《舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号S763.35学校代码10129UDC632学号2014392030001舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响VirulenceofLdNPVmixtureagentandeffectsonactivitiesofGlutahioneS-transferasesofgypsymothlarvae申请人：MyagmarTserennyam学科门类：林学学科专业：森林保护学研究方向：森林害虫综合治理指导教师：段立清教授论文提交日期：二○一八年六月 摘要舞毒蛾(LymantriadisparL.)是一种叶食害虫，具有寄主种类多、分布广、危害大的特征。舞毒蛾核型多角体病毒(L.disparnucleopolyhedrosivirus,简称LdNPV)是一种可以影响舞毒蛾种群数量的致病微生物。合适的荧光增白剂可以提高LdNPV对舞毒蛾幼虫的毒力，达到利用病毒防治舞毒蛾虫害的目的,为此室内用正交实验方法比较不同浓度的荧光增白剂和氯化锌对核型多角体病毒的增效作用，筛选出最佳配比，得到了复配剂；通过生物测定确定了复配剂对舞毒蛾的LC50和LT50，同时分析了复配剂对舞毒蛾的亚致死作用。为研究这种增效作用的原理，实验测定了复配剂各成分对舞毒蛾4龄幼虫血淋巴和中肠谷胱甘肽S-转移酶比活性的影响关系。研究结果如下：1.病毒中添加1%的荧光增白剂和0.1%的氯化锌，紫外照射6h后，对舞毒蛾的死亡率比正常人工饲料的情况提高3倍，舞毒蛾幼虫的死亡率是67.7%。说明这种配比可以显著提高LdNPV对舞毒蛾幼虫的致死作用。2.舞毒蛾幼虫取食添加1%荧光增白剂VBL与0.1%氯化锌（ZnCl2）的LdNPV后，病毒浓度与致死作用呈正相关，病毒浓度越高，致死率越高。对舞毒蛾２龄幼虫致死中浓度（LC50）为106.40Bs/µL，LC90为6457.40Bs/µL，浓度为390Bs/µL时，致死中时间LT50为13.12d，浓度为3900Bs/µL时，LT50为9.37d。3.加入荧光增白剂VBL和氯化锌（ZnCl2）的LdNPV对舞毒蛾幼虫有亚致死作用。雄性幼虫历期较对照缩短,不同病毒浓度下雄性幼虫历期较对照的缩短2-5d。随病毒浓度的升高，复配剂使舞毒蛾雌雄化蛹率、羽化率、产卵数量、卵块重量减少，且浓度越高，减少的越明显。取食未添加荧光增白剂和氯化锌的人工饲料的舞毒蛾与已被病毒感染的舞毒蛾单雌产卵量差异明显，比对照显著降低。4.VBL+ZnCl2+病毒复配剂和ZnCl2+病毒对舞毒蛾4龄幼虫的中肠、血淋巴GST酶活性有显著差异，比对照组（单独病毒）的酶活性增高，在第72h时表现为活性增加最大，达到显著差异。VBL+ZnCl2+病毒对舞毒蛾幼虫血淋巴GST的影响在第72h时表现为活性增加，24h时的血淋巴GST活性也显著增加，分别比单独病毒的增高3.7和7.2倍。VBL+ZnCl2+病毒复配剂对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第48h和72h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高2.4和4.6倍。关键词：舞毒蛾；核型多角体病毒；致病力；荧光素VBL；氯化锌；谷胱肽S-转移酶 VirulenceofLdNPVmixtureagentandeffectsonactivitiesofGlutahioneS-transferasesofgypsymothlarvaeAbstractThegypsymothlarvae(LymantriadisparL.)isoneofthemostdestructivedefoliatorofwidespeciesoftrees,shrubsandplants,especiallyofbroad-leafandconifertrees.TheLymantriadisparNuclearPolyhedrosisVirus(LdNPV)isapathogenicmicroorganismthathasbeenusedasapesticideagainstgypsymoths.OurresearchhasprovedthatselectedsuitablefluorescentwhiteningagentsandothersynergisticsubstancescouldimprovethepathogenicityandlethalityofLdNPVtothelarvaeofthegypsymothandachievedthepurposeofusingvirustocontroltheinsectpests.Inourexperiment,theeffectofdifferentconcentrationsoffluorescencewhiteningagentandzincchlorideonnucleotidepolyhedralviruswascomparedbyorthogonalexperimentalmethod,andtheoptimalproportionwasselected.TheLC50andLT50ofLdNPVagentsthesecondinstarlarvelofgypsymothweredeterminedbybioassay,andthesublethaleffectofcomplexmixtureongypsymothwasanalyzed.Inordertostudytheprincipleofthissynergisticeffect,afterthefourthinstarlarvaewerefedwithsevenkindsofdifferenttreateddietsincludingfluorescencewhitening,andzincchloride(ZnCl2),activitesofglutathiones-transferaseinhemoLymphandmidgutsoflarvaeweremeasured.Theresultswereasfollows:1.Byusing1%concentrationoffluorescentwhiteningagent(VBL）and0.1%zincchloride(ZnCl2),andexposed6hoursunderultravioletlight,themortalityofgypsymothlarvacausedbytheLdNPVmixturedagentwasthreetimeshigherthanthatofnormalLdNPV,andthemortalityratewas67.7%.ItwasindicatedthatthesynergisticsubstancescansignificantlyimprovethelethaleffectofLdNPVonthelarvaeofgypsymoth.2.ThelethaleffectoftheLdNPVmixturedagent(1%ofthefluorescencewhiteningagentVBL,theLdNPV,and0.1%chloride(ZnCl2))waspositivelycorrelatedwithconcentrationofthevirus.Whenthevirusconcentrationwasincreased,thelethaleffectwasalsoincreased.Inaddition,themedianlethalconcentration(LC50)oftheLdNPVmixturedagenttothe2ndinstarlarvaewas106.4OBs/µl,andLC90was6457.4OBs/µl. LT50ofthelarvaewas13.12dayswhenthedoseofthevirususedwas39OBs/µl,anditwasreducedto9.37dayswhenthevirusconcentrationwas3900OBs/µl.3.LdNPVmixturedagent(1%ofthefluorescencewhiteningagentVBL,theLdNPV,and0.1%chloride(ZnCl2))asublethaleffectonthelarvaeofthegypsymoth.Afterfeeding.MalelarvaefedonLdNPVmixturedagendiethadtheduration2to5daysshorterthanthatofthecontrol.Thenumbersofpupaewerereducedwhenvirusconcentrationwasincreased,andsignificantreductionintheweightandtheeggnumberwereobservedaswell.4.TheactivitiesofGSTbothinthehemoLymphandmidgutofthe4thinstarlarvalwerehighestafter72hoursoffeedingwithLdNPVmixturedagent(1%ofthefluorescencewhiteningagentVBL,theLdNPV,and0.1%chloride(ZnClth2))tothe4instarlarvae.InthehemoLymph,GSTactivityshowedanincreaseafter72hrs.offeeding,anditwas72timeshigherthanthatofafter24hrs.,whichwas3.7-fold.TheincreasesintheactivityofGSPinthelarvalmidgutwereobservedafter48hrs.and72hrs.,whichwere2.4and4.6-foldhigherthanthatofafter24hrs.offeeding.KeyWords:Gypsymoth;Nucleopolydrevirus;Virulence;FluoresceinVBL;Zincchloride;Glutathiones-transferase.Directedby：Prof.DUANLiqingApplicantforDoctordegree：MyagmarTserennyam(ForestProtection)(CollegeofForest,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010019,China) 目录1.