外耳道真菌病大鼠模型的建立

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分类号：R764.1密级：公开学校代码：11065学号：2015021385专业硕士学位论文外耳道真菌病大鼠模型的建立作者姓名曹琳指导教师朱富高教授专业领域耳鼻咽喉科学培养单位医学部答辩日期2018年5月15日 外耳道真菌病大鼠模型的建立摘要目的：外耳道真菌病是由外界致病性的真菌或者是外耳道内的条件致病性真菌侵袭感染外耳道浅部毛囊皮肤所造成的慢性感染性疾病,是耳鼻喉科临床上的常见病，尤其在沿海地区或南方温暖潮湿地区多发。并且近年来，临床上对于该疾病的药物研究较多，实验性的用于人类外耳道，但由于该疾病易复发，反复使用抗真菌药物其远期副作用不能评估。因此建立反复性及敏感性良好的外耳道真菌病的大鼠模型，观察病变不同时期外耳道皮肤病理变化，为今后研究真菌的致病性及宿主的防御机制具有重要作用，而且对于新的、敏感性的抗真菌药物，包括研究其有效性、毒副作用及药代动力学也具有积极作用。方法：选取48只wistar大鼠随机分为4组：A组为高浓度的1*10^9孢子/ml烟曲霉菌悬浊液接种免疫抑制组，B组为低浓度的1*10^6孢子/ml烟曲霉菌的悬浊液接种免疫抑制组，C高浓度的1*10^9孢子/ml烟曲霉菌悬浊液接种健康组，D生理盐水对照组。A组及B组免疫抑制大鼠于第一天选用环磷酰胺200mg/Kg腹部注射进行免疫抑制；第三天均选取大鼠右耳作为研究对象，使用无菌的砂纸卷曲成棒状，搔刮外耳道皮肤，以不出血为原则；制备的烟曲霉菌悬浊液按分组将相应浓度菌涂抹于外耳道受损皮肤，涂抹量每次均为200ul，此操作重复7天，接种完毕；对照组相应外耳道受损部位涂抹生理盐水。每组随机抽取4只大鼠，用耳内镜分别在第7天、14天、28天时观察大鼠外耳道，依据外耳道感染情况进行打分，并取接种处外耳道皮肤进行真菌镜检和组织病理学检查，比较相应阶段组内、组间感染情况有无统计学差异。结果：实验组大鼠外耳道在感染完毕后第7天左右均出现不同程度的肿胀增厚，皮肤破溃、糜烂、潮湿，淡黄色液体渗出并伴有局部的结痂，边缘处毛细血管扩张，部分出现渗血及脓性分泌物，2例出现外耳道狭窄；在第14天左右可观察到不同程度的湿性分泌物聚集，部分呈颗粒状、绒毛状、薄膜状覆盖，颜色为灰黑色、黄绿色、黄白色；在感染后28天内，实验组大鼠外耳道皮损情况逐渐减轻（破溃处逐渐愈合，结痂脱落，外耳道变干燥）；感染率为100%，各时间段组内感染情况打分均有统计学意义（P<0.05），且在接种完毕后第7天感染评分最高，分别为10.5±0.5分、8.9±1.3分、9.2±0.6分、5.5±1.3分；组间比较在第7天、第14天差异无统计学意义（P>0.05），第28天差异有统计学意义（P<0.05），高浓度烟曲霉菌接种免疫抑制组大鼠感染评分最高为12分。3组实验组真菌镜检均阳性，病I 理示炎性细胞浸润、坏死，肉芽肿形成。对照组未感染真菌。结论：本实验在健康大鼠和免疫抑制大鼠中均成功建立了曲霉菌感染的模型。3组实验组在感染初期外耳道皮损程度较重，逐渐呈现减轻的趋势，考虑宿主的免疫系统逐渐占据优势，导致致病菌被清除、炎症反应减轻，提示此病具有自愈性。硕士研究生：曹琳（耳鼻咽喉科学）指导教师：朱富高（教授）关键词：烟曲霉菌；模型；动物；外耳道真菌病II EstablishmentofamousemodelofotomycosisAbstractObjective:Otomycosisisachronicinfectiousdiseasecausedbypathogenicfungioutsidethebodyoropportunisticfungiintheexternalauditorycanal,anditisalsoacommonENTdiseaseespeciallyinthecoastalareaorwarmandhumidareasintheSouth.Intherecentyears,thecurativeeffectofresearchonthedrugintheclinic,whichareusedinhumanexternalauditorycanalcannotbeevaluatedfromthelong-termsideeffectsbecauseofrepeateduseofantifungaldrugs.Therefore,theestablishmentofamousemodelofotomycosiswithsensitivityandgoodrepeatability,andobservesindifferentperiodsoftheskinofexternalauditorycanal’spathologicalchanges,haveanimportantroleinthedefensemechanismofthehostandpathogenicityoffungi.Therealsohaveapositiveeffectforthenewantifungidrug,includingresearchesonitseffectiveness,side-effectsandpharmacokinetics.Methods:Totally,48Wistermicewererandomlyandequallydividedintofourgroups:Aishigh-concentrationimmunosuppressivemiceinoculatedwithAspergillusfumigatussuspensionof1*10^9CFUconidia/ml,Bislow-concentrationimmunosuppressivemiceinoculatedwithAspergillusfumigatussuspensionof1*10^6CFUconidia/ml,Cishigh-concentrationhealthygroup-healthymiceinoculatedwithAspergillusfumigatussuspensionof1*10^9CFUconidia/ml,andcontrolgroup-healthymiceinoculatedwithsodiumchloridephysiologicalsolution.Group-Aandgroup-B’simmunosuppressionbyabdominalinjectionofcyclophosphamide200mg/Kgonthefirstday,Onthethirdday,themice’srightearswereselectedasresearchobjects,usingsterilesandpapercoiledrod,scrapingtheskin,withprincipleofnobleeding.ThedifferentconcentrationofAspergillusfumigatussuspensionweresmearedonthedamagedskinofexternalauditorycanal,withtheinoculationvolumebeing200ul.Thecontrolgroupweresmearedonthedamagedskinofexternalauditorywithsodiumchloridephysiologicalsolution.Thisoperationhasbeenrepeatedfor7days.Skinappearanceattheinoculationsitewasobservedusingearendoscopy,andfourmiceweresacrificedineachgroupondayseven,fourteenandtwenty-eightafterinoculation.Accordingtothescoresofexternalauditorycanal’sinfectionandmicroscopicexaminationandhistopathology,toseeweatherthecomparisonofscoresofwithinandbetweengroupshasstatisticaldifferences.Results:Aftersevendays’infection,theskinoftheexperimentalgroupwereswellingandthickening,andwecouldseeulceration,erosion,exudationandalsosomemoist,paleyellowliquidwithlocalcrustingontheinoculatedplace,theedgehadangiotelectasis,someoftheseriousonesalsohadbleedingandpurulentsecretion,stenosisofexternalauditorycanalcanbefoundintwocases.Aroundfourteendays,somemoistsecretionsofdifferentdegreescanbeobserved,granular,villous,filmcoveringofsomeparts,thecolorisblack,yellow，whiteandgreen.Onthe28dayafterinfection,theconditionsofexperimentalmiceofexternalauditorycanalskinweregraduallyimproved(ulcerationhealing,scabfalloff,canalskinbecomesdry),theinfectionratewas100%.Significantwerenotedintheinfectivescoresofskinlesionsbetweenthethreetimepointsintheseexperimentgroups(P<0.05),andinseventhdaysafterinoculationofinfectivegradewasthehighest.Theywere10.5±0.5point、8.9±1.3point、9.2±0.6point、5.5±1.3point.Comparisonbetweengroupswasnotstatisticallysignificantinseventhdaysandfourteenthdays(P>0.05),comparisonsofinfectivescoresrevealedastatisticalsignificantIII differenceonthedayoftwenty-eight(P<0.05).High-concentrationimmunosuppressivemiceinoculatedwithAspergillusfumigatussuspensionof1*10^9CFUconidia/mlhasthescoreuptotwelvepointsofall.Thethreeexperimentalgroupswereallpositiveformicroscopicexamination,andthepathologyshowedinflammatorycellinfiltration,necrosisandgranulomaformation.Meanwhile,nomicewereinfectedinthecontrolgroup.Conclusion:Themousemodelofotomycosiswassuccessfullyestablishedinbothhealthymiceandimmunosuppressivemice.Threeexperimentalgroupattheinitialstageofinfectionwasserious,butgraduallyimproved.Consideringthatthehostimmunesystemgraduallyoccupiedtheadvantage,leadingtotheeliminationofpathogenicbacteriaandthereductionofinflammatoryreaction,suggestingthatthediseaseisselfhealing.GraduateStudent:LinCao（Otorhinolaryngology）DirectedbyProf.Fu-gaoZhuKeywords：Aspergillusfumigatus;model;animal;externalearmycosisIV 目录引言......................................................................................................................................3第一章实验材料和试剂....................................................................................................41.1实验动物及真菌.....................................................................................................41.1.1实验动物.............................................................................................................41.1.2真菌菌种.............................................................................................................41.2实验试剂及仪器.....................................................................................................41.2.1主要试剂及耗材.................................................................................................41.2.2主要仪器设备.....................................................................................................5第二章实验方法和步骤....................................................................................................62.1真菌的制备.............................................................................................................62.2实验动物的分组.....................................................................................