列整齐，以中央静脉为中心向外周呈放射状排列。其余组大鼠的肝细胞以大泡状为主的脂肪变性，伴有小泡状脂肪变肝细胞。伴有炎细胞浸润。18周正常组结构没有明显改变。模型组大鼠的肝细胞以大泡性为主的脂肪变性，伴有小泡状脂肪变肝细胞，伴有炎细胞浸润。酢浆草中剂量组、酢浆草高剂量组大泡性脂肪变细胞明显减少，肝间质炎细胞浸润明显减轻，高剂量组较中剂量组疗效明显，强的松组脂肪变细胞无明显变化。炎细胞减少和高剂量组疗效相当。2.肝功检测结果：12周造模完成时，与正常组相比，模型组、酢浆草中、高剂量组、强的松组AST、ALT、AKP、GGT明显升高，差异有统计学意义。18周，与模型组相比，酢浆草中、高剂量组、强的松组AST、ALT、AKP、GGT明显偏低，差异有统计学意义。与强的松组相比，酢浆草中、高剂量组AST、ALT、AKP、GGT差异变化不明显，差异无统计学意义。I 摘要3.其他生化指标检测结果:12周造模完成时，与正常组相比，模型组、酢浆草中、高剂量组、强的松组大鼠的SOD、ADH、ALDH下降，MDA升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。18周，与模型组相比，酢浆草中、高剂量组、强的松组SOD、ADH、ALDH升高，MDA下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与强的松组相比，酢浆草中、高剂量组SOD、ADH、ALDH、MDA变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。4.TNF-a免疫组化染色结果：12周造模完成时，模型组、酢浆草中、高剂量组、强的松组TNF-a均呈强阳性表达，在kuffer细胞胞浆及部分细胞膜呈棕黄色，18周，模型组巨噬细胞胞浆及部分细胞膜仍呈强阳性表达，酢浆草高剂量组、阳性药物组Kuffer细胞胞浆及部分细胞膜呈弱阳性表达。结论:1.酢浆草总提物可以显著降低AST、ALT、AKP、GGT的水平，减少对肝细胞的破坏，对酒精性肝病起到治疗作用。2.酢浆草总提物可以显著降低MDA的水平，升高SOD、ADH、ALDH的水平，其机制可能与减轻自由基对肝组织结构的氧化损伤有关。3.酢浆草总提物可以显著降低TNF-a在巨噬细胞胞浆及部分细胞膜的表达。关键词酒精性肝病酢浆草总提物TNF-aII AbstractAbstractobjects:Inthisstudy,ratsweregivenagavageofsamevolumewithalcoholasamodel,whichleadtoalcoholicliverdisease.Theobjectsweretoobservethetreatmentofalcoholicliverdisease,andtoexploreapossiblemechanism.Methods:68healthyandcleanmaleSDratswererandomlydividedinto5groups,therewere20ratsinthenormalgroupandtherewere12ratsinthemodelgroup,mediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalisandpositivecontrolgroup.Afterthecompletionof12weeksofmodeling,10ratsinthenormalgroupwereputtodeath,and2ratsintheothergroupswereputtodeath.Inadditiontothenormalgroupandthemodelgroup,theratsweregivengavagedrugtreatment.Ratsinmediumdosegroupofoxalisweretreatedwithoxalisextract3.5g/kg/d,ratsinhighdosegroupofoxalisweretreatedwithoxalisextract7.0g/kg/d,andthepositivecontrolgroupweretreatedwithprednisone0.9mg/kg/d.Duringtheexperiment,theratswerefreetofeedanddrink.Atthetimeof18weeks,theratswereputtodeath,thenwedetectedofthefollowingindicators:weighingbodyweightofrats,livertissueweight,comparingweightchangeandlivercoefficient;wedetectedindicatorsofliverfunction:AST,ALT,AKP,GGT,andwedetectedSOD,MDA,ADHandALDHinapplicationofBiochemicalkit.Atlast,wemadelivertissueparaffinsections,whichwereusedforHEstaining,immunohistochemicalofTNF-a.Result:1.Lightmicroscope,HEstaining:attheendof12weeksofmodeling,thelivertissueofnormalratswerenoobviouslesions,livercellsweremorphologicalrules,whichwerearrangedinneatrows,andlivercellswerearoundthecentralveininradialarrangement.Theremaininggroupofratslivercellswerebulloussteatosis,associatedwithsmallvesicularfattydegeneration，andwithinflammatorycellinfiltration.Thestructureofthenormalgroupof18weeksdidnotchangesignificantly.Livercellsofmodelgroupwerebulloussteatosis,associatedwithsmallvesicularfattydegeneration，andwithinflammatorycellinfiltration.Mediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalismacrovesicularsteatosiscellssignificantlyreduced,inflammatorycellsinfiltrationsignificantlyreducedinliverinterstitial.III AbstractLivercellsofthehighdosegroupofoxalisgroupwerebetterthanmediumdosegroup.fattydegenerationcellsofprednisonegrouphadnosignificantchanged,butinflammatorycellsreduced.2.liverfunctiontestresults:Aftercompletionof12weeksofmodeling,comparedwiththenormalgroup,AST,ALT,AKPandGGTinmodelgroup,mediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalisandprednisonegroupweresignificantlyincreased,thedifferencewasstatisticallysignificant.Atthetimeof18weeks,comparedwithmodelgroup,AST,ALT,AKPandGGTinthemediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalisandprednisonegroupweresignificantlylower,thedifferencewasstatisticallysignificant.Comparedwiththeprednisonegroup,AST,ALT,AKP,GGTinmediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalisdidnotchangesignificantly,thedifferencewasnotstatisticallysignificant.3.otherbiochemicalindicatorsoftestresults:Aftercompletionof12weeksofmodeling,comparedwiththenormalgroup,SOD,ADH,ALDHinmodelgroup,mediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalisandprednisonegroupweresignificantlydeclined,MDAinmodelgroup,mediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalisandprednisonegroupweresignificantlyincreased.thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Atthetimeof18weeks,comparedwithmodelgroup,SOD,ADH,ALDHinmodelgroup,mediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalisandprednisonegroupweresignificantlyincreased,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Comparedwiththeprednisonegroup,SOD,MDA,ADH,ALDHinmediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalisdidnotchangesignificantly,thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05).4.TNF-aimmunohistochemicalstainingresults:Aftercompletionof12weeksofmodeling,TNF-ainkuffercellsofmodelgroup,mediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalis,prednisonegroupwerestronglypositiveexpression,whichpresentredbrownattheKuffercellsandpartofcellmembrane.Atthetimeof18weeks,Kuffercellsandpartofcell’smembraneinmodelgroupwerestillstrongexpression;Kuffercellsandpartofcell’smembraneinmediumdosegroupofoxalis,highdosegroupofoxalis,prednisonegroupwereweaklypositiveexpression.Conclusion:1.TheoxalistotalextractscansignificantlyreducethelevelofAST,ALT,AKP,GGT,IV Abstractandcanreducethedestructionoflivercellsandcanplayaroleinthetreatmentofalcoholicliverdisease.2.TheoxalistotalextractscansignificantlyreduceMDAlevels,andincreasethelevelofSOD,ADHandALDH,itsmechanismmayreducefreeradicaloxidativedamagetothestructureoflivertissue.3.TheoxalistotalextractscansignificantlyreducetheTNF-aexpressionintheKuffercellsandpartofcell’smembrane.KeywordsalcoholicliverdiseaseoxalistotalextractsTNF-aV 目录目录第一章文献综述....................................................................................................................11前言...............................................................................................................................12酒精性肝病的概念.......................................................................................................13酒精性肝病的发病机制...............................................................................................23.1乙醇在体内的正常代谢.....................................................................................23.2酒精诱导机体产生的异常代谢.........................................................................23.3乙醇及其代谢产物的氧化应激过程.................................................................43.4细胞因子网络学说.............................................................................................53.5其他可能导致患病的因素.................................................................................63.6对血液系统的影响.............................................................................................64酒精性肝病的治疗进展...............................................................................................74.1完全戒酒.............................................................................................................74.2高营养支持...........................................................................................................74.3药物治疗.............................................................................................................84.4积极预防处理ALD患者的晚期并发症...........................................................94.5肝移植.................................................................................................................94.6中医药治疗.........................................................................................................9参考文献..................................................................................................................................11第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用......................................................141材料与方法.................................................................................................................141.1实验材料...........................................................................................................141.2实验方法...........................................................................................................152实验结果.....................................................................................................................232.1形态学结果.......................................................................................................232.2大鼠体重及肝系数变化...................................................................................272.3生化指标检测结果...........................................................................................30VI 目录2.4TNF-a在肝组织中免疫组化结果...................................................................372.5TNF-a免疫组化染色结果...............................................................................383讨论.............................................................................................................................394结论…………………………………………………………………………………37参考文献..................................................................................................................................41致谢......................................................................................................................................42攻读硕士学位期间取得的科研成果......................................................................................43VII 第一章文献综述第一章文献综述1前言我国酒精性肝病有迅速增加的趋势。2008年统计，ALD(alcoholicliverdisease)的人群患病率高达年统计，浙江人群患病率高达4.34%。2010年统计的人群患病率高达5.13%。有报道其中酒精性肝炎高达49.75%，远高于以往的有关报道。欧美8%和22%及日本31.8%的发病率。酗酒的人群中5%～20%有不同程度的肝硬化。ALD的防治已成为我国医学领域一个重要课题。酒精性肝病：是由于短期大量或长期饮酒引起的肝功能代谢紊乱，其发病机制尚待研究，目前缺乏有效的治疗手段，组织病理学以肝细胞脂肪变性，坏死，纤维组织增生，炎细胞浸润为特征，常伴有肝功能生化指标的异常，最终导致肝硬化，肝功能衰竭的临床综合征。目前的治疗方法包括完全戒酒、高营养支持、糖皮质激素、抗氧化剂、抗细胞因子等治疗，但这些药物总体疗效差，副作用明显，费用高，给患者家属和社会造成[1]沉重的负担。酢浆草（OxaliscomiculataL）,为酢浆草科植物酢浆草的全草，其味酸、凉，也称为酸浆草，三叶草，具有清热解毒，抗炎、抗毒素等作用，民间用于急性肝炎、急性黄疸的治疗，取得了良好的效果。酢浆草总提物是将酢浆草干粉浸于70%甲醇中提取的有[2]效成分，主要含有：总黄酮，有机酸类及脂质等。本研究以短期大量饮酒导致的酒精性肝病大鼠作为模型，观察酢浆草对酒精性肝病的防治效果，并且初步探讨酢浆草防治急性酒精性肝病的作用机制，为临床合理用药提供更科学、更可靠的理论基础。2酒精性肝病的概念ALD是导致患者机体代谢严重障碍的肝部致命性的脂肪肝，肝炎，肝纤维化，肝硬化。对于该病的发病机制和病理过程，目前尚待进一步研究。同时，对于该病的治疗手段也比较欠缺。