引言................................................................11.1舞毒蛾相关生物学...............................................11.1.1危害与分布...............................................11.1.2生活史...................................................21.1.3舞毒蛾天敌及制约能力.....................................21.1.4舞毒蛾的防治..............................................31.1.5物理防治..................................................31.1.6化学药剂防治.............................................41.1.7生物防治.................................................41.1.7.1苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)..........51.1.7.2舞毒蛾核型多角体病毒...............................51.1.7.3关于荧光增白剂VBL分析..............................81.2.VBL增效作用研究进展............................................91.2.1中国的舞毒蛾病毒研究......................................91.2.2国内外荧光增白剂研究.....................................101.2.2.1国外荧光增白剂研究.................................101.2.2.2中国荧光增白剂研究现状............................111.2.3国内外舞毒蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶研究现状................141.2.3.1国外舞毒蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶研究现状............141.2.3.2在中国舞毒蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶研究现状..........141.3研究意义及研究内容过程.........................................151.3.1研究目的及意义...........................................151.3.2研究内容................................................161.3.3技术路线................................................172．材料与方法.........................................................182.1供试材料......................................................182.2舞毒蛾幼虫饲养方法............................................182.2.1卵面的消毒...............................................182.2.2人工饲料的制作...........................................192.2.3幼虫饲养................................................192.2.4供试幼虫的选取与病毒的饲喂..............................192.3LdNPV的分离题纯...............................................202.4荧光素VBL对于舞毒蛾核型多角体病毒毒力的影响分析..............202.4.1幼虫的饲养及前期处理.....................................202.4.2VBL的增效作用测定......................................202.4.2.1生物测定..........................................212.4.2.2数据的处理........................................212.4.3实验的计划(VBL浓度筛选).................................212.4.3.1确定VBL最佳浓度研究办法...........................212.4.3.2VBL的抗紫外线作用的研究计划.......................212.4.4数据的处理...............................................22 2.5舞毒蛾核型多角体病毒的最佳复配剂对舞毒蛾幼虫亚致死的影响.......222.5.1幼虫的饲养及前期处理.....................................222.5.2最佳复配剂不同浓度的病毒溶液的配制......................232.5.3数据统计与分祈..........................................232.6荧光素及舞毒蛾核型多角体病毒对舞毒蛾酶活的影响.................232.6.1幼虫饲养及前期处理.......................................232.6.2酶液提取................................................242.6.3实验液的配置............................................242.6.4谷胱甘肽-S-转移酶GlututhioneS-transferases活性测定.....242.6.5蛋白质含量测定..........................................252.6.6数据统计与分析..........................................253.结果与分析.........................................................263.1荧光素VBL对舞毒蛾核型多角体病毒的毒力的影响分析...............263.1.1筛选获得LdNPV的最佳复配剂..............................263.1.2LdNPV的不同复配剂对舞毒蛾幼虫发育影响...................273.1.3小结....................................................293.2舞毒蛾核型多角体病的复配剂对舞毒蛾幼虫的致病力.................293.2.1最佳病毒复配剂对舞毒蛾二龄幼虫的死亡率的分析.............293.2.2最佳病毒复配剂对舞毒蛾二龄幼虫的致死中浓度LC50..........313.2.3不同浓度LdNPV舞毒蛾幼虫的致死中时间LT50.................313.2.4小结....................................................313.3舞毒蛾幼虫取食VBL、ZnCl2和不同浓度LdNPV感染的人工饲料后对舞毒蛾幼虫发育历期的影响................................................323.3.1舞毒蛾幼虫取食VBL、ZnCl2和不同浓度LdNPV感染的人工饲料对舞毒蛾雄幼虫发育历期的影响......................................323.3.2舞毒蛾幼虫取食VBL、ZnCl2和不同浓度LdNPV感染的人工饲料对舞毒蛾䧳幼虫发育历期影响........................................333.3.3最佳病毒复配剂对舞毒蛾蛹的影响..........................343.3.4VBL、ZnCl2和不同浓度病毒对舞毒蛾的产卵量及性比的影响.....353.3.5小结....................................................353.4舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾4龄幼虫酶的影响.....363.4.1血淋巴的谷胱肽S转移酶..................................363.4.1.1不同成分对舞毒蛾幼虫血淋巴GST的比较...............373.4.1.2小结..............................................413.4.2中肠的谷胱甘肽S转移酶..................................433.4.2.1不同成分对舞毒蛾幼虫中肠GST比较...................443.4.2.2小结..............................................484.结论与讨论..........................................................504.1结论...........................................................504.2讨论..........................................................504.3论文的创新点..................................................54致谢..............................................................55参考文献........................................................56附录..............................................................63作者简介........................................................65 插图和附表清单图1感染了NPV的舞毒蛾幼虫.................................................5图2显微镜下NPV的封闭体...................................................6图3舞毒蛾病毒的生命周期：.................................................7图4技术路线...............................................................17图5不同复配剂对舞毒蛾幼虫死亡率的关系....................................27图6不同复配剂对舞毒蛾二龄幼虫的死亡率和幼虫的死亡率的关系................28图7取食最佳病毒复配剂舞毒蛾幼虫的累计死亡率与时间的关系..................30图8舞毒蛾雄性幼虫发育历期关系............................................33图9最佳病毒复配剂对舞毒蛾雌幼虫发育历期的关系............................34图10单独添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应37图11单独添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应38图12单独病毒感染的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱肽S转移酶活性的时间效应...........39图13毒感染添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应......................................................................39图14病毒感染添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应....................................................................40图15病毒感染添加荧光素和氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应............................................................41图16单独添