................62.3外耳道真菌病动物模型的建立.............................................................................62.4耳内镜下观察感染后外耳道皮损.........................................................................62.4.1感染后外耳道皮损临床评分...........................................................................62.5真菌镜检与组织病理学检查.................................................................................72.6统计学处理...........................................................................................................7第三章实验结果................................................................................................................83.1皮损处总体观察.....................................................................................................83.2各组外耳道感染皮损处临床评分的比较.............................................................93.3各组真菌镜检与组织病理学变化.......................................................................10第四章讨论......................................................................................................................13结论....................................................................................................................................16参考文献............................................................................................................................17综述....................................................................................................................................191 综述参考文献....................................................................................................................28攻读学位期间发表论文....................................................................................................31致谢....................................................................................................................................32学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明....................................................332 引言引言外耳道真菌病是真菌侵入外耳道或外耳道内所引起的皮肤毛囊浅部的感染，属外耳道皮肤亚急性或慢性感染，较少累及中耳、内耳。多由于潮湿的环境、不洁的[1]挖耳习惯、抗生素及激素的滥用、机体抵抗力的下降等原因所引起，具有易复发、交叉感染、迁延不愈的特点，近几年发病率呈升高趋势。此病发病初期可以没有任何症状或者仅有轻微的耳痒,如果患者未去除病因或未进行相应的治疗,真菌感染会逐渐加重，出现瘙痒加重,伴有渗出、疼痛、听力下降等症状,影响患者的身体健康，降低生活质量。临床上根据患者的症状、体征以及外耳道分泌物真菌镜检及培养,不难做出诊断。在治疗上,一般采用局部清洁外耳道,如：负压吸引器吸出外耳道聚集的分泌物，使用3%的双氧水反复冲洗，保持外耳道干燥用以抑制真菌的生长,无直接抗真菌治疗措施。然而近几年来，临床上对于该疾病的药物研究逐渐增多，实验性的用于人类外耳道，部分取得较好的疗效，但由于该疾病易复发，反复使用抗真菌药物其远期副作用不能评估。动物模型，作为疾病治疗、病理生理等研究的一种有效的手段，已经广泛的应用于各种真菌感染的疾病中，但目前尚未发现建立外耳道真菌病的动物模型，这导致外耳道真菌病发病机制的研究相对滞后。因此，本实验选取48只外耳道清洁、无感染，鼓膜完整的Wister大鼠，模拟临床外耳道皮肤损伤，建立近似自然真菌感染的大鼠模型，根据相应时间段观察疾病发生发展的过程，根据大鼠外耳道真菌感染情况进行打分并取相应皮损进行真菌镜检及组织病理学检查。建立近似临床外耳道真菌感染的大鼠模型，为今后外耳道真菌病的发病机制和临床针对性治疗等研究提供充分有力的基础依据，解除患者疾患，提高生存质量，现将结果报告如下。3 青岛大学硕士学位论文实验材料和试剂1.1实验动物及真菌1.1.1实验动物成年清洁级Wister大鼠48只（青岛市黄岛区青岛大学附属医院科教楼动物房提供），体重200g—250g，均为雄性，要求耳廓无畸形、鼓膜完整、外耳道无感染。动物的饲养、处理与处死均严格按照动物保护与使用手册委员会（《InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeGuidebook》）要求操作。1.1.2真菌菌种烟曲霉菌标准株（菌株号3.0832）（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心）。1.2实验试剂及仪器1.2.1主要试剂及耗材1)注射用环磷酰胺：购于索莱宝专业生化试剂公司，批号YZ-100234；2)Saboutound培养基：购于索莱宝专业生化试剂公司；3)0.9%Nacl注射液：作为对照组试剂，由青岛大学附属医院提供；4)10%KOH溶液：便于显微镜下查找真菌孢子及菌丝，由青岛大学附属医院提供；5)无水乙醇：消毒用，由青岛大学附属医院提供；6)磷酸盐缓冲液（PBS）：购于购于索莱宝专业生化试剂公司；7)10%水合氯醛：麻醉用，由青岛大学附属医院动物房提供；8)江苏康健医疗用品有限公司耳拭子管：蘸取大鼠外耳道内分泌物；9)美国AxygenEP管（200ul、500ul、1500ul）：定量选取真菌；10)美国AxygenTip枪头（10ul、200ul、1000ul）：定量选取真菌；1.2.2主要仪器设备1）德国STORZ耳内窥镜：由青岛市黄岛区青医附院耳鼻咽喉科实验室提供；2）日本奥林巴斯显微镜及图文系统（OLYMPUSCX31）：图像的采集，查找曲霉菌菌丝及孢子；3）日本奥林巴斯电子喉镜：便于观察并采集图片；4 实验材料与试剂4）耳科手术器械（显微剪、显微镊、普通镊、普通剪、齿状镊）、1ml消毒空针、2ml消毒空针、尖刀刀片、圆刀刀片、无菌手术巾：用于真菌的接种及取皮损处皮肤；5）美国ThermoScientific离心机：用于真菌悬浊液的制备；6）美国ThermoScientific恒温震荡水浴床：用于真菌悬浊液的制备。