病变累及肝间质细胞，肝细胞和肝内胆管，其病理特征为：大量短时间饮酒或长时间饮酒导致乙醇及其代谢产物在肝内淤积，造成对肝组织的过氧化损伤，产生毒素，抗原抗体复合物，激活炎性细胞，造成肝实质细胞和间质细胞的损伤、凋亡[3]。继而成纤维细胞活化，细胞间质纤维化形成。肝功能进行性下降，胆管受压，肝内1 河北大学医学硕士学位论文胆汁淤积，进一步加重对肝脏的损伤，导致肝组织异常重塑。ALD终末期患者肝功能明显下降，肝脏消除体内毒素，合成蛋白质等功能丧失，临床表现为厌食、纳差、体重下降，肝性腹水、黄疸，门静脉高压，意识改变等症状，[4]最终因肝功能衰竭、消化道出血、肝性脑病、肝肾综合征导致患者死亡。3酒精性肝病的发病机制ALD分为3个阶段：酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化。3个阶段可单独也可混合存在。主要的病理特征为肝细胞脂肪变，以大泡状脂肪变为主，伴有小泡性脂肪[5]变，肝内间质纤维组织增生，假小叶形成，最终导致肝功能衰竭。ALD的发病机理很复杂，目前正在进一步研究中。它涉及到氧化应激、脂质过氧化、免疫因素、内毒素、炎症介质和细胞因子的激活，细胞凋亡等，还与遗传易感性、[6]性别、种族、营养状况等密切相关。3.1乙醇在体内的正常代谢摄入乙醇后，由于小肠的内表面积大，表皮为单层上皮，乙醇可通过自由扩散进入[6]血液循环等特点，约90%的酒精经小肠粘膜被吸收。主要在小肠的十二指肠和上端回肠的上皮细胞吸收，随后进入血液循环。乙醇在体内迅速分布到血管丰富的组织，如：肝、脑、肺等。乙醇在体内不能以原型的形式排出，它与脂肪组织有高度亲和力，在体内必须代谢成二氧化碳和水才能排除体外。乙醇代谢的主要场所是在肝进行代谢，也有很少一部分酒精约占5%通过呼吸作用从肺呼出。在少量饮酒后，乙醇在肝内主要通过乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase,ADH）脱氢氧化转化为乙醛，乙醛随后被乙醛脱氢酶（aldehydedehydrogenase,ALDH）加氧氧化形成乙酸，乙酸经一系列的代谢过程最终[7-9]生成二氧化碳（CO2）和水（H2O）排除体外。下面就参与乙醇代谢过程的酶分别阐述。首先是乙醇脱氢酶（ADH），编码ADH的基因位于4号染色体上。具有4种不同的等位基因分别编码。ADH为含锌的金属酶，分4种亚型，分别ADH1，ADH2，ADH3，ADH4。其中ADH2与乙醇的代谢密切相关。据有关统计，ADH2含量高的人群在饮酒量相同的前提下，患酒精性肝病的机率明显下降。同时，有实验证实：适当补锌可以减[10]轻酒精所致的肝细胞脂肪变，减少炎症因子的浸润。3.2酒精诱导机体产生的异常代谢在大量饮酒后，肝脏内ADH的含量远远不能满足需要，活性下降，为满足需要，2 第一章文献综述机体调动细胞色素P450（P450ⅡE1或CYP2E1）介导的微粒体乙醇氧化酶系统（(microsomalethanoloxidizingsystem，MEOS），MEOS代谢乙醇的功能受限于细胞色素P450，CYP2E1表达活跃的区域，乙醇的代谢加快；相反，CYP2E1表达缺少的区域，[11]乙醇的代谢速度降低。经检测，中央静脉周围的肝细胞高表达CYP2E1，造成该区氧消耗增多引起氧供不足，氧应激产物的堆积及脂质的转化受抑制，使该区肝细胞脂肪变[12]性最为显著。乙醇诱导CYP2E1的过程涉及到复制、转录、翻译等多部位、多步骤的调节，目前公认的观点认为：CYP2E1在体内表达的增加是通过减少翻译后蛋白的降解实现的。但有关试验却给出了相反的实验数据：检测到大量饮酒后模型动物体内CYP2E1mRNA(messengerribonucleicacid)的量显著升高。目前关于这一过程的调节正在[13-15]进一步研究中。乙醇、乙醛的肝损作用作用：乙醇对肝细胞有明显的直接毒性作用，肝线粒体肿胀、呼吸链酶减少、电子流通过氧化磷酸化偶联部位受阻，糖、脂质及部分蛋白质代谢障碍：蛋白质代谢障碍改变了氧化型辅酶I（NAD）和还原型辅酶I的比值及肝细胞内氧化还原状态，氧化型辅酶I（NAD）和还原型辅酶I的比值及肝细胞内氧化还原状态，致三羧酸循环受抑；引起肝内甘油三酯堆积；抑制蛋白质合成与分泌，刺激胶原合成；亦可增加二甲基亚硝胺等致癌物的作用，亦可增加二甲基亚硝胺等致癌物的作用，促进肝炎病毒引发的致肝癌作用。引发自由基、脂质过氧化损害，乙醇代谢过程中直接生成大量的活性氧基团，乙醛和P450酶系及谷胱甘肽结合，影响自由基酶系及谷胱甘肽结合，氧自由基过剩导致膜磷酯脂质过氧化反应破坏生物膜的流动性、通透性和完整性，影响细胞各种生理功能。生成的过氧化脂质进一步破坏蛋白质，破坏核酸等大分子，改变酶的功能，引起细胞各种功能的障碍。乙醛刺激肝胶原合成抑制微管的聚合，抑制微管的聚合，影响细胞内蛋白的转运和分泌。增加胶原合成，促进肝纤维化，诱发免疫反应和细胞因子的异常作用。乙醛和肝蛋白或酶结合，形成乙醛加成物，诱导乙醛和肝蛋白或酶结合，形成乙醛加成物，诱导与细胞膜结合的抗体生成，补体与含有免疫复合物的乙醛复合物结合时产生广泛性肝细胞损害。乙醇代谢产生的过氧化脂质可诱导炎性细胞激活Kupffer细胞和肝星形细胞，产生IL-1、IL-6、TNF-α(tumornecrosisfactor-α)及TGF-β、PDGF和FGF，参与炎症、再生与纤维形成，最终导致肝硬化的发生。3 河北大学医学硕士学位论文3.3乙醇及其代谢产物的氧化应激过程2-乙醇在MEOS的作用下生成大量的乙醛，同时产生氧自由基（O）,过氧化氢（H2O2）等氧应激产物。过多的乙醛在体内需要经过加氧氧化形成乙酸，在这一过程中消耗大量的氧，能量（ATP）,造成对细胞的缺氧损伤。乙醛作为半抗原，与肝内的蛋白反应基团或小分子氨基酸形成“加和物”，两者形成二聚体，作为抗原，诱导机体发生免疫应答，进而激活体内的细胞免疫和体液免疫，导致自身免疫反应的发生，产生大量的抗体，细[16]胞因子。抗体和细胞因子等作为信号因子，进一步激活炎症的级联反应。当酒精性肝病发展到自身免疫反应进展阶段，即使戒酒，肝细胞也会受到自身抗体的攻击，导致疾病呈不可逆性恶化。在一些患者和实验动物的血清中检测到加和物抗体的存在，进一步[17]证实了ALD的发展过程中，自身免疫反应起到了相当重要的影响。在乙醇代谢过程中，NAD(nicotinamideadeninedinucleotide)结合氢生成NADH,每代谢1分子乙醇消耗2分子NAD，导致NAD减少，NADH增加，从而使依赖NAD的生化反应减弱，而依赖NADH的生化反应增强。导致肝内的各种代谢过程出现紊乱。乙醛的毒性表现在：对破坏细胞膜的流动性和通透性，与细胞膜上的特异性抗体结合，导致对葡萄糖、氨基酸、脂质的穿膜失去选择性，同时对细胞的有害物质，如：内毒素等，[18]也可自由穿膜。长期饮酒的患者体内ALDH的活性下降，造成肝静脉中乙醛堆积，无法及时处理，进而引起肝细胞中乙醛堆积，试验证实肝细胞中乙醛的量和与肝损害程度成正比例关系。乙醛蛋白加和物还可激活肝间质成纤维细胞，导致间质纤维化，形成[19]肝纤维化。正常生理条件下，体内的氧化和抗氧化机制处于动态平衡状态，但长期饮酒患者破坏了这种平衡，肝内存在促氧化物质的显著增多，抗氧化物质的量和活性显著下降的现象。如：肝细胞线粒体内谷胱甘肽（GSH）的活性下降，造成对线粒体失去有效的保护[20]作用，导致线粒体的损伤、凋亡或死亡。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）又被称为奥谷蛋白，肝蛋白，是一种[21]机体内的活性物质，包括人体、动物、植物等。一般情况下，机体中自由基的恒定水平很低，对自身无破坏作用。但在某些病理条件或理化因素影响下，如：机体的炎症过程，自身免疫性疾病，电离辐射等作用下，会产生多种有害物质，其中对人体正常细胞[22]结构破坏最强的是：氧自由基，使脂质过氧化，多聚糖结构发生解聚，DNA断裂等。4 第一章文献综述这些氧自由基攻击细胞膜的不饱和脂肪酸，使不饱和脂肪酸发生过氧化反应，导致膜的伤害。SOD能有效的消除氧自由基，对细胞结构起到保护作用，起到抑制对机体的有害反应最小化的作用，从而对机体不断补充SOD，会起到抗衰老的特效。因此SOD可在[23]一定程度上起到反应体内抗氧化的水平。丙二醛（malondialdehyde,MDA）是氧自由基作用于脂质发生氧化反应生成的对机[24]体有害的终产物。机体在病理条件下，通过酶系统或非酶系统产生大量的氧自由基，而体内的抗氧化物质远远不能满足机体此时的需要，导致氧自由基攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应。脂质过氧化反应把氧自由基对细胞的破坏，转换成为其他脂质过氧化产物对人体的破坏，而且有级联放大作用，于是我们检测MDA的含量，就可以反应机体脂质过氧化反应发生的严重程度，进一步了解机体细胞受自由基损伤的程度。3.4细胞因子网络学说大量饮酒后，由于肠屏障作用的破坏，大量肠源性内毒素吸收入血，乙醇刺激炎症[25]细胞产生大量的炎症介质和细胞因子。激活后产生过多的炎症介质、细胞因子，与Kupffer细胞特异受体TLR4(Tolllikereceptor4)及CD14结合，激活Kupffer细胞，Kupffer细胞产生的炎症因子、细胞因子，使炎症反应强化放大，炎症反应更为剧烈。氯化钆针对Kupffer细胞有选择性杀伤作用，经检测氯化钆后，ALD大鼠的炎症介质、细胞因子均有明显的下降，阻断了级联反应的发生。但考虑到氯化钆对其他脏器的损害，目前仍[26]在寻找毒副反应小的替代药物。针对肠道吸收内毒素增多这一现象，一些学者喂食大鼠富含乳酸杆菌的食物，和针对肠源性毒素的抗生素：新霉素等，结果发现可在一定程度上缓解ALD的进展，减轻[27]ALD的临床症状。其中，对肝细胞破坏性较强的因子有TNF-a，TNF目前认为最早是1975年由Carswell学者发现的，Carswell在进行相关研究时意外发现，小鼠经卡介苗致敏后，再注射大肠杆菌内毒素，血清中出现了一种特殊的物质，该物质能将移植到小鼠腹腔的肿瘤发生缺[28]血、坏死，于是将该物质命名为肿瘤坏死因子。经研究，TNF在人体外获得成功表达，之后，美国、日本等地陆续进行TNF一期和二期临床试验，结果肿瘤患者出现了难以耐受的类似感染的严重不良反应。人们开始对TNF有了较为全面的了解。当机体处于5 河北大学医学硕士学位论文免疫应激状态时，TNF-a能提高中性粒细胞的吞噬作用，增加过氧化物阴离子产生，[29]TNF-a也可活化单核巨噬细胞，加速IL-2受体的表达，进而IL-2增多。同时攻击自身的细胞，使自身组织受到损坏。在不同疾病中TNF-a所起的作用不同。对于肿瘤而言，它起到了良好的抗肿瘤作用，但在自身免疫性疾病中，它攻击的是自身组织，造成免疫损伤。ALD中伴有大量TNF-a的表达，使机体处于免疫紊乱阶段，造成了大量炎症介质的级联放大反应，针对这一现象，在治疗ALD的药物中，我们考虑使用抗TNF-a的[30]药物。通过对大鼠灌胃给予TNF-α抗体，证实对ALD大鼠也有一定的疗效，但是，长时间给予TNF-α抗体却增加了药物导致肿瘤的风险加大，所以在临床上不建议推广。3.5其他可能导致患病的因素和人类许多疾病一样，接触可能致病的危险因素后，并不是所有的人都患病，还与患者的易感性有关。在所有的酗酒人群中，ALD的患病率约为10%~35%，于是ALD除与饮酒量、饮酒年限有关外，还与遗传因素、环境、营养状况和体内的激素水平相关[31]。1遗传因素乙醇代谢相关酶是受染色体上的基因定向调控的。其中编码ADH、ALDH、CYP2E1的基因都具有多态性，不同家族拥有不同的同工酶类型，于是出现ALD[32]在家族中有遗传倾向。2性别差异由于不同性别体内的激素种类，水平不同，对ALD的易感性不同，[33]经调查显示：在饮酒量相同的情况下，女性更易感。