禽网状内皮增生病病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

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－＼■‘中图分类号学巧代捣－１０２２４密级公巧学号１４０６２０５３１表＾系净户、聲专业聲位瑚古学位论文Ｔ－禽网状内皮增生病病毒ＲＰＣＲ检测巧法的建立及其应用作老赵规导师规世民拙广力学位类别普？医频±所在挙院动物医学学晓＇＇、＇＇－．：＇硏巧领域舎医学学习方式全＇日制．＇去＇－．、？■■＜．－Ｉ；：＇．Ｖ－－？一Ｉ．＇，ｊ’户＼．．二—六年五月〇－，．，娜；一誦着麵薩 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加！标注和致谢的地方外，论文中不包當其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注＝如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。’＇学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可＾？将学位论文的全部或部影！＾分内容编入有关数据库进行检索，可抖采用印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：＼日期：年月日导师签名日期：年月日 ClassifiedIndex：Code：10224Confidential(yes/no)：noNO.：140620531DissertationfortheProfessionalMasterDegreeTheEstablishmentofRT-PCRDetectionMethodsandApplicationtoReticuloendotheliosisVirusCandidate:ZhaoLiangSupervisor:ZhengShiminSunGuangliDegreeCategory:MasterofVeterinaryCollege:CollegeofVeterinaryMedicineResearchField:VeterinaryImmunologyPathologyStudyMode:Full-timeHarbinChinaMay2016 目录目录中文摘要.......................................................................................................................................I英文摘要.....................................................................................................................................III1引言...........................................................................................................................................11.1REV研究进展.....................................................................................................................11.1.1病原学.........................................................................................................................11.1.2REV的致病机制及其感染动物的临诊主要症状........................................................21.1.3REV的流行病学..........................................................................................................31.1.4REV的危害..................................................................................................................41.1.5REV的防治..................................................................................................................41.2REV的检测技术.................................................................................................................41.2.1REV的检测方法..........................................................................................................41.2.2REV的PCR检测方法.................................................................................................51.3本研究的目的与意义.........................................................................................................52材料与方法...............................................................................................................................62.1实验材料............................................................................................................................62.1.1病毒.............................................................................................................................62.1.2实验动物.....................................................................................................................62.1.3主要生物制剂和化学制剂...........................................................................................62.1.4主要仪器与设备..........................................................................................................62.2实验方法............................................................................................................................72.2.1试验动物分组及处理...................................................................................................72.2.2被检材料的采取...........................................................................................................72.2.3RT-PCR检测方法的建立.............................................................................................72.2.4RNA提取及cDNA合成..............................................................................................82.2.5PCR扩增及产物检测...................................................................................................82.2.6PCR体系最佳反应条件优化.......................................................................................92.2.7PCR方法的敏感性检验...............................................................................................92.2.8PCR方法的特异性检验...............................................................................................92.2.9PCR方法的重复性和稳定性检验................................................................................92.3所建立的RT-PCR方法的实际应用检验.........................................................................102.3.1对感染雏鸡主要组织器官中REV的检测................................................................102.3.2对现地临诊实际样品的检测......................................................................................103结果与分析.............................................................................................................................123.1PCR扩增结果...................................................................................................................123.2PCR反应条件的优化........................................................................................................123.2.1最佳退火温度的确定................................................................................................12I 