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应.44图17单独添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应.45图18单独病毒感染的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应...........45图19病毒感染添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应......................................................................46图20病毒感染添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱肽S转移酶活性的时间效应47图21病毒感染添加荧光素和氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱肽S转移酶活性的时间效应................................................................48表13种药剂喷药防治效果比较................................................4表2生物防治效果比较.......................................................5表3实验的计划(增效剂筛选)................................................22表4实验液的步骤..........................................................23表57种处理的试剂溶液的配制...............................................24表6谷胱甘肽-S-转移酶活性测定步骤.........................................25表7蛋白质标准曲线的制定..................................................25表8不同复配剂对舞毒蛾幼虫的死亡率........................................26表9不同复配剂对舞毒蛾二龄幼虫的死亡率....................................27表10复配剂中LdNPV不同浓度对舞毒蛾幼虫死亡率的影响.......................29 表11最佳病毒复配剂对舞毒蛾2龄幼虫的致死中浓度...........................31表12最佳病毒复配剂对舞毒蛾2龄幼虫的致死中时间LT50.........................31表13最佳病毒复配剂对舞毒蛾雄幼虫发育历期的影响...........................32表14最佳病毒复配剂对舞毒蛾雌幼虫发育历期的影响...........................33表15最佳病毒复配剂对舞毒蛾蛹的影响.......................................34表16最佳病毒复配剂对舞毒蛾雌雄性比，羽化率及成虫产卵质量的影响.............35表17不同成分对舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的影响...................36表18不同成分对舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的影响.....................43 内蒙古农业大学博士学位论文11.引言1.1舞毒蛾相关生物学1.1.1危害与分布毒蛾科昆虫的舞毒蛾(LymantriadisparL.)。别称秋千毛虫、苹果毒蛾、松针黄毒蛾、柿毛虫，吉普赛蛾、属昆虫纲鳞翅目毒蛾科毒蛾属，分为亚洲种群、欧洲种群及北美种群。其中亚洲种群被称为亚洲型舞毒蛾，包括日本亚种（L.disparjaponica）和亚洲亚种（L.disparasiaticaVnukovskij），亚洲的亚种主要分布在四国、日本的亚种主要分布在日本的本州、亚洲和欧洲的部分地区，九州和北海道的南部地区和西部地区。亚洲型舞毒蛾在中国主要分布在北纬20°-58°之间，主要分布在华北、华东、东北、西北及中国台湾，主要省分是吉林、黑龙江、陕西、内蒙古、青海、河南、河北、山东、宁夏、甘肃、新疆、山西、湖北、江苏、贵州、四川、台湾。国家林业部门,对全国的舞毒蛾发生的监测数据表明，2008年共发生533万亩地，主要分布在辽宁、黑龙江和内蒙古等地方，甘肃、河北、吉林、山西、贵州和四川等地也有发生。2009年发生面积减少，共计181万亩，主要分布于辽宁、黑龙江、内蒙古、吉林和河北等地，山西、陕西、甘肃、四川和新疆等地也有发生[1]。在蒙古国主要集中在杭盖、贺基、库苏古尔等森林的省区，以及鄂尔浑、斯楞格、铜勒等县区，以沿河的盆地地区居多。舞毒蛾对杨柳、灌丛等树木丛林的危害极大，而且，近6至10年间，舞毒蛾的数量与日俱增。相关研究表明，在中央省、色楞格县等地区舞毒蛾数量从2013年后开始明显增加，由其是2014年至2017年，舞毒蛾在乌兰巴托市传播速度极快。针叶林植物受到舞毒蛾危害后可自行恢复，但由于数量增长过快而导致大量树木受损严重[2]。舞毒蛾寄主的植物种类繁多，分布也广泛，抑制很困难。舞毒蛾的寄主植物可高达500余种，包括：苹果、板栗、樱桃、柿、桃、杏、柳、橡、梨、杨、榆、桑、樟子松、桦山松、云南松、落叶松、马尾松、油松、栎、桦、李、柿树、山楂、椴、槭、红松云杉等多种针阔叶树种和果树，在不同的地理分布区，主要危害的树种有所不同。雄、雌舞毒蛾得成虫均有强烈的趋光性，雄成虫还有较强的趋化性，雌成虫从体内释放的性引诱剂为顺（7,8—环氧—2—甲基）。舞毒蛾多发生在新砍伐的阔叶林、阔叶林以及植被稀少的松林中，通风且透光的林缘地带危害最重，而在郁闭度较大、林层复杂的林区很少大量发生[1，3]。AGM雌成虫可借风传播扩散，飞到新地区产卵。AGM卵块抗逆性比较强，可忍受极端的温、湿度，卵块可随草坪设施、原木、苗木、装箱、轮船集货盘、船体及钻探的设备或者人类活动实现远距离传播[1]。初卵幼虫有群聚性，毛长体轻，遇惊扰吐丝下垂，可借风远距离传播，距离可达到1.6km。2龄以后的幼虫白天的时候潜伏在落叶及树皮缝隙里或树上的枯叶，黄昏后出来取食，有较强的迁移能力，在饥饿时可以较长距离的转移，以此扩大危害 2舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响范围。幼虫：老熟时体长达到50-70mm，头黄褐色,有八字形黑色纹。前胸到腹部的第二节的毛瘤为蓝色，腹部的第三至九节的7对毛瘤为红色。6月中旬幼虫变老熟，为了化蛹，它们在树干裂缝处、石块下、枝叶间吐少量得丝缠固其身。蛹：体长19-34mm，雌蛹大，雄蛹小。6月下旬到7月上旬化蛹最多，蛹期为15天左右。成虫从6月底开始羽化，且成虫有趋光性，7月的中、下旬为盛期。气候干旱有利于舞毒蛾暴发，准备1年，增殖期2-3年，猖獗期2-3年，衰亡期3年，猖獗周期[1，4]为8年。1.1.2生活史舞毒蛾一年只发生1代，已经完成胚胎发育后的幼虫在卵内越冬，翌年5月上旬的时候幼虫开始孵化，孵化的早晚同卵块所在地点的温暖有关，产于石砾上和石崖中的卵块孵比化较晚。幼虫孵化后的群集在原卵块上，气温转暖的时后上树取食叶片及芽苞。1龄幼虫因为有“风帆”，所以可以借助风力远距离的飘移。在其生长的过程中具有分散的习性，幼虫的历期比较长，一般在一个半月左右。7月上旬的时候开始化蛹，蛹期为12-17d，主要在树枝的叶间，树干裂缝处、树皮缝、石块下，该虫不会织茧,切吐少量的丝,将蛹体固定住。8月份为羽化期，因为羽化后的雄成虫在日间的时候常常成群飞舞，因此称之为“舞毒蛾”。羽化后的2-3d即可交尾。雌蛾产卵在主枝表面、树干表面、石块下、树洞中、石砾上及石崖避风处等。每个雌虫的平均产卵量为450粒，每以个卵块为300多粒卵，大发生时,最高产卵量可达到1000粒，平均为750粒。大约在一个月内幼虫在卵内完全形成，然后会停止发育，进入到滞育期。卵期长达9个月，卵块在林间的分布的类型有两种类型：高[2]。密度的时后为聚集分布，低密度的时后为随机分布1.1.3舞毒蛾天敌及制约能力中国舞毒蛾天敌共计6目19科91种。其中寄生性昆虫57种，姬蜂科30种，寄生蝇27种，半翅目19种，步甲科10种。即卵期寄生天敌主要是大蛾卵跳小蜂（DoencyrtuskuwanalHoward.），幼虫期天敌主要是绒茧蜂，寄蝇；蛹期天敌主要有舞毒蛾黑瘤姬蜂、寄蝇等。内蒙古大兴安岭林区现在已知的舞毒蛾天敌昆虫约有30多种。另外还有捕食性天敌鸟类、蜘蛛、细菌、病毒等。保护好目前林区舞毒蛾天敌资源，减少化学杀虫剂的使用频率和范围，使舞毒蛾种群数量变动受到天敌的有效制约，则可以实现有虫不成灾的目的，保护好现有的森林资源。在舞毒蛾幼虫期，主要抑制天敌的是病毒、窄腹凹眼姬蜂和绒茧蜂，可杀死56.09%的幼虫。在舞毒蛾卵—蛹期，累计约有30.10%的个体被寄生性天敌昆虫寄生而致死。据相关资料显示，无天敌时舞毒蛾的数量在翌年（次代）将增至当代的44.9倍，而在有天敌干扰的情况下，种群数量只增加8.5倍[2]。 内蒙古农业大学博士学位论文31.1.4舞毒蛾的防治(1)加强虫情预报工作，及早发现虫源地。虫情预报多采用黑光灯的诱集法。６月底的时候是舞毒蛾成虫羽化期，在林缘等开阔的地带设置黑光灯诱蛾，目前较为适宜的方法为灯泡上部设灯伞，灯泡下设以漏斗，通过大型的纱笼内，每天天黑的时候开灯，次日凌晨的时候关灯，统计出雌雄蛾数。(2)人工采集幼虫法。这种方法对于小面积严重发生地块实施较好，烟剂方法的防治容易引起森林火灾，所以用这种方法也可控制舞毒蛾的大发生危害。采集时间应该在舞毒蛾的幼虫暴食期前的3-4龄期进行。这种防治的方法可以作为采卵块方法的延伸和补充。(3)烟剂防治法:每年的5月下旬到6月上旬，在舞毒蛾的幼虫为3龄期左右进行化学烟剂防治法，放烟的时间一般掌握在清晨或者傍晚时出现逆温层时进行，烟点之间的距离设为7m，烟点带间的距离设为300m，如果超过了300m，则应该补充辅助烟带。(4)喷雾喷烟防治法。人工采集舞毒蛾卵块后，在卵密度仍较高的地点，当卵孵化的高峰期时进行喷雾防治1龄的幼虫，注意掌握在舞毒蛾的卵孵化的高峰期。在林内防治的时候，应在3龄的幼虫期，可利用苏云金杆菌BtMP—342菌株进行喷雾防治；1.8%的阿维菌素,或者0.9%的阿维菌素乳油喷烟或喷雾防治，其他的用生物农药喷雾喷烟防治。(5)灯光诱杀法。及时掌握舞毒蛾的羽化始期，预测好羽化始盛期，并且在野外利用频振灯或黑光灯配高压电网进行诱杀，出灯的时候应以2台以上为一组，灯与灯间的距离设置为500米，这样可以取得较好的防治效果。(6)性引诱剂诱杀法。1970年的时候从7.8万只舞毒蛾的雌蛾的腹部末端提取了浓缩得到的性信息素，并广泛应用在舞毒蛾成虫的监测预报及防治工作中。并利用舞毒蛾性引诱剂,对舞毒蛾进行预测预报实验中证明该种方法具有简单易行、预报准确率高等特点[5]。1.1.5物理防治利用单一波长的太阳能灯诱捕舞毒蛾。采用林间放置320nm至585nm不同波长的太阳能灯、不同颜色诱捕容器、长波与短波灯不同距离组合、太阳能灯与频振式杀虫灯对非靶标昆虫诱虫效果的比较等方法,确定灯光诱捕舞毒蛾的最佳技术。栾庆书等在林间放置320-585nm不同波长的太阳能灯诱捕舞毒蛾，结果为：340nm太阳能灯诱捕舞毒蛾总量和雄虫量最大，且显著大于对照灯的相应诱捕量；赵妹研等［6］利用黑光灯诱杀舞毒蛾的试验表明，黑光灯管诱杀效果优于其他光源。杨素平等应用ＳＰ科力频振式光控雨停害虫诱杀灯对舞毒蛾成虫具有良好的诱集作用［7］。 4舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响380nm太阳能灯诱捕雌虫量最大［5］。吴海山等开展不同波长的LED灯诱杀舞毒蛾试验发现，波长365nm灯诱虫效果最好，全光谱、521nm（绿色）、585nm（黄色）、603nm（梧色）波长的灯未诱到或只诱到极少量舞毒蛾雌成虫[7]。诱捕舞毒蛾的最适时间为19∶30至21∶30。银色容器诱捕到的舞毒蛾最多。