[34]3合并患有乙型肝炎、或丙型肝炎，肝细胞更易受损。4ALD患者有长期酗酒史，酗酒导致胃肠道功能失调，患者多厌食、纳差，导致营[35]养不良，缺乏蛋白质和必需的维生素等。3.6对血液系统的影响大红细胞血症90%的长期饮酒者中可见有特征性的大红细胞血症，表现为平均红细胞体积轻度增大的圆形红细胞，无贫血，无红细胞大小不等，细胞内颗粒分布正常，给予叶酸、维生素B12治疗无效。长期饮酒者还可出现巨幼红细胞性骨髓像，伴有效造血的巨幼红细胞性贫血，其原因可分为酒精及其代谢产物直接作用，营养不良致叶酸缺乏等。长期饮酒者的骨髓进行铁染色，幼红细胞的细胞质中可见发蓝的稍稍粗大的铁颗粒，存在于细胞核周围的细胞浆内，呈圆环状排列称为环状铁粒幼细胞，它是一种病态6 第一章文献综述的幼红细胞，线粒体内铁的沉积，有环状铁粒幼红细胞的贫血叫铁粒幼性贫血。酒精能使与血红素合成初期反应相关的磷酸吡哆醛酸合成障碍，进而使合成血红素的中间及最终反应受阻。23%～35%的长期饮酒者可见环状铁粒幼细胞增加，出现无效造血的铁粒幼性贫血的病理生理反应。骨髓贮藏铁的变化和缺铁性贫血酒精对贮存铁和铁的脏器分布有影响。81%的长期饮酒者可见巨噬细胞内铁颗粒有聚集现象，可见铁蛋白、含铁血黄素等骨髓贮存铁增加的现象，此外在细胞质内可见铁颗粒。过量饮酒刺激消化道粘膜可致消化道出血，酒精性肝硬化所致食管静脉曲张破裂可发生大出血，丢失大量的铁。不吃副食的酗酒者，铁的摄入不足可引起骨髓贮藏铁含量低下，进而导致慢性缺铁性贫血，必须给予补充铁剂。酒精性肝病时血浆胆固醇酯水平低下，血浆磷脂酰胆碱增加，血浆卵磷脂-胆固醇酰基转移酶活性低下，红细胞膜胆固醇增加，磷脂酰醇胺等减少，发生薄而大的红细胞，成为表面积增大的有标识的红细胞，这种红细胞抵抗渗透压的能力较强，但是当发生酒精性肝硬化时，出现带刺的红细胞就易发生溶血性贫血。Zieve综合征是指过量饮酒的脂肪肝合并了黄疸、高脂血症、溶血性贫血的综合征，推测胰腺磷酯酶A逸出使血浆游离PC增加，发生红细胞破坏，但尚未证实出现的红细胞是薄红细胞、大细胞或超大细胞。假性多血症是指红细胞压积上升而全血球量正常状态，有时称为真性红细胞增多症。中年男性多见，吸烟、高血压、肥胖、过量饮酒是其诱因之一，红细胞压积增高时易发生高粘滞综合征和血栓症。4酒精性肝病的治疗进展ALD总的治疗原则包括：目前无特效疗法，支持疗法为主，完全戒酒，高蛋白、低脂肪营养支持，改善已存在的营养不良，尽可能减轻或制止肝细胞进一步受损伤，同时，对终末期ALD患者，积极对症处理肝硬化及其并发症。4.1完全戒酒有研究发现戒酒后10天左右肝内脂肪可明显改善，部分肝功异常者戒酒后反应较好。ALD患者改为每日少量饮酒，每3月监测，发现病变仍在进展。于是，我们强调[36]完全戒酒。完全戒酒是ALD患者一项最重要的措施。戒酒后容易发生戒断综合征，[37]导致患者不能耐受，发生反复。可适当药物辅助戒酒如：双硫仑、纳曲酮等。4.2高营养支持长期饮酒的患者多厌食、纳差，应主张少食多餐，以高蛋白、低脂肪的食物为主，7 河北大学医学硕士学位论文注意维生素B6、B12、C、K及叶酸的补充。主张高于常规的饮食摄入量，其中蛋白质1.2-1.5g/kg，热量35-40kcal/kg。肝功异常时，应休息，进食高蛋白及高热低脂饮食。胆碱、蛋氨酸对肝功恢复有帮助。肝得健是磷脂及多种B族维生素的复方制剂，作用是使肝细胞膜组织再生，加速肝脏脂肪代谢，合成蛋白质及有解毒功能。肝胆能由对甲基苯甲醇、烟酸酯-5α萘乙酸组成的复方制剂，作用是促进胆汁分泌、护肝、抗炎、并能抑制酒精中毒时，肝细胞的破坏作用。副作用轻微，个别出现轻度腹泻。可使被抑制的肝细胞活性恢复，刺激核酸合成和细胞再生，锌可以促酶活性，改善对酒精的代谢。[38]试验显示：ALD患者较早达营养指标者病死率有所降低。4.3药物治疗4.3.1糖皮质激素糖皮质激素可改善ALD患者厌食、纳差等症状，可抑制炎症细胞的浸润和免疫[39]过程，从而减轻肝细胞炎症反应，进而细胞因子分泌下降，抑制了炎症的级联反应。同时，糖皮质激素还可以抑制成纤维细胞的增殖分化，从而延缓肝纤维化、肝硬化的进程。目前是中重度酒精性肝炎的有效治疗方法。此外，长期应用糖皮质激素的副作用较大，如：诱发或加重感染、溃疡、出血，激素依赖，继发性高血压，糖尿病，患者多因消化道出血，肝衰竭、肝肾综合征、肝[39]性脑病而死亡，导致患者的远期生存率并未得到提高。4.3.2美他多辛理论上能加速血液、尿液中乙醇、乙醛的代谢，减轻酒精中毒后的精神症状，具[40]有促醒作用，但对于ALD患者肝功的改善并无统计学差异。4.3.3S-腺苷-L-蛋氨酸肝功能受损，导致腺苷蛋氨酸合成酶不足，使蛋氨酸向腺苷蛋氨酸的合成转化受[41]阻，从而在生理过程中预防胆汁淤积的机制障碍，造成胆汁淤积。适用于肝硬化前和肝硬化所致的胆汁淤积，从而降低ALD患者的生化指标。腺苷酸可减少急性酒精损害后肝内三酰甘油的增加，刺激线粒体氧化脂肪酸的作用。大量ATP(分解可为腺苷)也有上述同样作用。氯贝丁酯(安妥明)可以减少三酰甘油的合成，并经酶的诱导氧化长链脂肪酸。4.3.4抗氧化剂8 第一章文献综述水飞蓟素、甘草酸制剂，还原型谷胱甘肽等可清除部分自由基，打断过氧化损伤，进而对肝细胞膜，细胞器膜起到稳定作用，可有效降低ALD患者的生化指标。泰特其有效成分是谷胱甘肽。泰特是还原型的谷胱甘肽，其中硫氢基团与众多有毒化学物质及其他代谢物质结合起解毒作用。可用于酒精中毒、药物中毒及其他化学中毒。副作用：偶有皮疹，停药后消失。但药物费用偏高，经济负担重。4.3.5抗细胞因子治疗目前临床上处于试验阶段的有三种抗TNF-a的药物，己酮可可碱能降低中重度[42]ALD患者的住院病死率，而英利昔单抗和依那西普使远期预后恶化。同时它有增加肿瘤患病率等副作用，基于以上现状，抗细胞因子治疗尚处于试验阶段。4.4积极预防处理ALD患者的晚期并发症ALD患者的晚期并发症有：肝硬化，门静脉高压，食管胃底静脉出血，自发性细[43]菌性腹膜炎，肝性脑病，肝功能衰竭，肝肾综合征，肝细胞肝癌等。4.5肝移植ALD晚期患者可考虑肝移植，要求患者戒酒6个月，但由于器官短缺，病人的依[44]从性差，目前手术成功率低，死亡率高。4.6中医药治疗在治疗酒精性肝病方面，中医、中药也取得了良好的效果，为进一步研发新药开拓了视野。黄酮类物质能降低体内氧自由基、减轻脂质过氧化，降低5-脂氧化酶的活性，从而达到降低组织中MDA，白三烯，使超氧化物歧化酶的活性增强，从而使细胞免受各种氧化反应的损伤，以及减轻进一步激活体内的免疫系统，避免级联反应的发生，达到保[45]护机体正常组织结构，以及细胞微环境稳定的作用。在欧洲和亚洲的许多国家黄酮类物质均被作为抗肝毒的制剂，在临床上应用广泛。动物实验证实，黄酮类物质能明显改善CCl4对大鼠造成的肝组织细胞脂肪变和弥漫性大片状坏死，同时，脂多糖(LPS)诱导肿瘤坏死因子（TNF）的产生过多，造成对肝细胞[54-56]的破坏，黄酮类也可抑制这一过程。抑制肝微粒体细胞色素P450含量及活性，从而抑制了酒精在体内的异常代谢途径，使通过异常途径产生的过氧化物，自由基，各种[46]细胞因子，炎症介质等减少，因而起到对肝的保护作用。9 河北大学医学硕士学位论文黄酮类物质还能使受损肝细胞中的蛋白合成增加，同时，竞争性结合细胞膜上的受体，阻止毒素类物质与细胞膜的结合，促进肝细胞的恢复，进而肝功能得到恢复。10 第一章文献综述参考文献[1]LalloyerF,WoutersK,BaronM,etal.Peroxisomeproliferator-activatedreceptor-alphageneleveldifferentlyaffectslipidmetabolismandinflammationinapolipoproteinE2knock-inmice[J].ArteriosclerThrombVascBiol,2011,31(7):1573-1579.[2]ZhuL,WangL,WangX,HepaticDeletionofSmad7inMouseLeadstoSpontaneousLiverDysfunctionandAggravatesAlcoholicLiverInjury[J].PLoSOne,2011,6(2):177-187.[3]LieberCS.Pathogenesisandtreatmentofalcoholicliverdiseaseprogressoverthelast50years[J].RoczAkadMedBialymst,2005,50(3):7-20.[4]GateL,PaulJ,BaGN,etal.Oxidativestressinducedinpathologies:theroleofantioxidants[J].BiomedPharmacother,1,53(4):169-180.[5]RouachH,FataccioliV,GentilM,etal.Effectofchronicethanolfeedingonlipidperoxidationandproteinoxidationinrelationtoliverpathology.[J]Hepatology.1997;25(2):351-355.[6]YouM,CrabbDW.RecentAdvancesinAlcoholicLiverDiseaseII.Minireview:molecularmechanismsofalcoholicfattyliver[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2004,287(1):1-6.[7]JiC,Mehrian-ShaiR,ChanC,etal.RoleofCHOPinHepaticApoptosisintheMurineModelofIntragastricEthanolFeeding[J].AlcoholClinExpRes,2005,29(8):1496-503.[8]ChaudierJ,Ferrari-IliouR.Intracellularantioxidants:fromchemicaltobiochemicalmechanisms[J].FoodandChemicalToxicology,1999,37(9-10):949-962.[9]ParkEJ,JeonCH,KoG,etal.Protectiveeffectofcurcumininratliverinjuryinducedbycarbontetrachloride[J].JournalofPharmacyandPharmacology,2000,52(4):437-440.[10]NatoriS,RustC,StadheimLM,etal.Hepatocyteapoptosisisapathologicfeatureofalcoholichepatitis[J].JournalofHepatology,2001,34(2):248-253.[11]JinWP,QuanXQ.MengFP,etal.Relationshipamonghepatocyteapoptosis,P4502E1andoxidativestressinalcoholicliverdiseaseofrats[J].ZhongguoWeiZhongBingJiJiuYiXue,2007,19(7):419-421.[12]DeaciucIV,D'SouzaNB,BurikhanovR,etal.Inhibitionofcaspasesinvivoprotectstheratliveragainstalcohol-inducedsensitizationtobacteriallipopolysaccharide[J].ClinicalandExperimentalResearch,2001,25(6):935-943.