东北农业大学兽医硕士学位论文3.2.2最佳引物浓度的选择................................................................................................123.2.3最佳镁离子浓度的优化.............................................................................................133.3PCR方法的敏感性试验....................................................................................................143.4PCR方法特异性检测........................................................................................................143.5PCR方法重复性试验........................................................................................................153.6应用..................................................................................................................................163.6.1RT-PCR检测方法对感染雏鸡主要器官的REV检测...............................................163.6.2RT-PCR方法对现地临床样品的检测........................................................................164讨论.........................................................................................................................................184.1RT-PCR方法的建立及其条件优化...................................................................................184.2RT-PCR检测方法的实际应用..........................................................................................194.2.1所建RT-PCR方法对感染雏鸡主要器官的REV检测..............................................194.2.2所建RT-PCR方法对临诊样品的检测及其分析.......................................................195结论.........................................................................................................................................20致谢............................................................................................................................................21参考文献.....................................................................................................................................22攻读硕士学位期间发表的学术论文...........................................................................................26II CONTENTSCONTENTSAbstractinChinese......................................................................................................................IAbstractinEnglish....................................................................................................................III1Introduction..............................................................................................................................11.1Advanceinreticuloendotheliosisvirus(REV).....................................................................11.1.1Aetiology......................................................................................................................11.1.2PathogenesisandClinicalsymptomsofREV................................................................21.1.3EpidemiologyofREV...................................................................................................31.1.4HarmnessofREV..........................................................................................................41.1.5PreventionandcontrolofREV......................................................................................41.2ProgressondetectiontechniqueofREV...............................................................................41.2.1Orthodoxdetectiontechnique........................................................................................41.2.2PCRdetectionmethods.................................................................................................51.3Purposeandsignificanceofthisstudy...................................................................................52Materialsandmethods.............................................................................................................62.1Materials..............................................................................................................................62.1.1Viruses..........................................................................................................................62.1.2Mainbiologicalandchemicalreagents..........................................................................62.1.3Mainequipmentandapparatus......................................................................................62.2Methods................................................................................................................................62.2.1PCRPrimerdesign........................................................................................................72.2.2Disposeofsample.........................................................................................................72.2.3Materialadoptsandprocessing......................................................................................72.2.4TheextractionandsynthesisofRNA............................................................................72.2.5PCRAmplification........................................................................................................72.2.6Responsepatternoptimization.......................................................................................72.2.7PCRSensitivity.............................................................................................................82.2.8PCRSpecificity.............................................................................................................82.2.9Repetitionandconstancy...............................................................................................92.3ApplicationofRT-PCR.........................................................................................................92.2.1Organtesting.................................................................................................................92.2.2Sampletesting...............................................................................................................93Results.....................................................................................................................................123.1AmplificationofPCR.........................................................................................................123.2Responsepatternoptimization............................................................................................123.2.1Differenttemperature..................................................................................................12III 东北农业大学兽医硕士学位论文3.2.2Differentprimersconcentration...................................................................................123.2.3DifferentMg2+concentration.......................................................................................133.3PCRSensitivity..................................................................................................................143.4PCRSpecificity.................................................................................................................143.5Repetitionandconstancy...................................................................................................153.6ApplicationofRT-PCR......................................................................................................163.6.1organtestingbyRT-PCRmethod.................................................................................163.6.2SampletestingbyRT-PCRmethod..............................................................................164Discussion................................................................................................................................184.1EstablishmentofRT-PCRmethodandoptimizationofconditions.......................................184.2ThepracticalapplicationofRT-PCR...................................................................................194.2.1organtestingbyRT-PCR.............................................................................................194.2.2SampletestingbyRT-PCR...........................................................................................195Conclusion...............................................................................................................................20Acknowledgement......................................................................................................................21References..................................................................................................................................22PaperspublishedintheperiodofMastereducation................................................................26IV 摘要摘要本研究应用现代分子生物技术，以1日龄SPF雏鸡为研究对象，利用被网状内皮组织增生病病毒感染雏鸡的cDNA为模板，选取相对保守的LTR序列，设计并合成出特异性引物，建立了RT-PCR检测方法，并对该检测方法进行优化。