5 青岛大学硕士学位论文第二章实验步骤与方法2.1真菌的制备烟曲霉菌菌丝悬液的制备取适量烟曲霉菌孢子接种于250ml灭菌的Sabouroud液体培养基中，37℃恒震荡水浴床中培养48h后，离心半径10cm，3000r/min，离心5min，弃上清，将沉淀移至1500ulEP管中，研磨至菌丝体为20～40um片段，在光学显微镜下用血细胞计数板计数菌丝片段数，调整悬液的细胞密度为1*10^9孢子/ml及1*10^6孢子/ml。2.2实验动物的分组将48只Wister大鼠随机分为4组，每组12只，均选取双耳作为实验对象。第一组使用1*10^9孢子/ml的高浓度烟曲霉菌接种环磷酰胺（200mg/Kg）免疫抑制大鼠，第二组使用1*10^6孢子/ml低浓度烟曲霉菌接种环磷酰胺（200mg/Kg）免疫抑制大鼠，第三组使用1*10^9孢子/ml的高浓度烟曲霉菌接种健康大鼠，对照组使用0.9%的氯化钠溶液接种健康大鼠。2.3外耳道真菌病大鼠模型的建立所有大鼠均选用10%的水合氯醛3ml/Kg腹部注射麻醉后，第一组及第二组大鼠[2]于第一天选用环磷酰胺200mg/Kg腹部注射进行免疫抑制；第3天选取大鼠双耳外耳道作为研究对象，使用无菌的砂纸卷曲成棒状，作“*”样轻轻搔刮外耳道皮肤，以不出血为原则并且不伤及鼓膜，造成临床上自然的外耳道损伤，模拟人类自然挖耳导致的外耳道皮肤损伤状况；制备的烟曲霉菌悬浊液按分组将相应高、低浓度菌涂抹于外耳道受损皮肤，涂抹量每次均为200ul，此操作重复7天，即接种完毕；对照组在相应外耳道搔刮受损部位涂抹0.9%的氯化钠溶液。2.4耳内镜下观察真菌感染后外耳道皮损2.4.1感染后外耳道皮损临床评分每组随机抽取4只大鼠，分别于接种完毕后第7天、第14天、第28天行耳内镜检查并记录真菌接种处外耳道皮肤黏膜充血、肿胀、糜烂及分泌物渗出的情况，依据感染情况进行打分，如表1。6 实验步骤与方法表1：外耳道皮肤真菌感染情况临床评分外耳道皮肤真菌感染情况等级总分充血肿胀糜烂渗出00无（0）无（0）无（0）无（0）14轻微血管扩张（1）轻微肿胀（1）浅表糜烂（1）轻微渗出（1）28明显充血（2）明显肿胀（2）明显糜烂（2）明显渗出（2）312急性炎症伴出血（3）外耳道狭窄（3）伴出血（3）伴脓血（3）2.5真菌镜检与组织病理学检查处死大鼠后于外耳道皮损处取材，进行真菌镜检和组织病理学检查，第7天、第14天、第28天各时间段感染真菌的阳性例数；实验组所有大鼠处死后，均取其鼓膜及中耳黏膜行真菌镜检及组织病理学检查，观察是否出现真菌的感染。2.6统计学处理采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析，各组间的两两比较及组内的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。7 青岛大学硕士学位论文第三章实验结果3.1外耳道皮损处整体观察对比免疫抑制组及健康组，各组大鼠接种后行为活动均无明显异常。各组大鼠在使用砂纸棒搔刮外耳道皮肤后，均出现划痕，皮肤浅部的破损，无出血、未伤及鼓膜。在涂抹不同高、低浓度的曲霉菌之后的7天内，实验组大鼠外耳道皮肤均出现不同程度的肿胀增厚，皮肤破溃、糜烂、潮湿，淡黄色液体渗出并伴有局部的结痂，边缘处毛细血管扩张，部分出现渗血及脓性分泌物，2例出现外耳道狭窄，见图1、图2；实验组在涂抹后14天左右，实验组大鼠外耳道出现不同程度的湿性分泌物聚集，部分呈绒毛状、颗粒状、薄膜状覆盖，颜色为灰黑色、黄绿色、黄白色，见图3、图4；实验组在涂抹后28天内，大鼠外耳道皮损感染情况逐渐减轻（破溃处逐渐愈合，结痂脱落，外耳道变干燥）；对照组大鼠外耳道在使用磨砂棒呈“*”型搔刮后出现轻度肿胀，局部颜色变淡，涂抹0.9%的氯化钠溶液后外耳道潮湿，第2天皮损处出现结痂并随时间逐渐愈合，5天后几乎全部愈合，余无其他改变，见图5、图6。4组大鼠鼓膜形态正常，均未穿孔。（注：图1、图2为环磷酰胺免疫抑制大鼠接种1*10^9孢子/ml烟曲霉菌悬浊液后7天左右，皮损表现为黏膜的充血、肿胀、糜烂，黄色痂皮、血痂及湿性分泌物聚集。）8 实验结果（注：图3、图4为在接种后14天左右外耳道皮肤黏膜出现黄白色薄膜样湿性分泌物及颗粒状物覆盖。）（注：图5、图6为对照组接种生理盐水后外耳道皮肤黏膜稍有肿胀，但逐渐转为正常黏膜形态。）3.2各组外耳道感染皮损处临床评分的比较大鼠外耳道感染情况在实验组组间比较，第7、14天的3组感染情况差异无统计学意义（均P>0.05）；第28天，3组感染情况差异有统计学意义（P<0.05），见表2。9 青岛大学硕士学位论文表2：各组大鼠接种后皮损感染情况打分组别皮损数第7天第14天第28天A810.5±0.59.1±0.98.2±0.5B88.9±1.37.6±0.84.6±1.5C89.2±0.68.4±1.35.6±0.7D85.5±1.31.5±103.3各组真菌镜检及组织病理学变化以外耳道皮损病理切片中发现烟曲霉菌孢子为阳性结果，未发现则为阴性结果为依据。实验组在涂抹不同高、低浓度的曲霉菌后的第7天、14天、28天真菌镜检及组织病理阳性例数见表3；真菌镜检可见曲霉菌孢子（如图7），培养开始呈现白色的菌落，2-3天后变为绿色，数日后变为深绿色粉末状菌落生长如（图8）。组织病理学检查亦可发现真菌孢子存在，早期为弥漫性浸润渗出样的改变；晚期为坏死、化脓和肉芽肿形成，病灶内可找到大量菌丝（如图9）。表3：各组大鼠外耳道真菌感染皮肤在相应时间真菌镜检及组织病理阳性的数量第7天第14天第28天组别大鼠数受损耳数真菌镜检组织病理真菌镜检组织病理真菌镜检组织病理A48888888B48764241C48888664D4800000010 实验结果（图7为曲霉菌孢子）（图8为曲霉菌菌落，图9为曲霉菌菌丝）在第7天时实验组外耳道皮肤在组织病理学显示其炎症最为严重，为急性表现（如图10），可见上皮组织增生，密集的上皮内多形核细胞聚集，皮肤黏膜固有层炎症细胞浸润；在第14天时实验组组织病理显示中度的上皮细胞增殖以及上皮细胞内多形核细胞积累和浸润（如图11）；之后逐渐减轻，后期出现肉芽肿样形态（如图12），轻度的固有层上皮细胞增殖和上皮内多形核细胞的聚集和浸润，炎症逐渐趋于慢性。11 青岛大学硕士学位论文在对照组大鼠外耳道受损皮肤组织病理在第1天时呈现炎症细胞的聚集，组织水肿样变，在第5天时炎症细胞基本消失，呈现正常组织皮肤样改变。所有大鼠鼓膜及鼓室内黏膜真菌镜检及组织病理学检查均未见真菌孢子及其他异常改变。（图10、图11分别为环磷酰胺免疫抑制大鼠接种1*10^9孢子/ml烟曲霉菌悬浊液7天、14天后，外耳道局部皮肤病理组织变化。）（图12为环磷酰胺免疫抑制大鼠接种1*10^9孢子/ml烟曲霉菌悬浊液28天时，外耳道局部皮肤病理组织变化）12 讨论第四章讨论外耳道真菌病是由外界致病性的真菌或者是外耳道内的条件致病性真菌侵袭感[3]染外耳道浅部毛囊皮肤所造成的慢性感染性疾病,是耳鼻喉科临床上的常见病，尤其在沿海地区或南方温暖潮湿地区多发。目前关于真菌病发病的主要原因如下：①外耳道PH值改变：发生耳内进水或者不合理的用药可以改变外耳道的PH值，破坏正常外耳道偏酸性水平，从而利于真菌的产生。②外耳道长期炎性刺激：一、经常游泳而导致外耳道内处于潮湿的环境，经常挖耳致局部皮肤的破损，都易于继发各种细菌感染等因素引起的外耳道炎症；二、耵聍栓塞、外耳道异物、外耳道炎或者中耳炎引起的分泌物栓塞等长期刺激外耳道引起的炎症；三、耳道的分泌物，尤其是慢性中耳炎长期流脓，成为真菌滋生的培养基。