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分类号：Ｓ８５８．２８单位代码：１０１８３研究生学号：２０１５８５４０１９密级：公开吉林大学硕士学位论文（专业学位）双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测猪戊型肝炎病毒抗原方法的建立及流行病学调查ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｙｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｗｉｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓＥｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｉｇａｔｉｏｎ作者姓名：袁悦领域（方向）：兽医指导教师：王新平教授学位类别：动兽医学硕士２０１７年６月 双抗体夹心ELISA检测猪戊型肝炎病毒抗原方法的建立及流行病学调查DevelopmentofdoubleantibodysandwichELISAfordetectionofswinehepatitisEvirusantigenandepidemiologicalinvestigation作者姓名：袁悦领域（方向）：兽医指导教师：王新平教授学位类别：兽医硕士答辩日期：2017年6月 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士（或硕士）学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容夕卜，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：曰期：＞年６月曰１７ 中文摘要双抗体夹心ELISA检测猪戊型肝炎病毒抗原方法的建立及流行病学调查戊型肝炎病毒（HepatitisE，HEV）属于戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属中的成员，是引起人类和动物戊型肝炎病毒感染的病原体。近年研究发现，戊型肝炎作为一种人畜共患病，在人-猪的流行与传播中扮演重要角色，严重威胁着人类的健康，目前认为人HE的流行与传播主要是由猪戊型肝炎病毒引起的。有研究发现从猪体内分离的HEV与当地人分离出的HEV核苷酸序列同源性较高，与猪接触的职业人群血清抗HEV抗体均高于非职业人群，表明HEV在人和猪种间传播可能进行跨种传播。目前，HEV分为四种基因型，其中基因1型和2型主要感染人；基因3型和4型主要感染猪等家畜，同时也可以感染人和非人灵长类，猪感染HEV以基因3型为主。人HEV主要通过消化道感染，以青壮年感染率最高，孕妇感染病死率高达20%。猪感染HEV一般不出现临床症状，常呈现隐性感染，但作为HEV的自然宿主，可能参与引起人类的戊型肝炎。近年来食源性戊型肝炎流行情况严重，已成为全球关注重要的公共卫生问题，因此，掌握猪群HEV的感染情况，已成为保障人身安全的重要措施，对防控人戊型肝炎具有重要的公共卫生学意义。目前有关本病的实验室诊断方法有很多，如RT-PCR、ELISA、免疫印记、血清中和实验、免疫荧光显微实验、免疫电镜实验和免疫胶体金等技术。最常用的诊断方法是RT-PCR和ELISA方法。RT-PCR方法具有操作简单、敏感性高、特异性强等优点，但该方法易出现假阳性、所需检测设备昂贵、仅限于实验室诊断、难以检测大量临床样品。ELISA方法多用于检测病毒感染产生的抗体，难以用于本病的早期、快速诊断。因此，迫切需要建立一种特异、敏感、快速与简便用于HEV临床诊断的实验室检测方法。本研究应用RT-PCR扩增出编码HEV病毒核衣壳P1蛋白的核苷酸序列，并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，构建出pGEX-4T-1-P1重组表达质粒。应用表达、纯化的HEVP1蛋白，制备抗P1蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，并以此建立了检测HEV病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法。试验结果显I 示，建立的检测HEV病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法特异、敏感、快速与简便，可用于大规模HEV感染的流行病学调查。以建立的夹心ELISA方法对吉林与辽宁部分地区猪群感染HEV进行了调查，发现所调查地区均存在着不同程度的HEV感染。该结果将为快速检测HEV抗原提供有效方法，同时为揭示人类戊型肝炎发生与流行提供一定的理论依据。关键词：猪戊型肝炎病毒，P1蛋白，单克隆抗体，双抗体夹心ELISA，流行病学调查II AbstractDevelopmentofdoubleantibodysandwichELISAfordetectionofswinehepatitisEvirusantigenandepidemiologicalinvestigationHepatitisE（HE）isakindofzoonosis,causedbyhepatitisEvirus,whichnotonlycausehugeeconomiclossesbutalsoendangerhumanhealth.ThestudyshowthatHEplaysanimportantroleintheepidemicandspread,indicatingHEVcouldbetransmittedbetweenhumanandpigs.HEVisdividedintofourgenotypes,thegenetype1andtype2infecthumanbeings,thegenetype3andtype4infectswineandotherdomesticanimals.Inrecentyears,HepatitisEhasbecomeglobalpublichealthproblem.TherearemanyreportsrelatedtothelaboratorydiagnosticmethodforHEVdetectionsuchasRT-PCR,ELISA,immunoblotting,serumneutralizationtest,immunofluorescencemicroscopy,immuneelectronmicroscopyandimmunecolloidalgold.ThemostcommonlydiagnosticmethodsareRT-PCRandELISA.RT-PCRhastheadvantagesofsimpleoperation,highsensitivityandstrongspecificity.However,RT-PCRisexpensiveandispronetofalsepositivesandonlyforlaboratorydiagnosisandnotsuitablefordetectionoflarge-scalesamples.Therefore,itisnecessarytoestablisharapidandsimplemethodforHEVclinicaldiagnosis.Inthisstudy,weamplifiedpartialsequencesencodingHEVP1proteinandclonedittotheprokaryoticvectorpGEX-4T-1toconstructtheexpressionplasmidpGEX-4T-1-P1.ThepositiveplasmidwastransformedintotheexpressionstrainBL21.TherecombinantproteinwasexpressedundertheIPTGinductionandpurifiedbyurea.TheBALB/cmicewereimmunizedwiththepurifiedrecombinantP1proteinemulsifiedwithFreund’scompleteadjuvanttogenerateeithermonoclonalorpolyclonalantibodies.AdoubleantibodysandwichELISAmethodfordetectionofhepatitisEvirusantigenwasestablished,andthereactionconditionswereoptimized.DetectionofthesuspiciousHEVsamplescollectedfromseveralpigfarmsinJilinProvinceandLiaoningProvincerevealeda9%-33%ofpigsasHEV-positive.TheresultsnotonlyprovideaneffectivemethodforrapiddetectionofHEVantigenbutalsoprovideatheoreticalbasisforthedetectionofhepatitisEinfection.III Keywords:SwinehepatitisEvirus,P1protein,monoclonalantibody,doubleantibodysandwichELISA,epidemiologicalinvestigationIV 目录引言.....................................................1第一章文献综述..........................................31猪戊型肝炎的研究背景.................................32HEV的病原学研究.....................................43HEV流行病学研究.....................................74戊型肝炎的检测.......................................95戊型肝炎的治疗......................................11第二章HEVP1蛋白原核表达..............................132.1实验材料..........................................132.2实验方法..........................................152.3结果..............................................192.4讨论..............................................212.5小结..............................................22第三章HEVP1蛋白单克隆抗体的制备......................233.1实验材料..........................................233.2实验方法..........................................243.3结果..............................................273.4讨论..............................................31V 