在此基础上，又结合生物学检测技术，对试验中感染REV的SPF雏鸡心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏、胸腺和法氏囊进行检测，同时又对来自东北某省养殖场选取的50份现地临诊血液样品进行检测。本实验旨在建立REV的快速、高效检测方法，为日后疾病的防治提供重要的科学基础和依据。主要研究结果如下：（1）成功建立了检测网状内皮组织增生病病毒的RT-PCR方法，该检测方法能够有效地扩增出目的片段，可在4个小时内完成对样品的检测；（2）该检测方法的最佳优化条件为：退火温度53℃、引物浓度为0.3μmol/L、Mg2浓度为2.5μmol/L；（3）该方法敏感性高，能特异性检测REV样品。对样品的反复多次检测，检测结果高度一致，该方法具有较高的重复性和稳定性；（4）应用上述建立的RT-PCR检测方法，对试验中感染REV的SPF雏鸡的各个主要器官进行检测，结果表明SPF雏鸡各个主要器官均受到感染。对东北某省50份现地临诊血液样品进行检测，结果显示，阳性率高达92%。关键词：禽网状内皮组织增生病病毒；RT-PCR检测方法I AbstractTheEstablishmentofRT-PCRDetectionMethodsandApplicationtoReticuloendotheliosisVirusAbstractInthisstudy,wedevelopedaRT-PCRassaytotargettheREV-LTRregion,usingthecDNAofone-dayoldREVinfectedchickenasatemplate.BasedonthepublishedsequenceofREV-LTR,primersweredesignedandsynthesized.ThenaREV-PCRdetectionwasestablishedandoptimized.Onthisbasis,organsofchickenincludingheart,spleen,liver,lung,kidney,thymusandbursaofFabriciusweredetected.OtherwisewedetectfiftyclinicalbloodsamplesfromfivefarmsofnortheastChinabybiologicaldetectiontechnologyandPCRmethod.ThepurposeofthisstudyistoestablisharapidandefficientdetectionmethodofREV.Toprovideanimportantscientificbasisforthepreventionandtreatment.Theresultswereshowenasfollows:（1）TheRT-PCRdetectionmethodtoReticuloendotheliosisvirushavebesuccessfullyestablished.Thismethodcaneffectivelyamplifythetargetfragment.Theexperiencecanbefinishedin4hours.（2）Afteroptimized,theannealingtemperaturewasfixedon53℃,andtheconcentrationoftheprimersandMg2+werefixedon0.3μmol/Land2.5μmol/Lseparately.（3）Thismethodhasahighsensitivity,specificityandrepeatability.Theresultsarehighlyconsistentbytestingthesesamples.Thismethodhashighrepeatabilityandstability.（4）UsingtheaboveestablishedRT-PCRdetectionmethod,theresultshowsthatallthemajororgansofSPFchickenswereinfected,thepositiverateof50clinicalbloodsampleswereupto92%.Keywords:Reticuloendotheliosisvirus;RT-PCRmethodIII 引言1引言禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosisvirus，REV)属于三种致肿瘤病毒之一[1]。禽类在感染禽网状内皮组织增生病病毒后，可造成禽网状内皮组织增生病的发生，禽网状内皮组织增生病是引起禽类产生免疫抑制、急性网状细胞肿瘤、淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤的重要疾病[2]。当禽类单一感染REV时，一般不会表现明显的临诊症状，但当宿主同时感染REV与其他肿瘤病病毒或免疫抑制病病毒时[3]，如不及时治疗控制，则极易引起肿瘤，并产生严重的免疫抑制，影响禽类生长发育和生产性能。近年来，有研究报道，REV在非洲、欧洲、美洲、中东、亚洲和大洋洲都有发病情况，其中大洋洲国家之一澳洲也有REV污染马立克氏病疫苗的报道。还有研究表明，在美国和亚洲某些国家，禽类群体中REV的发病率达到了60%-80%，并有继续上升的趋势[4]。在我国随着科技的发展，禽类养殖业的扩增。REV在鸡群中感染情况逐渐严重，与其他有临诊症状的传染病相比，感染更为严重，并且能在不同的禽类间传播[5]，禽类中肿瘤发病率也逐年递增。同时，由于REV能与马立克病病毒(MDV)、鸡贫血病病毒(CAV)和J亚群禽白血病病毒(avianleukosisvirussubgroupJ，ALV-J)混合感染，造成我国禽类养殖场普遍存在感染情况，使得禽类的免疫力低下，提高了疫病的感染率，同时也导致其他种类疫苗的免疫失败，引起继发感染[6]，禽类疫病的诊治和防控工作更加严峻，造成了巨大的经济损失。1.1REV研究进展1.1.1病原学1.1.1.1病毒的历史背景禽网状内皮组织增生病(retieuloendohteliosis，RE)是禽网状内皮组织病毒引起的以肿瘤、免疫抑制、生长缓慢为特征的疾病[7]。目前，该病发病率已达到20%-30%，是危害家禽养殖业的重大疾病[8]。RE在世界众多国家均存在发病情况，鸡群中存在REV或抗体。有美国科学家研究发现，在该国选取的92个鸡群中有近50%的鸡血清呈阳性[9]。在我国南方江苏省、北方山东省、黑龙江省和北京等地都陆续出现了RE。REV属于反转录病毒科丙型反转录病毒属，目前已分离到30多株REV，虽然不同毒株的致病力不同，但都具有相似的抗原性，即属同一血清型，最早的REV分离株为REV毒株（T株），是在1958年，由英国学者从患有内脏淋巴肿瘤的火鸡中分离得到[10]。1986年，我国首次分离得到非缺陷型REV毒株，1988年于南京又分离得到REV-C45病毒株[11]。截止到现阶段，世界众多国家已分离出不同种REV毒株共计30多株，均具有相似的抗原特性[12]。1.1.1.2RE病毒的形态学病毒粒子呈球形，其直径为80nm-100nm，每个病毒表面附着有突起。该病毒基因组为单股RNA，由含有两个亚单位的复合体组成。根据基因组大小，REV可分为复制缺陷型(REV-T)和非复制缺陷型（REV-A)两种病毒株[13]。复制缺陷型REV基因组的长度大约为57kb[14]，主要是由于env区基因的部分缺失和gag-pol区基因的大段缺失[15]造成的，而非复制缺陷型REV基因组长度大约为9.0kb，可于多种禽体内复制。1 东北农业大学兽医硕士学位论文1.1.1.3RE病毒的理化特性REV对外界环境的抵抗力较强，在37℃条件下加热20min，其致病性会减弱为50%，37℃条件下加热1h，致病性仅为原来的1%，在4℃条件下相对比较稳定，在-70℃条件下，非常稳定可被储存。同时REV对紫外线有较强的抵抗力，但不具有耐酸性，同时部分有机溶剂，例如乙醚，氯仿都能使其灭活[16]。1.1.1.4RE病毒的基因组及结构蛋白REV的基因组为单链RNA，含有两个RNA亚单位组成的复合体，完全复制性REV基因组由gag、pol和env以及两端的LTR结构组成[17]。其中，gag基因编码为pl2、ppl8、pp20、p30和pl0等5种结构蛋白，p30具有群特异性抗原，在病毒粒子的装配中发挥重要作用；env基因编码为gp90和gp20两种糖蛋白。而缺陷型REV，则缺少大段gag-pol区基因和部分env区基因，其中缺陷型REV毒株的急性致瘤作用，与env区含有的具有转化作用的替代片段V-rel致病基因有关[18、19]。1.1.1.5RE病毒的复制机制REV复制机制主要分为以下7个主要步骤[20]：（1）吸附：病毒与细胞表面的特异性受体结合；（2）穿入：囊膜与细胞膜融合，核衣壳释放到细胞内；（3）反转录：以自身基因组RNA为模板合成前cDNA；（4）整合：cDNA进入细胞核，整合到宿主染色体上；（5）转录：在酶的作用下转录形成病毒RNA；（6）翻译：合成各种蛋白质；（7）装配和释放：囊膜蛋白包裹着RNA和病毒粒子，以出芽方式，从细胞膜内释放。1.1.2REV的致病机制及其感染动物的临诊主要症状禽网状内皮组织增生病发病机制，迄今还没有全部清晰，根据毒株种类的不同，其致病机制也不同。通常状况下，完全复制型病毒基因组不具有v-rel基因，其末端含有的重复序列（LTR）具有启动子作用[21-22]，当前病毒DNA整合到宿主癌基因c-myc附近时，就可启动癌基因的表达和细胞的转化，首先导致非肿瘤性病变，后可衍变为淋巴瘤；而缺陷型T株，因其含有致瘤性的v-rel基因，可引起急性肿瘤。缺陷型REV-T有病毒致瘤基因v-rel，当以前病毒v-rel形式整合入宿主DNA中时即可转化靶细胞；以细胞c-rel取代v-rel的重组病毒也具有致瘤性。感染REV的鸡群主要表现为，慢性肿瘤及急性网状细胞瘤、生长停滞的矮小综合征[23]。感染鸡群中慢性肿瘤通常无明显的临诊症状，鸡在死亡前会出现精神抑郁的情况，当进行病理剖检时，通常可以看到弥散性的灰白肿瘤灶，在器官上分布。感染鸡群中急性网状细胞瘤，通常伴有弥散性或局灶性浸润病变，常见于性腺、胰腺、肾脏和心脏，脾脏和肝脏肿大。病理组织学变化，通常可见大的空泡状细胞的浸润和滋生[24]。鸡群中患有矮小综合征的个体，主要病变包括胸腺和法氏囊萎缩、矮小、贫血、肠炎、腺胃炎、外周神经肿大、羽毛发育异常、翼羽的羽支粘附到局部的毛干上，以及肝和脾坏死，发育受阻。感染鸡在病毒感染后3-52 引言周，其体重相对于正常个体降低20%-50%。并且被REV感染的个体常伴有细胞和体液免疫应答的下降，主要是REV在感染机体时，以网状内皮细胞或者淋巴细胞为靶细胞，侵害禽类的免疫系统，诱发明显的体液和细胞免疫抑制，从而降低机体对其他病原，甚至疫苗的免疫应答。一般情况下，新孵雏鸡或雏火鸡感染。REV后，其死亡率可达100%。1.1.3REV的流行病学1.1.3.1REV流行情况REV呈世界性分布，能够感染的自然宿主范围比较广泛，传播方式多样。