[13]ChalasaniN,YounossiZ,LavineJE,etal.TheDiagnosisandManagementofNon-alcoholicFattyLiverDisease:PracticeGuidelinebytheAmericanAssociationfortheStudyofLiverDiseases,AmericanCollegeofGastroenterology,andtheAmericanGastroenterologicalAssociation[J].AmJGastroenterol,2012,3(4):128-130.[14]GalliA,CrabbD,PriceD,etal.Peroxisomeproliferator-activatedreceptorgammatranscriptionalregulationisinvolvedinplatelet-derivedgrowthfactor–inducedproliferationofhumanhepaticstellatecells[J].Hepatology,2000,31(1):101-108.11 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第一章文献综述[31]BorrgsE,CouteileC,RosellA,etal.GeneticpolymorphismofalcoboldehydrogenaseinEuropeans:TheADH2alleledecreasestheirskforalcoholism[J].Hepatology,2000,3l(4):984-989.[32]BruixJ,ShermanM;AmericanAssociationfortheStudyofLiverDiseases.Managementofhepatocellularcarcinoma:Anupdate[J].Hepatology,201153(3):1020–1022.[33]KonoH,RusynI,YinM,etal.NADPHoxidase–derivedfreeradicalsarekeyoxidantsinalcohol-inducedliverdisease[J].JClinInvest.,2000,106(7):867–872.[34]IakimchukGN,GendriksonLN.Studyofclinicalefficiencyofessentialphospholipidsandsilymarincombinationinnonalcoholicandalcoholicsteatohepatitis[J].EkspKlinGastroenterol,2011,11(7):64-69.[35]HardieWD,KorfhagenTR,SartorMA,etal.GenomicProfileofMatrixandVasculatureRemodelinginTGF-β-InducedPulmonaryFibrosis[J].AmJRespirCellMolBiol,2007,37(3):309-321.[36]StumptnerC,OmaryMB,FickertP,etal.HepatocyteCytokeratinsAreHyperphosphorylatedatMultipleSitesinHumanAlcoholicHepatitisandinaMalloryBodyMouseModel[J].AmJPathol,2000,156(1):77-90.[37]SlukvinII,BoorPJ,JerrellsTR,etal.Initiationofalcoholicfattyliverandhepaticinflammationwithaspecificrecallimmuneresponseinalcohol-consumingC57Bl/6mice[J].ClinExpImmunol,2001,125(1):123-33.[38]YouM,ConsidineRV,LeoneTC,etal.TheRoleofAdiponectinintheProtectiveActionofDietarySaturatedFatAgainstAlcoholicFattyLiverinMice[J].Hepatology,2005,42(3):568-577.[39]McMullenMR,PritchardMT,WangQ,etal.EarlyGrowthResponse-1TranscriptionFactorIsEssentialforEthanol-InducedFattyLiverInjuryinMice[J].Gastroenterology,2005,128(7):2066-2076.[40]RashidA,WuTC,HuangCC,etal.Mitochondrialproteinsthatregulateapoptosisandnecrosisareinducedinmousefattyliver[J].Hepatology,1999,29(4):1131-1138.[41]ZhouZ,SunX,LambertJC,etal.Metallothionein-IndependentZincProtectionfromAlcoholicLiverInjury[J].AmJPathol.2002,160(6):2267-2274.[42]DayCP,YeamanSJ.Thebiochemistryofalcohol-inducedfattyliver[J].BiochimBiophysActa.1994,1215(1-2):33-48.[43]CarrollM.Leevy,MD,ŞerbanA,etal.NutritionalAspectsofAlcoholicLiverDisease[J].ClinicsinLiverDisease,2005,9(1):67-81.[44]BergheimI,GuoL,DavisMA,etal.MetforminPreventsAlcohol-InducedLiverInjuryintheMouse:CriticalRoleofPlasminogenActivatorInhibitor-1[J].Gastroenterology,2006,130(7):2099-2112.[45]李伟平,任浩洋,张宝阳,等.VEGF在大鼠慢性酒精性肝损伤中的表达[J].世界华人消化杂志,2006,14(18):1766-1770.[46]卿笃信,凌奇荷.酒精代谢酶与酒精性肝病的关系研究进展[J].国外医学,2003,23(3):310-313.13 河北大学医学硕士学位论文第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用酒精性肝病：是由于短期大量或长期饮酒引起的肝功能代谢紊乱，其发病机制尚待研究，目前缺乏有效的治疗手段，组织病理学以肝细胞脂肪变性，坏死，纤维组织增生，炎细胞浸润为特征，常伴有肝功能生化指标的异常，最终导致肝硬化，肝功能衰竭的临床综合征。目前的治疗方法包括完全戒酒、高营养支持、糖皮质激素、抗氧化剂、抗细胞因子等治疗，但这些药物总体疗效差，副作用明显，费用高，给患者家属和社会造成沉重的负担。酢浆草（OxaliscomiculataL）,为酢浆草科植物酢浆草的全草，其味酸、凉，也称为酸浆草，三叶草，具有清热解毒，抗炎、抗毒素等作用，民间用于急性肝炎、急性黄疸的治疗，取得了良好的效果。酢浆草总提物是将酢浆草干粉浸于70%甲醇中提取的有效成分，主要含有：总黄酮，有机酸类及脂质等。本研究以短期大量饮酒导致的酒精性肝病大鼠作为模型，观察酢浆草对酒精性肝病的防治效果，并且初步探讨酢浆草防治急性酒精性肝病的作用机制，为临床合理用药提供更科学、更可靠的理论基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物健康清洁级SD雄性大鼠68只，体重为110g±10g，购自河北医科大学实验动物中心，动物合格证号：2011-0519。饲养于我校实验动物室，室温，自由饮水、摄食。1.1.2实验试剂酢浆草总提物酢浆草总提物是将酢浆草干粉浸于70%甲醇中提取、蒸干后的有效成分，主要含有：总黄酮，有机酸类及脂质等，黄酮含量为0.5%。牛栏山北京二锅头，56º；醋酸强的松片，阳性对照药，购自天津太平洋制药有限公司，批号为100157；SOD、MDA、ADH试剂盒均购自南京建成生物工程公司，AST(aspertateaminotransferase)、ALT(alanineaminotransferase)、AKP(alkalinephosphatase)、GGT(gamma-glutamyltranspeptidase)试剂盒购自南京建成生物工程公司，TNF-a试剂盒、ALDH试剂盒购自上海立博生物工程公司。14 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用1.1.3实验仪器KD-MB生物组织包埋机（浙江金华科迪仪器设备有限公司生产），WFZUV-2000紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司生产），RM2126石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司生产），全自动生化分析仪，AXIOSTARPLUS生物显微镜（德国CARLZEISS公司生产），GL-16G-Ⅱ高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂生产）；DHG-9143BS-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造公司生产）；PT-MR2100组织匀浆器（瑞士Kinematica公司生产）。1.2实验方法[4]1.2.1动物分组及模型建立健康清洁级雄性SD大鼠68只随机分为5组，正常组20只，模型组，酢浆草中剂量组，酢浆草高剂量组和阳性药物对照组各12只。牛栏山北京二锅头灌胃，8ml/kg/次，2/d，12周造模完成后，正常组处死10只，其余各组随机处死2只，观察造模效果。造模后第二天开始灌胃给药。1.2.2给药方法醋酸强的松和酢浆草总提物用蒸馏水配置成混悬液，造模后第二天开始灌胃给药。酢浆草中剂量组给予酢浆草总提取物3.5g/kg/d，酢浆草高剂量组给予酢浆草总提取物7.0g/kg/d，阳性药物对照组给予醋酸强的松0.9mg/kg/d，模型组给予等体积的生理盐水。各组大鼠每周称量1次体重，实验期间，大鼠自由饮水、摄食，造模完成后，正常组10只，其余各组随机取2只大鼠取血，处死大鼠并取肝组织，12周造模完成时，取血，18周再次取血后处死动物，取肝组织。1.2.3肝组织的采集各组大鼠12周造模完成时，18周时，10%水合氯醛麻醉，完整分离肝组织，迅速称重，整个过程在冰上操作，剪取部分肝右叶放入10%甲醛中固定，剩余肝组织放入冻存管中液氮速冻后，保存于-70℃冰箱中备用。1.2.4各项指标的检测(1)大鼠每周体重变化实验期间每周定期测大鼠体重变化，比较各组间大鼠的体重变化有无统计学意义。(2)大鼠肝系数测定15 河北大学医学硕士学位论文大鼠处死后，完整分离肝组织，称量后计算肝系数。计算公式如下：肝系数=肝重量（g）/体重（kg）(3)制备切片肝组织经10%甲醛浸泡48h后，行梯度乙醇脱水处理，常规液体石蜡包埋，切片机切片，厚度约5um，存于4ºC保鲜冰箱，供HE染色使用。