长波灯与短波灯相距50m时,短波(340nm)诱虫灯的诱捕量最大,且显著大于其他距离和短波对照灯的诱捕量,在此距离条件下,长波(520nm)诱虫灯的诱捕量最小。单一波长的太阳能灯对非靶标昆虫的杀灭作用显著小于频振式杀虫灯。340nm太阳能灯可作为诱捕舞毒蛾的首选灯具,通过与筛选出的最适时间、敏感容器颜色和距离组合,能够在林间达到较好的诱捕效果。1.1.6化学药剂防治(1)用40%氧化乐果乳油、40%久效磷乳油及2.5%溴菊酯乳剂试剂，对2至5龄舞毒蛾幼虫进行喷杀试验，幼虫平均减退率分别为88.25%、99.4%及98.25%。用2.5%浓度的溴氰菊酯乳油试剂制作毒绳，对舞毒蛾2至3龄幼虫和4至5龄幼虫进行扎毒绳试验，幼虫平均减退率分别为97.7%及77.6%。实际生产活动中使用扎毒绳防治法，平均虫口减退率可以达到91.3%。(2)对3龄前幼虫使用60%甲胺磷1000倍液、80%敌敌畏乳油800倍液、40%乐果乳油1200倍液以及用作对照的清水４种药剂做对比试验，发现前3种药剂的虫口[5]。减退率均达到了90.0%以上，防治效果比较明显（见表1）表13种药剂喷药防治效果比较Tab1Threekindsofpreventionandcontrolofthesprayingeffectcomparison2药剂名称浓度调查面积/m防前总虫数/头防后总虫数/头虫口减退率（%）60%甲胺磷1000X31251490.080%故故畏乳油800X31241191.040%乐果乳油1200X3126993.3对照清水3129128-1.1.7生物防治在幼虫1-3龄时，用青虫菌0.1亿孢子/mL的菌液或杀螟杆菌1亿孢子/mL的菌液防治，其幼虫虫口减退率分别为89.2%和87.5%，防治效果较好（见表2）[5]。 内蒙古农业大学博士学位论文5表2生物防治效果比较Tab2Comparisonofbiologicalcontroleffects2处理调查面积/m防前总虫数/头防后总虫数/头虫口减退率（%）青虫菌（0.1亿孢子/mL）314813689.2杀螟杆菌（1亿孢子/mL）315013487.51.1.7.1苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis,简称为Bt)，一般从土壤或死亡了的昆虫体内提取分离，在革兰氏染色的实验会呈阳性，苏云金芽孢杆菌在芽孢产生过程中，会产生一种杀虫蛋白晶体(InsecticidalCrystalProteins，简称ISPs)，该物质使舞毒蛾等害虫停止进食，使害虫因饥饿、中毒等病症死亡，其对对舞毒蛾等多种纲、科、目的有害昆虫有杀灭作用［8］。同时，Bt具有具有低毒、环保、专一、高效和对人畜安全等优点，且可与真菌类微生物源农药或昆虫病毒混合使用，作为一种被广泛应用于实际生产工作中的微生物源的低毒力杀虫剂有很强的增效的作用[9]。目前，国内外已经有很多对不同种类的害虫高毒力的菌株及杀虫晶体蛋白的研究,但对亚洲舞毒蛾的高毒力菌株及杀虫晶体蛋白研究很少。本文对苏云金芽孢杆菌对舞毒蛾的幼虫的生物活性进行了测定，并且对高毒力菌株的杀虫蛋白的大小、晶体蛋白形态和基因型等方面进行了研究，找到了其中对舞毒蛾有强效的毒杀作用的杀虫蛋白基因型。这成果为发现更多对舞毒蛾具有生物活性的Bt菌株奠定了很好的基础，也为实际应用提供了更可靠的依据[8]。1.1.7.2舞毒蛾核型多角体病毒舞毒蛾核型多角体病毒（NPV）是一种昆虫间传播的病毒性疾病,由于病变幼虫柔[10，11]软的外观而常被称为“枯萎病”（图1）。核型多角体病毒是一种DNA病毒，隶[12]属杆状病毒科:Baculoviridae,杆状病毒属:Bacilovirus。图1感染了NPV的舞毒蛾幼虫Fig.1Gypsymothlarvainfectedwiththenucleopolyhedrovirus(UGA1301021www.forestryimages.org).该病是由核型多角体病毒（LdMNPV）引起的，随着舞毒蛾种群密度增加可迅速达 6舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响到流行（爆发）的比例。这些流行病源于舞毒蛾内部和次代之间传播速率的增加，因为幼虫被感染并死于植株的叶片上，这些幼虫尸体解体后会作为带病饲料被健康幼虫摄入从而感染。幼虫与叶子一起摄入病毒包涵体（OB）（图2），并且随着多面体蛋白质基质溶解在肠中，杆状病毒颗粒（病毒体）被释放[13]。图2显微镜下NPV的封闭体Fig.2Occlusionbodiesofthegypsymothnucleopolyhedrovirusundermagnification.(RogerZerillo)(1)NPV的一般形态特征1.具包涵体，4、5、6或不规则形，在已被感染NPV的细胞核中复制，可分2个亚型：2.单粒包埋：包涵体内有两个及以上病毒粒子，一个囊膜内只存在一个病毒粒子。3.多粒包埋：包涵体内有两个及以上病毒粒子，一个囊膜内存在多个病毒粒子。4.大小：NPV病毒粒子整体呈杆状特征，形状各异，一般在20至70nm到200至400nm。(2)NPV的理化性质1．呈不溶于乙醚、乙酸等多种有机溶剂和清水特征;2．不被细菌和细胞蛋白酶分解破坏，但在PH为2.0—2.9时，可被胰蛋白酶和木瓜蛋白酶消化其蛋白，并破坏病毒粒子;3．强碱、强酸会使蛋白质溶解；4．多角体不经弱酸处理不能染色；5．活体外可用Na2CO3稀溶液（0.008—0.05moL）溶解，长时间的溶解在Na2CO3中会使病毒粒子失去活性；6．多角体病毒在自然界可存活很长时间；7．抗菌素普遍无法对NPV病毒粒子产生效用。(3)NPV对昆虫的侵染侵染症状：幼虫感染NPV病毒→逐渐出现食欲减退等现象→幼虫体表呈油光状→幼虫中肠血淋巴浑浊→幼虫因病尾足紧挂枝叶倒挂而死。因病而死的幼虫会流出白色 内蒙古农业大学博士学位论文7或褐色的浓稠体液。(4)NPV侵染循环NPV病毒到达幼虫体内随后溶解在胃中→病毒粒子与中肠细胞膜上的微绒毛相融合→侵入细胞质→侵入细胞核→病毒DAN在细胞核内开始复制→细胞核呈变大趋势→核衣壳穿过细胞核膜→病毒粒子出血腔并侵入其他细胞→包涵体包封→NPV病毒体侵入肠壁并攻击幼虫内部组织和器官，病毒在细胞核中迅速增殖，最终导致内部组织解体和幼虫死亡（图3）。整个过程需要10到14d，该过程取决于幼虫的大小、环境温度即病毒剂量[13]。图3舞毒蛾病毒的生命周期：病毒包涵体（OB）（A）溶解在昆虫的肠道中，释放进入中肠（B）的非封闭病毒（NOV）并最终通过血腔。非封闭病毒进入血细胞和其他细胞类型并复制（C），产生更多的包涵体（D）和封闭病毒（E）。细胞最终会破裂并向血腔内释放包涵体和封闭病毒。感染病毒10至14天后病虫死亡（F）。Fig.3Gypsymothviruslifecycle:viralocclusionbodies(OB)(A)dissolveintheinsect'sgutliberatingnonoccludedvirus(NOV)thatentersthemidgut(B)andeventuallypassesthroughtothehemocoel.ThereNOVentershemocytesandothercelltypesandreplicates(C),producingmoreNOV(D)andOB(E).CellseventuallyrupturereleasingNOVandOBintothehemocoel.Theinsectdies(F)10–14daysafterconsumingthevirus.(RogerZerillo)即将死亡的幼虫具有特有的油光外观，因病毒而死亡的幼虫通常会变成棕黑色，呈倒V形悬挂在植株上，摸起来很脆弱，且经常体表破裂并释放含有数百万个闭塞体的棕黑色液体。由真菌Entomophagamaimaiga杀死的幼虫通常会保持它们本身的颜[14]。以用于控制舞毒蛾种群数量结果相一致的剂色，不会呈倒V形悬挂，且不易触碰量向环境中添加NPV不会使NPV病毒水平升高，仍然会保持在自然发生的水平。当成年雌虫将其卵产于有NPV病毒的植株表面时卵会感染病毒，幼虫从这些被感染的卵中孵化出来，会有很高的感染几率（卵表传染transovum）。当NPV病毒自然发病后，病毒会在土壤、枯枝落叶和植株表面上至少存在1年以[15]上。开始时，病毒感染可能低于舞毒蛾种群密度，且由于密度依赖性过程，寄主[16]密度增加会加速病毒传播。自然界中，哺乳动物、鸟类、寄生虫等生物的活动都 8舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响[17]会加快舞毒蛾NPV病毒的扩散，在杀灭有害昆虫的过程中发挥积极作用。Reardon和Podgwaite发现[18]，NPV病毒的发病率与寄生虫菜蛾绒茧蜂Apantelesmelanoscela和银毒蛾寄蝇的发病率呈正相关。此外，Raimo等人发现，菜蛾绒茧蜂雌性可以在感染病毒的舞毒蛾幼虫中传播NPV[19]。在众多密集的舞毒蛾种群中，病毒会杀死多达90％的幼虫，并将舞毒蛾种群密度控制在基本不危害树木即经济允许水平之下[13]。1.1.7.3关于荧光增白剂VBL分析荧光增白剂（FluorescentBrightener，二苯乙烯联苯二磺酸钠），是一种被世人所熟知的有机化合物。我国自主研发的第一个荧光增白剂产品即VBL，该产品于四十多年前被研发出来，因其效果良好而在国内被广泛投入使用，其主要功效是棉织物和纸浆等产品的增白以及印花产品的增艳,至今仍被广泛应用。据不完全统计,全国生产荧光增白剂具有一定规模的企业就有近五十余家,乡镇和个体企业则难计其数,年[20]。产量在万吨以上,是我国荧光增白剂的支柱品种之一按照不同的化学结构，荧光增白剂可分为五大类:香豆素型、二苯乙烯型、苯并氧氮型、苯二甲酰亚胺、吡唑啉型型。荧光增白剂VBL是典型的二苯乙烯三嗪类荧光增白剂产品，化学名称为4,4'-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐，分子式为C36H34N12O8S2NA2，是阴离子型荧光增白剂，广泛被用于日化工业、纺织业、纸张制造等行业［21-24］。荧光增白剂是一种白色的染料，或者称为荧光染料，也是应用较为广泛的化工原料。荧光增白剂的增白原理是光学上的补色、增亮，使用后可显著提高白色基质的白度、浅色基质的鲜艳度，且不会损伤被增白的基质。使用该产品比传统的化学漂白法和加蓝增白法简单，是目前最常用也最有效的提高基质白度的方法之一。目前，全世界在产的荧光增白剂达到了一千余种，年产量达到十五万吨以上，已被发现的分子结构式多达十五种甚至更多。部分研究表明，荧光增白剂的毒性强弱在很大程度上会受到它的分子结构式影响，在对现在市场上常用的荧光增白剂进行毒理实验的数据表明：在适量的添加范围内，荧光增白剂低毒或无毒［25］。实验中，荧光增白剂可以吸收波长为300mm-400mm的不可见紫外光，再放射出波长为420mm-480mm的可见蓝紫色荧光。其产生的蓝紫色荧光同实验基质原有的微黄色荧光互为光学互补色，达到将纸张、塑料或其他物体上用化学方法不能除去的黄褐色素变为白色以达到提高产品商品价值的目的。应当注意的是，所有荧光增白剂中均含有的苯、噻吩、萘等物质的基团，有可能引发癌症[26]。张红兵等人研究表明，紫外线环境下，荧光增白剂VBL溶液会产生一种顺反异构反应，当溶液浓度低时，反式异构体转化成顺式异构体的速度加快。因此应当把荧光增白剂VBL溶液放置在背光、阴凉的环境下，避免紫外线直接照射[27]。 内蒙古农业大学博士学位论文9尚金燕等研究表明，昆虫取食添加了荧光增白剂VBL的人工饲料，会提高感染食下重组植酸酶病毒(rBmNPV-phy)的几率。据此可知，荧光增白剂可能导致昆虫的消化系统生理功能损坏,使病毒到达血腔，影响昆虫生理活动正常进行。对此,有必要进一步筛选更合适的感染增效物质,达到既提高感染率,又不影响表达量的目的[28]。1.2.VBL增效作用研究进展1.2.1中国的舞毒蛾病毒研究近年以来,对舞毒蛾和苹毒蛾两种昆虫的核型多角体病毒进行了研究，发现这两[29]。1976种病毒毒性比较强，传播方便，成功应用后可以导致有害昆虫大范围死亡年的时候,在辽宁省盖县杨树林区舞毒蛾大发生,我们经过镜检,发现患病致死的大量幼虫是因为病毒所致。实验室内，通过对4至5龄的幼虫进行毒力测定。初步测得的LC[30]50。为2.1×105IPBs/mL。