目前，世界各地REV流行情况不断有所报道。调查表明，韩国和埃及含有REV抗体鸡群达34%-75%[25]。2006年，台湾地区选取某一鸡群，进行了病毒分离和抗体检测，结果显示，42组16周龄以上鸡群的血清中，血清呈阳性的有39组，阳性率高达92.8%[26]。自1988年，我国首次在南京地区分离得到首株REV病毒以来，REV在国内流行逐渐增加，20世界80年代，其发病情况偶有报道，20世纪90年代的调查结果表明，部分鸡场中REV抗体阳性率各不相同且差异较大，从21%到71%不等。21世纪初，随着经济的快速发展，养殖场规模和数量急剧增多，各个鸡场的阳性检出率也逐渐增多。崔治中等[27]运用ELISA检测方法，选取5个省份9个公司100个鸡群的血清样品进行检测，结果表明，呈REV阳性鸡群有36个，阳性率在0-100%不等，不同地区的鸡群阳性率均不同。2009年，秦立廷等[28]从全国范围内由南到北的5个省份的众多蛋鸡场收集的样品，并进行检测，结果显示，REV感染在各个省份都有不同程度的存在，REV阳性率在11.5%-84.6%之间。2009年，张洪海[29]从山东省内选取4周龄以上种鸡，应用血清学、免疫组织化学和PCR检测方法进行检测，结果发现，其REV平均抗体阳性率为40.36%。2013年，董海岚等[30]选取河南省南阳市20个大规模养鸡场的蛋鸡和4个种鸡场不同批次的蛋种鸡和肉种鸡，利用ELISA方法对其进行了检测，结果显示，20个养鸡场REV阳性率为29.8%，4个种鸡场抗体阳性率为44.6%。REV感染不仅流行广泛，还可与其他传染较为严重的病毒发生混合感染，特别是在与IBDV、CAV、ALV-J等病毒并发或继发感染后，大大的增加了死亡率[31]。目前，REV感染流行范围在逐步扩大，可见REV已呈世界性分布。经研究发现，许多国家的鸡群都有REV抗体(或者病毒)存在，在家禽中的阳性率也逐年攀升，免疫抑制、基因重组、混合感染、疫苗污染、垂直与水平传播等近年来已经引起广泛关注。1.1.3.2REV的感染宿主REV的自然宿主有鸡、火鸡、鹅、鸭、孔雀、日本鹤鹑等禽类，这些动物对感染可产生应答，从而形成特征性病变、病毒血症或抗体，动物中最易感染为火鸡[32-34]。同时，鸡和火鸡也是最常见的试验宿主。一般REV对低日龄鸡感染比较严重，尤其是新孵出的雏鸡及胚胎，可引起严重的免疫抑制或免疫耐受[35]。随着雏鸡日龄的增加，因其免疫系统逐渐发育健全，具有较为完善的免疫机能，REV感染后可能只会出现一过性病毒血症。1.1.3.3REV的传播途径REV传播方式多样，可以通过水平和垂直传播引起不同程度的感染，诱发鸡群的免疫抑制。其中REV水平传播，一般情况下，需要昆虫的介导，种类和毒株可影响水平传播，从血3 东北农业大学兽医硕士学位论文清学阳性鸡群的羽毛囊、法氏囊、脾脏、泄殖腔拭子、粪便和其他体液及垫料中均可检测到REV[36]。垂直传播的传播率相对较低，通常情况下，由被REV污染的商业禽用疫苗引起的人工传播，是发病的主要原因。除水平传播和垂直传播外，REV还可以通过与感染的禽类直接接触而传播[37]。1.1.4REV的危害REV呈世界性分布，REV本身对禽致死作用并不明显，但是病毒感染动物后，能伤害禽类机体免疫系统，对机体的免疫器官造成严重损伤，免疫活性细胞不仅数量减少，而且免疫活性细胞活性受到抑制，造成机体的免疫抑制，使感染机体的抵抗力下降[38-39]，对某些病菌的易感性增强，继而可感染其他病毒病和细菌病[40]。近年来，REV在家禽中的感染率，己经呈逐年上升趋势，给养禽业造成严重的经济损失。1.1.5REV的防治控制和消灭REV的流行蔓延，最重要的方法是，禁止染病机体和污染物进入易感鸡群，制定严格的卫生防疫制度，喂食的饲料要保证来源绝对安全，杜绝从疫区引进种禽类和各种蛋类，新购进的禽类进入养殖场前要经过严格的检疫，并隔离饲养2周以上，再经筛选后，健康个体才可进入群中饲养。严格消毒措施也是防止REV传播的一项重要措施，其根本在于切断病原的传播途径。养殖场应有设施齐全的消毒设备，养殖场进出口应设有消毒池，工作人员在进入养殖场区内之前，必须要经过消毒并且更换自身的工作服和鞋靴才可进入，进入场区的车辆和用具也要经过消毒，并制定消毒制度，做到定期性和临时性相结合的消毒，在禽类进入养殖场区前进行1-2次彻底消毒，待全部禽类销售后再对饲养区进行1-2次的彻底清洁和消毒。饲养过程中，定期检测REV抗体，一经发现血清学呈阳性个体立即淘汰，及时杜绝群体中大范围传播。并且严格保证由SPF化鸡胚生产疫苗，防止弱毒疫苗被REV污染[41.42]。1.2REV的检测技术1.2.1REV的检测方法尽管国内外先后建立起了REV琼脂免疫扩散试验[43]。间接免疫荧光抗体试验、间接ELISA方法以及ABC-ELISA等方法检测REV抗体。但是当抗体水平极低时，容易造成假阴性的结果因此，确诊需进行病原检测[44.45.46]。病毒分离培养是最经典、最准确的检测方法。采集病料，进行研磨、分离上清液、过滤除菌后，接种鸡胚成纤维细胞(CEF)单层，吸附两小时，加入含有10mL/L犊牛血清的培养基，培养7天。然后再消化和传代一次，继续培养7天，电镜下观察病毒粒子的形态。同时将样品消化传代至96孔细胞培养板中，培养7天[47]。用REV特异性抗血清做免疫荧光试验(IFA)，这一过程至少需要数十天，不但耗时太长，而且其灵敏性也不够。另外，取患病禽的组织器官，制成组织切片，用REV囊膜糖蛋白单克隆4 引言抗体作为一抗，加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，细胞浆内有绿色荧光染色者，则判为阳性，从而建立了可以直接从组织切片中检测REV的免疫荧光技术。此方法能够清晰地显现出REV抗原的存在、位置及组织病理变化，检测时间短、检出率高，可以直接对病毒抗原进行定位，但是不适合现地大量检测[48.49]。1.2.2REV的PCR检测方法PCR方法检测REV是基于反转录病毒复制周期中，RNA转化为DNA，RNA前病毒DNA插入到宿主DNA中，能够长期存在并垂直传播给宿主后代。故直接使用组织DNA，由PCR方法直接扩增出目的片段。LTR序列由569个核苷酸组成，称长末端重复，在很多细胞是有效的启动子，病毒RNA的转录和翻译就是通过其长末端重复(LTR)序列中的启动子和增强子进行的。实验室所应用的PCR方法的检测结果要明显优于传统的病毒分离，因其检测用时短、检测结果准确、具有很高的敏感性和特异性，可以鉴别出临诊症状暂时呈正常状态的的阳性个体，确定早期感染。所以，可以作为针对REV流行病学调查的一种检测方法，又因为其具有很大的适用范围，同时也可作为REV确诊的一种手段，适用于大批量的检测。早在20世纪初就有科学家成功应用PCR方法，在病料组织中检测到REV前病毒的LTR序列[50]。同时应用PCR方法检测REV，多是用于检测REV的前病毒DNA。REV的前病毒DNA可插入到宿主DNA中，所以可以直接使用组织DNA作为模板，扩增出目的片段。在检测时经常选择LTR作为检测点，因为不同毒株的LTR序列相似度非常高，不同毒株之间的差异较小[51]。PCR方法除了可以用于检测组织中的REV前病毒DNA，还可以用于检测前病毒插入MDV，火鸡疱疹病毒（HVT）或FPV中的序列，因而被广泛应用于疫苗污染REV的检测之中，对比组织培养灵敏度明显提高[52]，结果更明显，易于区别，样品易于保存，重检也十分便捷，数小时即可完成，具有良好的的实用性。1.3本研究的目的与意义根据以上叙述可知，RE已经对家禽养殖业造成了极大危害，且随着经济的快速发展，养殖企业数量的增多，疾病的传播呈现越来越严重趋势。而禽类在感染REV病毒后，能引起肿瘤的生成，导致生长缓慢，同时还能引起感染机体免疫器官发生萎缩，造成了免疫抑制作用，机体自身抵抗力下降，其自身免疫功能受到了极大的影响，对其他类型的疾病无任何抵抗力，同时大大降低了对其他禽病疫苗的免疫效应，以致引起免疫失败，更容易诱发混合感染。因此，建立快速、便捷的REV检测方法，对于该病的防治有着至关重要的意义。综合目前国内已分离出的REV毒株，并进行同源性比较，发现REV毒株的LTR序列高度一致，各毒株间的差异性较小，故选取REV基因的LTR序列设计出特异性引物进行PCR扩增。并对原有的PCR体系进行优化和重复性试验，筛选出最佳PCR反应体系。对已建立好的PCR体系进行应用，所检测样品数量大，检测结果准确。实现了对REV在特性、灵敏、准确的实时监测，为RE的快速诊断、流行病学调查、防治和生产实践中的检测提供了便利，同时也为REV的免疫抑制、致病机制、感染机制和预防措施等方面的研究奠定了基础。5 东北农业大学兽医硕士学位论文2材料与方法2.1实验材料2.1.1病毒REV——T株购于北京中国兽药监察所新城疫病毒(NDV)疫苗购于哈药集团生物疫苗有限公司禽传染性法氏囊病病毒（IBDV）疫苗购于浙江诺倍威生物技术有限公司禽传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗购于北京信得威特生物技术有限公司2.1.2实验动物1日龄SPF混合雏鸡16只，购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心并饲养管理2.1.3主要生物制剂和化学制剂（1）Trizol试剂Invitrogen公司（2）氯仿天津市红岩化学试剂厂（3）异丙醇天津市富宇精细化工有限公司（4）乙醇天津市红岩化学试剂厂（5）Oligo(dT)（6）dNTPMixture（7）loadingBuffer（8）Marker试剂（5）~（8）均为宝生物(大连)工程有限公司（9）5×第一链合成缓冲液（10）M-MLV逆转录酶（11）10×Buffer（12）BlendTaq试剂（9）~（12）均为Promega公司产品（13）琼脂糖GENE公司（14）溴化乙锭(EB)上海华舜生物工程有限公司2.1.4主要仪器与设备（1）﹣80℃冰箱英国NewBrunswickScientific公司（2）低温高速离心机德国Sigma公司（3）PCR扩增仪日本TaKaRa公司（4）DK-8D型电热恒温水槽上海一恒科技有限公司6 材料方法（5）DYY-6C型电泳仪北京六一仪器厂（6）CHAMPGEL-60000凝胶成像系统Sagecreation公司（7）洁净操作台Thermo科技公司2.2实验方法2.2.1试验动物分组及处理16只1日龄SPF雏鸡随机分为对照组（A）组和REV感染组（I组）和NDV感染组（Ⅱ组）、IBDV感染组（Ⅲ组）、IBV感染组（Ⅳ组）。并分别作如下处理A组（对照组）:4只SPF雏鸡，通过腹腔注射生理盐水0.5mL/只I组(REV感染组):6只SPF雏鸡，经与A组相同方式注射等量REV稀释液Ⅱ组(NDV感染组):2只SPF雏鸡，经与A组相同方式注射等量NDV稀释液Ⅲ组(IBDV感染组):2只SPF雏鸡，经与A组相同方式注射等量IBDV稀释液Ⅳ组(IBV感染组):2只SPF雏鸡，经与A组相同方式注射等量IBV稀释液上述五组雏鸡严格隔离，按照SPF雏鸡饲养要求，分别饲养管理。