(4)HE染色步骤脱蜡：把切片置于二甲苯Ⅰ15min↓二甲苯Ⅱ15min↓梯度乙醇脱水：无水乙醇Ⅰ5min↓无水乙醇Ⅱ5min↓95%乙醇2min↓85%乙醇2min↓蒸馏水浸洗1min↓染色：苏木素染色2min，自来水反复冲洗↓分色液（1%盐酸乙醇）5sec，自来水冲洗↓氨水溶液反蓝，自来水冲洗↓伊红染色30sec，自来水冲洗16 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用↓梯度乙醇脱水：80%乙醇30sec↓95%乙醇30sec↓无水乙醇Ⅰ1min↓无水乙醇Ⅱ1min↓透明：二甲苯Ⅰ5min↓二甲苯Ⅱ5min↓中性树胶封片(5)肝脂肪变细胞计数和炎症细胞计数在显微镜下每组选取30个视野，进行肝脂肪变细胞计数，炎症细胞浸润程度计数。统计脂肪变得分，炎症浸润程度得分，计分方法如下：脂肪变得分：0分为小于5%的肝细胞脂肪变；1分为5%~33%的肝细胞脂肪变；2分为33%~66%的肝细胞脂肪变；3分为66%~75%的肝细胞脂肪变；4分为75%以上的肝细胞脂肪变。炎症浸润程度得分：0分为间质无炎症和坏死；1分为少量炎细胞浸润，坏死不明显或仅有1个坏死区域；2分为炎细胞广泛浸润，可见2个坏死区域；3分为大量炎细胞广泛浸润，可见3个或3个以上坏死区域。(6)生化指标测定把肝组织从-70℃低温冰箱中取出，放入0℃的生理盐水中漂洗，剪碎，称取肺组织0.1g，加生理盐水适量，制成5%的组织匀浆，离心：3000r/min，10min，取上清液进行相关指标的测定。肝组织匀浆中SOD含量的测定试剂的组成与配制17 河北大学医学硕士学位论文试剂1：贮备液10ml×1瓶，使用时若有结晶析出需先溶解，每瓶贮备液加蒸馏水稀释至100ml即配制成试剂1应用液，4℃贮存；试剂2：液体10ml×1瓶，（4～10）℃贮存；试剂3：液体10ml×1瓶，（4～10）℃贮存；试剂4：液体350μl×2支，4℃贮存，不可冷冻，4号稀释液5ml×2瓶，4℃贮存，用时二者按1：14稀释，配好的试剂四4℃贮存；试剂5：粉剂×1支，用时加（70～80）℃双蒸水75ml溶解后备用，配好后4℃避光冷藏贮存；试剂6：粉剂×1支，用时用蒸馏水75ml溶解后备用，配好后的试剂4℃避光贮存；配制显色剂：按照试剂5：试剂6：冰乙酸=3：3：2的体积比配成显色剂，配好后的显色剂4℃避光贮存。操作步骤表1SOD操作步骤试剂测定管对照管试剂1（ml）1.01.0样品（ul）50μl-蒸馏水（ml）-50μl试剂2（ml）0.10.1试剂3（ml）0.10.1试剂4（ml）0.10.1用旋涡混均器充分混匀，置37．0℃恒温水浴40分钟显色剂（ml）22混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，lcm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。注：最佳样品取样量的选择：因样品种类不同，其SOD活力不同，导致测定样品取样量不同。因此，需做3只不同取样量的测试管，取样量分别为10ul、30ul、50ul，计算（对照管OD值-测定管OD值）/对照管OD值，其结果在0.48~0.50之间的一管为最佳取样量。18 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用结果计算组织匀浆中SOD活力（U/mgprot）=（对照管OD值-测定管OD值/对照管OD值）÷50%×（反应液总体积/取样量(ml)）÷组织中蛋白含量（mgprot/ml）。肝组织匀浆中MDA含量的检测试剂的组成与配制试剂1：液体20ml×1瓶，室温贮存(低温时会凝固，每次测试前适当水浴加温溶解，直至完全透明方可使用)；试剂2：液体12ml×1瓶，用时每瓶加340ml双蒸水混匀，4℃贮存；试剂3：粉剂×1支，用时将粉剂加入到90~100℃的双蒸水60ml中，充分溶解后用双蒸水补足至60ml再加冰醋酸60ml，充分混匀，配好的试剂避光4℃冷藏；标准品：10nmol/ml四乙氧基丙烷5ml×1瓶，4℃贮存。操作步骤表2MDA操作步骤标准管标准空白管测定管测定空白管10nmol/ml标准品（ml）0.2---无水乙醇（ml）-0.2--测试样品（ml）--0.20.2试剂1（ml）0.20.20.20.2混匀试剂2（ml）3333试剂3（ml）111150%冰醋酸（ml）---1旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40分钟，取出后流水冷却，然后3500~4000转/分，离心10分钟，取上清，532nm处，lcm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。结果计算19 河北大学医学硕士学位论文组织中MDA含量（nmol/mgprot）=（测定管OD值-标准空白管0D值/标准管OD值-标准空白管OD值）×标准品浓度（10nmol/ml）÷蛋白含量（mgprot/ml）。组织匀浆ADH的测定试剂的组成与配制1.试剂1:40ml×1瓶，4℃贮存；应用液的配制：临用前用双蒸水1:1稀释混匀。2.试剂2:20ml液体×1瓶，4℃贮存。3.试剂3：粉剂×8瓶，-20℃以下贮存。试剂3应用液的配制：临用前每瓶用10ml的双蒸水溶解混匀，-20℃以下贮存。操作步骤组织匀浆：直接取原液进行检测表3ADH操作步骤空白管测定管试剂1应用液（ml）0.700.65试剂2（ml）0.050.05试剂3应用液（ml）0.750.75充分混匀，置37．0℃恒温水浴10分钟待测液（ml）0.05加入样本的同时开始计时，充分混匀，15秒时，340nm处，0.5cm光径，测定OD值A1，迅速将反应液置于37．0℃恒温水浴锅中，20分15秒时取出，测定OD值A2。结果计算ADH活力（U/ml）=[测定(A2-A1)-空白(A2-A1)]÷6.22÷0.5反应液总体积（ml）÷样本量（ml）÷反应时间×1000。组织匀浆ALDH的测定试剂的组成与配制20 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用表4ALDH操作步骤酶标板96孔检测稀释液A10ml标准品2瓶检测稀释液B10ml样品稀释液20ml检测溶液A120ul底物溶液10ml检测溶液B120ul终止液10ml浓洗涤液30ml组织匀浆的制备同上。标准品（冻干粉）2瓶，每瓶使用前用样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒、搓动促进干粉溶解，浓度为100ng/ml，做系列倍比稀释，分别稀释到100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml,6.25ng/ml，3.12ng/ml，样品稀释直接作为标准浓度0ng/ml，临用前配制。检测溶液A的配制:临用前与检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量进行配制，实际配置时应多配制0.1-0.3ml，如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配比，充分混匀，配制后应尽快使用。检测溶液B的配制同检测溶液A。浓洗涤液：使用时每瓶加蒸馏水稀释25倍方可使用。操作步骤1.加样分别设空白孔，标准孔，待测样品孔，空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，加样时将样品尽量加于酶标板孔底部，避免碰触孔壁，充分晃动混匀，在酶标板加上覆加薄膜，37℃反应2小时。2.弃去液体，吸干，不用洗涤，每孔加检测溶液A工作液100ul，（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液的比例配制），37℃反应1小时。3.弃去孔内液体，吸干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/孔，吸干。4.每孔加检测液B工作液100ul，37℃反应1小时。5.弃去孔内液体，吸干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/孔，吸干。6.依次每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色。（约30分钟内，肉眼即可见标准品的前3-4孔有显著的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显即可停止反应）。21 河北大学医学硕士学位论文7.依次每孔加终止液50ul，终止反应，此时蓝色立即转为黄色，终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入保持顺序相同。8.用酶标仪测定在450nm波长各孔的OD值，应在终止液加入后15分钟内测定。结果计算以标准物的浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，在半对数坐标纸上绘制坐标曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出对应的浓度，再乘以稀释倍数，或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。(7)免疫组化操作步骤（TNF-a）将切片50℃热固定2min↓4%多聚甲醛PBS固定25min，蒸馏水洗↓3%H2O2室温下孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，3min×3次↓滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min↓倾去血清，不洗，滴加一抗（1:50），湿盒内4℃过夜↓取出湿盒，室温放置30min，PBS冲洗，3min×3次↓滴加生物素化二抗工作液，湿盒内37℃孵育15min，PBS冲洗，3min×3次↓滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，湿盒内37℃孵育15min，PBS冲洗，3min×3次↓DAB显色（1ml双蒸水pH约7.0，加入一滴约50mml试剂A(浓缩缓冲液)，混合均匀，然后将试剂B和试剂C各一滴加入其中，再次混匀。必要时可过滤此溶液。此溶液必须现配现用，配好后避光保存，30min内使用，剩余的液体应弃去），显微镜下控制显色程度，自来水冲洗22 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用↓苏木素染色20sec，自来水反复冲洗↓1%盐酸酒精分化，自来水冲洗↓氨水溶液反蓝，自来水冲洗↓梯度乙醇脱水：80%乙醇1min，95%乙醇1min，无水乙醇Ⅰ1min，无水乙醇Ⅱ2min↓二甲苯Ⅰ透明1min，二甲苯Ⅱ透明2min↓中性树胶封片。阴性对照用0.01PBS代替一抗，其余步骤同上。1.2.5数据处理采用SPSS17.0统计学软件进行相关数据的处理，总体进行单因素方差分析，组间比较用LSD法，结果以`c±s表示。P＜0.05即为差异有统计学意义。2实验结果2.1形态学结果2.1.1HE染色结果12周造模完成后，显微镜下观察示：正常对照组肝细胞排列整齐，肝细胞周围间质结构正常，未见炎症细胞浸润。模型组肝细胞呈大泡样脂肪改变，伴少量肝细胞呈小泡状脂肪变，间质伴大量炎细胞浸润，未见纤维结构增生。18周，显微镜下观察示：正常对照组肝细胞排列整齐，肝细胞周围间质结构正常，未见炎症细胞浸润。模型组肝细胞呈大泡样脂肪改变，伴少量肝细胞呈小泡状脂肪变，间质伴大量炎细胞浸润，未见纤维结构增生。