1978，黑绒茧蜂能把致死剂量的核型多角体病毒传给舞毒蛾幼虫,多角体内涵体可通过感染的寄生蜂传给舞毒娥幼虫或它的食物,故第三种侵染途径亦属可能[31]。1979，许文儒，高三俊，李敬涛，用虫尸稀释液行小区感染一龄作蚕及野外蚕场喷毒感染一、二岭柞蚕试验,病毒浓度从56一87,000个IPBs/mL,对柞蚕未见致病性[32]。1979年春,在河北张家口坝上地区,发现有大量榆尺镬幼虫自然死亡,经他们鉴定为核型多角体病毒感染致死[33]。1980，指出秋后到第00二年2月采集舞毒蛾越冬卵块,放入0C左右下保存,养虫室温度最好20-26C,湿度[34]3.26为75-90%。1983，对2-3令健康幼虫的半致死剂量LC50为1×10IPBs/mL，其杀虫率可达到95%以上[35]。1984，过三年来对舞毒蛾自然流行病的调查研究,舞毒蛾NPV在森林生态系中滞溜的时间多长,以及NPV在森林生态系中控制害血的持久性等问题,尚需较一长时间去深入研究[36]。1985，指出多年使用农药使虫体产生了一定程度的抗药性,并且污染了环境,杀伤了天敌益虫,成本又较高。同时，舞毒蛾核型多角体病毒还有方便、高效的优点，持效期较长，且防治成本较低，一般可以将成本控制在0.8至1元/基地面积。4-5月份开始采集虫尸,繁殖的病毒可,在6--7月份用于防治舞毒蛾。在6-7月采集虫尸繁殖的病毒,要放在。一4℃的环境中保存,来年春季用来防活舞毒蛾[37]。1985，指出凡经核型多角体病毒侵染的组织、细胞已自动崩解,一经搅拌,NPV便散落于水中,未染病的组织通过差速离心就能去掉[38]。岳书奎等人通过试验发现，舞毒蛾NPV对动物及人类均无致病性[39]。1986年，实验发现哺乳动物比鸟类的群体更能传播NPV[40]。1986年，我国新疆地区首次发现了舞毒蛾核型多角体病毒,这一发现大大推动了相关学科的研究进展[41]。1990，用免座电镜金颗粒标记技术准确、快速地对舞毒娥(L.disparL.)核型多角体病毒抗原进行了定位和鉴定[42]。1993,雌雄比例倾向于雄性。电镜照片显示在雌性幼虫中被侵染的组织包括脂肪、气管基底膜、腹神经节、胸腺、卵巢及大脑[43]。1999,舞毒蛾24龄幼虫为对象,对大邑株舞毒蛾核型多角体病毒毒力进行测定,其LC50为1.82×10 10舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响44IPBs/mL,95%置信限上限为2.41×10IPBs/mL,下限为1.22×10IPBs/mL；用浓度65[44]1.6×10IPBs/mL和1.6×10IPBs/mL进行感染,其LT50分别为7.38d、8.24d。表明3种剂量病毒杀虫剂均不能引起小白鼠骨髓细胞染色体损伤,该杀虫剂对哺乳动物小白鼠是安全的[45]。几丁质酶基因与多角体蛋白基因的进化速率存在差异性[46]，舞毒蛾核型多角体病毒(LdMNPV)的基因组结构、UDP-转葡糖基酶基因、增强子基因(enhancin基因)、蛋白激酶基因(VPK基因)、多角体蛋白(polyhedrin)基因、PE基因、P39-衣壳基因、DNA聚合酶基因(DNApol)、25KFP基因以及LdMNPV基因工程的同源区(hrs)的结构和功能已有报道，在害虫的防治领域,构建LdMNPV重组杆状病毒杀虫剂是LdMNPV分子生物学和基因工程的发展方向[47]。在2003年，在內蒙古部分林区，人们对舞毒蛾核型多角体病毒等多種生物措施的防治效果进行了试验[48]。采用室内食料给毒法测定了舞毒蛾核型多角体病毒3个地理品系LdNPV-D(北美品系)、LdNPV-H(中国黑龙江品系)和LdNPV-J(日本品系)对取食落叶松Larixprincipis-rupprechtii的舞毒蛾(LymantriadisparL.)2龄幼虫的致死中量及致死中时间[49]。从内蒙的舞毒蛾体内分离到的LdMNPV中,少数舞毒蛾表面有凹陷的孔洞,病毒粒子从这些个孔洞中游离出来,这也阐明,此技术能够从多角体悬液中扩增出目的片段的原因。在将来的LdMNPV的检测中,可利用虫体进行研磨过滤离心后得到的组织液作为模板进行扩增[50]。对舞毒蛾的形态特征、生活习性、发生规律等生物学特性进行分析,提出了人工摘卵块、人工捕杀、灯光诱杀成虫、涂抹药环、化学防治等防治措施,重点提出了利用舞毒蛾核型和质型多角体病毒进行生物防治[51]。1.2.2国内外荧光增白剂研究1.2.2.1国外荧光增白剂研究目前发现的一种增效方法是：将药物与少量增效物质（比如荧光增白剂）相结合。这些增效物质略微加快了死亡时间并减少了致死病毒量[52]。Shapiro等人首次发现了TinonalLPW等品类的荧光增白剂能极大地提高NPV的活力,而且这种增效作用会对各式各样的NPV产生效力[53]。Bischoff等人从一种舞毒蛾NPV(LymantriadisparMNPV,LdMNPV)基因组中克隆出一个增效蛋白基因,并对它进行了核苷酸和氨基酸序列分析,发现LdMNPV的增效蛋白基因结构和已测序的3种GV(TnGV,PuGV,HaGV)的增效蛋白基因结构很相似;它与GV的氨基酸序列也有29%的同源性。随后,他们又对LdMNPV的增效蛋白基因进行了表达[54,55]。目前，人们通过添加多种添加剂，来让降低50％LC50和LT50所需的病毒量发生作用，从而增加几种杆状病毒的功效，如Neem提取物；硼酸已被证明可用于增强几种杆状病毒的活性[52,56]。荧光增白剂一般会被用于生产肥皂及洗涤剂中。这种复合化合 内蒙古农业大学博士学位论文11物会吸收紫外线并将紫外线中的不可见光转化为可见光（人们利用这一特点将荧光增白剂作为紫外线保护剂使用）。同时，它们也可以通过降低LC50和LT50来作为病毒增强剂使用，荧光增白剂发挥增强病毒活性作用的最佳浓度为1％，通过添加荧光增白剂，可以减少幼虫死亡时间30-72％[57]。荧光增白剂可以有效增强几种杆状病毒活性，例如SpodopterafrugiperdaMNPV（SfMNPV）[52]，LymantriadisparLdNPV（LydiNPV）和Autographacalifornica（AucaMNPV），AnagraphafalciferaNPV（AnfaNPV）和A.segetumNPV（AgseNPV）和AgseGV（Khattab等人，通过添加浓度为1％（wt：wt）的1,2-二苯乙烯荧光增白剂2TinopalLPW，将甜菜夜蛾核型多角体病毒（SeMNPV）的LC50从2.9PIB/mm降至0.022[58]PIB/mm，效果比较明显。NeelamNarang等研究表明，舞毒蛾核型多角体病毒的法国分离株是三种毒株中毒性最低的，使用荧光增白剂可以在生产活动中明显增强舞毒蛾病毒的致死能力[59]。当昆虫中肠中存在荧光增白剂时，抑制细胞死亡和抑制感染的中肠细胞脱落可以促进病毒复制，很大程度上会提高昆虫幼虫体内的LdMNPV活性[60]。MagdaKhattab目前的工作描述了一个半场试验，以比较AgarGVEG埃及分离物在祈祷和麦麸饵剂配方中的功效，其中添加和不添加增强剂荧光增白剂以控制棉花幼苗上的第3和第4年幼虫[56]。1.2.2.2中国荧光增白剂研究现状1999，马永平欧等人指出增效蛋白在生物农药中的实际应用,是生物农药改良的[61]。以3龄棉铃虫(Helicoverpaarmigera)幼虫为供试虫,以荧光增白重要途径之一剂TinopalLPW为佐剂,经生物测定比较芹菜夜蛾核型多角体病毒(Synrapha[62]falciferaNPV,SfaNPV)对棉铃虫的LC50值和LT50值。生物增效剂病毒增强素及化学增效剂荧光增白剂的增效活性特点和增效机理,以及病毒增强素分子生物学方面研究进展。在颗粒体病毒、核型多角体病毒、昆虫痘病毒中均发现了病毒增强素,它是一种金属蛋白酶。已明确病毒增强素和荧光增白剂增效作用与昆虫围食膜的破坏有关,其他增效机理有待进一步研究[43]。除了JD意外的荧光增白剂，几乎所有的荧光增白剂都会对对SfaNvP病毒的致死率产生明显的增效作用,这些荧光增白剂不再被用作增白增艳，而是在确保安全无[64]。张丽红等在2004年对公害的情况下作为生物杀虫剂辅剂被广泛的开发利用起来荧光增白剂进行了病毒毒力生物测定，发现荧光增白剂（FB-28）能够提升甜菜夜蛾幼虫的死亡率,降低它的LC50，缩短它的LT50；实验证明荧光增白剂的增效作用与感染虫龄存在相关，此外，应用组织切片技术对感染病毒的幼虫中肠组织病理以及血淋巴细胞感染观察表明，在幼虫的病毒接种物中添加合适浓度的荧光增白剂不会改 12舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响变病毒在幼虫中肠组织中的感染部位，却可以提高幼虫对病毒的敏感性，产生更多的病灶。荧光增白剂对重组病毒确实具有增效作用.实验采用经过低温处理过的甜菜夜蛾作为供试幼虫,保证幼虫处于较为一致的发育阶段,使实验结果更为准确[65]。用1％TinopalLPW荧光增白剂作为蜀柏毒蛾核型多角体病毒增效剂对蜀柏毒蛾2龄幼虫进行室内毒力测定，结果表明1％TinonalLPW对ParocneriaorientaNPV[66][67]102有较强的增效作用。周建华等研究发现，除9.0×10PIB/hm+1%TinopalLPW表现出显著的增效作用外，其余剂量虽然有增效作用但不明显。1%TinopalLPW可作为PoNPV的增效剂加入到制剂中。但由于PoNPV制剂中含有一定量的水份，由于TinopalLPW水溶液Ph呈碱性，将1%TinopalLPW加入PoNPV制剂中长时间放置后对PoNPV毒力是否有影响及其对高龄蜀柏毒蛾幼虫的毒力增效作用等有待研究。杨孔等在实验中，对蜀柏毒蛾2龄幼虫进行毒力测定，他们选用1%浓度的UBL荧光增效剂，对蜀柏毒蛾核型多角体病毒进行增效时发现，UBL荧光增白剂可以显著提高NPV对幼虫的感染力，使更多的幼虫染病，同时加快染病幼虫的死亡，显著降低一定区域内蜀柏毒蛾幼虫的密度，从而灭杀害虫，保护树木[68]。2008，采用茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)分别与5%鱼藤酮、10%烟碱、5%除虫菊素、0.6%氧苦·内酯、荧光增白剂BA混配饲喂茶尺蠖2龄幼虫的方法进行杀虫活性增效研究.结果表明:EoN-PV与0.6%氧苦·内酯混配,增效比达到1.57,表现出良好的杀虫增效作用;与荧光增白剂BA混配,缩短了致死中时间,提高了茶尺蠖幼虫的[69]染毒致死率。2008，离体和活体处理粘虫幼虫围食膜后,通过SDS-PAGE分析其围食膜蛋白条带的变化、观察其形态学特征、生物测定等方法研究了荧光增白剂FB28和棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白(En-Ha)对粘虫幼虫的围食膜的破坏作用及其对粘虫核型多角体病毒(MsNPV)的增效作用。En-Ha和FB28均能够通过破坏围食膜完整性[70]提高MsNPV的感染率,使LC50显著降低。阿地力研究发现，荧光增白剂具有将春尺蠖死亡率提高20%至35%，并将其死亡时间提前了1d以上、LT50提前2d以上的作用。AciNPV的LC[71]50降低了22倍，有效降低了AciNPV的应用浓度。0.5%的VBL和1%的BA对HcNPV的增效作用明显,可作为HcNPV的增效剂加入到制剂中。但是由于荧光增白剂水溶液pH呈碱性,长期存放可能对HcNPV的毒力会产生影响,因此在生产中可以尝试采用伴侣的方式配制,即一定浓度的HcNPV病毒液外[72]。BL水溶液加一定质量的荧光增白剂,两者单独包装存放,使用时按比例现配现用pH呈碱性,敌百虫遇水易分解。因此,1%VBL、15μL·L-1敌百虫作为蜀柏毒蛾核型多角体病毒增效剂应现配现用[73]。 内蒙古农业大学博士学位论文13杨高鹏、段立清等为探索荧光增白剂TinopalLPW对舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)的增效机制，明确寄主植物、LdNPV地理品系对舞毒蛾酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)的影响，他们用TinopalLPW，LdNPV3种不同地理品系(LdNPV-H品系、LdNPV-D品系、LdNPV-J品系)以及它们的混合液共6个溶剂、蒸馏水及TinopalLPW2个对照样本，分别对以青杨、华北落叶松和山杏为寄主植物的舞毒蛾5龄幼虫进行实验[74]。