2.2.2被检材料采取A组和I组SPF雏鸡于染毒后的第1、7、21、56天随机各选取1只，进行心脏采血处死，取其肝脏、脾脏、法氏囊等器官，置于-80℃冰箱保存，被检。I组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组SPF雏鸡于相应病毒感染后的第56天，随机各选取2只，进行心脏采血处死，取其肝脏、脾脏、法氏囊等器官，置于-80℃冰箱保存，被检。2.2.3RT-PCR检测方法的建立2.2.3.1引物设计及其合成从GenBank中分别查找到数个REV分离株的基因序列，由于REV-T株临诊上感染病例，多由CSV和SNV感染或是混合感染所致。故最终选取SNV分离毒株的LTR序列，对相关序列进行了同源性分析，结果与其他的REV基因序列相比同源性高度一致，因此，利用Primer5.0与Oligo6.0软件对基因登录号为FJ439120毒株的LTR序列进行引物设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及扩增片断大小见表2-2-3。表2-2-3引物序列及其扩增片段Tab.2-2-3Theprimerssequencesandamplificationfragmentssizes基因登录号，，引物名称序列(5-3)片段长度(bp)GeneaccessionNamesofprimersSequencesFragmentssizesnumber上游引物：CATGGGTACGAACGAACGGGA353bpFJ439120下游引物：CATTGTGGGACATTCGACATT7 东北农业大学兽医硕士学位论文2.2.4RNA提取及cDNA合成2.2.4.1RNA提取（1）将研钵、离心管、移液枪枪头等器材进行高温灭菌并预冷。使用前30min打开低温离心机。在实验台、手套、移液枪上喷洒酒精，消除RNA酶防止影响实验结果。（2）取A组及I组1、7、21、56天和Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组第56天的雏鸡心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胸腺、法氏囊器官组织，在用液氮的前提下将组织研磨成粉末，趁液氮尚未完全挥发完时，将粉末转移至1.5ml离心管中，每100mg组织加1.0mlTrizol，并反复吹打均匀，用力震荡，使其混合均匀，放于冰盒上静置5min。（3）将离心管置于台式低温离心机中，于4℃条件下，10000r/min离心10min。（4）离心后取上清液，加入200µl氯仿，立即震荡摇匀后，放于冰盒上静置10min。（5）将离心管置于台式低温离心机中，于4℃条件下，10000r/min离心15min。（6）取上清液置于离心管中，加入等量异丙醇，置于冰盒上静置10min。（7）将离心管置于台式低温离心机中，于4℃恒温条件下，10000r/min离心10min。（8）离心后弃上清液，取沉淀，加入1ml乙醇DEPC水洗涤沉淀，再次将离心管置于台式低温离心机中，于4℃恒温条件下，10000r/min离心5min。（9）离心后，弃上清液，加入DEPC水20μl，反复吹打沉淀，于-80℃冰箱保存，备用。2.2.4.2cDNA合成（1）以RNA为模板，Oligo(DT)为引物进行合成，加入以下试剂去离子水8.0μlOligo(dT)1.0μldNTP1.0μlRNA2.0μl（2）混合物在65℃条件下加热5min，加热结束后，迅速置于冰上并短暂离心，离心后加入第一链合成缓冲液4μl。（3）轻轻混匀，离心管中各组成分，于37℃水浴2min。（4）向离心管中加入1μl的M-MLV逆转录酶，吹打混匀。（5）42℃水浴50min。（6）70℃加热15min，以终止反应。2.2.5PCR扩增及产物检测2.2.5.1PCR扩增确立最佳反应条件前，按照常规的50µlPCR反应体系进行扩增，所需材料如下：引物1.0μlcDNA1.0μl10×PCRBuffer5.0μldNTPs5.0μl超离子水37.5μl8 材料方法BlendTaq0.5μl反应程序如下：预变性条件为94℃4min；变性温度和时间为94℃30S；退火温度和时间为55℃30s；延伸温度和时间为72℃1min；进行30个循环；最后72℃延伸10min。2.2.5.2琼脂凝胶电泳检测产物琼脂糖凝胶电泳溶液配置如下：琼脂糖0.15g1×TAE15.0ml称量琼脂糖0.15g，溶于15mL1×TAE缓冲液中，用微波炉加热至其全部溶解，冷却至50℃～60℃时，加入10µL溴化乙锭（EB，1mg/mL）溶液混匀至终浓度为100µg/mL，再将其倒入预置好的凝胶板中，待其凝固后，在每个加样孔分别加入5µLPCR产物样品及标准的DNAMarkerDL2000，100V电压，电泳30min，后再紫外检测仪上观测，并记录电泳结果。2.2.6PCR体系最佳反应条件优化2.2.6.1最佳退火温度的确定以禽网状内皮组织增殖病病毒建立PCR检测体系，采用51℃、51.5℃、52℃、52.5℃、53℃、53.5℃、54℃、54.5℃8种退火温度进行PCR扩增，确定最佳退火温度。2.2.6.2最佳引物浓度的选择以禽网状内皮组织增殖病病毒建立PCR检测体系，每管分别添加引物0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、共设置4个浓度梯度进行PCR扩增，选择最佳引物浓度。2.2.6.3最佳镁离子浓度的优化以禽网状内皮组织增殖病病毒建立PCR检测体系，改变Mg2+浓度，每管分别添加Mg2+：1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，共设置5个浓度梯度进行PCR扩增，优化出最佳Mg2+浓度。2.2.7PCR方法的敏感性检验采用胶回收方法，纯化PCR产物目的条带，应用紫外分光光度计，测得纯化后的目的条带浓度，然后，以10倍浓度梯度倍比进行稀释，将稀释好的DNA模板，按照优化好的单项PCR条件进行敏感性测定。2.2.8PCR方法的特异性检验提取同日龄分别接种新城疫病毒（NDV)、禽痘病毒(IBDV)、禽传染性支气管炎病毒（IBV)和REV的SPF雏鸡组织的cDNA模板，以禽网状内皮组织增生病病毒cDNA作为阳性对照，检测所建立的PCR方法的特异性。2.2.9PCR方法的重复性和稳定性检验取同时期的未处理雏鸡的cDNA为阴性对照，取同时期禽网状内皮组织增生病病毒cDNA作为模板，进行PCR扩增4次，观察试验结果；然后，再取不同时期提取的禽网状内皮组织增生病病毒cDNA作为模板，进行PCR扩增4次，观察试验结果，确定所建立PCR方法的重复性和稳定性。9 东北农业大学兽医硕士学位论文2.3所建立的RT-PCR方法的实际应用检验2.3.1对感染雏鸡主要组织器官中REV的检测SPF雏鸡感染RE病毒后，分别于1、7、21、56日龄时进行宰杀，分别取其肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊等器官。1、将研钵、离心管、移液枪枪头等器材进行高温灭菌并预冷。使用前30min打开低温离心机。在实验台、手套、移液枪上喷洒酒精，消除RNA酶防止影响实验结果2、取1、7、21、56天的雏鸡心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、法氏囊器官组织，在用液氮的前提下，将组织研磨成粉末，趁液氮尚未完全挥发完时，将粉末转移至1.5ml离心管中，每100mg组织加1.0mlTrizol，并反复吹打均匀，用力震荡，使其混合均匀，放于冰盒上静置5min。3、将离心管置于台式低温离心机中，于4℃恒温条件下，10000r/min离心10min。4、离心后取上清液，加入200µl氯仿，立即震荡摇匀后，放于冰盒上静置10min。5、将离心管置于台式低温离心机中，于4℃条件下，10000r/min离心15min。6、取上清液置于离心管中，加入等量异丙醇，置于冰盒上静置10min。7、将离心管置于台式低温离心机中，于4℃条件下，10000r/min离心10min。8、离心后弃上清液，取沉淀，加入1.0ml乙醇DEPC水洗涤沉淀，再次将离心管置于台式低温离心机中，于4℃恒温条件下，10000r/min离心5min。9、离心后，弃上清液，加入DEPC水20μl，反复吹打沉淀。再以RNA为模板，Oligo(dT)为引物进行合成，加入以下试剂去离子水8.0μlOligo(dT)1.0μldNTP1.0μlRNA2.0μl（1）混合物在65℃条件下加热5min，加热结束后，迅速置于冰上并短暂离心，离心后加入第一链合成缓冲液4μl。（2）轻轻混匀离心管中各组成分，于37℃水浴2min。（3）向离心管中加入1.0μl的M-MLV逆转录酶，吹打混匀。（4）42℃水浴50min。（5）70℃加热15min以终止反应。再用已建立的优化好的PCR体系进行检测，确定各器官对REV的感染情况。2.3.2对现地临诊实际样品的检测1）从-80℃冰箱中取出冻存的样品，置于冰水混合物上缓慢融化。2）待溶解后，将离心管置于台式低温离心机中静置5min，再在4℃恒温条件下，10000r/min离心10min。3）离心后，取上清液置于新的离心管中，加入0.2mL氯仿，漩涡震荡10s，置冰盒上10min。10 材料方法4）再于4℃恒温离心机上，10000r/min离心10min，取上清液置于新的离心管中。5）加入等量的异丙醇，漩涡均匀，4℃条件下，静置30min。6）再于4℃恒温离心机上，10000r/min离心10min。7）弃上清，加入1.0mLDEPC乙醇洗涤，再于4℃恒温离心机上，7000r/min离心3min，保留沉淀，室温放置晾干。8）加入20μlDEPC水溶解RNA沉淀。再以RNA为模板，Oligo(dT)为引物进行合成，加入以下试剂：去离子水8.0μlOligo(dT)1.0μldNTP1.0μlRNA2.0μl（1）混合物在65℃条件下，加热5min，加热结束后，迅速置于冰上并短暂离心，离心后加入第一链合成缓冲液4μl。（2）轻轻混匀，离心管中各组成分，于37℃水浴2min。（3）向离心管中加入1.0μl的M-MLV逆转录酶，吹打混匀。（4）42℃水浴50min。（5）70℃加热15min以终止反应。用已建立的优化好的PCR方法进行检测，确定各样品中是否有REV的存在。从50份样品中任意选取10份血液样品进行PCR扩增。11 东北农业大学兽医硕士学位论文3结果与分析3.1PCR扩增结果按照前面2.2.5的检测方法进行扩增，反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3-1。扩增产物目的条带在353bp附近，检测结果与预期结果相符。