强的松组脂肪变肝细胞无明显改变，炎性细胞浸润明显减轻，未见纤维组织结构增生。23 河北大学医学硕士学位论文结果见图1-1到1-7。图1-112周正常组（HE,×160）图1-212周模型组（HE,×160）图1-318周正常组（HE,×160）图1-418周强的松组（HE,×160）图1-518周酢浆草高剂量组（HE,×160）图1-618周酢浆草中剂量组（HE,×160）图1-718周模型组（HE,×160）24 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用2.1.2脂肪变肝细胞和炎症程度计数结果实验过程中，强的松组死亡1只，模型组、酢浆草高剂量组死亡2只。12周造模完成时，与正常组相比，模型组、酢浆草中、高剂量组、强的松组肝细胞脂肪变程度、炎症细胞浸润程度明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；18周即治疗6周后，与模型组相比，酢浆草中、高剂量组、强的松组肝细胞脂肪变程度、炎症细胞浸润程度，差异有统计学意义（P＜0.05）。与强的松组相比，酢浆草中、高剂量组肝细胞脂肪变程度、炎症细胞浸润程度变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表5-1，表5-2和图2-1，图2-2，图2-3，图2-4。表5-1各组大鼠12周肝组织脂肪变和炎症程度计分情况的比较（`c±S）组别例数脂肪变程度计分炎症程度计分正常组100.95±0.050.52±0.03模型组83.57±0.86*1.94±0.74*注：*与正常组比较：P<0.05。表5-2各组大鼠18周肝组织脂肪变和炎症程度计分情况的比较（`c±S）组别例数脂肪变程度计分炎症程度计分正常组100.94±0.070.52±0.04模型组83.57±0.911.94±0.73▲▲中剂量组92.04±0.791.22±0.75▲▲高剂量组81.98±0.850.95±0.69▲▲强的松组93.22±0.790.71±0.55▲注：与模型组比较：P<0.05。25 河北大学医学硕士学位论文5*43脂肪变计分12周210正常组模型组图2-112周大鼠肝细胞脂肪变程度比较注：*与正常组比较：P<0.05。54▲▲正常组3模型组脂肪变计分▲酢浆草中剂量组酢浆草高剂量组2强的松组1018周图2-218周各组大鼠肝细胞脂肪变程度比较▲注：与模型组比较：P<0.05。26 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用3*2.52炎症程度计分1.512周10.50正常组模型组图2-312周大鼠炎症细胞浸润程度比较注：*与正常组比较：P<0.05。1.6▲▲1.41.2▲炎1正常组症模型组程0.8酢浆草中剂量组度计酢浆草高剂量组0.6强的松组分0.40.2018周图2-418周各组大鼠炎症细胞浸润程度比较▲注：与模型组比较：P<0.05。2.2大鼠体重及肝系数变化2.2.1大鼠体重称量的结果实验过程中，强的松组死亡1只，模型组、酢浆草高剂量组死亡2只。实验期间测量大鼠第1天，第12周，第18周时的体重，1d时，各组之间均无差异（P＞0.05）；12周时，大鼠造模完成，与正常组相比，模型组、酢浆草中、高剂量组、强的松组大鼠的27 河北大学医学硕士学位论文体重明显偏低，有统计学差异（P＜0.05）；18周时，模型组体重增长最为缓慢，正常组大鼠体重增长最快，模型组、酢浆草中、高剂量组、强的松组各组增长居中，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，酢浆草中、高剂量组、强的松组大鼠体重升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与强的松组相比，酢浆草中、高剂量组大鼠体重变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表6和图3。表6各组大鼠体重变化表（`c±S）组别例数第1d（g）第12周（g）第18周（g）正常组10143.41±9.13439.32±39.17501.32±40.13模型组8147.02±7.39240.02±39.45*270.53±43.29酢浆草中剂量组▲9141.02±10.39310.14±39.01*350.82±41.34酢浆草高剂量组8144.19±10.05309.51±41.42▲▲*370.44±43.95强的松组9147.18±10.24311.78±40.92▲*340.75±45.24▲▲▲注：*与正常组比较：P<0.05；与模型组比较：P<0.05，与模型组相比：P<0.01。600500▲▲▲▲400正常组***模型组体重（g）300*酢浆草中剂量组酢浆草高剂量组强的松组20010001天12周18周图3各组大鼠体重变化比较▲▲▲注：*与正常组比较：P<0.05；与模型组比较：P<0.05，与模型组相比：P<0.01。2.2.2大鼠肝系数的比较结果28 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用实验过程中，强的松组死亡1只，模型组、酢浆草高剂量组死亡2只。12周即造模完成时，与正常组相比，模型组、酢浆草中、高剂量组、强的松组肝系数明显偏高，差异有统计学意义（P＜0.05）。18周时，与模型组相比，酢浆草中、高剂量组、强的松组肝系数下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与强的松组相比，酢浆草中、高剂量组肝系数变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表7-1，表7-2和图4。表7-112周各组大鼠肝系数比较（`c±S）组别例数第12周正常组103.02±0.44模型组86.17±0.94*注：与正常组比较：*P<0.05。表7-2各组大鼠肝系数比较（`c±S）组别例数第18周正常组103.85±0.37模型组86.94±0.85▲酢浆草中剂量组95.03±0.72▲酢浆草高剂量组84.97±0.85▲阳性药物对照组94.74±0.15▲注：与模型组比较：P<0.05。29 河北大学医学硕士学位论文8*765肝系数412周3210正常组模型组图4-112周大鼠肝系数比较注：*与正常组比较：P<0.05。987▲▲6正常组▲肝模型组5系酢浆草中剂量组数4酢浆草高剂量组3强的松组21018周图4各组大鼠肝系数比较▲注：与模型组比较：P<0.05。2.3生化指标检测结果2.3.1血清学指标检测结果实验过程中，强的松组死亡1只，模型组、酢浆草高剂量组死亡2只。18周，生化指标的检测结果显示：与模型组相比，酢浆草中、高剂量组、强的松组SOD升高，MDA30 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与强的松组相比，酢浆草中、高剂量组SOD、MDA变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表8-1，表8-2，图5-1，图5-2。18周，血清学指标的检测结果显示：18周与模型组相比，酢浆草中、高剂量组、强的松组AST、ALT、AKP、GGT显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与强的松组相比，酢浆草中、高剂量组AST、ALT、AKP、GGT变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表9-1，表9-2，图6-1，图6-2，图6-3，图6-4。表8-112周酢浆草总提物对大鼠血清SOD、MDA的影响（`c±S）组别例数SODMDA-1-(U·mg)(mmol·mg正常组20170.25±14.101.85±0.58模型组1275.14±9.16*3.35±0.77*中剂量组1273.82±9.45*3.50±0.81*高剂量组1270.38±8.99*3.44±0.79*阳性组1272.42±9.05*3.07±0.82*注：*与正常组比较：P<0.05。表8-218周酢浆草总提物对大鼠血清SOD、MDA的影响（`c±S）组别例数SODMDA-1-1正常组10165.64(U±mg15.17)(mmol1.85±0.66mg)模型组880.64±13.453.17±0.61▲▲中剂量组9136.07±11.792.05±0.64▲▲▲高剂量组8137.03±12.032.13±0.62▲▲▲阳性组9154.27±13.581.85±0.79▲▲▲注：*与正常组比较：P<0.05，；与模型组比较：P<0.05，与模型组比较：P<0.01。31 河北大学医学硕士学位论文200180▲▲▲▲160140正常组120模型组SOD(U/mg)100酢浆草中剂量组***80*酢浆草高剂量组强的松组604020012周18周图5-1各组大鼠血清SOD比较▲▲▲注：*与正常组比较：P<0.05，；与模型组比较：P<0.05，与模型组比较：P<0.01。5***4*正常组3▲▲▲▲模型组MDA(mmol/mg)酢浆草中剂量组酢浆草高剂量组2强的松组1012周18周图5-2各组大鼠血清MDA比较▲▲▲注：*与正常组比较：P<0.05，；与模型组比较：P<0.05，与模型组比较：P<0.01。32 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用表9-112周酢浆草总提物对大鼠血清肝功能比较（`c±S，U/L）组别例数ALTASTAKPGGT正常组2024.82±6.0361.59±13.8161.75±19.0314.29±5.14模型组1270.14±10.16**220.75±26.91*194.52±37.21*112.95±14.51*中剂量组1269.37±11.43*237.18±25.74*199.04±31.85*107.96±11.53*高剂量组1270.49±10.16*224.51±27.16*187.16±35.07*118.01±17.31*强的松组1272.40±10.41**229.49±30.27*190.84±34.73*109.57±15.74*注：*与正常组比较：P<0.05，**与正常组比较：P<0.01。表9-218周酢浆草总提物对大鼠血清肝功能比较（`c±S，U/L）组别例数ALTASTAKPGGT正常组1026.03±5.2769.31±15.6262.47±19.4621.04±5.56模型组859.14±9.52201.62±17.95169.39±37.2189.37±12.49中剂量组936.34±9.31▲157.23±24.09▲116.37±29.35▲55.14±12.65▲高剂量组833.51±11.64▲▲117.38±22.75▲95.19±24.85▲▲46.54±14.55▲强的松组933.02±10.04▲▲149.43±31.79▲105.14±26.22▲51.72±12.22▲▲▲▲注：与模型组比较：P<0.05，与模型组比较：P<0.01。90*****80*7060正常组50▲▲▲模型组ALT(U/L)▲▲酢浆草中剂量组40酢浆草高剂量组30强的松组2010012周18周图6-1各组大鼠ALT比较▲▲▲注：*与正常组比较：P<0.05，**与正常组比较：P<0.01，与模型组比较：P<0.05，与模型组比较：P<0.01。33 河北大学医学硕士学位论文300****250200▲▲正常组▲模型组AST(U/L)150酢浆草中剂量组酢浆草高剂量组100强的松组50012周18周图6-2各组大鼠AST比较▲注：*与正常组比较：P<0.05，与模型组比较：P<0.05。