王树娟为提高LdMNPV防治效果，在室内采用饲养给毒法测定了不同浓度的TinopalLPW对LdMNPV不同地理品系的增效作用及光保护作用，并比较了荧光增白素对不同病毒品系LC[75]50及LT50的影响。TinopalLPW对LdMNPV3个地理品系均有增效和光保护作用,而且随着TinopalLPW浓度的增加,增效作用增强,1%TinopalLPW的增效作用最好[76]。苏云金芽孢杆菌(Bt)和舞毒蛾核型多角体病毒Lymantriadisparnuclearpolyhedrosisvirus(LdNPV)混用对舞毒蛾(L.disparL.)的毒杀效果，证明Bt与LdNPV混用对舞毒蛾具有增效作用,并能弥补单剂缺陷[77]。洪柱等饲毒龄期和饲毒浓度对幼虫存活率和体质量增长均有不同程度的影响，饲毒龄期越小、饲毒浓度越高，死亡时间越早，死亡率越高，体质量增长越缓慢;而且饲毒时龄期越小、饲毒浓度越高，虫尸质量也越小，其含毒量也越低。饲毒时间与含毒量成抛物线型，饲毒时间过短或过长，体内含毒量均较低[78]。几种荧光增白剂对采自伊朗East-Azarbaijan的棉铃虫Helicoverpaarmigera核型多角体病毒两个地域株(EAZ-I和EAZ-II)对棉铃虫2龄幼虫的杀虫活性,以提高这两个地域株的生物学活性。在害虫综合治理中影响围食膜通透性的荧光增白剂与核型多角体病毒制剂混用是一种可供选择的重要方[79]法。为了防止病原微生物对昆虫的侵害，昆虫在进化过程中会在中肠细胞与肠腔之间形成一种免疫机制，即围食膜，如果能够破坏围食膜，就能加快致死病毒对昆虫的感染。分别研究了荧光增白剂FB28和棉铃虫(Helicoverpaarmigera)颗粒体病毒增效蛋白(En-Ha)对美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus，HcNPV)的增效作用。这两种试剂均会影响到围食膜蛋白的[80]表达谱，进而提高病毒的感染率，并使其毒力显著提高。以甜菜夜蛾为试虫,研究荧光增白剂OB对甜菜夜蛾核型多角体病毒的增效作用，在0.25%至1%的浓度范围内,随着荧光增白剂OB浓度的增加,其对甜菜夜蛾核型多角体病毒的增效作用不断提升,最高增效倍数达到110.2倍。而在2至4龄幼虫范围内,荧光增白剂OB,对甜菜夜蛾核型多角体病毒的增效作用会随着甜菜夜蛾虫龄的增大而降低[81]。绿原酸降低了LdNPV对舞毒蛾幼虫的致死中浓度,缩短了致死中时间。绿原酸可提高LdNPV对舞毒蛾2龄幼虫的致病力,其机理有待进一步研究[82]。JA诱导抗性和LdNPV对舞毒蛾幼虫生长和代谢的负面影响有明显的协同增强效应。另一方面也说明JA作为诱导因子可诱导青杨产生积极的防御反应，这种防御反应也影响了Ld 14舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响NPV[83]。LdNPV对取食添加丁香酸饲料的幼虫产生明显的亚致死效应,并且LdNPV浓度高于240OBs/μL时,雌、雄幼虫历期延长、雄蛾寿命会缩短,雄性羽化率会降低,雌成虫产卵量降低,产卵量较对照减少一半左右。结果提示,丁香酸可提高LdNPV对舞毒蛾幼虫的致病力,增加LdNPV对舞毒蛾的亚致死作用[84]。以甜菜夜蛾为试虫,研究荧光增白剂OB对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的增效作用，表明荧光增白剂OB能显著提高苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫的毒力。在0.10%-0.90%的浓度范围内,增效作用随着荧光增白剂OB浓度的增加先增大后持平。添加量为0.50%时,就可达到较好的增效效果,然而荧光增白剂OB对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的增效作用随着供试昆虫虫龄的增大而降低[85]。1.2.3国内外舞毒蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶研究现状1.2.3.1国外舞毒蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶研究现状谷胱甘肽S转移酶GST是昆虫体内重要的解毒代谢酶类，参与各种外源毒物的代谢，如水解、氧化、还原、轭合等，从而起解毒作用[86]。多数昆虫缺乏硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶。谷胱甘肽转移酶同工酶有硒独立的过氧化物酶活性，并且与独立的抗坏血酸过氧化物酶（APOX）机制一起对昆虫中肠组织中的过氧化物进行代谢[87]。VesnaPERIĆ-MATARUGA研究Cu-Zn超氧化物歧化酶（SOD）、其凝胶电泳图谱、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性、谷胱甘肽（GSH）的量和谷胱甘肽S转移酶（L.disparL）幼虫中肠组织GST-Ⅱ期生物转化酶活性的影响。这些结果提供了未来将昆虫适用于简单模型系统的研究的可能性，提供了关于ghrelin(一种胃分泌的酰化生长激素C147H245N45O42)在复杂生物体的抗[88]氧化保护中发生作用的依据。MilenaVlahovi´c检测暴露于10和30μgCd/g干食物的舞毒蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶（GST）的活性。基于通过与谷胱甘肽结合的酶反应，在急性和慢性实验后，总体活性保持不变。仅观察效应浓度（10μgCd/g干食物）在镉施用后3d恢复后才显着增加活性。将近所有的表型可塑性指数都能显示出差异性。尽管GST在异体生物转化中具有重要作用，但我们的研究结果表明，这种在昆虫中肠中的酶并不代表它是镉解毒的关键因素[89]。1.2.3.2在中国舞毒蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶研究现状谷胱甘肽S－转移酶是能催化生物体内的还原型谷胱甘肽与外源化合物的亲电[90]子基团发生轭合，最终形成硫醚氨酸排出体外。有研究报道非甾醇蜕皮激素类杀[91]虫剂在昆虫体内的解毒代谢与谷胱甘肽S－转移酶和多功能氧化酶有关。兰亦全等报道甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)福州自然种群对虫酰肼的抗性与谷胱甘肽S[92]－转移酶有一定关系。王建军等研究发现亚致死剂量甲氧虫酰肼对斜纹夜蛾 内蒙古农业大学博士学位论文15(Spodopteralitura)体内谷胱甘肽S－转移酶和多功能氧化酶具有一定的诱导作用[93]。鲁绍伟研究表明，以杨树叶片为食物，4-5龄舞毒蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶的比活力升高。取食抗虫杨树Pb1、Pb33和Pb47叶片48h以后,舞毒蛾幼虫中肠酯酶的比活力比取食了CK幼虫酯酶比活力的62.9%、70.7%和74.5%；24小时以后,幼虫中肠谷胱甘肽S-转移酶的比活力值分别比取食了CK幼虫谷胱甘肽S-转移酶比活力下降了25.7%、27.7%和17.9%[94]。冯春富在研究中发现，分别取食茉莉酸甲酯和正常幼苗的舞毒蛾幼虫的GST显著低于对照，然而取食另外2种做过处理的幼苗的舞毒蛾幼虫显著高于对照。舞毒蛾的幼虫有了取食的植物抗性，这影响到同一种群后续取食者的解毒机制，这是植物的抗性和昆虫种内的竞争的综合表现[95]。1.3研究意义及研究内容过程1.3.1研究目的及意义蒙古国普遍运用化学及其他普通方法来达到预防森林害虫的目的，其中使用最广泛的还是化学方法。目前广泛采用的方法会对生态环境造成严重破坏，在杀害害虫的同时也会将益虫杀害殆尽。所以，为了达到既能杀害害虫，又能保护益虫的目的，我们更加提倡使用生物方法灭虫。杆状病毒作为具有重要的应用潜力生物杀虫剂,但其杀虫速度相对较慢、容易受紫外线影响,最后导致活力降低、宿主活动区域变得狭窄等缺点,还不足以大规模的应用。为了能够提高杆状病毒的毒力,人们做了很多的努力,其中包括筛选毒力性强的毒株、采用基因重组的办法来构建重组病毒等的方式。近几年,荧光增白剂对杆状病毒的增效作用已经被较为广泛地研究。荧光素对舞毒蛾核型多角体病毒毒性具有促进作用，为病毒增效剂的研究做贡献。荧光增白剂是一种佐剂,将其添加在病毒接种物中,可以有效提高害虫的死亡率,加速其死[96-102]。研究舞毒蛾核型多角体病毒的毒力对于研制以其为主要成份的无公害亡时间杀虫剂进行生物防治，对于发展可持续农林业有很大的意义。本文研究目标是在筛选获得舞毒蛾核型多角体病毒的最佳复配剂基础上，研究舞毒蛾核型多角体病毒复配剂对舞毒蛾2龄幼虫地致病力和亚死作用，并研究舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及组分对舞毒蛾谷胱甘肽S转移酶活性的影响。通过实地舞毒蛾核型多角体病毒最佳复配剂对舞毒蛾2龄幼虫致病力的影响（LC50、LT50）及舞毒蛾核型多角体病毒复配剂对舞毒蛾的发育的影响。测定确定舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及组分对舞毒蛾4龄幼虫谷胱甘肽S转移酶活性的关于期变化。 16舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响1.3.2研究内容（1）舞毒蛾核型多角体病毒复配剂的筛选。（2）舞毒蛾核型多角体病毒复配剂对舞毒蛾2龄幼虫致病力的影响（LC50、LT50）。（3）舞毒蛾核型多角体病毒复配剂对舞毒蛾的发育影响。（4）舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾谷胱甘肽S转移酶活性的影响。 内蒙古农业大学博士学位论文171.3.3技术路线卵病毒分离提取人工饲料制备一龄幼虫二龄幼虫三龄幼虫四龄幼1．VBL浓度筛选2．测定致死中浓度LC50,LT503．测定谷胱肽S转移酶0%VBL+0%ZnCl2+0hCK对照血淋巴提取中肠提取30.5%VBL+0%ZnCl2+6病毒浓度3.9x10离心5000，离心10000，415min30min1%VBL+0%ZnCl2+12h病毒浓度3.9x1051%VBL+0.1%ZnCl2+6h病毒浓度3.9x10配药品60%VBL+0.1%ZnCl2+12病毒浓度3.9x10加药品70.5%VBL+0.1%ZnCl2+病毒浓度3.9x10测定OD340测定OD5950.5%VBL+1%ZnCl2+12人工饲料+病毒(V)+荧光1%VBL+1%ZnCl2+0h素(VBL)+氯化锌酶活分析0%VBL+1%ZnCl2+6h记录蛹称重成虫雌雄分类、自由交配产卵观察称重计数数据整理、调研、实验结构分析、思考才撰写、修改论文与讨论图4技术路线Fig.4Thetechnologyroadmap 18舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响2．材料与方法2.1供试材料昆虫：将舞毒蛾的越冬卵（由辽宁省阜新市林业局提供）轻轻搓后取掉覆盖毛状物，将卵粒浸泡在1%84消毒液中（有效氯含量为4.5%-5.5%(w/v)），10s以后，用蒸馏水冲洗3次并阴干，然后放入温度为25±1℃的培养皿里，用光周期为16L:8D的气候培养箱孵化，将初孵幼虫转入养虫杯中并带有人工饲料，在相等的条件饲养至2龄后取同一天达到2龄的舞毒蛾幼虫作为备用。化学试剂：混合盐Wessonsaltmix、酪蛋白Casein、HethyParhydroxybenzoate、Usdavitaminpremix、山梨酸Sorbicacid、Fe3(PO4)2、麦麸Wheatgerm、琼脂Agar、荧光素VBL（SIGMA公司产品），丙酮，磷酸二氢钠，氯化锌ZnCl2,磷酸氢二钠，乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2），PMSF，DTT，蒸馏水，考马斯亮蓝CoomessiebrilliantblueG250（Sigma）、牛血清白蛋白Albuminbovinserystaline(Amresco)等。