3.5小结..............................................31第四章夹心ELISA检测HEV方法建立与应用...............324.1实验材料..........................................324.2结果..............................................354.3讨论..............................................404.4小结..............................................41结论....................................................42参考文献................................................43导师简介................................................53作者简介................................................54致谢..................................................55VI 英文缩略词表英文缩略英文全称中文全称HEVhepatitisEvirus猪戊型肝炎病毒ORFOpenreadingframe开放性阅读框RNARibonucleicacid核糖核酸RT-PCRReversetranscriptionPCR反转录PCRdNTPDeoxy-ribonucleosidetriphosphate三磷酸脱氧核（糖核）苷ODOpticaldensity光密度值BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白DMEMDulbeccomodifiedEaglemem改良Eagle培养基IPTGIsopropy1异丙基-β-D-硫代吡喃LBLauriabertanimediumLB培养基SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠AmpAmpicillin氨苄青霉素bpBasepair碱基对ntnucleotide核苷酸KDKilo-dalton千道尔顿PAGisopropy-β-D-thiogalactoside]异丙基-β-D-硫代半乳糖苷PBSSodiumphosphatebuffer磷酸盐缓冲液ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验HRPHorseradishperoxide辣根过氧化物酶EBEthidiumbromide溴化乙啶VII 引言戊型肝炎病毒（HepatitisE，HEV）属于戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属中的成员，是引起人类和动物戊型肝炎病毒感染的病原体。戊型肝炎（hepatitisE,HE）是由戊型肝炎病毒（HEV）引起一种经肠道传播的人畜共患性传染病。该病最初在发展中国家广泛流行，尤其是非洲和亚洲部分地区，目前在全世界各个地区普遍存在。近年研究发现，该病在人-猪的流行与传播中扮演重要角色，严重威胁着人类的健康，目前认为人HE的流行与传播主要是由猪戊型肝炎病毒引起的。研究发现从猪体内分离的HEV与当地人分离出的HEV核苷酸序列同源性较高，与猪接触的职业人群血清抗HEV抗体均高于非职业人群，表明HEV在人和猪种间传播可能进行跨种传播。临床症状和实验室诊断表明，人HEV主要通过消化道感染，以青壮年感染率最高，孕妇感染病死率高达20%。猪感染HEV一般不出现临床症状，常呈现隐性感染，但作为HEV的自然宿[1]主，可能参与引起人类的戊型肝炎。1983年，Balayan首次发现HEV病毒粒子，在此之前一直将HEV认为是一种非甲非乙型的肝炎病毒。直到1989年东[2]京国际会议上正式将HEV命名为戊型肝炎病毒，1990年Reyes首次获得病毒[3]的全基因，1997年Meng等人首次报道猪源戊型肝炎病毒，HEV为球形的、无囊膜、单股正链RNA病毒，病毒粒子大小为27-34nm，HEV为戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属唯一成员。HEV有一个血清型，4个主要的基因型，基因型1和2仅感染人类，基因型3和4主要感染猪等家畜，同时也可以感染人和非人灵长类，猪感染HEV以基因3型为主。其中基因型1和2广泛分布于发展[4]中国家，基因3型已经成为发达国家一个重要的病原体。自2007年上海某郊区猪场首次分离到基因3b亚型毒株以来，随后在中国的五个省份均存在基因3型HEV的流行。2013年在河北保定某猪场首次获得基因3a亚型部分基因序[5]列，2016年曹玉峰于本实验室首次获得基因3a亚型毒株全基因组，并证实人和猪群种间传播的可能。近年来食源性戊型肝炎流行情况严重，已成为全球关注重要的公共卫生问题，因此，掌握猪群HEV的感染情况，已成为保障人身安全的重要措施，对防控人戊型肝炎具有重要的公共卫生学意义。目前有关本病的实验室诊断方法有很多如RT-PCR、ELISA、免疫印记、血清中和实验、免疫1 荧光显微实验、免疫电镜实验和免疫胶体金等技术。其中最常用的诊断方法是[6,7]RT-PCR和ELISA方法。RT-PCR方法具有操作简单、敏感性高、特异性强等优点，但该方法易出现假阳性、所需检测设备昂贵、仅限于实验室诊断、难以检测大量临床样品。ELISA方法多用于检测病毒感染产生的抗体，难以用于本病的早期、快速诊断。因此，迫切需要建立一种特异、敏感、快速与简便用于HEV临床诊断的实验室检测方法。本实验根据HEV编码的病毒核衣壳抗原特性，应用RT-PCR扩增出编码HEV病毒核衣壳P1蛋白的核苷酸序列，并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，构建出pGEX-4T-1-P1重组质粒。阳性质粒转化到表达菌株BL21后，应用IPTG诱导表达重组蛋白。将纯化后的蛋白先后用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后免疫小鼠，制备抗P1蛋白鼠源单克隆抗体，再用同样的乳化方法免疫兔子，制备抗P1蛋白兔源多克隆抗体。用制备的抗体建立双抗体夹心ELISA方法检测HEV抗原，并优化了反应条件。试验结果显示，建立的检测HEV病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法特异、敏感、快速与简便，可用于大规模HEV感染的流行病学调查。应用建立的双抗体夹心ELISA方法对吉林省和辽宁省部分地区疑似HEV感染猪粪便样品进行检测，结果显示不同地区猪群均存在不同程度的HEV感染。该结果将为快速检测HEV抗原提供有效方法，本研究为临床上HEV流行病学调查、早期快速诊断、以及本病的预防和治疗提供可靠的方法。同时为揭示人类戊型肝炎发生与流行提供一定的理论依据。2 第一章文献综述1猪戊型肝炎的研究背景戊型肝炎（HepatitisE，HE）目前被视为一种由戊型肝炎病毒引起的经粪-口传播的非甲非乙型肝炎，该病临床症状与病理表现与甲肝相似，可经肠道传[8,9]播。HE做为一种新发的人畜共患性传染病，给人类的健康造成了严重的威胁，严重影响了养猪业的发展，最初由于环境遭到污染以及基础设施不够健全导致HE的发病和流行，目前该病主要流行于发展中国家，发达国家一般以散[10,11]发为主。戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）是引起急性肝炎或者爆发性肝炎的主要病原体，HEV是戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属的唯一成员[12]。HEV感染是一个世界性公共卫生问题，通过饮用受污染的水或者食用未煮熟的食物感染戊型肝炎，经粪-口途径传播流行，该病的易感人群是青少年和孕妇，孕妇感染导致急性肝功能衰竭，病死率为1%-4%，免疫功能低下的患者死[13]亡率高达20%。HEV不仅仅能感染人类，也可以感染非人的灵长类、猪、禽类、啮齿类等动物，目前认为猕猴是最有价值的动物模型，而猪是HEV的主要[6,14]贮存宿主。HEV感染可导致急性和慢性肝炎，戊型肝炎作为一种自限性疾病，受感染者没有明显临床症状和病理变化，但是HEV能引起患病动物的持续[15,16]性感染和免疫功能低下，对人类潜在的威胁不容忽视。HEV基因组包含三个开放阅读框架ORF1、ORF2和ORF3，其中编码病毒的核衣壳ORF2区域分为S、P1、P2三个线性结构域，通过对P1结构域的表达有助于进一步了解HEV核衣壳的稳定性，同时也为了解其他结构域的功能和结果提供理论基础[17]。HEV存在变异大、遗传不稳定等特点，导致其编码的核衣壳抗原表位多种多样，对ORF2区域的研究也可以更好的了解变异后病毒核衣壳抗原表位的分布，同时为今后HEV疫苗的研究提供理论依据。近几年随着戊型肝炎感染率逐渐升高，建立一种快速、简便的流行病学检测方法不仅仅有利于戊型肝炎临床[18,19]诊断，同时也可以防止该病的发生和传播。3 2HEV的病原学研究2.1HEV的基因组、蛋白[20]1983年印度学者Balayan在疑似甲肝患者体内检测甲肝病毒阴性，自此出现一种新的肠道型肝炎病毒，由于这种病毒形状似嵌杯状，所以将这种病毒归属于杯状病毒科，此后有研究发现HEV基因组序列同源性与和杯状病毒差别较大，所以在国际病毒分类学委员会第八次报告上将HEV归属于戊型肝炎病毒[21-23]科戊型肝炎病毒属。戊型肝炎病毒（HEV）是一种二十面体没有包膜的单链RNA病毒，病毒粒子直径大小为27-34nm，基因组全长约7.3kb，HEV独’’特的基因组结构为5端的7-甲基鸟嘌呤帽子结构（Cap）和3端多聚腺苷残基’’’尾（PolyA），基因组5和3两端分别有一段短非编码区（UTR），5非编码’区约由58核苷酸（nt）组成，3非编码区约由68个核苷酸（nt）组成。HEV基因组包含三个开放阅读框架（ORF），ORF不同区域分别编码病毒的结构蛋’白和非结构蛋白，ORF1是位于5端的一段非结构基因，由第28-5107个核苷酸组成，与病毒RNA合成有关，其核苷酸易发生变异，ORF1保守区域表达与病毒复制有关的多种酶类，最保守区域位于2011-2325nt，该区域能够保持HEV基因的稳定性，曾有研究发现ORF1可能与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用’有关。ORF2位于3端5107-7087nt，做为HEV核苷酸序列最保守的区域，编码第599到660氨基酸组成的核衣壳蛋白，ORF2与病毒组装、细胞附着和免疫原性有关，HEV其主要抗原表位集中在病毒核衣壳。因此曾有人推测ORF2编码的蛋白包含了病毒的细胞受体结合位点，ORF2编码的蛋白区域结构复杂多样，从起始密码子开始出现信号肽序列和富含碱性氨基酸的核衣壳样区域，所以ORF2编码的区域与HEV病毒粒子核衣壳形成密切相关，ORF2的抗原表位主要集中在在ORF2段的C端，这些抗原位点与患病动物急性期血清抗HEV-IgG和抗HEV-IgM抗体的产生有关。该蛋白具有三个线性结构域S、P1和P2，S结构域编码第118-313个氨基酸，与HEV粒子核衣壳组装有关，P1蛋白具有主要的免疫优势表位，编码第313-453个氨基酸，能够增强HEV病毒粒子的稳定性，P1结构域是亚单位基因工程疫苗的首选区段，P2结构域从第454个氨基酸到ORF2区域的末尾，折叠成HEV粒子的“棘”和三个“环”，与抗原抗体4 中和作用有关。