M12000bp1000bp750bp500bp353bp250bp100bp注：M：DNA分子标准DL2000；1:LTR序列经PCR扩增产物Notes：M：DL2000DNAMarker；1：AmplificationresultofREV图3-1REV的PCR扩增电泳图Fig.3-1Amplificationeffecttosingletemplate3.2PCR反应条件的优化3.2.1最佳退火温度的确定在其他条件不变的情况下，分别采用51℃、51.5℃、52℃、52.5℃、53℃、53.5℃、54℃、54.5℃8种退火温度进行PCR扩增。经多次PCR试验确认，最佳退火温度为53℃。3.2.2最佳引物浓度的选择在退火温度为53℃，Mg2+浓度为1.5μmol/L，每管分别添加引物0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、共设置4个浓度梯度进行PCR扩增，选择最佳引物浓度，结果如图3-2。12 结果与分析M12342000bp1000bp750bp500bp250bp100bp注：M：DNA分子标准DL2000；1-4：引物添加量：0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μlNotes：M：DL2000DNAMarker；1-4：primersadddosage:0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl图3-2不同引物浓度扩增效果Fig.3-2Amplificationeffectundertheconditionofdifferentprimersconcentration由图3-2可知，在退火温度为53℃时，引物添加量为0.3μl时，其扩增效果最好，故引物最佳浓度为0.3μmol/L。3.2.3最佳镁离子浓度的优化M123452000bp1000bp750bp500bp250bp100bp注：M：DNA分子标准DL2000；1-5：Mg2+添加量：1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μlNotes：M：DL2000DNAMarker；1-5：Mg2+adddosage:1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μl图3-3不同Mg2+浓度条件下的扩增效果Fig.3-3AmplificationeffectunderthedifferentMg2+concentration13 东北农业大学兽医硕士学位论文在退火温度为53℃，引物浓度为0.3μmol/L时，改变Mg2+浓度，每管分别添加Mg2+：1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，共设置5个浓度梯度进行PCR扩增，由图3-3可知，Mg2+浓度为2.5μmol/L时，其扩增效果最好，故Mg2+最佳浓度为2.5μmol/L。3.3PCR方法的敏感性试验将cDNA模板以10-1–10-10进行稀释，进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测结果，确定所建立PCR方法的敏感性。结果如图3-4。M123456789102000bp1000bp750bp500bp250bp100bp注：M：DNA分子标准DL2000；1~10：模板稀释度：10-1–10-10Notes：M：DL2000DNAMarker；1~10：templatedilution:10-1–10-10图3-4PCR敏感性试验结果Fig.3-4TheresultofsensitivitytestbyPCR在退火温度为53℃，引物浓度为0.3μmol/L，Mg2+浓度为2.5μmol/L时，最小检出量为阳性模板的10-6拷贝。3.4PCR方法特异性检测以同时期两组REV的核酸为对照，以同时期两组的新城疫病毒（NDV)，禽传染性法氏囊病病毒（IBDV），禽传染性支气管炎病毒（IBV)作为待检测样品，检测所建立PCR方法的特异性。由图3-5结果表明：三对引物对REV具有高度专一性。只有以REV的cDNA为模板扩增出的产物出现目的条带，其余样品均未出现条带。14 结果与分析M12342000bp1000bp750bp500bp250bp100bp注：M：DNA分子标准DL2000；1~4：NDV组、REV组、IBDV组、IBV组Notes：M：DL2000DNAMarker；1~4：AmplificationresultofNDV、REV、IBDV、IBV图3-5PCR方法特异性试验结果Fig.3-5TheresultofspecificitytestbyPCR3.5PCR方法重复性试验M1234567891011122000bp1000bp750bp500bp250bp100bp注：M：DNA分子标准DL2000；1~4：阴性样品间重复性比对；5~8：阳性样品批内重复性比对；9~12：阳性样品批间重复性比对Notes：M：DL2000DNAMarker；1~4：Reproducibilityinter-testresultofnegativesample；5~8：Reproducibilityintra-testresultofpositivesample；9~12：Reproducibilityinter-testresultofpositivesample图3-6重复性试验结果Fig.3-6Theresultofreproducibilitytest由图3-6可知：在退火温度为53℃，引物浓度为0.3μmol/L，Mg2+浓度为2.5μmol/L条件下，未感染雏鸡cDNA为阴性对照4次检测结果均未发现任何条带，同时期以RE病毒cDNA15 东北农业大学兽医硕士学位论文作为模板4次检测结果均呈现明显的条带，不同时期提取的RE病毒cDNA作为模板进行PCR扩增4次结果均可见明显的条带。表明所建立的PCR检测方法具有较高的重复性和稳定性。3.6应用3.6.1RT-PCR检测方法对REV感染雏鸡主要器官的REV检测用已建立的PCR方法，对REV感染SPF雏鸡不同时期主要组织器官REV感染情况进行检测，结果如表3-1：表3-1REV感染SPF雏鸡后主要组织器官REV感染情况Table3-1ChangesofTissueandorgansofSPFchicksinfectedwithREVTable3-1TheinfectionsituationofREVintissueandorganofSPFchickensinfectedwithREVREV感染后时间172156REVinfectionaftertime肺脏Lung+++—心脏Heart+++—肝脏Liver+++—脾脏Spleen+++—肾脏Kidney—++—胸腺Thymus+++—法氏囊Bursa++++注：“＋”表示单项PCR为阳性；“－”表示单项PCR为阴性；Notes：“＋”representpositiveresultdetectbySinglePCR“－”representnegativeresultdetectbySinglePCR由表3-1可知，肺脏、心脏、肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊均可检测到REV；肾脏在REV感染后7日，可检测到REV；在REV感染雏鸡后56日时，仅有法氏囊中可检测到REV，其余器官中均未检测到REV。3.6.2RT-PCR方法对现地临诊样品的检测（1）用建立的PCR检测方法，对2015年下半年，来自东北某省养殖场随机采集的50份雏鸡血液样品进行了检测，结果发现，50份血液样品中，阳性样品为46份，阳性率为92%。结果如表3-2.16 结果与分析表3-250份样品的检测Table3-2Detectionof50samples血液样品检测结果TheresultBloodsamples1-10++++++—+++11-20—+++++++++21-30++++++++++31-40+++++++—++41-50++—+++++++注：“＋”表示单项PCR为阳性；“－”表示单项PCR为阴性；Notes：“＋”representpositiveresultdetectbySinglePCR“－”representnegativeresultdetectbySinglePCR（2）用已建立的PCR检测方法，对从50份血液样品中随机抽取10份样品进行PCR检测，结果发现，除7号血液样品外，其余9份样品均呈现明显的阳性条带。图3-7。M123456789102000bp1000bp750bp500bp250bp100bp注：M：DNA分子标准DL2000；1–10：选取的10份血液样品Notes：M：DL2000DNAMarker；1-10：Bloodsample图3-7血液样品的PCR扩增结果Fig.3-7AmplificationeffecttobloodsamplebyPCR17 东北农业大学兽医硕士学位论文4讨论4.1RT-PCR方法的建立及其条件优化近年来，由REV感染所引发的禽网状内皮组织增生病，及其所造成的危害，如肿瘤的产生；机体免疫抑制，对其他疾病的继发感染以及患病禽类生长速度减慢，致死率高等危害，已引起国内外广大学者和养殖者的关注[53]。但是，由REV感染所引起的临诊表现与病理变化不具有特异性，特别是三种能引起肿瘤产生，并致机体产生免疫抑制的疾病，在临诊症状和病理变化上极具相似性，故对该病的临诊诊断显得十分困难，不易于区别造成诊断错误。因而，在遇到疑似感染个体时，必须要通过实验室检查，才可做出确切诊断。实验室检测方法多种多样主要包括:传统的血清学方法，同一批次所能检测的样品量小，很难适用于大规模的流行病学调查和生产实践上诊断的需要，不具有应用性；抗体检测方法，其灵敏度相对较弱，当抗体水平很低的情况下，检测结果极易引起错误，无法排除某些阳性样品，准确率低；病毒分离鉴定，是最经典、应用最多的病原检测方法，所选取的病料通常为产生病变的禽类，从病料中分离病毒较为繁琐，且分离后对培养物的培养时间较长，需要盲传代，每代盲传需要7天，全部试验结束，需要数十天，耗时较长，直接导致整个试验周期延长，不够快速便捷；病理学检测，选取病料制成病理切片，通过镜下观察进行检测，但制片过程繁琐，不适宜大规模检测；ELISA检测法，操作比较复杂，从病料中直接分离病毒比较困难，所需成本造价较高。随着REV的逐步传播，建立敏感性高，特异性强，重复性、稳定性好，便于操作，造价低廉，适用于大规模应用的诊断方法是非常重要的。PCR技术具有检测快捷、样品保存方便、准确率高的特质，基本可以满足上述需要，适用于检测[54-57]。REV为单股正链RNA二聚体，其基因组核酸是双倍体正股RNA。REV分为完全复制型和复制缺陷型两种。