250****200▲正常组150▲模型组▲▲AKP(U/L)酢浆草中剂量组酢浆草高剂量组100强的松组50012周18周图6-3各组大鼠AKP比较▲▲▲注：*与正常组比较：P<0.05，与模型组比较：P<0.05，与模型组比较：P<0.01。34 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用160140****120正常组100模型组GGT(U/L)80酢浆草中剂量组▲▲▲酢浆草高剂量组60强的松组4020012周18周图6-4各组大鼠GGT比较▲注：*与正常组比较：P<0.05，与模型组比较：P<0.05。2.3.2组织匀浆指标检测结果实验过程中，强的松组死亡1只，模型组、酢浆草高剂量组死亡2只。12周时，与正常组相比，模型组、酢浆草中、高剂量组、强的松组ADH、ALDH明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。18周时，与模型组相比，酢浆草中、高剂量组、强的松组ADH、ALDH显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与强的松组相比，酢浆草中、高剂量组ADH、ALDH变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表10-1，表10-2，图7-1，图7-2。表10-112周酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠组织匀浆中ADH、ALDH的影响（`c±S，n=8）组别例数ADHALDH正常组203.67±1.249.04±1.83模型组121.74±0.97*4.01±1.20*中剂量组121.92±0.91*3.97±1.94*高剂量组121.67±0.90**4.84±1.05*强的松组121.71±1.24*3.54±1.42**注：*与正常组比较：P＜0.05；**与正常组比较：P＜0.01。35 河北大学医学硕士学位论文表10-218周酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠组织匀浆中ADH、ALDH的影响（`c±S，n=8）组别例数ADHALDH正常组103.54±0.948.47±1.45模型组82.05±0.915.71±1.33▲▲中剂量组93.23±0.847.59±1.95▲▲高剂量组83.48±0.717.51±1.05▲▲强的松组93.52±0.998.14±1.57▲注：与模型组比较：P＜0.05。65▲▲▲4正常组模型组*ADH3****酢浆草中剂量组酢浆草高剂量组强的松组21012周18周图7-1各组大鼠肝组织ADH比较▲注：*与正常组比较：P<0.05，**与正常组比较：P<0.01，与模型组比较：P<0.05。36 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用1210▲▲▲8正常组模型组ALDH6**酢浆草中剂量组***酢浆草高剂量组4强的松组2012周18周图7-2各组大鼠肝组织ALDH比较▲注：*与正常组比较：P<0.05，**与正常组比较：P<0.01，与模型组比较：P<0.05。2.4TNF-a在肝组织中免疫组化结果TNF-a表达阳性反应物质呈棕黄色，主要位于Kupffer细胞胞浆中，并可见细胞膜表达。正常组大鼠Kupffer细胞TNF-a免疫组化染色显示，TNF-a几乎不表达；模型组18周Kupffer细胞TNF-a出现了强阳性表达。强的松组和酢浆草高剂量组18周大鼠肝组织Kupffer细胞TNF-a也出现了弱阳性表达。结果见图8。图8-1（×320）图8-2（×320）37 河北大学医学硕士学位论文图8-3（×640）图8-4（×640）图8-5（×320）图8-1：18周模型组；图8-2：18周正常组；图8-3：18周强的松组；图8-4：18周酢浆草高剂量组;2.5TNF-a免疫组化染色结果用方差分析进行各组间平均光密度分析，结果显示：实验过程中，强的松组死亡1只，模型组、酢浆草高剂量组死亡2只。18周，与模型组相比，酢浆草中、高剂量组、强的松组TNF-a呈弱表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。与强的松组相比，酢浆草中、高剂量组TNF-a表达变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表11，图9。表11酢浆草免疫组化染色18周光密度结果（`c±S）组别例数18周正常组100.0044±0.0054模型组80.0981±0.0026▼强的松组90.0795±0.0063▼酢浆草高剂量组80.0674±0.0038▼注：与18周模型组相比，P＜0.05。38 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用0.120.1▼▼0.08正常组模型组平均光密度0.06强的松组酢浆草高剂量组0.040.02018周图9各组大鼠肝组织中TNF-a的比较3讨论酒精性肝病：是由于短期大量或长期饮酒引起的肝功能代谢紊乱，其发病机制尚待研究，目前缺乏有效的治疗手段，组织病理学以肝细胞脂肪变性，坏死，纤维组织增生，炎细胞浸润为特征，常伴有肝功能生化指标的异常，最终导致肝硬化，肝功能衰竭的临[1]床综合征。酢浆草（OxaliscomiculataL）,为酢浆草科植物酢浆草的全草，其味酸、凉，也称为酸浆草，三叶草，具有清热解毒，抗炎、抗毒素等作用，民间用于急性肝炎、急性黄疸的治疗，取得了良好的效果。酢浆草总提物是将酢浆草干粉浸于70%甲醇中提取的有[2]效成分，主要含有：总黄酮，有机酸类及脂质等。采用酒精灌胃大鼠制造酒精性肝病模型，目前酒精的度数、用量、灌胃时间尚不统一，本研究通过参考大量的文献，采用了时间、剂量相对居中的模型，并通过12周造模后，采血检测肝功能指标，具有统计学意义，制作肝组织HE染色切片可见大泡型脂肪细胞明显增加，并伴有小泡型脂肪细胞和印戒细胞，正常组和其它组肝系数的比较，[3-4]具有统计学意义。探讨酢浆草总提物防治酒精性肝病的机制，酢浆草总提物可使动物长期灌胃酒精后造成的红细胞增大有所改善，可能的机制与酢浆草总提物含有维生素、蛋白类营养物质有关。通过检测酒精造模大鼠的肝功能，发现较模型组相比，酢浆草中高剂量组肝功有显著的改善，经统计学分析具有统计学意义，现初步认为酢浆草总提物含有一定的黄酮39 河北大学医学硕士学位论文成分，它通过降低自由基对细胞膜、线粒体的损伤，保护了细胞的完整性，使胞内德各[5-7]种溶酶不能发挥作用，各种免疫应答未被激活，从而成为有效的肝细胞保护性物质。本实验通过检测SOD、MDA活性，进一步在过氧化损伤方面对酢浆草总提物的有效成分做了初步分析，在应用酢浆草总提物12周后，检测大鼠血清中SOD、MDA的含量，发现血清中SOD的含量较模型组明显升高，有统计学意义。但于正常组大鼠SOD的含量水平相比，也有明显差异，同样，作为反映机体细胞损伤程度和过氧化程度的指标MDA,较模型组相比，也有显著的降低。从而，酢浆草总提物起到了抗自由基的作用，降低氧自由基、过氧化氢（H2O2）等氧应激产物，可保护肝细胞免受自由基的损伤。本实验通过检测ADH、ALDH等参与乙醇代谢的关键酶活性，发现：在酢浆草总提物灌胃治疗6周后，ADH、ALDH的酶活性较模型组显著提高，去除对细胞毒性作用更加强的乙醛，对细胞而言，保护作用更加显著。乙醛可作为半抗原激活机体的免疫反应，级联反应的结局是大量细胞的损伤。凋亡甚至死亡。ALDH活性增强抑制了这一过程。本实验采用了免疫组化的方法，检测到12周时TNF-a在模型组、酢浆草高剂量组、强的松组呈现高表达，经过一段时间的治疗后，TNF-a在酢浆草组、强的松药物组的表达较前明显减弱。酢浆草总提物能有效抑制酒精性肝病的进程也有一定的形态学基础，采用酢浆草总提物灌胃治疗6周后，取大鼠肝组织行HE染色，结果发现，脂肪变细胞较前明显减少，肝细胞间质中的炎症细胞较前也明显减少，从而肯定了酢浆草总提物对ALD的治疗效果，为进一步提纯酢浆草奠定了基础。4结论:1.酢浆草总提物可以显著降低AST、ALT、AKP、GGT的水平，减少对肝细胞的破坏，对酒精性肝病起到治疗作用。2.酢浆草总提物可以显著降低MDA的水平，升高SOD、ADH、ALDH的水平，其机制可能与减轻自由基对肝组织结构的氧化损伤有关。3.酢浆草总提物可以显著降低TNF-a在巨噬细胞胞浆及部分细胞膜的表达。40 第二章酢浆草总提物对酒精性肝病大鼠的治疗作用参考文献[1]张宇,陈韶华,丁伟等.酒精性肝病大鼠肝脏组织中铁的测定[J].浙江医学,2010,26(3):190-191.[2]NatoriS,RustC,StadheimLM,etal.Hepatocyteapoptosisisapathologicfeatureofalcoholichepatitis[J].JournalofHepatology,2001,34(2):248-253.[3]LudwigJ,HashimotoE,PoraykoMK.Hemosiderosisincirrhosis:astudyof447nativelivers[J].Gastroenterology,2007,112(3):882-888.[4]鲁晓岚,罗金燕,胡长根,等.三种大鼠脂肪肝模型的比较[J].胃肠病学和肝病学杂志,2005,14(3):243-248.[5]IkejimaK,LangT,ZhangYJ.Expressionofleptinreceptorsinhepaticsinusoidalcells[J].CompHepatol,2009,3(9):12-15.[6]YuC,LiY,ChenW,etal.GenotypcofethanolmetabolizingenzymegenesbyoligonucleotidemicroarrayinalcoholicliverdiseaseinChinesepeople[J].ChinMedJ,2002,115(7):1085-1087.[7]FinottoS,SieblerJ,HansdingM.Severhepaticinjuryininterleukin-18(IL-18)transgenicmice:akeyroleforIL-18inregulatinghepatocyteapoptosisinvivo[J].Gut,2004,53(3):392-400.41 河北大学医学硕士学位论文致谢本论文是在导师丁良教授的悉心指导和基础医学院的段斐老师、周玉娟老师、孟明老师、曹志然老师的耐心帮助下完成的，在整个研究过程中各位老师倾注了大量的心血和精力，从课题的选择到项目的最终完成，都始终给予我细心的指导和不懈的支持。三年来，使我不止在学业上收获了很多，同时还在思想、工作上和生活上给了我无微不至的关怀，在此谨向各位老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。三年的学习使我深切感受到集体的力量。感谢对本实验室的李少春、刘莉、高文、李静、刘未华、任明等同学在实验中给予的帮助和支持表示深深的感谢！在以上这些老师和同学的大力协助下，我的论文才得以顺利完成。在此向大家表示衷心的感谢！最后向论文评阅人和答辩委员会所有专家教授表示最诚挚的感谢！42 致谢攻读硕士学位期间取得的科研成果发表论文：1酢浆草白茅根煎剂辅助治疗急性黄疸型肝炎52例临床观察[J].临床合理用药杂志,2012,5(4):26-27.43