③免疫力低下：常见于老年人、婴幼儿、肿瘤患者、糖尿病等慢性病患者及恶病质患者，此人群抵抗力差，易感染真菌。④近年来由于抗生素的不正确使用或者滥用常常导致耳部抗真菌的微生物菌群缺少或失调，也容易引起耳部真菌感染。⑤环境温暖、湿度的增加：两个条件的改变均对真菌的繁殖有利。外耳道真菌感染属皮肤浅部毛囊的感染，浅部真菌最适生长温度为22-28℃，一般真菌在中等湿度的环境下生长较好。⑥耵聍成分：耵聍主要含有硬脂、脂肪酸、油脂膜、黄色素和蛋白质，还有0.1%的水以及少许钾、钠、白垩等元素。其中，脂肪酸属酸性物质，它的存在可以增加外耳道的酸性程度，具有杀菌的作用，此外有研究人员证明，耵聍里的成分能抑制数种细菌的生长和繁殖，同样也具有抑制真菌生长的作用，故经常挖耳导致的耵聍缺乏有利于真菌生长、繁殖，而挖耳导致的皮肤破损，更加为细菌、真菌的繁殖提供条件。⑦外耳道狭窄：此因素也导致外耳道真菌感染，正常情况下，外耳道外界为外耳门，内界为，是一条伸入颞骨的盲管，此盲管非一条笔直的管道，呈S型，它由软骨部和骨部组成，软骨部位于外侧，占外耳道总长的1/3，骨部位于内侧，占2/3，耳道总长2.5-3.5cm。上述软骨部与骨部交界处构成外耳道的第一处狭窄，第二处狭窄位于骨部距鼓膜0.5cm处。两处外耳道狭窄皮肤较薄，耳道深部的脱落上皮及分泌物常常堆积，不能及时排出，当发生耳内进水或湿度增加时，就会滋生真菌。此外，部分人群中存在外耳道狭窄，此类人群更容易发生外耳道真菌病。近年来，随着免疫制剂、抗瘤药物、激素以及广谱抗生素的广泛应用，免疫功能低下病人的增加,真菌引起的外耳道感染在临床上呈上升趋势,致病性真菌感染机会明显增多，又由于患者因耳痒等症状长期挖耳，形成恶性循环,导致疾病迁延不愈。[4]对于外耳道真菌病的致病菌种，已有较多报道，1988年SternJC等提出外耳道真菌病致病菌种检出以曲霉菌、桔青霉菌以及白色念珠菌为主。2007年杨琼等[5]报道外耳道真菌病中致病菌常见率依次为黑曲霉、烟曲霉、毛霉菌、须癣毛癣菌、13 青岛大学硕士学位论文[6-7]热带念珠菌。2014年SamphathCP等报道，外耳道真菌病中曲霉菌属占80%，青霉菌属占8%，白色假丝酵母菌占4%，根霉菌属占1%。在我科门诊由秦昌秀医师收集的142例外耳道真菌病的患者中，共培养出117株真菌，其中曲霉菌占78.6%，近平滑假丝酵母菌占7.7%，白假丝酵母菌占5.1%，青霉菌占5.1%。因此，本实验选取临床上最常见的曲霉菌作为建立外耳道真菌病大鼠模型的致病菌种。临床诊疗过程中发现，广大患者对外耳道真菌病没有足够的认识，常常因为耳痒及其他不适误认为细菌感染外耳道或者中耳，未能及时到正规医院就医，常常自行在药店购买抗生素口服或者激素类和抗生素类滴耳液滴耳。据我科门诊调查，患者在就诊前因外耳道不适或其他原因局部或全身使用抗细菌类抗生素可达38%，使用抗真菌类药物的患者占6.1%，使用最常见的抗生素为氧氟沙星类滴耳液、复方氯霉素滴耳液，长期耳内滴用及口服广谱抗生素使其内环境发生改变，与真菌拮抗的细[8]菌及微生物减少，导致真菌的滋生并不易治愈。临床上有部分患者患外耳道真菌病时，因耳部不适而更加频繁地挖耳，导致真菌、细菌合并感染，在检查外耳道时不能见到具有霉苔特征的体征，仅见脓性分泌物，常常误认为外耳道炎或者中耳炎，需要经真菌镜检和（或）真菌培养确诊。故对反复的耳漏、耳痒、耳痛的外耳道炎患者，抗细菌抗生素治疗的无效时，应考虑真菌感染的可能，可常规性真菌镜检或[9]真菌培养确诊。验证本实验是否成功，均采用真菌镜检和真菌培养来证明模型的建立，组织病理学检查辅助观察真菌的病理学特征。真菌培养和镜检是外耳道真菌病最常用也是最简单的方法，镜检的优点是方便快捷，临床医师容易操作，可以通过耳内镜获取分泌物直接送至检验科，甚至可以棉签深入耳道直接获取分泌物送检，但此方法检出率低，并不能确定菌种。对于外耳道真菌病的治疗，近些年来，临床上对于该疾病的药物研究较多，如[10-11]伊曲康唑、两性霉素B等，实验性的用于人类外耳道，取得良好的效果，但由于该疾病易复发，反复使用抗真菌药物其远期副作用不能评估，目前对此病的治愈率仍不理想。主要使用局部抗真菌治疗，局部抗真菌药物在医院的种类很有限，如制霉菌素、氟康唑、达克宁软膏等，遇到治疗效果差的患者，即使有药敏结果也没有很好的局部药物代替。而建立医学动物模型对于疾病的病理、生理等实验室研究以及临床表现的研究、筛选具有针对性、敏感性药物的研究具有重要的意义，众所周知，人类的疾病发生、发展是一非常复杂的过程，如果在人体上反复、大量取材或对某种不确定药物进行实验性的治疗，首先不仅在伦理道德上收到限制，同时所用时间较长，没有横向大量同种疾病的患者，不利于疾病的研究，更不利于患者的身体、心理健康。因此，借助相应的动物，模拟某种特定疾病的发生发展过程，建立该病的动物模型，可以14 讨论人为的改变外环境或内环境所制造的不利因素，更准确的观察所建立疾病的动物模型的病理、生理学特点及临床特点，并与人类在该病的变化作比较，有助于更准确[12-13]的、多方面的了解该疾病的发展规律、发病机制以及药物的选择。如：Dixon、Niki等在研究肺曲霉菌病时就建立了醋酸可的松或环磷酰胺免疫抑制的小鼠模型，对于原发性及侵袭性、复发性的肺曲霉菌病的研究提供里积极的意义。因此，建立反复性及敏感性良好的外耳道真菌病的大鼠模型，为今后研究真菌的致病性及宿主的防御机制具有重要作用，而且对于新的、敏感性的抗真菌药物，包括研究其有效性、[14-15]毒副作用及药代动力学也具有积极作用。因此，本实验选取外耳道通畅无感染并且鼓膜完整的Wister大鼠，使用砂纸棒磨损外耳道皮肤，模仿临床自然挖耳导致的皮肤破损，通过环磷酰胺腹腔注射进行免疫抑制，在磨损的外耳道皮肤处涂抹不同浓度的烟曲霉菌悬液，并提供真菌适宜的生长湿度及温度，为真菌突破免疫的第一道防线进行黏附创造有利的条件，尽量避免环境的污染，有利于提高模型的成功率。在感染完毕后第7天、14天、28天感染处外耳道皮肤真菌镜检和组织病理学检查发现曲霉菌孢子，真菌培养为曲霉菌生长，而鼓膜及中耳未发现真菌感染，证实本实验在免疫抑制大鼠和健康大鼠中均成功建立了外耳道曲霉菌感染的模型，也说明接种后烟曲霉菌向附近的外耳道皮肤蔓延，只造成外耳道局布的感染，较少累及鼓膜及中耳，可能与烟曲霉菌本身的致病性并不强或者由于免疫屏障作用大鼠机体对该菌具有一定的免疫力有关。外耳道皮损感染情况临床评分与外耳道组织病理学检查所见的局部炎症细胞浸润、上皮增生及组织水肿情况相一致，也就是在一定程度上反映了病情的轻重。本实验中，A组免疫抑制大鼠接种1*10^9孢子/ml烟曲霉菌的悬浊液与B组免疫抑制大鼠接种1*10^6孢子/ml烟曲霉菌的悬浊液所致的大鼠外耳道感染情况较重即临床评分较高，提示今后应尝试更低浓度感染外耳道成功所需的真菌悬浊液的浓度，以更接近临床实际的感染情况。实验组组间比较，在第7天和14天时外耳道感染情况打分差异无统计学意义，提示在免疫抑制大鼠和健康大鼠中均能建立真菌感染模型。在第28天时，高浓度菌感染免疫抑制组比高浓度菌感染健康组大鼠外耳道感染情况打分高，说明免疫抑制后，对真菌的抵抗力下降，恢复变慢。3组实验组在感染初期外耳道皮损程度较重，第7天感染最为严重，逐渐呈现减轻的趋势，考虑宿主的免疫系统逐渐占据优势，导致致病菌被清除、炎症反应减轻，提示此病具有自愈性。15 青岛大学硕士学位论文结论1.本实验在健康大鼠和免疫抑制大鼠中均成功建立了曲霉菌感染的模型。2.3组实验组在感染初期外耳道皮损程度较重，逐渐呈现减轻的趋势，提示此病具有自愈性。3.烟曲霉菌向附近的外耳道皮肤蔓延，只造成外耳道局布的感染，较少累及鼓膜及中耳，可能与烟曲霉菌本身的致病性并不强或者由于免疫屏障作用大鼠机体对该菌具有一定的免疫力有关。4.