ORF3位于ORF1和ORF2之间与ORF2重叠，大小约为369nt，编码114个氨基酸组成的小分子磷蛋白，有研究表明ORF3有可能与亚细胞定位和病毒形态发生有关，ORF3蛋白是一种多功能蛋白，与病毒复制和发病机制研究是密切相关的，同时ORF3蛋白与病毒的形态以及病毒从被感染细胞中病毒粒子的释放有关，此外还与发病初期机体的血清抗HEV-IgG抗体有关[24,25]。2.2HEV基因型至今为止HEV基因型还没有一个固定的分类标准，国内外各专家学者对HEV基因型的分类多种多样，主要是根据HEV全基因组、氨基酸序列、核苷酸序列同源性以及遗传距离将HEV进行分型，根据HEV全基因组序列的差异将HEV为四种基因型，目前这种分类方法应用最为广泛，根据基因型的不同大体细分为很多个基因亚型，基因型1包括1a、1b、1c、1d、1e五种亚型，基因型1以缅甸株为主在全世界普遍存在的基因亚型；基因型2包括2a、2b两种亚型，以墨西哥株为代表，在非洲部分地区散发出现。基因型3包括（3a、3b-3j）10个亚型，以美国HEVUS-1和US-2株为代表，我国上海和吉林某地区也曾报导过，基因型4包括（4a-4n）12个亚型，主要以中国辽宁、北京以及台湾[26,27]毒株为主。后续有学者将禽HEV独立出来做为一种新的基因型，尽管HEV基因型具有多样性，不同基因型氨基酸序列同源性较高、交叉免疫反应保护较好，所以目前血清型只有一种，因此目前对于HEV基因型深入研究变的相对重要一些，通过对HEV基因型的进一步了解，进而了解HEV的起源和流行，从而预防该病的发生和传播。HEV不同基因型感染不同动物都有不同的宿主，并产生不同的临床症状。基因型1和2主要感染人类，主要流行在发展中国家，据估计，世界71%的人口均感染戊型肝炎病毒基因型1和2，同时每年大约有300万急性戊型肝炎感染者感染HEV均属于基因型1和2，基因型3和4主要作为工业化国家的人畜共患的主要病原体，我国主要以基因型3和4感染报导的较多。2007年，上海部分地区猪群血清中获得了基因3a亚型部分基因[28]组，2017年，曹玉峰首次在东北部分地区猪群的粪样中获得HEV基因3a亚型的全基因组，并证实了HEV跨物种传播的可能性。不同的基因型在临床上表5 现出不同的临床症状，急性期肝炎主要由基因1型引起，基因型3主要引起慢[29]性感染，HEV基因型4感染似乎是无症状的，需要进一步确诊。2.3HEV的理化性质HEV粒子直径大小为27-34nm，在电镜下有两种形态，一种为不完整的HEV病毒粒子，具有电荷透亮区，电镜下呈现圆形亮光，蔗糖梯度离心沉降系数为165s，另一种为完整的HEV病毒粒子，由于内部密集，电镜下呈现黑白相间的圆球，蔗糖梯度离心沉降系数为183s。病毒粒子的浮密度在酒石酸钾和3甘油中的浮力密度为1.189g/cm，在蔗糖溶液中为1.349g/mL，在氯化铯中的3浮力密度为1.40g/cm。高温达56℃可以将病毒粒子部分灭火，高达60℃可将其全部灭活，反复冻融可导致病毒活性降低，HEV在含有镁离子和锰离子的碱[1,30]性环境中可以长期保存。2.4HEV细胞培养由于缺乏合适的细胞培养系统，导致HEV体外培养比较困难，同时缺乏小动物感染模型，严重阻碍了HEV感染细胞机制的研究，PLC/PRF/5细胞培养系统是第一个有效的HEV细胞培养系统，这种细胞是由人类的肝癌细胞和人类肺癌A549细胞衍生出来的，基因3型JE03-1760F毒株成功的在PLC/PRF/5细胞[31]培养系统中得到。随着研究的深入，从患病动物粪便和血清中分离到HEV所有基因型均可以应用于PLC/PRF/5细胞培养系统。通过这项研究证实HEV不仅分布在肝，也感染肺、肾、脾、甚至结肠、胆汁、淋巴结、扁桃体中也有HEV的存在，戊型肝炎病毒感染宿主的免疫应答增强的肝损伤的机制尚不清楚[32,33]。目前研究较多的为原代细胞、传代细胞和二倍体细胞培养。原代细胞培养最初是Tam等人用10%缅甸株的粪便悬液接种猕猴，血液中丙氨酸氨基转移酶升高时，收集病毒粒子感染细胞，按照正常的细胞培养条件培养受感染细胞，结果证实该猕猴肝细胞系可以使病毒在体外复制。HuangRT等人曾在人胚肺二倍体细胞接种新疆株HEV87A粪便悬液，经第二次传代的细胞，在电镜下观察到细胞内有大量的病毒粒子，新疆株HEV87A毒株粪便悬液感染人肺癌细胞系，传代培养的细胞可见到明显的细胞病变。DongC等人用同样的方法将HEVSAR55毒株接种于PLC/PRF5细胞系，在细胞传代培养过程中病变明显[34]。6 3HEV流行病学研究HEV通过粪-口途径感染，主要通过饮用污染水源和食用未熟的感染HEV的肉进行传播，其次通过母婴垂直传播和输血等间接接触的方式进行传播。国内专家学者曾报道，献血者很多为HEV病毒的携带者，由于没有对血液进行及时检测，进而导致受血者感染戊型肝炎。污染的水源与戊型肝炎感染密切相关。基因1型和2型主要感染人，基因3型和4型做为人畜共患病的主要病原体，猪做为HEV的贮存宿主，所以猪是HEV的主要传染源，其中食源性传播是感染HEV的重要途径。1997年美国专家报导过第一例猪戊型肝炎以来，随[35]后许多发达国家和发展中国家均报导过猪戊型肝炎。随着专家和学者对HEV的不断研究，发现HEV的易感动物比较广泛，包括人类、灵长类、猪、牛、羊、啮齿动物等，最新研究表明HEV也可以感染雪貂、狐狸和蝙蝠，戊型肝炎是一种动物源性疾病，猪作为HEV最主要的贮存宿主，可以传染给人和黑猩猩。猪HEV不仅可以在种间进行传播，也可以传播给人，全基因组序列分析发[36]现人和猪的HEV的同源性达到99%。HEV感染首次在1955-56年爆发于印度，感染人数达到29000人，之后戊型肝炎感染几次爆发在中国，印度、索马里、尼泊尔、乌干达等国家。1986年我国新疆戊型肝炎流行，发病人数为十几万人，死亡人数达到700多人，50%以上是孕妇。之后戊型肝炎散发地区包括内蒙古、吉林、河北、湖北等地。欧洲、北美洲、日本和新西兰曾食用未煮熟的猪肉导致食源性感染戊型肝炎。2014年泰国HEV急性感染。经鉴定与猪源HEV变异有关，2015年对韩国一家屠宰厂工人的调查发现，HEV感染血清IgG阳性率为33.5%，此外台湾、加拿大、日本、英国等地区也检查出猪源[37]HEV。总结戊型肝炎爆发的原因，通常在大暴雨、洪水疫情、地震、等自然灾害发生后，动物作为主要的传播媒介通过饮用污染水源或食用未煮熟的食物，导致该病的发生和流行，另外在干燥的夏季也容易爆发该病，原因是当河流或溪流中的水减少时，导致水中粪便污染浓度的增加，感染率进而升高。戊型肝炎在世界范围流行形式包括：大流行、爆发、散发零星流行。近几年，HEV引起了世界性的关注，因此戊型肝炎常常呈散发，流行，大流行、爆发等[38]已经很少出现。7 3.1临床症状和病理变化HEV感染产生广泛的临床表现与甲肝的临床症状相似，大多数人感染HEV的急性病例会表现出急性肝炎如黄疸、呕吐、腹泻、发热、粪尿呈黄色等[39]症状，但戊肝比甲肝临床症状更严重，死亡率也比甲肝高很多，二者鉴别诊断主要依据特异性血清学检查。戊型肝炎潜伏期大约为15-60d，根据临床症状的不同分为以下几种类型：急性黄疸性肝炎、急性肝炎无黄疸症状、急性重度[40-42]肝炎以及急性淤胆性肝炎，临床发病以急性黄疸性肝炎为主。戊型肝炎又被称作肠炎型肝炎，所以临床长表现出肠炎型症状。孕妇戊型肝炎病毒感染的临床过程是很严重的，往往会导致暴发性肝衰竭和怀孕后期死亡，死亡率高达20%-25%，特别是生活在发展中国家的人群，对于HEV引起孕妇高死亡率的原因目前尚不明确，但是不会造成胎儿畸形。临床上实验证实，在HEV感染的受试者体内检测但肝脏转氨酶升高，当肝功能指标检测不正常的时候，且黄疸症状出现1-2w以后，可在血液中检测到HEV的RNA，随着病程的增长RNA在粪便中的含量逐渐高于血液中RNA的含量，在酶免疫检测发病初期的患者显示抗戊型肝炎病毒免疫球蛋白IgM明显升高，持续时间为4-6个月。临床病理表现在肝脏表面有出血点，肝门淋巴结肿大，并伴有肠系膜淋巴结肿大。病理组织切片显示肝细胞变性坏死，肝小叶中央静脉周围的肝细胞的肝细胞呈溶解[43]性坏死，门静脉周围主要为单核细胞和淋巴细胞浸润为主。3.2HEV的传播与防控戊型肝炎多发生在发展中国家，所以社会的发展程度是HEV发生和传播的重要因素。1998年印度西部部分地区戊型肝炎流行病学调查发现，男性HEV感染率对于女性，外出旅行的感染者多于未外出旅行的，低收入人群患戊型肝炎感染率高于高收入人群。另外，接触污染的水源一样能导致该病的感染率，[44,45]包括猪场兽医等职业人员血清抗HEV-IgG高于普通人群。HEV主要通过污染的水源和使用未煮熟的食物感染，HEV传播途径是粪-口传播或者通过献血、器官移植过程中血液传播，由于个人或者环境卫生设施不健全导致该病的流行。HEV感染宿主范围广泛包括哺乳动物、禽类、鱼类，导致戊型肝炎防控[46-48]存在诸多困难，郑英杰等人曾证实过猪是戊型肝炎病毒的主要携带者，人戊型肝炎感染主要来自猪。8 4戊型肝炎的检测4.1RT-PCR目前RT-PCR方法应用于多种疾病的早期检测，在分子生物学领域广泛应[49,50]用，常用来检测发病初期动物粪便、唾液、胆汁和血清。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA，但是常常由于操作不当出现假阳性。HEV全基因序列中只有ORF1区段变异性较高，ORF2和ORF3区域都很保守，应用RT-PCR方法可以对任何一段基因序列进行扩增。HEV的RT-PCR检测方法运用一般的程序，先从组织或者粪便中提取RNA，反转录合成cDNA，应用不同的特异性引物进行分段扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。之前有学者曾建立一种新型多重RT-PCR方法，用于检测甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，设计三对针对甲、乙、戊型肝炎病毒的特异性引物，将检测结果与阳性毒株测序结果对比，显示多重RT-PCR方法检测三种病毒特异性均达到100%，HBV，HCV和HEV敏感性分别达到89%，87%，74%所以目前多重RT-PCR方法可以做为一种快速、简单可靠、灵敏的肝炎检测方法。4.2酶联免疫吸附实验（ELISA）酶联免疫吸附实验（ELISA）方法常用于检测HEV重组蛋白，该方法是检测HEV抗原和血清HEV抗体的常用方法，通过在酶标板上包被重组蛋白或人[15]工合成肽，再加入待检血清，加入酶标二抗，最后加底物显色。其中HEV抗原包括，发病动物体内分离出的全病毒抗原、组织细胞培养得到的全病毒抗[51-55]原、表达抗原以及合成肽抗原。4.3血清中和实验[14]1997年Meng等人在运用RT-PCR方法基础上又使用血清中和实验。中和包括简单定性中和实验法、固定病毒稀释血清法、固定血清稀释病毒法和空斑减少法。简单定性中和实验主要用于病毒的检测，操作方法是将HEV病毒液稀释到一定浓度后与抗血清等比例混合，对照组则将HEV病毒液与正常动物血清混合，混合后接种易感细胞或者实验动物，细胞出现病变或者动物不死亡可验证HEV的存在，相反证明无HEV感染。固定病毒稀释血清法多用以检出待检血清中的中和抗体，将病毒倍比稀释后与抗血清结合设为实验组，与正常动9 物血清结合设为对照组，37℃温箱中放一个小时后，接种易感细胞或者实验动物，对照组动物死亡实验组正常，可验证病毒的存在。固定病毒稀释血清法的判断标准为：中和指数＞50者为阳性，10-49为可疑，＜10为阴性。固定血清稀释病毒法常用于检测抗病毒血清的中和效价。空斑减少法常用于细胞培养上的血清中和实验，将病毒液稀释到一定浓度后，设置不同稀释度的血清，当空斑减少50%血清稀释度即为该血清的中和价。