实验所需仪器及设备：冰箱（Haier公司）、高速冷冻离心机（HettichzentrifligenGmbHCo.KG），超净工作台（哈尔滨产）、全自动气候培养箱（哈尔滨东拓科技有限公司）、高压灭菌锅（上海博迅实业有限公司）、HH-S型恒温水浴锅（武没金宝华科技有限公司）、TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），微量移液枪（RainininstrumentCo.,inc）、微电脑控制移液器（法国产），离心管、枪头、搅拌器（Ｍｅｄｉａ公司）、电子天平（北京塞多利有限公司）、烧杯、玻璃管、匀浆器、软镊子、镊子、解剖剪、培养皿，玻璃棒、试管架、24孔细胞培养板，容量瓶，乳胶手套等。人工饲料：在舞毒蛾人工饲料配制方面加拿大太平洋森林研究中心（Pacificforestrycentre,PFC）提供了参考配方。舞毒蛾核型多角体病毒：将用LdNPV感染过的舞毒蛾死虫（由内蒙古农业大学农学院植物保护教研室提供），经蔗糖梯度提纯后用蒸馏水稀释到所需浓度后得到所需病毒。2.2舞毒蛾幼虫饲养方法2.2.1卵面的消毒首先配制好2%的84消毒液，配比即980mL水+20mL84消毒液；再在三个容器里分别装入1000mL的蒸馏水，将舞毒蛾虫卵（已称好重量）用密度大，防腐蚀纱布包裹，做为备用。将两个大号培养皿放在干净的试验台上，并各垫滤纸一张，记为Ａ、Ｂ。在1%的84消毒液中轻轻挤压包好的虫卵，消毒约3秒，此过程需戴好橡胶手套。随后，将消毒后的舞毒蛾虫卵分别在三个容器中用蒸馏水逐步清洗、挤压。将消毒 内蒙古农业大学博士学位论文19后的虫卵放置在培养皿中的滤纸上，用镊子适当的拨动，将其均匀散开后晾干，待虫卵表面完全无水后导入Ｂ号培养皿里，用保鲜膜封住，再用最小号昆虫针扎孔，然后放入培养箱里开始饲养。注意在实验前一天，准备人工饲料，并需要观察虫卵是否孵化。2.2.2人工饲料的制作饲料配方：适当的成份用量；蒸馏水Water800mL；酪蛋白Casein25.0g；混合盐WessonSaltMix8.0g；山梨酸SorbicAcid2.0g；琼脂Agar15.0g；HethyParhydroxybenzoate1.0g；Fe3(PO4)20.15g；麦麸WheatGerm120.0g；UsdaVitaminPremix10.0g。2.2.3幼虫饲养Ａ.群体饲养：将初孵幼虫放进装有人工饲料的大养虫杯中，每杯5头。（在孵卵后三天，就应该着手配制，没份饲料大概能倒24杯，计算好所需饲料的数量）Ｂ.舞毒蛾幼虫每龄约5-6d，养至2龄供试。2.2.4供试幼虫的选取与病毒的饲喂准备阶段:着手配制人工饲料（未经任何处理的），每份饲料大约可倒24杯，要计算好所需饲料的数量。再准备好24孔培养皿、微量移液器、玻璃管、镊子、吸耳球、移液枪、烧杯、蒸馏水、玻璃瓶。2龄幼虫孵化后，将其换至小甜心杯中进行24h饥饿处理。在该2龄幼虫饥饿处理第18h的时候，准备病毒。（注：病毒应保存在避光，低温环境内，实验室采用将其用锡纸包裹后，冷藏在冰箱内。）A.先将病毒用锡纸包裹，再将其放于电动震荡仪，并将缝隙用脱脂棉在边缘挤紧，震荡1.5-2h。（注：放入震荡仪的时间不宜过长，防止病毒过热后影响实验效果。）B．约准备需要第一部分1000头二龄,第二部分1000头二龄，第三部分200头四龄幼虫虫子C．利用玻璃管将未经任何处理的人工饲料取出，并将饲料吹入24孔培养皿中心，每孔吹入1cm长的饲料段。D．用微量移液器(法国产)吸取病毒液1μL滴到人工饲料段上，每个孔接入1头经过饥饿处理24h后的供试2龄幼虫，用封口膜密封,并盖好盖，七个培养皿为一组，用牛皮纸包裹（舞毒蛾幼虫适宜黑暗取食）后，放置于气候培养箱中(T:25±1℃，RH:60%，L:D;16:8)。 20舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响E．取食24h以后，将完全食尽饲料段的幼虫转移至青杨枝条上饲养，并舍弃未食尽饲料的幼虫。2.3LdNPV的分离题纯先取适量的感染过LdNPV的舞毒蛾死虫体，放置150mL的烧杯中，按1g虫体加入20mL蒸馏水的比例加入蒸馏水。用玻璃棒搅拌后同时加入10mL浓度为1%的SDS（十二烷基硫酸钠），进而将盖子盖住，搅拌2h。再用三层纱布过滤（6单层），移除较大碎片，并将纱布用橡胶皮筋固定，覆盖在大烧杯上。将过滤的液体倒入离心管内，弃底层沉淀物，待平衡后，以（15℃）3000rpm的速度，离心30min。随后，倒掉上层清液，将离心管内上部的昆虫脂肪用滤纸擦掉，并加水摇匀，这一步需要重复再做2次。（若温度太低会使SDS析出）之后，倒掉上层清液，用滤纸将脂肪擦除，加入约15mL蒸馏水，摇匀，使悬浮物再次悬浮。利用滤纸将悬浮物过滤（滤纸下面垫2单层纱布，1张滤纸只能承受5mL悬浮液），用勺子将滤纸上的悬浮物轻轻得刮下，倒入烧杯中。将悬浮液倒进离心管，将盖子好盖。将烧杯底部的沉淀物弃去，3000rpm，15℃离心30min。倒掉上层清夜，将悬浮物以约20mL蒸馏水稀释，轻轻冲洗浅黄色悬浮物。将上述悬浮物倒入12.5mL的45%的蔗糖溶液，蔗糖溶液用完后保存在4℃的冰箱里。平衡后8000rpm，15℃离心30min。弃掉上清液，将悬浮物加入30mL蒸馏水里稀释，摇均匀。平衡后3000rpm，15℃离心30min。弃掉上层清夜，再加入30mL蒸馏水稀释，摇均匀。平衡后3000rpm，15℃离心30min弃除上层清夜，将悬浮物蒸馏水稀释（蒸馏水的量根据个人所需病毒浓度而定，约3-4mL）。将病毒溶液放置于冰箱内4℃保存（长时间保存，建议-20℃）。2.4荧光素VBL对于舞毒蛾核型多角体病毒毒力的影响分析2.4.1幼虫的饲养及前期处理将舞毒蛾的越冬卵（由辽宁省阜新市林业局提供）轻轻搓后,取掉覆盖的毛状物，将卵消毒以后，放置温度为25±1℃的培养皿里，放到用光周期为16L:8D的气候培养箱里孵化，将初孵幼虫转移至带有人工饲料养虫杯中，在相等的条件饲养至2龄后取同一天达到2龄的舞毒蛾幼虫为备用。2.4.2VBL的增效作用测定准备0．5%和1%二种浓度的荧光素VBL（南通丽思化学助剂有限公司），将1%和0.1%氯化锌（天津市大茂化学试剂厂）和浓度均为390OBs/μL的LdMNPV配制成相应病毒+荧光素和氯化锌混合液，冷藏，待用（温度为0-4℃），分别以蒸馏水和上述三种浓 内蒙古农业大学博士学位论文21度的荧光素作为对照进行生物测定。2.4.2.1生物测定测定方法选择食料给毒法［103］，在24孔细胞培养板内，每孔放入一小段人工饲料（人工饲料需切成长约8mm，直径约1mm的小段），吸取病毒液1μL滴到人工饲料段上（微量移液器为法国制作），用封口膜密封后盖好盖，接入1头饥饿24h的供试幼虫，置于T=(25±1)℃，RH=60%，L∶D=16∶8的气候培养箱中。取食24h以后，将完全食尽饲料段的幼虫转到正常人工饲料饲养上，将未食尽饲料的幼虫舍弃。每个处理及对照做3个重复，每个重复用48头舞毒蛾幼虫，增效的作用共用幼虫720头。并每天做观察并记录幼虫的死亡情况，直到幼虫化蛹。2.4.2.2数据的处理用SPSS数据处理软件，进行单因素方差分析中的Duncan's法检验差异显著性。2.4.3实验的计划(VBL浓度筛选)2.4.3.1确定VBL最佳浓度研究办法３实验中采用了L３正交设计(Orthogonalexperimentaldesign)，L正交设计是一种研究多因素多水平的设计方法[104]，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。正交表需要作9次实验，观察氯化锌(A)、光保护剂VBL(D)、光照h(B)这3个因素，根据专业知识确定各因子的水平：氯化锌：A1=0（%)，A2=0.1(%)，A3=1(%)光照h：B1=0(小时)，B2=6(小时)，B3=12(小时)光保护剂VBL：D1=0（%)，D2=0.5(%)，D3=1(%)这是三因子3水平的多指标(X、Y、Z)问题，如果做全面试验需要3×3=81次试验，用L9(34)来做只要9次。具体安排如表。2.4.3.2VBL的抗紫外线作用的研究计划将舞毒蛾核型多角体病毒浓度设置为390OBs/μL，将添加0.5%VBL的混合液和单独的病毒液分别在与30W的紫外灯相距40cm处照射，照射时间为4h、8h、12h和16h后，冷藏在0-4℃的环境下待用，将其与没有进行30W的紫外灯相距40cm处照射处理的相应浓度的病毒液进行对照生物测定。在荧光素VBL对舞毒蛾核型多角体病毒毒力影响的研究中共使用了幼虫1080头。 22舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响表3实验的计划(最佳复配剂剂筛选)Tab.3Experimentplan(synergisticagentselection)标水平组合实验因子签氯化锌光照h光保护剂VBLM1A1B1D10%VBL+0%ZnCl2+0hZnCl2(A1)0%0(B1)VBL(D1)0%M2A1B2D20.5%VBL+0%ZnCl2+6hZnCl2(A1)0%6(B2)VBL(D2)0.5%M3A1B3D31%VBL+0%ZnCl2+12hZnCl2(A1)0%12(B3)VBL(D3)1%M4A2B2D31%VBL+0.1%ZnCl2+6hZnCl2(A2)0.1%6(B2)VBL(D3)1%M5A2B3D10%VBL+0.1%ZnCl2+12hZnCl2(A2)0.1%12(B3)VBL(D1)0%M6A2B1D20.5%VBL+0.1%ZnCl2+0hZnCl2(A2)0.1%0(B1)VBL(D2)0.5%M7A3B3D20.5%VBL+1%ZnCl2+12hZnCl2(A3)1%12(B3)VBL(D2)0.5%M8A3B1D31%VBL+1%ZnCl2+0hZnCl2(A3)1%0(B1)VBL(D3)1%M9A3BD10%VBL+1%ZnCl2+6hZnCl2(A3)1%6(B2)VBL(D1)0%2.4.4数据的处理用Excel软件对取食9种处理的舞毒蛾幼虫死亡情况进行统计，数据处理采用SPSS数据处理软件，进行单因素方差分析中的Duncan's法检验差异显著性。2.5舞毒蛾核型多角体病毒的最佳复配剂对舞毒蛾幼虫亚致死的影响2.5.1幼虫的饲养及前期处理卵消毒后，放置温度为25±1℃的培养皿里，用光周期为16L:8D的气候培养箱里孵化，将初孵幼虫转入到带有人工饲料养虫杯中，饲养至2龄，取同一天达到2龄的舞毒蛾幼虫作为备用。利用９次实验中最有效的组合LdNPV+1%VBL+0.1%氯化锌34567与5种不同浓度3.9×10，3.9×10，3.9×10，3.9×10，3.9×10OBs/mL相结合，得出以下实验结果。LdNPV+1%VBL+0.1%氯化锌的致死中浓度LC50,LT50在荧光素VBL与舞毒蛾核型多角体病毒结合对舞毒蛾幼虫亚致死的影响研究中共使用了幼虫864头。 内蒙古农业大学博士学位论文232.5.2最佳复配剂不同浓度的病毒溶液的配制表4实验液的步骤Tab.4StepsofcompoundexperimentalfluidLdNPV浓0.1%LdNPV浓度（OBs/µL）液体重1%VBL度（OBs/标签ZnCl2量（mL）（mL）11．7117117011700117000µL）（mL）39000MA6222----3900MB622-2---390MC622--2--39MD622---2-3.9MF622----2注：-:不加该种试剂；添加1%VBL和0.1%氯化锌的病毒浓度为3.9,39,390,3900,39000OBs/µL的正常人工饲料。2.5.3数据统计与分祈用POLO-PC软件计算（LC50，LT50）。采用SPSS数据处理软件，进行单因素方差分析中的Duncan's法检验差异显著性。Exsel软件：用于对幼虫化蛹、成蛾时间、雌、雄蛹重、雌雄数量、雌、雄成蛾数量、剖腹卵数量的统计、汇总；SPSS20.软件：用于分析VBL、ZnCl2和LdNPV结合对舞毒蛾幼虫的生长发育的各项指标的差异。2.6荧光素及舞毒蛾核型多角体病毒对舞毒蛾酶活的影响2.6.1幼虫饲养及前期处理将舞毒蛾幼虫使用正常饲料味养至4龄，再饥饿24h，分别作以下处理：(1)根据4龄幼虫食量，将约30mg人工饲料块(2mm×2mm×2mm)置于24孔组织培养皿里，用微量的移液器滴加入浓度为390OBs/μL的病毒液3μL（对照滴加蒸馏水）；(2)将24孔组织培养皿里，每孔再接入1头饥饿处理24h的4龄幼虫，封口并加盖，遮光后放置T:25±1℃RH:80％L:D:16:8的全自动气候培养箱里，取食24h；(3)将完全食尽饲料段的幼虫转移到含正常饲料的小养虫杯内饲养，并对取食12h，24h，48h，72h的4龄幼虫进行谷胱甘肽转移酶活性测定实验。