同样免疫抑制大鼠接种高浓度菌群较接种低浓度菌群外耳道感染情况较重，即临床评分较高，提示今后应尝试更低浓度感染外耳道成功所需的真菌悬浊液的浓度，以更接近临床实际的感染情况。16 参考文献参考文献[1]HugueninA,NoelV,RogezH,etal.ScedosporiumapiospermumotitiscomplicatedbyaTemporomandibulararthritis:Acasereportandmini-review.[J]Mycopathologyla,2015,180(3-4):257-264.[2]章强强，翁心华，朱利平，等.小型无绿藻脑膜炎及其真菌学研究.中华皮肤学杂志,2006,39(8):445-447.[3]农辉图，李菊裳，黄光武，等.耳真菌病的真菌学与治疗方法研究［J］.临床耳鼻咽喉科杂志，1999，13（10）：438-440.[4]SternJC,LucenteFE,ShahMK.Invitroeffectivenessof13agentsinotomy-cosisandreviewoftheliterature[J].TheLaryngoscope,1988,98(11):1173-1177.[5]杨琼，高春生，孙彩波，等.耳部真菌病临床分析（附187例报告）[J].中华耳科学杂志，2007,5（2）:161-163.[6]NavaneethanN,YaadhavaKrishnanRP.Typeofantifungals:doesitmatterinempiricaltreatmentofotomycosis?[J].IndianJOtolaryngolHeadNeckSurg,2015,67(1):64-67.[7]黄丽华.消化内科无痛胃肠镜临床的应用疗效分析[J].当代医学,2012,(25):51.[8]林昶，易自翔，林勤，等.霉菌性中耳乳突炎的诊治[J].中华耳鼻咽喉科杂志，2000,35（3）：171.[9]金玲，葛荣明，朱亚捷.表现为脓样耳漏的耳真菌感染的诊治体会[J].头颈耳鼻咽喉-头颈外科，2001,8（6）:336-338.[10]陈春燕，陈童.肺部曲霉菌感染的药敏分析[J].实用医学杂志，2007,23（11）：1761.[11]赵顺英，江载芳，徐赛英.儿童慢性肺曲霉菌病四例的诊断和治疗［J］.中华儿科杂志，2005，43（2）：113-116.[12]DixonDMetal.TheEstablishmentofamouseModelofCandidiasis[J].InfectImmun,1989.57(5):1452-1456.[13]NikiYetal.TheEstablishmentofMiceModel[J].ClinMicrobiol,1991.29(7):1317-1322.[14]余晓东，刘维达.动物模型与真菌病研究.国际皮肤性病学杂志,2006，32（2）：79-81.[15]SampathCP,SubbannayyaK,ManshaS,etal.PrimaryOtomycosisintheIndian17 青岛大学硕士学位论文Subcontinent:Pre-DisposingFactors,Microbiology,andClasSifi-cation.IternationalJournalofMicrobiology,2014:1-9.18 综述综述外耳道真菌病的概述、诊疗及真菌病动物模型的新进展外耳道真菌病是指在适宜条件下，外耳道既存的条件致病真菌或者外耳道外侵[1]的真菌生长繁殖，致使外耳道发生炎性改变的一类疾病。本病为全球常见疾病，[2]其患病率在外耳道炎中占5—25%，其中，此病多发在沿海、靠近江河及天气表现[3,4,5,6]为闷热、潮湿的亚热带、热带地区，也可因空气中布满粉尘所致。当所获的外耳道真菌病合并中耳炎时，往往因耳流脓症状，或其它耳部不适时常常只注意治疗慢性中耳炎，而未常规行真菌镜检，因此忽略真菌性外耳道炎的治疗；尚有部分患者耳部霉苔的特征不典型，常常误认为是细菌感染,细菌引起的上述外耳道感染症状与真菌引起的外耳道感染症状极其相似，仅凭临床医师的观察很难区别，这就有可能带来误诊以及随之而来的错误用药。如真菌感染错误应用抗细菌药物，反而导致真菌感染的加重，故临床中在应用抗菌药物无效的情况下应考虑真菌感染，及时更改抗真菌药物，同时加做外耳道分泌物的培养和镜检，明确是否真菌感染。近年来，外耳道真菌病的发病率逐年上升，除了上述临床观察的错误判断的及治疗，广谱抗菌药物的滥用以及免疫抑制剂和糖皮质激素的广泛使用也是重要因素，抗生素及免疫抑制剂的广泛引用常常导致耳部菌群失调，容易引起耳部真菌感染。外耳道真菌病治疗起来有时病程较长，且症状易反复，故临床中急需提高其诊断的正确率，从而缩短其病程，降低其复发率。同时临床中控制抗生素的滥用，在不必须使用免疫抑制剂时应减少使用，把我糖皮质激素的应用范围，不作为一线药物时应尽量避免，同时加强锻炼，提高患者的免疫力，向群众极力宣教上述内容也是必不可少的项目。1.1外耳道真菌病的临床表现本病在男女人群中的发病率报道不一，有文献报道外耳道真菌病发病率女性高[7,8][9,10]于男性，但亦有文献报到真菌性外耳道炎好发于青年男性。本病发生于20-30岁之间的比例较多，主要原因可能为这个年龄段的人暴露在真菌环境中机会更多[11,12]。但50岁以上男性也同样易感此病，可能与饮酒、吸烟、不良的饮食习惯等有关。1.1.1症状外耳道真菌病的临床症状程度不一，轻度症状主要包括：1、耳闷不适，耳痒或胀痛。耳闷及胀痛多因为真菌产生的分泌物堵塞耳道，严重者压迫鼓膜引起，耳痒感多由分泌物刺激皮肤所致；2、耳鸣、听力下降甚至眩晕感。多因分泌物受堵，侵19 青岛大学硕士学位论文及鼓膜，影响声音的传导及鼓膜的弹性；3、部分患者出现耳道潮湿。重度症状主要包括：1、真菌分泌物刺激并破坏局部，产生肉芽组织及化脓性改变，引起头痛甚至破坏骨质累及面神经引起面瘫；2、坏死性外耳道炎；3、出现全身症状，如发热等。1.1.2体征耳鼻喉科专科查体轻度可见外耳道充血肿胀，表明覆有白色点状或者绒毛状物，白色或者黄色，重者可见耳道充血肿胀累及鼓膜，耳道及鼓膜表面充满密集的点状、绒毛状附着物，呈黑色或者褐色。耳内镜下观察更为清晰，局部清理后可见皮肤充血，糜烂，鼓膜增厚充血，部分区域可见肉芽。上述表现多因感染的真菌菌属不同而有不同表现。酵母菌感染的外耳道真菌病，常见黄色或者白色菌丝，耳道充血不严重；曲霉菌感染的外耳道真菌病可见褐色或者黑色的分泌物，量多，多堵塞耳道，鼓膜受累；念珠菌感染引起的外耳道真菌病，常见皮肤糜烂充血，表面覆有白色分泌物，有时伴有渗出，鼓膜表面可见分泌物；毛霉菌相对严重，因其具备侵袭性，对皮肤破坏较多，引起局部糜烂破溃流脓，甚至累及外耳道骨质，侵犯血管，导致血管栓塞而局部组织坏死，并且破坏鼓膜完整。1.2外耳道真菌病的相关辅助检查1.2.1临床检查手段对于耳部的检查，额镜和电耳镜是最基础的也是最常用的手段。最早对于以外耳道疾病就诊患者，常常采用额镜辅助检查外耳道及鼓膜，其优点为操作简单、快速，但因外耳道解剖呈现一横向“S”形，在额镜辅助检查下往往对外耳道及鼓膜细微变化窥不清或只能窥及部分。光学电耳镜带有光源，且具备放大作用，所自带的耳镜可抚平外耳道的皮肤绒毛，阻挡耵聍，更接近鼓膜，相比额镜能够更加近距离[13]的窥清外耳道及鼓膜的情况，但仅限于观察。上述两种手段，便捷且简单操作，但缺陷明显，故临床中更推荐耳内镜检查。耳内镜视野更加清晰，它不但可以在内镜显示器下看清外耳道及鼓膜的情况，甚至观察两者的变化，而且它能帮助医师及时的清理外耳道的分泌物、肉芽组织、团块以及即时的获取分泌物送检培养或者镜检。所以，耳内镜大大提高了外耳道真菌病的诊断率，同时，耳内镜对于外耳道真菌病的治疗有明显促进作用。外耳道真菌病治疗除了药物以外，最重要的治疗手段就是局部的清理，及时的清理外耳道分泌物，不但能明显缓解患者的不适症状，同时能加快疾病的康复。