由于缺乏体外感染模型，极大的影响了血清抗HEV抗体的检测以及血清中和滴度的定量分析，也影响了HEV刺激机体产生的抗体反应机制和免疫学机制的研究，国内有学者曾成功建立肝癌细胞系感染模型，应用此模型并结合用血清中和实验，定量评价病毒感染肝癌细胞后不同的中和能力，该方法首先将待检HEV稀释一定倍数加到待检血清[56,57]中，37℃温箱中放一个小时后，接种到易感细胞中。4.4免疫电镜实验（IEM）免疫电镜技术（IEM）主要分两类：免疫凝集电镜技术和免疫电镜定位技术。IEM的主要原理是在电子显微镜下通过追踪抗体标记物进而指示抗原的位置。1980-1983年前苏联学者Balayan等人使用免疫化学技术与电镜技术结合的[1,58]方法，通过IEM技术在患者粪便悬液中观察到了HEV病毒粒子。IEM同RT-PCR方法均可以检测发病初期、潜伏期以及恢复期粪便、唾液、血清和胆汁中的病毒粒子，其中电镜下观察到3个以上病毒粒子或者3个以上与抗体反应的病毒凝聚物则判断为阳性，但是IEM要求病毒粒子密度足够大才能在镜下被检出，该方法没有RT-PCR灵敏度高，操作没有酶联免疫吸附实验（ELISA）简便，需要特殊的精密仪器，所以IEM至今不被广泛应用于HEV[59]的检测。4.5免疫荧光显微实验（IFE）免疫荧光技术是免疫学特异性反应与荧光素标记物相结合的技术，根据荧光素发光的原理将病毒定位在细胞内，在荧光显微镜下观察。IFE用于检测肝脏组织中的HEV抗原，通过纯化后的经荧光标记素标记的抗HEV-IgG检测HEV，Bradley等人报道过IFE方法成功检测到了HEV感染的黑猩猩的肝脏中HEV抗原。IFE方法同样适用于HEV感染潜伏期和急性肝炎感染期，该方法特[60]异性强，灵敏度高，但是不能长期保存。10 4.6免疫印记（IB）IB这种方法检测HEV具有特异性高的特点，是用来确诊戊型肝炎病毒感染的有效手段。该方法是通过表达重组蛋白或者重组抗原进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到硝酸纤维膜上后加入被检血清中抗HEV-IgG和IgM抗体，当血清HEV抗体为阳性时，重组蛋白或抗原与血清抗体结合，加入抗人或猪酶标二抗，最后加显色液，加入受HEV感染的血清后，硝酸纤维膜上出现阳性条带。[30,但是，该方法操作时间长，常常用于实验室检测无法进行临床样品大量检测61,62]。5戊型肝炎的治疗HEV做为一种自限性感染，治疗以一般及支持治疗为主，辅以适当药物，避免使用损肝药物。临床实验证实抗病毒药物治疗不做为治疗急性戊型肝炎的首选，急性肝炎患者一般选择肝移植做为治疗的方法，近几年研究发现，聚乙二醇干扰素等抗病毒药物成功应用于肝移植患者和血液透析患者，但是干扰素不能被用于肾脏移植患者，需要进行肾脏移植的慢性HEV感染患者常口服利巴韦林进行治疗，利巴韦林不仅仅对肾脏移植、胰脏移植的患者有效，也用于治疗心脏移植的患者，欧洲曾有报道，利巴韦林能够有效的治疗免疫功能良好的急性HEV感染者，在印度某地区利巴韦林能够有效的治疗HEV基因1型感[16,33]染，临床上利巴韦林的治疗。HEV只有一种血清型，在防控方面结合综合性预防措施以接种疫苗为主，但是由于HEV缺乏成形的细胞培养系统，所以目前对于戊型肝炎的活疫苗和弱毒疫苗方面的研究比较少，对于戊型肝炎研究较多的为DNA疫苗、原核表达重组蛋白疫苗、真核表达重组蛋白疫苗、基因工程亚单位疫苗。目前国际上还没有一种已经上市的戊型肝炎疫苗，但是在黑猩[63-66]猩、猕猴等动物实验进行的疫苗研究都很顺利。市场上比较认可的两种疫苗是昆虫细胞中表达的rHEV疫苗和以及在大肠杆菌中表达的HEV239疫苗，rHEV疫苗是Li等人通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统，成功表达目的蛋白大小为30KD-100KD片段，这些片段自我组装成略小于病毒粒子的不完整颗粒，将rHEV疫苗免疫尼泊尔部分地区的志愿者检测其安全性和免疫原性，实验结[67-71]果表明该疫苗虽足够安全，但是还没有完全应用于市场。HEV239疫苗的11 研发来自厦门大学，它是应用HEV基因1型抗原制备得到的，是一个截短的ORF2蛋白，有293个氨基酸，约26KD，其安全性和有效性评估在中国南部顺利完成，全球112604个人被选为受试者，临床结果显示该疫苗对94%的肝炎患者有效，后续又有实验证实HEV239疫苗对HEV基因型4感染有效，目前中[72-74]国已经批准使用HEV239疫苗。12 第二章HEVP1蛋白原核表达HEV是一种单链正股RNA病毒，具有5’端帽子结构（Cap）和3’端的多聚腺苷酸尾巴（PolyA），基因组全长7.3kb，HEV具有4个基因型，1个血清型，基因1，2型只感染人，基因3，4型是人畜共患病的病原体[75,76]。HEV编码的蛋白从N端到C端具有三个相互重叠的开放阅读框ORF1、ORF2、ORF3，ORF1编码病毒非结构蛋白，ORF2编码病毒核衣壳蛋白，ORF3编码的蛋白质目前不够清楚，HEV其主要抗原表位集中在病毒核衣壳，核苷酸序列最保守，曾有人推测ORF2编码的蛋白包含了病毒的细胞受体结合位点[77-82]。核衣壳蛋白具有三个线性结构域S、P1、P2，P1蛋白具有主要的免疫优势表位，因此常成为亚单位基因工程疫苗的首选区段。本实验将ORF2编码的P1蛋白作为目的蛋白进行原核表达，制备出抗P1蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，并建立了双抗体夹心ELISA方法，在HEV感染初期方便对戊型肝炎做[83,出早期诊断，为临床上HEV的流行病学调查提供了方便、快捷的检测手段84]。2.1实验材料2.1.1粪便、病毒株、菌株及载体样品采自吉林省不同地区疑似戊型肝炎病毒感染的猪场，病毒株为本实验室从发生严重腹泻、呕吐、黄疸的病猪中分离和保存的毒株，由-80℃保存。菌株为Top10和BL21，载体为pGEX-4T-1质粒，均由本实验室于-80℃保存。2.1.2主要仪器设备PCR扩增仪（ETC811，东胜龙）；；4℃冰箱（中国海尔）；酶标仪（中国）；天能凝胶成像系统；超声破碎仪（SONICS）；上海博迅高压灭菌锅；长沙湘智高速冷冻离心机；SANYO二氧化碳培养箱；SANYO超低温冰箱；TECAN全自动酶标仪。2.1.3试剂和溶液13 氨苄青霉素、限制性内切酶BamHI、EcoRI、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、无水乙醇、异丙醇、氯仿购自深圳市易瑞生物技术有限公司。ProteinMaker、DNA胶回收试剂盒、TRIzol购自美国Invitrogen公司。2.1.3.1质粒提取相关溶液的配制①SolutionⅠ：45ml20%Glucose(1.1M)，20ml0.5MEDTA(pH8.0)，25mL1MTris-Hcl(pH8.0)，加入910mL去离子水定容至1L，高温高压灭菌后4℃保存。工作浓度为20mg/mL，使用前按照1：25的比例加入RNaseA。②SolutionⅡ：10%SDS50mL，2NNaOH50mL，500mL去离子水定容，新鲜配制，与室温保存。③SolutionⅢ：57.5mL醋酸，147g醋酸钾，去离子水定容至500mL，新鲜配制，室温保存。④1mMEDTA：0.37gNa2EDTA·2H2O，加灭菌水将溶液定容至1L，pH8.0，室温保存。⑤TE溶液：1mMEDTA，10mMTris-Hcl，pH8.0。2.1.3.2蛋白纯化相关溶液配制①LysisBuffer：1mMEDTA，100mMNacl，50mMTris，PH8.0，室温保存。②8M尿素：10mMTris0.6055g，0.1MNaH2PO47.8g，尿素240.24g，溶于500mL去离子水中，pH8.0，室温保存。③Tris-Hcl：称取181.7gTris溶于800mL的去离子水中，充分混匀，去离子水定容至1L，pH8.5，室温保存。2.1.3.3SDS-PAGE相关溶液配制①Tris-HCl（1M）：称取48.44gTris溶于300mL的去离子水，充分混匀，pH6.8，室温保存。②Tris-HCl（0.5M）：称取30.2gTris溶于300mL的去离子水，充分混匀，pH8.8，室温保存。③30%丙烯酰胺：1g双甲叉丙烯酰胺，29g丙烯酰胺，定容至100mL。④5×Glycine电泳缓冲液：12.08gTris-base，188gGlycine，10gSDS，去离子水定容至1L。14 ⑤10%过硫酸铵：10g过硫酸铵溶于100mL去离子水中，4℃保存。⑥考马斯亮蓝染色液：450mL甲醇，100mL冰醋酸，2.5gG-250混匀定容至1L，滤纸过滤除去颗粒样溶物，室温保存。⑦脱色液：450mL冰醋酸，50mL甲醇，去离子水定容至1L，混匀。2.2实验方法2.2.1引物设计参照GenBank国内外收录的HEVORF2基因组序列，并根据pGEX-4T-1克隆载体的特点，用DNAStar软件设计了一对引物，预期扩增产物大小为537bp，引物序列如下：上游引物UP:5'-CGCGGATCCGTTATTCAGGATTACGATAAC-3'下游引物DN:5'-CCGGAATTCTTAGGGGTAATCAACAGTATC-3'2.2.2病料总RNA的提取病料中总RNA提取按照本文献方法[85]进行。产物于-80℃保存备用或直接进行RT-PCR。2.2.3反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）2.2.3.1cDNA的合成按照MLV说明书规范操作，总反应体系10µL：①RNA/引物混合物的制备;随机引物1µLRNA模板5µL②70℃水浴10min，冰上冷却2min;③RT反应体系15 扩增体系组成各个组分含量上述混合溶液6uLMLV反转录酶（20U/µL）0.25uLdNTPMixture（各10mmol/L）0.5uL5×MLVBuffer2uLRNaseinhibitor（40U/µL）0.25uLRNasefreeddH2O1uL⑤42℃静置lh，70℃水浴15min后冰浴5min，产物于-80℃保存备用。2.2.3.2PCR扩增使用上述获得的cDNA模板进行目的基因的扩增，反应总体系25µL：PCR扩增体系组成各个组分含量cDNA2uldNTPs（2.5mmol）3ulForwardPrimer（上游引物）1ulReversePrimer（下游引物）1ulRNasefreeddH2O15ul将反应体系混匀置于PCR扩增仪内，反应程序如下：95℃、5min，进入循环：95℃、30s，56℃、30s，72℃、50s，共36个循环；最后72℃、10min。取6µLPCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测观察，最终回收目的基因片段。2.2.4pGEX-4T-1-P1表达载体的构建2.2.4.1PCR扩增片段和pGEX-4T-1双酶切在-20℃冰箱取出限制性内切酶BamHI/EcoRI、10×KBuffer、置于冰上，将以上溶液加入1.5mlEP管中，混匀后5000r/min离心1min，37℃温箱中酶切5h，最终将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析并进行胶回收。用限制性内切酶BamHI/EcoRI对PCR回收片段和pGEX-4T-1双酶切，操作步骤如下：16 酶切反应体系各个组分含量DNA6μgBamHI1uLEcoRI1uL10×KBuffer2uLddH2O10uL2.2.4.2酶切后回收与纯化将符合目的片段大小的条带参照TaKaRa公司的回收试剂盒回收目的片段，操作过程如下：（1）在紫外光下切掉含有目的条带的凝胶块儿，转移到EP管中按照1：3（W/V）加入BufferGM溶解胶块。