本试验所创建的PCR方法，所采用的类型为缺陷型REV-T株，与完全复制型相比，有大段gag-pol区基因的缺失和部分env区缺失，唯一仅存完整区域为LTR序列[58]，通过对不同种REV毒株的基因序列进行同源性分析，不同种毒株的LTR序列高度一致，故选取保守的LTR序列设计引物，以病毒RNA为模板进行反转录，得到cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增。灵敏性试验显示，其具有良好的灵敏性。特异性试验显示，阳性对照和阴性对照均正常，禽网状内皮组织增生病病毒出现明显条带，呈阳性。其他所选取的样品，无条带出现，呈阴性。表明根据保守序列所设计出的引物，对禽网状内皮组织增生病病毒具有高度特异性，可区别新城疫病毒(NDV)、禽传染性法氏囊病毒（IBDV）、禽传染性支气管炎病毒（IBV)。重复性试验，选取同时期提取的空白对照SPF雏鸡的cDNA、被禽网状内皮组织增生病病毒感染SPF雏鸡的cDNA和不同时期提取的被禽网状内皮组织增生病病毒感染SPF雏鸡的cDNA作为模板，进行反复PCR扩增试验，结果显示，不但条带清晰而且其位置一致，表明所建立的PCR方法具有很强的重复性和稳定性。且全部试验可在4h内完成，检测样品耗时少，试验周期短，结果准确。本试验所建立的PCR检测方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测耗时短等优点，适用于疫病研究和疫病临诊快速检测，可作为实验室检测的重要手段，为进一步研究REV奠定了技术基础。18 讨论4.2RT-PCR检测方法的实际应用4.2.1所建RT-PCR方法对感染雏鸡主要器官的REV检测为保证所建立的PCR方法具有良好的应用价值，故对感染RE病毒的SPF雏鸡主要器官的REV进行检测。Witter等[59]研究证明，REV毒株在引起法氏囊肿瘤产生病变的同时，主要影响的器官是法氏囊和肝脏。雏鸡在感染REV后，以淋巴细胞或是网状内皮细胞为靶细胞，细胞和体液免疫抑制产生，机体对其他病原或是抗原的免疫应答下降，严重损害了免疫器官的功能。法氏囊作为禽类主要免疫器官，受到病毒感染情况尤为严重，B淋巴细胞在其中分化成熟，生成囊激素，使B淋巴细胞具有免疫活性。脾脏作为禽类最大的外周免疫器官，T、B淋巴细胞都在其中生长，可以参与免疫，还可以合成和分泌免疫活性物质。胸腺是禽类的细胞免疫中枢，T淋巴细胞在胸腺中成长，分化成熟，生成胸腺激素，维持自身免疫系统的稳定[61]。REV同时可在肝脏内大量增殖，使其实质细胞发生变性，造成肝细胞发生严重的功能障碍，导致机体免疫机能降低。由于实质细胞变性坏死和网状细胞增生，可继而诱发肾脏、心脏、腺胃、肺脏，均出现病变。本研究发现，1日龄SPF雏鸡在感染REV的初始阶段，应用所创建的PCR检测方法，可在肺脏、心脏、肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊，检测到REV的存在。本结果与REV主要侵害免疫系统的相关报道相一致[60.61]；肾脏器官在病毒感染后7日，可检测到REV的存在，这与崔治中等对雏鸡在感染REV后，机体产生免疫抑制的研究结果相一致[62]，在病毒感染后期56日时，仅有法氏囊中可检测到REV，其余器官中均未检测到REV，这与翟新验[63]的研究结果高度一致。4.2.2所建RT-PCR方法对临诊样品的检测及其分析[64]。近年来，REV在我国鸡群中的感染已相当普遍通常，具有完整免疫系统的成年鸡在感染REV后，会出现短暂的一过性病毒血症[65]。如果通过鸡胚直接感染了REV或成长数日龄后感染了REV，则通常会引起持续性病毒血症[66]，并引起免疫抑制，有些个体甚至表现为终生病毒血症。同时，雏鸡感染REV会引起肿瘤性疾病的发生，也是目前影响养鸡业健康发展，以及农业产业结构调整过程中“三农”增收重要疾病之一，此病能够引起感染鸡出现生长迟缓，出羽量少、免疫抑制、死亡率升高等等，给养殖业造成经济损失。由于该病的致死率高，所以创建及时有效的临诊诊断方法是非常重要的。本研究选取的临诊血液样品，范围涉及到东北某省养殖场。从选取血液样品的养殖场结构上看，均为REV非免疫养殖场。应用PCR检测方法对血液样品进行检测，结果其阳性率达到92%。以上研究结果说明，REV的感染情况在该地区养殖场已非常严重，应用本试验所建的PCR检测方法，能够有效地鉴别出呈阳性样品，准确性高，检验量大。对该病的监测和预防有着重大的实用意义，具有很强的应用推广前景。19 东北农业大学兽医硕士学位论文5结论5.1成功建立了检测REV的RT-PCR检测方法。该方法，其最佳反应条件为：退火温度为53℃、引物浓度为0.3μmol/l、Mg2+浓度为2.5μmol/l，灵敏度为阳性模板的10-6拷贝。5.2该RT-PCR方法与NDV、IBDV和IBV未见交叉反应，表明具有高度特异性。5.3应用建立的PCR检测方法，对感染雏鸡的主要器官进行REV检测，结果表明，除肾脏外其余器官均能立刻检测到REV的存在；肾脏在感染7日，可检测到REV存在；只有法氏囊一种器官从感染初期到末期始终能检测到REV存在。5.4应用建立的PCR检测方法，对养殖场选取的50份血液样品进行检测。结果表明，50份血液中有46份样品反应呈阳性，即为REV感染个体，感染率为92%。20 东北农业大学兽医硕士学位论文致谢感谢我的导师，郑世民教授的悉心指导，从试验设计到论文撰写，导师都给予了细致的安排和精心的指导。向尊敬的导师郑世民教授致以崇高的敬意和由衷的感谢！感谢导师对我学习、工作、生活以及未来人生道路的指引和帮助。感谢教研室高雪丽副教授、刘超男副教授、吕晓萍实验师给予的支持和帮助；感谢实验室各位同学的热心帮助，在此一并表示衷心的感谢！再一次，向所有曾经帮助、关心、支持我的亲人、老师、朋友和同学们致以衷心的谢意，谢谢你们！21 东北农业大学兽医硕士学位论文参考文献[1]殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社，1997，11[2]MillerPE，PaulMurphyJ，SullivanR，etal.0rbiallymphosarcomaassociatedwithreticuloendotheliosisvirusinapeafowl[J].JAmVetMedAssoc，1998，13(3)：377-380[3]张志，崔治中.鸡肿瘤病料中马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒共感染的研究[J].中国预防兽医学报，2003，9(4):274-278[4]SasakiT,SasakiS,andKoyomaH.ASurveyofanantibodytoRetieuloendotheliosisvirus.inseraofchickensandotheraviansPeeiesinJapan[J].VetMediSci，1993，4(5):885-888[5]RuPB,SpeneseL,HoelzerD,etal.Immunosuppressioninducedbyavianreticuloendotheliosisviruse:Meehanismofinductionofthesuppressorcell[J].Jlmmunol，1979，1(23):1362-1370[6]KimT，MaysJ，FadlyA，etal.ArtificiallyinsertingareticuloendotheliosisviruslongterminalrepeatintoabacterialartificialchromosomecloneofMarek'sdiseasevirus(MDV)altersexpressionofnearbyMDVgenes[J].VirusGenes，2011，2(1)：345-353[7]WaIkerMH，RuPBJ，RubinAS，etal.Specificityintheimmunosuppressioninducedbyavianreticuloendotheliosisvirus[J].InfectImmun，1983，10(4):225-235[8]AlyMK,HassanA.SerologicalsurveyonreticuloendotheliosisvirusinfactionincommercialchickenandturkeyflocksinEgypt.Proceedingsofthe5thScienceConference[J].EgyptVetPouLtryAssociation，1998，3(11):51-68[9]AuLisioCG.Prevalenceofreticuloendotheliosisinchickens’immunofluorescencestudies[J].ProceedingsoftheSocietyforExperimentalBiologyandMedicine，1969，13(10)：178-181[10]BagustT.ReticuloendotheliosisvirusinfectionofVertebrates,4virusinfectionofBirds[J].ElseverSciencePublishersB.VAmsterdam，1993，2(8)：437-454[11]廖明，徐成刚，焦培荣，等.当前禽病多发原因、重要病毒性疾病流行特点与防控对策[J].中国家禽，2011，33（1）：31-33[12]ChenPY，CuiZZ，LeeLF，etal.Serologicdifferenceamongnondefectionreticuloendotheliosisvirus[J].ArchVirol，1987，9(3):233-246[13]吕玲.我国禽病研究的新起点[J].中国家禽禽，2012，34(21)：6-9[14]BarbosaT,ZavalaG,ChengS,etal.FullgenomesequenceandsomebiologicalpropertiesofreticuloendotheliosisvirusstrainAPC-566isolatedfromendangeredAttwater'sprairiechickens[J].VirusRes，2007，12(4)：68-77[15]CoffinJM.Structureoftheretroviralgenome.RNAtumorviruses.MolecularBiologyofTumorViruses[J].ColdSpringHarbor，1982，3:261-368[16]Lopez-LastraM,GabusC,DarlixJ.Characterizationofaninternalribosomalentry22 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