所以，临床医师应充分发挥主观能动性，积极普及耳内镜的[14]开展，既收费便宜合理，又易于掌握且操作简单，更重要的是提高诊断率，缩短疾病的康复周期，应大大提倡。1.2.2实验室诊断20 综述目前对真菌病的实验室诊断主要依靠以下检查:①做真菌镜检及真菌培养检查;②取标本做涂片检查或取组织病理检查;③放射免疫荧光测试;④血清学检查和皮肤实验;⑤聚合酶链式反应。其中，真菌培养和镜检是最常用也是最简单的方法，[15]其中真菌培养是金标准。真菌医师镜检的优点是方便快捷，临床医师容易操作，可以通过耳内镜获取分泌物直接送至检验科，甚至可以棉签深入耳道直接获取分泌[16]物送检，但此方法检出率低，并不能确定菌种。这是对所有送检真菌总体镜检结论。真菌培养过程相对复杂，首先要将标本接种，每天观察其镜下的结构、形态、生理特点以及习性，根据培养周期区分浅部真菌和深部真菌，从而更容易明确该真菌的科、属、种，指导临床医师更准确治疗。但上述培养的过程相对复杂，且周期较长，对于医师和患者都不合适，所以临床更推崇非培养但又准确率高的方法，其[17]中，血清学和分子生物学方法是目前的热点，但成本较上述两种方法明显升高。1.3外耳道真菌病的鉴别诊断外耳道真菌病是临床比较常见且简单的疾病，但诊断的正确率并不高，其主要原因主要有以下三点，第一：临床上与外耳道真菌病容易混淆的疾病主要有慢性化脓性中耳炎、慢性外耳道炎以及外耳道湿疹，在患者抗炎治疗无效且患者主诉发生变化的情况下，应仔细考虑有无外耳道真菌病的可能。第二：患者对真菌感染的认识不充分，误认为是细菌感染所引起的炎症，常常去不正规医院或者就近药店买抗细菌类抗生素使用。第三：部分乡镇医院无检测真菌感染的实验室设备或者医院没有抗真菌类的滴耳液。外耳道真菌病应与以下疾病鉴别：①外耳道湿疹：以小儿多见，本病发作多伴有全身其余部分湿疹的发作，容易消退，抗炎抗湿疹药物有效，病程较短，且小儿不易发作真菌感染。②弥漫性外耳道炎：主要以疼痛为主诉，患者早期轻微疼痛，随着疾病进展，疼痛明显，不能触碰，甚至影响吞咽动作的发生，多伴有耳闷的症状，主诉耳痒的较少，查体可见外耳道红肿，狭窄，重者会出现耳道皮肤的溃烂、渗出及分泌物，更严重者会出现耳廓周围的红肿，甚至出现耳周部淋巴结的肿大以及压痛。临床治疗中抗炎治疗明显有效，尤其是局部放置带有抗菌药物的纱条以及全身应用抗菌药物。③坏死性外耳道炎：好发于老年人、糖尿病患者、艾滋病、肾移植、骨髓移植和白血病等免疫抑制的患者，本病起病较急，临床症状多表现为耳部的刺痛，多为持续性且逐渐加重，较一般外耳道炎严重，夜间明显，可放射至至颞部，有脓性或血性分泌物，亦可出现颅神经损害现象如周围性面神经麻痹、颈静脉孔综合征等，检查是可发现外耳道皮肤红、肿、触痛，外耳道狭部底壁皮肤糜烂，肉芽增生，寻此可探及坏死腔，耳廓、耳屏可肿胀，有明显触痛和牵拉痛，乳突区亦有肿胀和叩痛。鼓膜穿孔或坏死。经一般抗炎治疗常无明显效[18]果。21 青岛大学硕士学位论文2外耳道真菌病的治疗新进展早在1843年Andral和Cavarret，1844年Mayer尝试用多种方法对该疾病[19]进行诊断和治疗，但目前对此病的治愈率仍不理想。主要使用局部抗真菌治疗，局部抗真菌药物在医院的种类很有限，如制霉菌素、氟康唑、达克宁软膏等，遇到治疗效果差的患者，及时有药敏结果也没有很好的局部药物代替。再者曲霉菌属感染，因条件限制，并未做药敏试验。2.1抗真菌药物抗真菌药，顾名思义，是指抑制真菌生长繁殖或者消灭真菌的药物，临床上，根据其化学结构，主要分为四类，包括抗生素类抗真菌药、唑类抗真菌药、丙烯胺类抗真菌药、嘧啶类抗真菌药。抗生素类抗真菌药主要包括制霉菌素、两性霉素B。这类药物作用机制为：药物可与真菌细胞膜中成分，即麦角固醇结合，改变真菌细胞膜的通透性，引起真菌细胞内氨基酸、甘氨酸等小分子物质和钠钾离子等电解质的外渗，破坏细胞的内环境，从而抑制真菌生长致其灭亡。两性霉素B是强效杀真菌药，几乎对所有真菌具有抗菌活性，抗真菌普广，因其副作用多，外耳道真菌感染者很少使用。近年来国内研究出了两性霉素B脂质体、两性霉素B脂质体复合物、两性霉素B胶体分散剂，是两性霉素B的新型剂，这3种剂性的药品保留或者增加了两性霉素抗真菌的药理作用，同时有效减少了两性霉素的毒副作用，临床中对于全身的真菌性疾病，应用较广。制霉菌素为多烯抗真菌药，作用机制与两性霉素B相似，对念珠菌、新生隐球菌、曲霉菌属的抗菌活性较高，且不易产生耐药性。制霉菌素一般口服或者静脉应用较少，临床中一般多用于局部应用，耳鼻喉临床医师多选取制霉菌素做滴耳液治疗外耳道真菌病，因为其局部应用时不吸收，不良反应小，尤其是对于皮肤、浅表的真菌感染，效果明显，但其对深部真菌作用不大。2.1.1丙烯胺类抗真菌药丙烯胺类抗真菌药主要包括萘替芬、特比萘芬。其主要作用机制为鲨烯环氧酶。该氧化酶可以抑制鲨烯转化为羊毛固醇，同时阻断羊毛固醇向麦角固醇的转化，从而破坏真菌细胞膜的结构和功能，影响细胞内成分，致其死亡。该环氧酶为非竞争性、可逆性抑制剂。唑类抗真菌药2.1.2唑类抗真菌药唑类抗真菌药包括咪唑类和三唑类，咪唑类抗真菌是用于浅部真菌感染的首选药物，其包括酮康唑、咪康唑、益康唑、克霉唑、联苯卡座，酮康唑等，其主要作22 综述用机制如下：药物可影响真菌细胞膜中麦角固醇的合成，改变真菌细胞膜的通透性，导致真菌细胞内成分的外渗，改变细胞体内环境，导致真菌生长抑制或者死亡。。三唑类抗真菌药包括伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑等，可作为治疗深部真菌感染首选药,其作用机制不同于咪唑类药物，主要作用机制与真菌细胞色素P450相关，二者保持较高的亲和力，从而破坏真菌细胞导致其死亡。上述两种药物作用机制的不同，导致了二者的活性和副作用的差异。其中，三唑类药物的抗真菌活性明显高于咪唑类，且毒副作用小。目前，临床上多见的是三唑类的药物制剂，同时对于三唑类的药物的研究也一直在持续中。文献报道，上海第二军医大学药学院在国内外率先建立起了一套集分子设计、化学合成、分子筛选为一体的抗真菌药物为一体的创新设计体系，运用计算机辅助药物设计以及分子生物学技术，并从中研制出了一个[20]高效、低毒、广谱的抗真菌新药-艾迪康唑。2.1.3嘧啶类抗真菌药咪唑类抗真菌药的作用机制多是影响真菌细胞DNA的合成，从而停止真菌的复制与繁殖，是一类人工合成的广谱抗真菌药。临床上应用较多的氟胞嘧啶，后者进入真菌细胞内后通过一系列反应来抑制胸腺嘧啶核苷合成酶的合成，从而阻断尿嘧啶脱氧核苷转变为胸腺嘧啶核苷，影响DNA的合成，阻止真菌细胞的繁殖。2.1.4其他辅助药物硼酸酒精滴耳液，分子成分主要有硼酸、乙醇，硼酸有收敛抗炎的作用，乙醇可消毒脱水，二者结合能够抑菌、制霉、止痒。双氧水，又名过氧化氢溶液，具有较强的氧化性，它一方面作用于菌体，氧化体内的蛋白质，使其失去生物学活性，另一方面能有效的冲洗真菌，临床中多配合抗真菌药物局部应用，二者相得益彰。2.2外耳道真菌病的治疗外耳道真菌病是耳鼻喉科门诊最常见的疾病之一，临床治疗中多以局部用药为主，全身用药一般较少，因其全身用药对肝肾毒副作用较大，治疗前后及中间过程中要不断监测肝肾功的变化，故只有在真菌病感染较重出现全身症状时才选择全身用药。目前国内外尚无对外耳道真菌病疗效评定的统一标准。目前外耳道真菌病局部治疗治疗原则为：局部规律应用抗真菌药物，及时清理外耳道分泌物，保持耳道干燥清洁，根据真菌培养结果及时调整敏感抗真菌药物，全身症状严重者加用全身用药。国内外诸多学者尝试用不同方法试图治疗及降低外耳道真菌病复发，至今仍未有太大进展。[21]赵青等通过对诊治过的86例外耳道真菌病患者行真菌学检测，并给予0.5%23 青岛大学硕士学位论文氟康唑滴眼液，局部治疗外耳道真菌病，取得满意疗效。选取的氟康唑是临床中最常用的抗真菌药物，该药物抗菌谱广、局部易吸收，且毒性远小于两性霉素；岳耀[22]光等则针对伴外耳道真菌病的肉芽性鼓膜炎的治疗做了临床统计及研究，收集了41例外耳道真菌病并发肉芽性鼓膜炎的患者，通过耳内镜检查并治疗即耳内镜下观察清理并局部应用硝酸银等烧灼，以及局部药物治疗即局部抗生素滴耳加局部抗真[23]菌药，取得良好疗效。