（2）当EP管中的BufferGM将胶块完全溶解掉以后，将混合溶液转移到SpinColumn，12000r/min离心1min，重复将管底溶液再次转移到SpinColumn中，重复步骤一次。（3）向SpinColumn管中加入800μL的BufferWB，12000r/min离心1min，重复步骤一次。（4）将SpinColumn置于CollectionTube上，室温12000r/min，离心1min，重复步骤一次。（5）将SpinColumn置于新的1.5mLEP离心管上，室温放置4min，在SpinColumn中央部分加入30~50μL的60℃预热灭菌蒸馏水，室温静置1~2min，重复步骤一次。（6）12000r/min离心1min，重复步骤一次。（7）将回收产物冻存于-80℃保存备用。2.2.4.3pGEX-4T-1-P1表达载体的构建按照TaKaRa公司的T4DNALigase说明书进行，按如下体系（10µL）进行：17 连接体系组成各个组分含量酶切pGEX-4T-1载体500ngPCR回收产物150ngT4DNA连接酶1uL10×T4DNALigaseBuffer1uLddH2OAddto10μL上述溶液混匀后，5000r/min离心1min，4℃过夜。2.2.5连接产物的转化将连接产物转化到TOP10感受态中，转化的具体步骤如下：将EP管置于冰上放置35min，迅速放于42℃水浴锅中，水浴90s后在冰浴3min。将1mLLB培养液加入EP管中，220r/min于37℃摇床中震荡培养1h，10000r/min离心1min，弃去大部分液体上清，重悬菌液沉淀，在超净工作台上将重悬菌液涂抹到Amp-LB固体培养基上，将平板倒置于37℃恒温箱中培养过夜。2.2.6重组质粒的验证2.2.6.1重组质粒的提取质粒提取步骤如下：①12000r/min离心3min，弃清倒掉，保留菌沉淀；②加入100μL的SolutionI重悬沉淀；③继续加入200μL的SolutionII，缓慢的摇晃EP管，室温放置5min直到液体变得清亮；④最后加入150μL的SolutionIII，用手轻轻混匀5-8次，直到有白色絮状物析出后，室温放置3min，12000r/min离心5min；⑤将上清液移置新的1.5mL离心管中，加入等体积无水，混匀后，室温静置5min，12000r/min离心15min；⑥弃尽上清，12000r/min离心1min以除去管壁上残留的酒精，室温放置10min使酒精完全挥发；⑦加入适量含RNase的TE缓冲液将沉淀溶解，-20℃保存。2.2.6.2阳性质粒的鉴定按照2.2.4.1方法对阳性质粒（10µL）酶切体系进行双酶切，酶切后用1%琼脂糖凝胶电泳验证，并将切出目的条带的质粒送由上海生工生物工程股份有限公司进行测序分析。2.2.7重组菌的诱导表达及纯化2.2.7.1目的蛋白的表达18 按照2.2.5转化步骤将5µL阳性质粒缓慢加入到100µLBL21表达感受态细胞中混匀，挑取几个单克隆菌落接种于50mLAmp/LB液体培养基中，培养至对数生长期(OD600nm=0.6~0.8)后，取出一定量菌液加入甘油，上下震荡混匀，保存于-80℃备用。再取出3mL菌液作为未加过IPTG的阴性对照。剩余菌液加入终浓度为1mmol/L的IPTG，混匀后在37℃振摇诱导5h，诱导结束后取2mL菌液12000r/min离心1min，弃掉上清，沉淀用100µL灭菌水重悬后加入100µL2×细菌裂解液，反复吹吸直至液体变清亮之后加入10%~20%的β-巯基乙醇，混匀后在沸水中加热10min使蛋白变性，SDS-PAGE凝胶电泳分析。2.2.7.2诱导表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳分析（1）将上述处理好的菌液在沸水中煮沸10min（2）制备分离胶和浓缩胶：用洗涤剂将玻璃板、样品梳等清洗干净，再用ddH2O清洗数次，用吸水纸将液体擦干备用，固定玻璃板，确定玻璃板之间不会漏出液体。2.2.7.3重组蛋白的纯化及浓度测定取上步验证表达蛋白的菌液2mL加入到200mL氨苄抗性的培养基中，摇菌至OD4900.6-0.8之间，再按上述诱导条件进行诱导，诱导完成8000r/min离心10min收菌。将沉淀溶解于适量的PBS中，反复冻融三次后超声40min（超5s停5s，），8000r/min离心10min。上清和沉淀分别进行10%SDS-PAGE电泳，确定表达蛋白大部分存在于沉淀物中后，应用包涵体纯化法纯化蛋白，即将沉淀用1.5M尿素洗涤沉淀三次后，溶解于适量的8M尿素中，进行10%SDS-PAGE电泳，确定蛋白纯化效果。蛋白纯化后调整其浓度至5mg/mL，-80℃保存备用。2.3结果2.3.1PCR扩增结果PCR扩增片段，经1%琼脂糖凝胶电泳验证（如图2-1）所示，537bp处出现特异性目的条带，与预期大小一致。19 图2-1PCR产物凝胶电泳M：DL2000DNAMaker；1：P1基因PCR产物电泳；2：阴性对照2.3.2重组质粒pGEX-4T-1-P1的构建与鉴定将扩增的目的基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体后，以限制性内切酶BamHI/EcoRI双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳出现一条537bp的目的条带和一条4900bp左右的pGEX-4T-1载体片段（如图2-2）所示，得到预期大小的目的片段，表明重组质粒构建正确。图2-2重组质粒双酶切产物凝胶电泳图M：DL5000Marker；1：重组质粒双酶切。20 2.3.3重组蛋白的SDS-PAGE分析诱导表达产物经SDS-PAGE检测，结果显示，重组蛋白成功诱导表达并与预期大小一致，大小约为44KD，未经诱导的菌则未见目的蛋白条带。用尿素纯化包涵体的方法纯化表达的蛋白，经SDS-PAGE电泳检测结果显示纯化效果好（如图2-3）。经仪器测得的蛋白浓度值为6.5µg/µL。图2-3重组蛋白的表达与鉴定M：低分子量蛋白质Marker；1：IPTG未诱导细菌表达产物；2：IPTG诱导细菌表达产物；3：纯化后的包涵体沉淀2.4讨论许多学者曾多次证实猪源HEV全基因序列与人源HEV全基序列同源性高达99%，戊型肝炎作为一种猪源性人畜共患病已经得到证实。该病不仅仅对养[86,87]猪业的发展造成阻碍，更对人类的健康造成严重的威胁。据报道，自2000年以来戊型肝炎的爆发率逐年增高，该病的严重性越来越得到广泛的重视，由于HEV作为噬肝性病毒体外培养系统还不够成熟，目前有关戊型肝炎疫苗和诊断试剂盒的研发比落后，因此建立一种快速、特异的检测方法，对预防该病的[14,88]早期感染以及传播尤为重要。21 HEV的主要抗原表位集中在病毒核衣壳。曾有研究表明，ORF2编码的蛋[89]白包含了病毒的细胞受体结合位点。ORF2核苷酸序列最为保守，编码的病毒衣壳蛋白具有三个结构域S、P1和P2，结构域P1蛋白位于454-840aa，具有主要的免疫优势表位，与病毒一抗体结合及中和作用有关，由于ORF2具有这种免疫特性，因此HEV疫苗的研究多选用ORF2区段。本研究选择HEVORF2[90]段基因保守区域P1结构域合成特异性引物。根据以往HEV血清流行病学调[91,92]查数据显示，我国流行的HEV基因型为基因1型和4型，加强猪HEV病原流行病学检测，为今后HEV病原流行病学调查分析奠定基础，也为HEV3型人畜共患病的研究提供基因水平上的依据。外源基因体外原核表达的关键取决于原核表达载体，在此基础上选择高效表达蛋白的基因，pGEX-4T-1载体具有多个限制性内切酶酶切位点，能在感受肽细胞中稳定存在并自我复制，本研究运用分子生物学领域的技术方法，设计特异性引物并扩增了P1结构域的结构基因，构建出pGEX-4T-1-P1原核表达载体，重组载体转化到表达菌BL21中以后，获得含有GST标签的重组蛋白大小为44KDa，与预期大小相同。经过验证，重组蛋白在大肠杆菌表达系统内的表达形式为包涵体，用尿素对表达的融合蛋白进行纯化得到高浓度的重组蛋白，重组蛋白可用于后续制备单克隆抗体和多克隆抗体等实验。用纯化过的融合蛋白免疫兔子获得兔源多克隆抗体，可用于建立特异性的双抗体夹心ELISA方法[93]。2.5小结2.5.1成功扩增出目的基因片段P1、构建原核表达载体pGEX-4T-1-P1。2.5.2重组质粒转化到BL21感受肽细胞中，成功表达重组蛋白，用尿素纯化方法获得高浓度融合蛋白。22 第三章HEVP1蛋白单克隆抗体的制备自1975年英国科学家Kohler和Milstein发明单克隆抗体技术以来，后续又有德国人G.J.F.Kohler、阿根廷人C.Milstein和丹麦科学家N.K.Jerne等人进行完善，1988年格瑞格·温特携同他的团队制备出人源单克隆抗体，并运用该技[94-术治疗过许多人类的疾病，杂交瘤单克隆抗体技术现已经得到了迅猛的发展96]。该技术目前被应用于科学研究以及临床医学等领域，尤其在分子生物学方[96-99]面取得了划时代的意义。单克隆抗体与抗原结合能力较强，可用于作为双抗体夹心ELISA方法中的捕获抗体，本研究运用单克隆抗体技术制备稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H3，并使用纯化的单克隆抗体为双抗体夹心ELISA方法的建立打下基础。3.1实验材料3.1.1细胞、实验动物、HEV鼠源阳性血清骨髓瘤（SP2/0）细胞系由本实验室保存，冻存于-80℃。雌性6-8周龄的Balb/C小鼠，购自长春生物制品研究所。免疫小鼠效价达到1：16000时，经眼球采血获得HEV阳性血清，冻存于-80℃。3.1.2仪器和设备酶标仪、核酸蛋白浓度测定仪、CFM-500Z倒置荧光显微镜购自Thermo。3.1.3试剂和溶液3.1.3.1试剂PEG-4000、胎牛血清（FBS）、HAT、HT、RMPI1640培养基均购自长春博迅生物技术有限责任公司，弗氏不完全佐剂（FIA）、弗氏完全佐剂（FCA）、液体石蜡、DMSO、HRP标记的羊抗鼠IgG购自长春博迅生物技术有限责任公司；96孔酶标板、单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自SinoBiological公司。3.1.3.2溶液的配制23 ①PBS：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g定容至1L去离子水中，pH7.4。②PBS-T：Tween-20终浓度为0.05%。③包被缓冲液：1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3，加去离子水定容到1L，调pH值为9.6，4℃保存。④底物缓冲液（pH5.5）：0.lM24.3mL柠檬酸溶液，0.2M25.7mLNa2HPO4·12H2O，加去离子水定容至100mL，4℃保存。⑤显色液：底物缓冲溶液中每10mL加入4mg的OPD，现用现加50~100µL30%的H2O2溶液。⑥终止液（2MH2SO4）：22.2mL浓硫酸加入到177.8mL去离子水中，加入同时用玻璃棒搅拌，室温保存备用。⑦1640培养基：将购自于Gibco的RPMIMedium1640粉剂加入到1L灭菌的蒸馏水中，再加入2.0g/L的NaHCO3，经0.22μm的滤器过滤后4℃保存。全部操作都应在生物安全柜中进行。⑧HAT和HT培养基：在配好的1640培养基中加入HATMediaSupplement(50×)HybriMax和HTMediaSupplement(50×)HybriMax即可，加入时按说明书要求进行稀释。⑨饱和硫酸铵：240g硫酸铵加水定容至500mL，，放入50℃水浴锅中使沉淀充分溶解后调节PH至7.2，室温保存。⑩（0.06mol/L）醋酸盐缓冲溶液：NaAC0.591g，冰醋酸300mL，二馏水120mL，溶解后调节PH至4.0，定容至500mL。3.2实验方法3.2.1鼠源多克隆抗体的制备与鉴定3.2.1.1免疫小鼠将纯化后的融合蛋白100ug与弗氏完全佐剂等体积混合，达到油包水的乳化效果，每只皮下注射3只雌性6-8周龄的Balb/c小鼠，进行首次免疫，皮下多点注射100uL每只。间隔2周以后，再次用融合蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合，免疫计量与免疫方式均与首次免疫相同，进行第二次免疫。第三次免24 疫程序同第二免疫。第三次免疫结束后10d断尾采血，分离血清，用间接4ELISA方法检测血清效价，选择血清效价高达10的小鼠，腹腔注射100μg融合蛋白，对效价高的小鼠进行加强免疫，并用间接ELISA方法测定鼠源多克隆抗体效价，血清于-80℃冻存。3.2.1.2鼠血清效价检测步骤在96孔酶标板中以100ng/100μL的量包被融合蛋白，4℃包被过夜，37℃温箱中用5%脱脂奶粉封闭1h，PBS-T将酶标板洗涤3次，每次洗涤5min，尽量将96孔酶标板内液体甩干净，加入预先倍比稀释好的血清100μL每孔，每个稀释倍数做3个重复，37℃孵育1h，PBS-T洗涤3次，5min每次，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，50μL每孔，37℃温箱中孵育45min，PBS-T洗涤3次，5min每次，加入底物显色液50μL每孔，显色15min后加入2MH2SO4硫酸，50μL每孔，终止显色。测定OD490的值，将获得的数据进行分析，选择效价高P/N＞2的小鼠进行下一步实验。3.2.2鼠源单克隆抗体的制备与鉴定3.2.2.1饲养层细胞的准备在细胞融合前一天，取6-8周龄的雌性BALB/c健康小鼠，用剪刀将颈部脱臼处死小鼠，在酒精中浸泡15min后，在超净工作台上按照如下操作进行：将处死的小鼠放置在无菌的平皿中，轻轻按摩腹部，用剪刀和镊子将小鼠腹部剪开一小口，钝性分离将腹膜暴露，用20mL注射器吸取10mL无血清1640注入小鼠腹腔中，避开腹膜上的血管以及腹腔内组织器官，一只手轻揉腹部2min，另一只手将腹腔中的液体吸出，加入胎牛血清和无血清的选择性培养基HAT，形成20%胎牛血清的选择性培养基HAT，细胞计数直到细胞浓度达到51×10/mL，100μl每孔将液体转移到96孔细胞培养板中。3.2.2.2细胞融合5对效价高于1:10的小鼠进行加强免疫，5天后摘取小鼠眼球，获得阳性血清，颈部脱臼处死小鼠，酒精中浸泡10min，无菌条件下摘取小鼠脾脏，放入钢筛上，用注射器柄轻轻研磨，用无血清1640培养基洗涤脾细胞三次，取细胞状态良好的SP2/0细胞用无血清1640培养基洗涤三次，将脾细胞与SP2/0细胞按照1：5的比例与50mL离心管中轻轻混合，在37℃水浴条件下，逐滴加入125 mL预先预热好的50%PEG-4000溶液，缓慢晃动离心管是融合剂与细胞充分接触，静置30秒以后逐滴加入无血清1640终止融合，1000r/min，离心8min后加入含有20%FBS的选择性培养基HAT，轻轻晃动离心管底部使细胞分散，按100μL每孔将液体加入到96孔细胞培养板中，在37℃，5%CO2培养箱中进行观察培养。5d以后用20%含有FBS的HAT进行第一次半换液，以后每隔5d进行一次全换液。3.2.2.3阳性杂交瘤细胞的筛选与亚克隆融合10d以后，融合细胞量达到孔底的1/10时，按照3.2.1.2介绍的方法检测杂交瘤细胞产生单克隆抗体的特异性。用纯化后的融合蛋白和GST标签蛋白做为包被抗原，融合细胞上清做为一抗。用有限稀释法对阳性细胞孔进行3-4次亚克隆培养，操作步骤如下：亚克隆前一天制备饲养层细胞，将阳性孔细胞吹散进行细胞计数，将细胞稀释成10个细胞/mL，均匀地转移到96孔细胞培养板内，100μL/孔，10d后用倒置显微镜观察细胞在96孔底部生长的量，并用间接ELISA方法检测克隆细胞上清效价。用同样的方法对孔底只有一簇细胞团的克隆细胞重复筛选2次，最后选择OD490值高，克隆细胞上清阳性率达到100%，生长状态好的单克隆细胞转移到24孔板中进行扩大培养，当单克隆细胞铺满24孔板底部时，将细胞转移到60mm细胞培养板上扩大培养，当细胞生长到60mm细胞培养板的80%-90%时轻轻悬浮细胞，1000r/min离心8min，用细胞冻存管冻存部分杂交瘤细胞，剩余的细胞在60mm细胞培养板中继续扩大培养。3.2.2.4杂交瘤细胞抗体稳定性将阳性杂交瘤细胞用900μL胎牛血清重悬，取100μLDMSO，加入到细胞冻存管中，4℃冰箱保存预冷2h，然后转到-20℃2h，-80℃2h，最后放入液氮罐。一段时间后将细胞重新复苏，将细胞冻存管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，小心开启瓶盖，把细胞转入细胞培养板中，将细胞连续传4代，待细胞稳定生长后用3.2.1.2介绍的方法检测冻存前后细胞上清，最终确定阳性杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的稳定性。3.2.2.5单克隆抗体腹水的制备与纯化26 用体内腹水诱生法在小鼠腹腔中制备单克隆抗体，将高压过的灭菌液体石蜡注入到6只10周龄BALB/c小鼠腹腔内，每只0.5mL，7d以后，用无血清RPMI1640培养基将60mm细胞培养板中的细胞悬浮起来，60mm细胞培养板中细胞密度达到90%左右可以注射两只老鼠，8-10d后可见小鼠腹围明显增大，触摸腹部有紧实感，无菌条件下用10#注射器针头刺入小鼠腹部收集腹水，以后每隔两天收集一次腹水，将腹水置于37℃中静置2h，再于4℃冰箱中静置数小时，3000r/min离心8min，腹水由上到下可分为三层，脂肪层、呈微黄色的腹水、细胞沉淀，吸取中间层的腹水冻存于-80℃备用。采用本实验室优化的正辛酸/饱和硫酸铵方法[85]沉淀IgG，并用紫外分光光度计测定蛋白浓度。3.2.2.7Westernblot分析按照文献[103]的方法将纯化的蛋白进行SDS-PAGE，将电泳产物转至硝酸纤维膜（NC）上，转膜后将膜用5%脱脂奶粉室温摇床上封闭1h，PBS-T洗涤3次，加入纯化好的腹水（1：500）室温作用1h，按上述方法洗涤后加入HRP标记羊抗小鼠IgG（1：3000），室温作用1h，PBST洗涤3次，用ECL显色。3.2.2.6单克隆抗体亚型鉴定按照SinoBiological公司生产的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书进行，选择不同亚型的抗体作为包被抗体，融合细胞上清作为检测抗体，按照3.2.1.2介绍的间接ELISA步骤进行。3.3结果3.3.1免疫小鼠效价测定间接ELISA方法检测第三次免疫后小鼠血清效价，结果显示当血清效价达到1：12000（见表3-1），取脾进行细胞融合。27 表3-1免疫小鼠抗体效价血清稀释倍数重复次数（Repeattimes）（Antibodydilution）12310001.2631.2851.29720000.8480.8350.87540000.6440.6380.69180000.4560.4290.441160000.3260.3080.311320000.2530.2650.270阳性1.081.061.09阴性0.1180.0890.1033.3.2细胞融合细胞融合第10d后，倒置显微镜下观察融合细胞形态如下，左图为低倍镜下观察结果，右图为高倍镜下观察结果，可见骨髓瘤细胞形态呈圆形、透亮、聚堆生长，间接ELISA方法检测融合细胞上清效价为阳性。图3-1融合上的杂交瘤细胞形态3.3.3阳性杂交瘤细胞筛选28 融合后十几天的阳性孔杂交瘤细胞在24孔板扩大培养，经两次亚克隆以后，再次用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清效价，最终得到能分泌HEVP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H3（见表3-2）。表3-2亚克隆细胞上清效价检测结果HEV效价检测GST标签检测123456123456A1.9632.1482.1041.9921.9851.9970.0280.0480.0820.0190.0760.062B1.7482.2982.0182.1082.7352.1750.0810.0100.0940.1110.0950.081C1.9442.1012.1041.9881.9381.9910.0760.0830.0730.1040.0890.102D1.9561.9882.0402.0182.3292.3410.0760.0710.0820.0190.0660.021E2.2261.9992.0192.2012.2082.2110.1030.1090.0300.1030.0910.047F2.1532.0192.4802.1012.1652.1700.2080.0730.0330.0910.0830.062G2.982.1082.3082.3082.062.990.0470.0570.0330.0870.0820.074H2.1182.3082.3402.1082.0892.1030.0280.0280.0840.0380.0340.0733.3.4杂交瘤细胞抗体稳定性检测间接ELISA检测第4次传代的阳性杂交瘤细胞株细胞冻存前后效价变化，结果显示5H3-D6、5H3-A6、5H3-A7阳性细胞株能够稳定分泌单克隆抗体（见表3-3）。表3-3融合细胞稳定性鉴定结果冻存前细胞上清效价冻存后细胞上清效价D62.532.3242.1852.9972.0412.2082.3792.038A62.2302.3472.4392.3042.3942.3442.5392.290A72.3292.3942.3472.2392.3682.3952.4012.304阳性1.2731.3841.2841.386阴性0.0790.0920.0890.089注：D6、A6、A7为第二次亚克隆阳性孔细胞上清，每个亚克隆阳性孔重复4次。29 3.3.5小鼠腹水效价测定间接ELISA方法检测倍比稀释的小鼠腹水效价（见表3-4）。结果小鼠腹5水效价为1.28×10。用正辛酸-饱和硫酸铵方法纯化小鼠腹水，经检测单抗浓度为5mg/mL。表3-4小鼠腹水效价检测结果稀释倍数单5001000200040008000160003200064000128000256000+_抗D61.9981.8051.7171.6831.5741.3431.1030.6890.4690.2281.8940.136A61.8391.7201.5461.5041.4111.2130.8890.7070.4260.2891.8550.194A72.2192.1151.9251.8051.5931.5261.1920.7350.5670.3351.8920.1723.3.6WesternBlot分析将纯化的单抗用WesternBlot分析，结果如图3所示P1蛋白与单抗发生反应。图3-2WesternBlot方法鉴定单抗腹水结果。M：蛋白Marker；1：纯化腹水（1：500）30 3.3.7单抗亚型鉴定应用鉴定单克隆抗体亚型的试剂盒，检测亚克隆后杂交瘤细胞上清，结果显示，获得一株单克隆抗体5H3，其产生的抗体为IgG2b亚型。3.4讨论1957年Burnet在研究抗体的产生机制中，曾提出每个B淋巴细胞具有特异性受体，只能结合具有一种抗原表位的抗原决定簇，单克隆抗体是由单一杂交瘤细胞分泌的只针对一种抗原表位的高纯度、特异、均一的抗体，纳摩尔浓度的高亲和力，但是单克隆抗体保存过程中稳定性差，反复冻融后效价容易降低，本实验应用间接ELISA方法测定冻存前后的杂交瘤细胞上清效价，最终获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株5H3。