李锦秀应用氟康唑与碘伏联合应用治疗外耳道真菌病，统计中选取了75例外耳道真菌病患者作为研究对象，并对总体做了对照组和治疗组的划分，发现治疗组的疗效明显高于对照组，研究不但证明了该治疗的有效性，同时提醒临床，目前真菌耐药性成为突出问题，两种及两种以上的药物联合应用应作为[24]临床治疗的一种选择。赵质彬等则运用其他治疗方法，选取106例外耳道真菌病患者，予耳内镜下清理及局部涂擦派瑞松来治疗该病，统计发现总治愈率高达92%。研究中指出耳内镜对于该病的清理极其重要，同时发现曲安奈德作为中小糖皮质激[25]素可有抗过敏、抗炎止痒的作用。熊建等为了观察氟康唑氯化钠联合低功率激光治疗外耳道真菌病的临床疗效，选取了106例患者，应用上述治疗，统计其复发率，发现二者联合应用具有协同作用，需要指出的是，局部照射有良好的抑菌效果，同[26]时促进微循环，改善组织缺氧状态，镇痛抗炎。刘艳等分析了联苯苄唑乳膏治疗外耳道真菌病的疗效，选取了83例患者，采用耳内镜下清理后外用药物，取得良好效果。联苯苄唑为较强的光谱抗真菌的药物，它的药效机制较为特殊，低浓度时抑制真菌细胞膜形成，高浓度时破坏真菌细胞膜，均可杀死真菌，同时它还具备抗细[27]菌的作用，对皮肤刺激小，使用安全。王少罗等使用冷冻治疗外耳道真菌病，其方法为：首先用双氧水冲洗外耳道，保护好鼓膜避免破损，应用冷冻液快速涂抹外耳道，短时多次，重复，后观察，注意观察患者避免出现恶心眩晕等不适。该治疗[28]取得良好效果。李毅等报道使用4%硼酸酒精和达克宁霜治疗外耳道真菌病，其疗效评定标准为：无效：症状无改善，外耳道可见真菌及其分泌物；症状明显减轻，外耳道可见真菌及分泌物；显效：症状明显减轻，外耳道正常；治愈：症状消失，[29]外耳道清洁、干燥。治疗效果良好，几乎未发现无效病例。2汪志等报道利用氦氖激光耳腔内照射联合水杨酸滴耳液治疗外耳道真菌病，在耳腔内应用激光局部照射病变部位，通过热效应改善局部血液循环及淋巴回流，前者加速病变修复，后者[30]可以增强局部免疫系统功能，从而达到抗炎止痛的目的。彭郑坚等运用中西医结合的方法治疗外耳道真菌病，选取78例患者，给予氟康唑滴眼液及中药丹参酮胶囊[33]联合治疗，取得不错效果。2015年易建武选取59例外耳道真菌病患者，分为两组，治疗组应用耳内镜下派瑞松软膏纱条联合氟康唑治疗真菌病，发现上述方法对于难治性外耳道真菌病具有良好的效果。24 综述综上所述：外耳道真菌病是耳鼻喉科常见病，诊断主要根据患者症状、体征做出诊断，因其临床症状、体征与耳科其他疾病相似，且很多时候与其他耳部疾病并存，故其误诊率高，延误治疗。治疗上主要采用局部抗真菌药物治疗，如何降低外耳道真菌病的误诊率、降低复发率、提高治愈率，临床研究者正在努力探索中。3.1医学动物模型的概念动物模型，作为疾病治疗、病理生理等研究的一种有效的手段，已经广泛的应用于各种真菌感染的疾病中，医学动物模型是指在医疗的科学及实验研究中模拟人类疾病表现所建立的模型。但目前尚未发现建立外耳道真菌病的动物模型，这导致对于外耳道真菌病针对性的药物治疗及发病机制的研究相对落后。目前常用于研究真菌病的动物模型包括家兔、大鼠、小鼠、豚鼠以及使用免疫抑制剂的动物等。3.2部分真菌病动物模型的建立3.2.1曲霉菌病动物模型的建立目前，对于肺曲霉菌病是曲霉菌种疾病的主要研究对象，Dixon、Niki等使用免疫抑制的小鼠建立了模型，使用不同浓度的烟曲霉菌分生孢子悬浊液1*10^7孢子/ml烟曲霉菌的悬浊液、1*10^8孢子/ml烟曲霉菌的悬浊液、1*10^9孢子/ml烟曲霉菌的悬浊液分别滴入小鼠鼻内，经鼻、咽、喉、气管、支气管、肺途径感染小鼠，其死亡率与曲霉菌的浓度呈正相关，证实这种小鼠模型适用于急性肺曲霉菌病的研究中。Spreadbury等用新西兰白兔研究侵袭性的肺曲霉菌病的模型的建立。同样使用免疫抑制剂如环磷酰胺和皮质类固醇进行免疫抑制，直接气管内接种4*10^4孢子/ml烟曲霉菌的悬浊液，结果在肉眼所见和显微镜所见都可证实曲霉菌孢子的存在，并观察了该病的病理生理过程，为该病的发病机制和治疗做出了贡献。3.2.2念珠菌病动物模型的建立念珠菌是正常人体内的共生菌，在人体内外环境平衡时静止存在，当机体免疫力下降时才可发病。因此，建立念珠菌病的动物模型常需要对其进行免疫抑制，常见的模型有大鼠、小鼠以及基因敲除的动物，常见的免疫抑制剂包括雌激素、环孢素[36]A、放射光线等在局部或者系统性感染念珠菌病中起免疫抑制作用。Krause等使用环孢素A对系统性念珠菌病和局部的念珠菌感染如鹅口疮样病变在小鼠中建立的模[37]型；Cole等比较了使用环孢素A免疫抑制及未使用免疫抑制剂中接种小鼠胃内念珠菌病，结果发现，在免疫抑制和非免疫抑制组中的口腔、咽喉、食管和胃内均存在较持久的念珠菌，可导致慢性感染的发生，且在未成年幼鼠中更易发病。Haziroglu等使用腹腔直接注射假热带白色念珠菌于免疫抑制的白色小鼠，处死后观察组织病25 青岛大学硕士学位论文理学，同样证实模型成功的建立。部分研究着还通过持续小剂量的腹腔注射雌激素的方法来促使小鼠发情，来增加白色念珠菌病的易感性，也有部分研究中直接切除小鼠的卵巢，并腹腔注射雌激素，均建立起阴道念珠菌病的模型。同样在研究阴道念珠菌病的抗原抗体中发现，取小鼠阴道分泌物中并未发现念珠菌抗体，也就是说[38]念珠菌抗体在抗念珠菌病中的作用有限；但有研究者对不直接采用念珠菌悬浊液作抗原，而采用白色念珠菌的细胞壁蛋白部分提取物以及分泌型天冬氨酸蛋白酶作为感染小鼠的抗原，作用于雌激素免疫抑制化的小鼠，结果在小鼠阴道分泌物中成功检验出抗体的存在，对白色念珠菌病的抗原抗体研究有着重要作用。但是对于光滑念珠菌病的动物模型的建立就较为困难，因为其具有较低的致病能力。3.2.3隐球菌病动物模型的建立球孢子菌因其较强的致病能力，及小鼠本身机体的易感性，可作为最为常见的真菌病的动物模型，球孢子菌的致病时间较长，可达30天左右，方便观察疾病的发生、发展过程，并且小鼠对此感染的免疫反应较强，对于病理组织的观察更为方便，Huppper等研究隐球菌引起感染的小鼠模型中对BALB/c和CB-17免疫分子做了分析，在感染后发现该疾病的免疫反应主要依靠T细胞介导的免疫反应，当人为的敲除T细胞后，CD细胞占优势，追踪免疫防御机制从肺部的播散至中枢神经系统，发现与艾滋病患者肺部感染隐球菌的防御机制顺序一致，这提示建立隐球菌病动物模型，可为今后研究抗真菌感染的抗生素和肺内感染的系统性药物的应用与意义。3.2.4癣病动物模型的建立对于癣病的研究理想模型常选用家兔或豚鼠，因为其本身的易感性，可不经任何干预而致病。一般制作癣病的动物模型，是在刮除豚鼠或家兔背部毛后直接接种红色毛癣菌，在病理组织中可分离出癣菌的孢子，以此可证实模型成功的建立。因该模型易于建立，因此成为评估抗真菌药物的有效模型，在模型建立之后，经口或者静脉注射不同剂量的抗真菌药物，根据接种部位病理检查真菌孢子生长的数量来评估抗真菌药物的疗效。有研究表明KP-103这种抗真菌治疗剂明显优于其他抗真菌药物，此疗效不仅与其抵抗真菌的致病性有关，而且作用持久，不易在皮肤中丧失，可保持持续的灭菌作用。此后的研究有部分学者应用NND-502乳膏涂抹所建立的癣菌病和念珠菌病的动物模型，在治疗后的7天、28天和120天分别取接种治疗部位的皮肤作组织病理培养，均未发现真菌孢子、菌丝的出现，因此证明此剂为较有效的抗癣菌及抗念珠菌病药物。26 综述总结此综述：治疗上主要采用清洁外耳道，使用双氧水冲洗外耳道，对于真菌药物的治疗还在研究中。因此，建立相应的动物模型，可推动真菌病的发病机制的研究，建议使用有针对性、副作用小、敏感性的抗真菌药物。27 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