由于免疫原为一种含有GST标签的融合蛋白，在亚克隆之前需要用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞筛选，选择只与P1蛋白特异性反应不与GST标签蛋白反应的杂交瘤细胞上清进行下一步实验。单克隆抗体制备的整个过程应确保无菌操作，骨髓瘤细胞和脾细胞按照本实验室建立的方法进行，选择60mm骨髓瘤细胞培养板7-8板，6-8周龄的BALB/c小鼠的脾脏，二者混合融合效率较高。单克隆抗体制备过程中，选择血清效价高的小鼠进行融合，能够提高融合的成功率，减少实验周期，对于已经融合上的细胞，选择仅有一簇细胞团的细胞生长孔，这样既能减少亚克隆的次数又可以尽快获得单克隆抗体。单克隆抗体的制备为病毒的结构以及致病机理方面奠定基础。3.5小结3.5.1经免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞成功融合，经过几次亚克隆，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清效价，最终得到一株能分泌抗HEVP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H3，其分泌的抗体为IgG2b亚型。53.5.2制备腹水并进行纯化，腹水效价达到1.28×10，纯化后得到单克隆抗体IgG浓度为5mg/mL，小鼠眼球采血获得鼠源多克隆抗体做为阳性血清。31 第4章夹心ELISA检测HEV方法建立与应用猪戊型肝炎病毒流行范围越来越广泛，但是对该病的流行病学调查较少，目前检测该病的方法较多，主要包括免疫电镜、免疫荧光、RT-PCR、ELISA、免疫胶体金技术、免疫印记法、血清中和实验等方法。较为常用的方法为RT-PCR，该方法特异性强、敏感性高，但是容易出现假阳性，需要特定仪器，而且难以在临床上进行大量样品检测。本研究建立一种双抗体夹心ELISA方法检测HEV抗原，该方法与RT-PCR方法相比，具有敏感性高、重复性好、操作简便等优点，为临床上HEV的检测提供了有效的方法，运用建立的方法对东北部分地区猪群感染HEV情况进行流行病学调查，不同猪群均存在不同程度HEV感染，为今后HEV流行病学研究提供理论依据。4.1实验材料4.1.1粪便和血清捕获抗体为HEV鼠源单克隆抗体，检测抗体为兔源多克隆抗体，待检样品为采自吉林省和辽宁省部分地区发生腹泻的猪群。4.1.2抗体及其他实验材料OPD、HRP-羊抗鼠IgG均购自Sigma公司；96孔酶标板购自浙江拱东医用塑料厂。4.1.3ELISA主要试剂的配制按照3.1.3.2方法进行配制。4.1.4主要仪器和设备Model680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)。4.2实验方法4.2.1抗HEVP1兔源多克隆抗体的制备4.2.1.1兔源多克隆抗体的制备与纯化按照3.2.1.1小鼠免疫的免疫途径和免疫程序对家兔进行免疫，与小鼠免疫不同的是家兔的免疫剂量为2mg，第三次免疫10d后，用间接ELISA方法检32 测兔子血清效价，当血清效价达到10000×以上时，心脏采集血液并分离血清获得多克隆抗体，用3.2.2.5纯化抗体的方法纯化多克隆抗体，-80℃保存备用。4.2.1.2辣根过氧化物酶（HRP）标记兔源多克隆抗体应用郭春祥法[104]标记IgG分子，具体操作步骤如下：1.A液：称取5mg粉末状辣根过氧化物酶，溶于500μL去离子水中混匀。2.B液：称取64mgNaIO4溶于5mL去离子水中混匀。3.C液：量取500μLB液加入到A液中混匀，4℃静置半小时。4.D液：量取0.09mL乙二醇加入10mL去离子水中，备用。5.量取500μLD液与C液混合，室温静置半小时6.取1mL纯化好的IgG与上述溶液按照比例混合，转移到透析袋中，0.1MPH7.0的PBS中4℃透析过夜，每隔5个小时更换一次透析液。7.透析完成后，向透析液中加入0.2ml5M的NaBH4，混匀，4℃静置2小时。8.用饱和硫酸铵方法沉淀标记IgG：12000r/min，离心20min，用0.1M的PBS重悬沉淀，转移到透析袋中，按照上述透析方法透析过夜，最后将透析袋在蔗糖中包埋10min，将透析袋中液体吸出，于-80℃保存。4.2.2夹心ELISA试验条件的优化4.2.2.1捕获抗体最佳包被量以及酶标抗体最佳稀释倍数的确定①包被抗体：采用方阵滴定法将纯化的HEV-P1单克隆抗体作为捕获抗体，每孔分别包被0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.4μg、0.5μg、0.8μg，4℃过夜；以0.1mmol/LpH7.2含有0.05%Tween-20的PBS-T洗涤液洗板3次。②加封闭液：加入5%脱脂奶粉37℃封闭1h；以PBS-T洗涤液洗涤3次③加入待检抗原：弃掉封闭液，加入1：5（W/V）预处理粪便样品100µL，37℃感作60min④加酶标二抗PBS-T洗涤3次后，分别加入500×、800×、1000×、2000×和3000×稀释的HRP标记抗体，以最佳作用条件37℃感作40min。⑤显色：以同样方法洗涤后，加入OPD显色试剂，每孔50µL。⑥终止显色：室温避光作用15min后，加入2mol/LH2SO450µL终止反应，测定OD490值。4.2.2.2最佳封闭液的确定33 在上述确定好的捕获抗体包被量和确定酶标二抗稀释倍数前提下，分别用5%脱脂奶、2%BSA、1%BSA缓冲液作为封闭液，检测用已建立的夹心ELISA方法检测为阳性的粪便，测定OD490值，确定最佳封闭液。4.2.2.3最佳封闭时间的确定根据上述确定下来的最佳反应条件，在ELISA板中进行加入100µL最佳封闭液，在37℃中分别孵育30min、45min、1h、1.5h、2h。检测阳性粪便，分析测定结果，确定最佳封闭时间。4.2.2.4酶标抗体最佳孵育时间的确定基于上述已经确定的反应条件，将已确定的阳性粪便最为检测抗原，将稀释好的酶标二抗每孔50µL加入ELISA板中，放入37℃温箱中孵育0.5h、45min、1h，测定OD490的值，计算P/N值，确定酶标二抗最佳作用时间。4.2.2.5最佳显色时间的确定在上述已优化好的实验条件基础上，加入新配制的显色液，每孔50µL，室温避光显色10min，15min，20min，25min，30min，加入终止液后测定OD490的值，分析数据，确定最佳显色时间。4.2.3特异性试验用以建立的双抗体夹心ELISA方法对猪圆环病毒（PCV2）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪伪狂犬病毒（PRV）感染的阳性粪便样品进行检测，同时分别用HEV阳性粪便和阴性粪便作为对照，每组做三个重复，分析检测结果，确定建立方法的特异性。4.2.4重复性试验应用建立的方法分别用同一批次酶标板、不同批次酶标板检测3份HEV阳性粪便样品和3份阴性粪便样品，每份样品重复4次，分别确定板内和板间重复性。4.2.5敏感对比实验用建立的方法检测10份阳性样品和25份阴性样品，将检测结果与RT-PCR方法进行比较，确定两种方法符合率。4.2.6夹心ELISA阴、阳性样品的临界值34 用已建立的双抗体夹心ELISA方法对54份经RT-PCR鉴定为阴性的粪样进行检测，每个样品重复三次。应用统计学方法计算样品的平均值（x）和标准差（SD）。当待检粪便样品的OD490≥xOD490(阴性)+3SD阴性、并且阳性对照/阴性对照>2时判定为阳性。4.2.7吉林某地区HEV流行病学调查用建立出来的夹心ELISA方法初步检测408份吉林省和辽宁省部分地区的猪粪进行HEV病原流行病学调查。4.3结果4.3.1兔源多克隆抗体的标记结果纯化的兔源抗VP1多克隆抗体的浓度为12mg/mL，将纯化的多抗取5mg用郭春祥法进行标记。用分光光度计测定并计算抗体的各项指标，IgG浓度为2.05mg/mL，根据计算每个IgG分子约标记2.12个HRP分子。CHRP(mg/mL)=OD403×0.4=0.761mg/mLCIgG(mg/mL)=(OD280-OD403×0.3)×0.62=2.05mg/mL酶/抗体(mol比)=CHRP/CIgG×4=1.4854.3.2最佳捕获抗体包被量和酶标二抗最佳稀释倍数的确定用建立的夹心ELISA方法确定，最佳捕获抗体包被量为200ng，酶标抗体最佳稀释倍数为1：400，且P/N＞2时，为最佳反应条件（表5-1）。表4.1棋盘法确定单抗最佳包被量和酶标二抗最佳稀释倍数HRP二抗稀阳性阴性释倍数单抗最200×400×800×1000×2000×200×400×800×1000×2000×佳包被量1μg1.0980.8050.6170.3230.2030.2330.1790.1430.1390.128750ng0.8390.5200.3460.2490.2190.2970.1660.1370.1490.128500ng0.6190.4370.3280.2890.2100.2370.1670.1280.1240.136200ng0.5920.4390.2290.2080.2010.2030.1590.1370.1840.145100ng0.3290.2840.2170.2140.2140.1830.1360.1590.1780.17550ng0.3190.3130.3070.2500.2280.1480.1280.1650.1280.14735 4.3.3最佳封闭液的确定根据建立的夹心ELISA方法，在96孔板中加入不同封闭液，37℃温箱分别孵育30min、45min、1h、1.5h、2h，结果根据OD490和P/N值确定最佳封闭液（见表4-2），5%脱脂奶粉P/N平均值为4.48，2%BSA的P/N平均值为3.57，1%BSA的P/N平均值为2.37。最佳封闭液选择5%脱脂奶粉。表4-2封闭液的确定阳性阴性5%脱脂奶粉0.3590.3510.3570.3540.0780.0830.0720.0732%BSA0.2280.2230.2430.2380.0780.0720.0610.0751%BSA0.1920.1910.1950.1920.0910.0900.0870.0874.3.4最佳封闭时间的确定根据建立的夹心ELISA检测结果，封闭时间0.5h、45min、1.0h、1.5h、2h的P/N值分别为：8.71、8.64、10.52、8.10、7.82，封闭时间为1h时P/N值最大，所以最佳封闭时间为1.0h。4.3.5酶标抗体最佳作用时间的确定根据建立的夹心ELISA检测结果，酶标二抗在37℃温箱中孵育0.5h、45min、1h时P/N值分别为7.93、8.29、8.01，酶标二抗孵育45min时P/N值最大，所以酶标二抗最佳作用时间为45min。4.3.6最佳显色时间的确定根据建立的夹心ELISA检测结果，显色时间为10min，15min，20min，25min，30min时，P/N值分别为7.20、8.25、8.69、8.62，结果显示20min时候显色最明显，所以底物最佳显色时间定为室温显色20min。4.3.7特异性试验36 以建立的双抗体夹心ELISA方法对HEV、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪圆环病毒（PCV2）和猪伪狂犬病毒（PRV）感染的阳性粪便样品进行检测，结果显示只有HEV粪便为阳性反应，而PEDV、PCV2、PRV粪便均为阴性反应（表4-3），表明建立的双抗体夹心ELISA方法特异性良好。表4-3特异性试验结果检测样品PEDVPCV2PRVHEVPBS检测结果－－－＋－4.3.8重复性试验用建立的双抗体夹心ELISA方法分别检测三份阳性样品和三份阴性样品，每组做四个重复，结果见（表4-4和4-5），重复性实验结果如下，阳性粪便和阴性粪便样品板内变异系数（CV）为3.61%-7.57%。板间变异系数（CV）为3.95%-10.0%，说明该方法具有较好的重复性。表4-4板内重复性试验结果各重复孔的D490nm值样品编号平均值标准差变异系数第1孔第2孔第3孔第4孔10.7050.750.7810.7470.7460.0273.61%20.4040.3860.3650.3780.3830.0543.68%30.4690.4880.5450.5150.5040.0095.67%40.0780.0630.070.0720.070.0057.57%50.0910.0850.0840.080.0850.0044.60%60.0860.0720.080.810.0790.0056.25%注：1、2、3、4、5、6为同一批次ELISA板编号，1、2、3板为阳性样品，4、5、6为阴性样品，每个样品做4个重复。37 表4-5板间重复性试验结果不同批次OD490值样品编号平均值标准差变异系数第1孔第2孔第3孔第4孔10.9130.8130.7850.7730.8210.0556.70%20.5240.4560.4040.4220.4520.04510.0%30.5770.5060.5910.5240.5490.0356.44%40.0620.0670.0680.0760.0680.0057.30%50.0870.0810.0820.0780.0820.0033.95%60.0080.0080.0740.090.0810.0067.09%注：1、2、3、为阳性样品，4、5、6为阴性样品，每个样品做4个重复，第1孔、第2孔、第3孔、第4孔板为不同批次ELISA板。4.3.9敏感对比性实验将建立的双抗体夹心ELISA方法与RT-PCR方法进行对比，分别检测10份阳性样品和20份阴性样品，检测结果如下：表4-6双抗体夹心ELISA方法与RT-PCR方法对比检测结果RT-PCR方法合计阳性阴性双抗体夹心ELISA方阳性10010法阴性02020102030合计4.3.10夹心ELISA阴、阳性样品的临界值的确定经建立的双抗体夹心ELISA方法检测到了50份阴性样品结果（见表4-6），并应用统计学方法进行分析，确定了双抗体夹心ELISA检测HEV的判定标准，平均值为0.138，标准差为0.028，x+3SD=0.222，当OD490值≥0.222判定为阳性，否则判断为阴性。38 表4-7夹心ELISA阴、阳性样品的临界值的确定OD490值0.1240.1130.1130.0850.0730.1210.0550.1810.1200.1320.1240.0560.1040.1220.1520.1450.1140.1830.0920.1770.1060.0910.1240.1490.1350.1670.0930.1100.1620.0670.1680.1760.0680.1050.1720.2100.1190.0870.0810.0820.0780.1820.1030.0140.1020.1200.1080.1030.0740.090.0810.0960.1830.1474.3.11夹心ELISA方法检测临床样品的结果表4-8吉林省和辽宁省不同猪群HEV感染ELISA检测结果分类样品数阳性数阳性率育肥猪1545233%妊娠母猪7979%保育仔猪50918%产房母猪1253226%39 表4-9吉林省和辽宁省部分地区猪群HEV感染ELISA检测结果分类样品数阳性数阳性率沈阳正大981818%公主岭1072221%长春2036030%4.4讨论在检测HEV的所有检测方法中，提取RNA和RT-PCR检测方法是最基本的方法，但是操作过程较为复杂，RNA在提取的过程中容易降解[105,106]。1971年，瑞典学者Perlman和Engrail将免疫技术应用与检测液体中微量物质，与此同时荷兰学者Schurz和Van提出固相免疫检测抗原和抗体的方法，目前酶联免疫吸附试验（ELISA）成为酶免疫测定技术中应用最广的技术[6,107,108]。该方法反应原理是抗原和抗体的结合，使反应具有特异性，同时酶分子与抗体结合可以催化底物产生放大反应，这种放大反应使ELISA方法具有高度敏感性，所以ELISA方法具有特异和敏感的特点，该方法既能检测抗体又可以检测抗原，猪群抗HEV抗体的检测取自感染HEV一段时间后血清中，因此戊型肝炎流行早期很难做出诊断[14,103,109,110]。本研究通过采集病猪粪便获得HEV抗原，该方法操作简单不仅仅能在第一时间获得抗原，也保证了的动物的正常生产，双抗体夹心ELISA方法作为一种新的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法，属于一种非竞争性反应，可以检测具有多个抗原决定簇的多价抗原，是检测抗原最常用的方法，该方法具有敏感性高、特异性和重复性好、便于应用于临床样品大量检测等优点，为检测HEV提供一种有效的方法[111-113]。本实验将原核表达并纯化的P1蛋白做为抗原，制备抗P1抗原的鼠源单克隆抗体和抗P1抗原的兔源多克隆抗体，选择不同物种提高了方法的敏感性和特40 异性。单克隆抗体是由单一杂交瘤细胞分泌的只针对一种抗原表位的高纯度、特异、均一的抗体，选择将单克隆抗体作为捕获抗体，不仅仅能特异性识别待检抗原，也能够避免操作过程非特异性的结合造成假阳性反应。多克隆抗体由于类和亚类的不同而多种多样，一个病毒粒子由于具有多个抗原表位（抗原决定簇），能够与多个多克隆抗体结合，使抗原抗体反应亲和力更强，将兔源多克隆抗体做为检测抗体，在双抗体夹心ELISA方法中起到放大反应的作用。应用双抗体夹心ELISA方法对吉林省和辽宁省部分地区的408份猪粪样进行检测，数据统计分析发现，不同地区猪群均出现不同程度的猪戊型肝炎病毒感染，但是其中育肥猪的感染率最高，感染猪戊型肝炎的临床症状主要包括腹泻、黄疸、消瘦等症状，但是临床检验结果发现，部分病猪的临床症状并没有猪戊型肝炎的典型症状，由于该病为一种自限性疾病，因此怀疑无明显临床症状的动物可能处于康复阶段，所以引起不够明显的临床症状和病理表现。但是数据显示，无论是育肥猪、妊娠母猪还是保育仔猪均存在不同程度的戊型肝炎感染，因此，养猪业的生产环节应该加强管理，避免该病的发生和流行。此结果为今后东北地区的流行病学调查提供理论基础，同时为进一步防控本病提出了可靠的手段。全世界的人都以猪肉作为主要动物蛋白来源，尤其是在发展中国家和占全世界大多数人口的亚洲国家，导致该病在人群和猪群中共同流行，并且存在自由传播，食用未熟的猪肉导致该病的发生和流行，通过建立的双抗体夹心ELISA方法临床大连检测HEV，为揭示人类戊型肝炎发生与流行提供一定的理论依据。4.5小结4.5.1建立一种检测HEV抗原双抗体夹心ELISA方法，确定最佳捕获抗体包被量为200ng，酶标抗体最佳稀释倍数为1：400，最佳封闭液选择5%脱脂奶粉，最佳封闭时间为1.5h，酶标二抗最佳作用时间为45min，底物最佳显色时间定为室温显色20min，当D490值≥0.222判定为阳性，否则判断为阴性。4.5.2应用双抗体夹心ELISA方法检测408份猪的粪样，对东北部分地区猪群HEV感染进行病原流行病学调查，调查数据显示东北不同地区都存在不同程度HEV感染。41 结论1.构建pGEX-4T-1-P1原核表达载体，获得纯化重组蛋白。2.获得抗重组蛋白的兔源多克隆抗及HRP标记的兔源多克隆抗体。3.获得一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H3，并制备抗重组蛋白的鼠源单克隆抗体。4.建立一种检测HEV抗原的双抗体夹心ELISA方法，该方法特异、敏感、快速简便，稳定性及重复性良好。5.应用建立的双抗体夹心ELISA方法对东北部分地区的猪群粪样进行检测，数据显示不同地区猪群均存在不同程度HEV感染，为今后该病的流行病学调查提供诊断方法，并为揭示人类戊型肝炎发生与流行提供一定的理论依据。42 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导师简介王新平，1963年1月生，博士，教授、博士生导师。现任中国畜牧兽医学会动物传染病分会理事、中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会理事。1984.7毕业于山东农业大学兽医专业，获得农学学士学位；1987.7毕业于解放军兽医大学传染病与预防兽医学专业，获得农学硕士学位并留校任教；1996.7毕业于解放军农牧大学传染病与预防兽医学专业，获得农学博士学位。1998.7-2002.6美国塞勒姆帝京大学、德州大学医学中心进行博士后研究；2002.6-2005.10美国伊利诺大学芝加哥分校研究助理教授；2005.10-2011.10美国西北大学、芝加哥大学所属埃文斯顿健康研究所研究员。2010.9-至今吉林大学动物医学学院教授。主要从事动物传染病，尤其是病毒性传染病的诊断与防治、病毒致病机理、病毒学和进化生物学等方面的研究。在国内率先开展了检测牛病毒性腹泻病毒抗原、BVD流行病学与防治、猪流行性腹泻病毒实验感染猪排毒消长规律、鸡产蛋下降综合征免疫、新发牛肠道病毒感染等方面的研究。首次揭示出国内牛、羊和鹿群存在严重牛病毒性腹泻病毒感染，首次在国内发现和分离出猪源牛病毒性腹泻病毒ZM-95毒株，确定国内猪群存在BVDV感染。首次于国内发病牛群分离出E种肠道病毒。在国外任职期间，率先开KSHV的分子病毒学及其致肿瘤机制；在国际上首次克隆出多种低等动物釉原蛋白基因，并对其功能与进化进行研究，研究成果由英国主办的国际创新期刊（InternationalInnovation）进行了专题报道。先后主持国家自然科学基金、农业部、吉林省科委、解放军农牧大学校长基金等项目7项。作为主要参加者，参与美国国家自然科学基金、NIH等课题10余项。发表论文40余篇，获得军队科技进步二等奖4项，三等奖3项，第三届全国青年畜牧兽医科技工作者优秀论文一等奖1项。参与指导博士后、博士生和硕士生近20名。现为吉林省引进高层次创新创业人才，吉林大学国家重点学科-预防兽医学引进学术带头人。目前主持国家重点专项子课题、国家自然科学基金、吉林省重点科技攻关项目、吉林省高层次人才引进专项课题和吉林大学人才引进专项课题共6项。53 作者简介姓名：袁悦性别：女出生年月：1991年6月籍贯：黑龙江省绥化市政治面貌：群众学习经历：2011年9月-2015年7月，青岛农业大学动物医学学院本科；2015年9月-2017年7月，吉林大学动物医学学院兽医硕士。54 致谢研究生学习时光已经接近末尾，回首走过的岁月，心中倍感充实，随着论文的结尾，多年的读书生涯也将告一段落，一路走来，感恩至今，学生时代美好的回忆仿佛就在昨天。硕士生涯期间，首先诚挚地感谢我的导师王新平教授，本实验的顺利完成倾注了导师大量的心血。老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想上给我以无微不至的关怀，王老师朴实无华、平易近人的人格魅力，对学生产生了深远的影响，在此谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢!同时，本课题的顺利完成离不开实验室师姐们的悉心的指导，以及感谢小伙伴们的关心和帮助，感谢你们愿意为我付出宝贵的时间，愿我们友谊长存。最后感谢我的父母，感谢你们这些年对我的栽培，学生生涯即将结束，我今后会用我的努力做为回报，愿你们平安健康，同时再一次真诚地向帮助过我的老师和伙伴们表示衷心的感谢，感恩之情难以言表，谨以最朴实的话语致以最崇高的敬意！作者：袁悦2017年6月55