实验分为以正常饲料+蒸馏水为对照，VBL饲料,ZnCI2饲料,正常饲料+病毒，VBL饲料+病毒，ZnCI2饲料+病毒,VBL+ZnCI2饲料+病毒，7组进行。共设7个处理，每个处理做3个重复，每个重复需要5头幼虫；4个时间段，一种酶。虫量计算：7处理×3重复×4个时间×5头幼虫=420头四龄幼虫需要。 24舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响2.6.2酶液提取参照VanAsperen的办法，对4龄舞毒蛾幼虫进行酶液提取。先选取5头健康活沷的4龄舞毒蛾幼虫，再用预冰盘中处理。(1)血淋巴：剪掉胸足，出血后用移液枪吸取收集，加入1mL0.1moL/L磷酸缓冲0液（pH=6.5），在于4C下，5000rpm的转速离心15min,取上清液，预冰块水混合物保存待测。(2)中肠：剪掉前后的三节，抽取中肠，用预冷过的磷酸冲液溶液冲掉体液，加入00.1moL/L磷酸缓冲液（pH=6.5），冰浴匀浆，置于4C下，10000rpm的转速离心30min,取上清液，放置在预冰块水混合物保存待测。2.6.3实验液的配置表57种处理的试剂溶液的配制Tab.5Theconfectingof7kindsofprocessingreagentLdNPV液体重量1%VBL0.1%ZnCl2蒸馏水6处理标签1.17x10O（mL）（mL）（mL）（mL）Bs/mL对照MT16---6VBLMT262--4ZnCI2MT36-2-4LdNPVMT46--24VBL+LdNPVMT562-22ZnCL2+LdNPVMT66-222ZnCL2+VBL+LdNPVMT76222-注：-:不加该种试剂；MT1：对照；MT2：添加1%VBL正常人工饲料；MT3：添加0.1%氯化锌正常人工饲料；MT4：单独病毒正常人工饲料；MT5：添加1%VBL和病毒正常人工饲料；MT6：添加0.1%氯化锌和病毒正常人工饲料；MT7：添加1%VBL，0.1%氯化锌和病毒正常人工饲料。2.6.4谷胱甘肽-S-转移酶GlututhioneS-transferases活性测定(1)将四龄幼虫剪掉胸足，出血后，用移液枪吸取并收集，加入预冷的0.1moL/L磷酸缓液，其中，乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2）含1mmoL/L，0.1mmoL/LPMSF0和0.1mmoL/LDTT，在玻璃匀浆器中充分匀浆，以4C，5000g离心15min。用上清液。(2)将四龄幼虫放置冰浴上解剖中肠，除去内含物，用1.15%氯化钾溶液中漂洗，加入预冷的0.1moL/L磷酸缓液（含1mmoL/L乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2），00.1mmoL/LPMSF和0.1mmoL/LDTT），在玻璃匀浆器中充分匀浆，4C，10000g离 内蒙古农业大学博士学位论文250心30min。上清液用滤纸抽滤，滤液立即用于实验或者于-20C条件下保存备用。(3)在测定的试管中分别加入2.3mL的0.1moL/L磷酸缓冲液（pH=6.5）,0.1mL酶液和0.5mL还原型谷胱甘肽（GSH），0.1mL的1.0mmoL/LCDNB的底物，在空白的对照杯中以煮死的酶液代替正常酶，其余的同测定杯。加入所有的试剂后0在25C反应3min后，加入0.3mL的三氯乙酸止反应，在终止反应后加入空白对照管重酶液，在1500r/min条件下离心5min，取上清液于340nm下测定OD值[105]。表6谷胱甘肽-S-转移酶活性测定步骤Tab.6ThemeasuringstepofGlutathione-S-transferaseactivity重复反应体系123空白磷酸冲液(mL)2.32.32.32.3酶液(mL)0.10.10.1GSH(mL)0.50.50.50.5CDNB(mL)0.10.10.10.10在25C反应3min三氯乙酸(mL)0.30.30.30.3酶液1在1500r/min下离心5min测340处的OD值。2.6.5蛋白质含量测定表7蛋白质标准曲线的制定Tab.7Establishmentofthestandardcurveforthemeasurementofproteincontent试剂123456BSA标准液（mL）00.010.020.030.040.05蒸馏水（mL）0.050.040.030.020.010考马斯亮蓝（mL）0.250.250.250.250.250.25蛋白质含量（µg）010203040501-2minOD595注：考马斯亮蓝Ｇ－２５０试剂：考马斯亮蓝100ｍｇ，９５％在辟ＳＣｍＬ，85%H3PO4100mL定容1000mL。牛血清蛋白(BSA)标准液：称取5mg的BSA溶于100mL蒸靖水，用玻璃棒揽拌[3]打到充分溶解。用考马斯亮蓝G-250法对蛋白质进行测定：实验设计３个重复，按照表２的步骤进行操作，在于紫外可见分光光度计下测量595nm的OD值。WBSA的含量(g)为横坐标,OD平均值为纵坐标，绘制碌准曲线。2.6.6数据统计与分析 26舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响应用Excel软件进行统计，用SPSS20.0软件，对不同处理的舞毒蛾的4龄幼虫中肠和血淋巴谷胱甘肽-S-转移酶活性进行分析，Duncan检验在0.05水平上不同处理间差异显著性。3.结果与分析3.1荧光素VBL对舞毒蛾核型多角体病毒的毒力的影响分析3.1.1筛选获得LdNPV的最佳复配剂表8不同复配剂对舞毒蛾幼虫的死亡率Tab.8Themortalityofdifferentmixtureagentsongypsymothlarvae死亡虫数处理供试虫数平均死亡率（%）（头）M1对照+LdNPV1082523.3±7.9b,cM20.5%VBL+6h+LdNPV10843.7±2.3aM31%VBL+12h+LdNPV1081110.3±3.3a,bM41%VBL+0.1%ZnCl2+6h+LdNPV1087367.7±8.7dM50.1%ZnCl2+12h+LdNPV1081110.3±3.3a,bM60.5%VBL+0.1%ZnCl2+LdNPV1081816.7±5.9a,bM70.5%VBL+1%ZnCl2+12h+LdNPV1083633.3±4.2cM81%VBL+1%ZnCl2+LdNPV1086055.7±2.7dM91%ZnCl2+6h+LdNPV1082825.7±4.1b,cck对照10810.3±0.3a注：1、表中数据为平均值±SE,小写字母不同表示在Ρ<0.05水平下差异显著（Dancun’s多重比较），下同;2、30W紫外灯40cm下照射0h、6h和12h.表8，本实验运用正交实验方法对添加荧光素和氯化锌对核型多角体病毒的增效作用进行了研究。实验共做了上述9种处理，结果如下：处理M1，未添加荧光素和氯化锌，仅单独病毒，即在正常人工饲料的情况下，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为23.3%；处理M2、M3、M5、M6和M9的死亡率较单独病毒（M1）低，它们的死亡率分别为3.7%、10.3%、10.3%、16.7和25.7；处理M4、M7及M8的死亡率较单独病毒高，它们的死亡率分别为44.4%、10%、32.4。处理M4病毒中添加1%浓度的荧光素和0.1%的氯化锌，并伴有6h紫外灯照射，其死亡率比较高，比单独病毒的死亡率提高了3倍，为最佳增效剂配比。 内蒙古农业大学博士学位论文27M10%VBL+0%ZnCl2+0hM20.5%VBL+0%ZnCl2+6hMM41%VBL+0.1%ZnCl2+6hM50%VBL+0.1%ZnCl2+12hMM70.5%VBL+1%ZnCl2+12hM81%VBL+1%ZnCl2+0hMck8070605040Mortality(%)率30亡图5不同复配剂对舞毒蛾幼虫死亡率的关系Fig.5TherelationshipbetweenthemortalityofGypsymothlarvaebydifferentmixtureagents处理M1，取食正常饲料的舞毒蛾幼虫在为3.9OBs/µL时，舞毒蛾幼虫在给毒的第8d开始死亡，第10d开始大量死亡，第13d死亡率达到最高，第14d死亡终止；8种处理较单独病毒（M1）开始死亡期，开始大量死亡期，死亡率达到最高期，死亡终止低期，它们分别没有差异显著，为7-8d、10-12d、11-15d和12-15d。本实验通过运用正交实验方法对添加荧光素和氯化锌对核型多角体病毒的增效作用进行了研究。共做了上述的9种处理，并且对每种实验处理的不同结果进行了比较，在病毒中添加荧光素和氯化锌后会影响舞毒蛾幼虫发病的速度，荧光素和氯化锌的浓度越高，发病率越快，死亡率越高。最有效的实验处理为第M4种和第M8种实验处理。3.1.2LdNPV的不同复配剂对舞毒蛾幼虫发育影响表9不同复配剂对舞毒蛾二龄幼虫的死亡率Tab.9Mortalityratesofdifferentmixtureagentsfor2th-instarlarvaeofgypsymoth二龄死虫处理亡虫数平均死亡率（%）死亡时间（d）数（头）b,cbM1对照+LdNPV1081412.9±4.69.0±0.0a,bbM20.5%VBL+6h+LdNPV10832.7±1.68.6±0.3a,b,cbM31%VBL+12h+LdNPV10887.4±0.98.6±0.6ebM41%VBL+0.1%ZnCl2+6h+LdNPV1086761.1±6.98.6±0.3a,b,cbM50.1%ZnCl2+12h+LdNPV10854.6±0.99.3±0.3b,cbM60.5%VBL+0.1%ZnCl2+LdNPV1081211.1±4.210±0.5 28舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响dbM70.5%VBL+1%ZnCl2+12h+LdNPV1082725±1.69.6±0.3ebM81%VBL+1%ZnCl2+LdNPV1085954.6±1.88.6±0.6cbM91%ZnCl2+6h+LdNPV1081614.8±2.48.6±0.3注：M1：单独病毒处理的正常人工饲料；M2：添加0.5%VBL的病毒，照射6h；M3：添加1%VBL的病毒，照射12h，M4：添加1%VBL和0.1%ZnCl2的病毒，照射6h；M5：添加0.1%ZnCl2的病毒，照射12h；M6：添加0.5%VBL和0.1%ZnCl2的病毒;M7:添加0.5%VBL和1%ZnCl2的病毒，照射12h；M8：添加1%VBL和1%ZnCl2的病毒处理正常人工饲料。表9可见，取食核型多角体病毒感染的不同人工饲料的舞毒蛾幼虫在二龄的时候大部分死亡。蒸馏水对照组的舞毒蛾幼虫在二龄期是5.6d。处理M1，未添加荧光素和氯化锌，仅单独病毒，即在正常人工饲料的情况下，舞毒蛾感病二龄幼虫的死亡率为12.9%；处理M2、M3、M5、M6和M9的二龄幼虫的死亡率低于单独病毒（M1），它们的二龄幼虫的死亡率分别为10.2%、5.5%、8.3%、1.7和14.8；处理M4、M7及M8的死亡率较单独病毒高，它们的死亡率分别为48.2%、12.1%、41.7%。处理M4病毒中添加1%浓度的荧光素和0.1%的氯化锌，并伴有6h紫外灯照射，其死亡率比较高，比单独病毒的死亡率提高了48.2%，为最佳增效剂配比。它们处理的二龄的时候舞毒蛾幼虫死亡率没有差异显著，为平均86，10d,但对照（CK）没感染病毒的舞毒蛾幼虫的二龄发育历期是5.6d。说明用添加荧光素和氯化锌的舞毒蛾核型多角体病毒处理过的人工饲料对舞毒蛾幼虫发育影响大。图6不同复配剂对舞毒蛾二龄幼虫的死亡率和幼虫的死亡率的关系Fig.6Relationshipbetweenmortalityandmajormortalityofthe2th-instarlarvaeofGypsymothwithdifferentmixture 内蒙古农业大学博士学位论文299种实验处理，对二龄幼虫死亡率和幼虫死亡率的不同结果进行了对比，从上图可以看出，在病毒中添加荧光素和氯化锌会影响舞毒蛾二龄幼虫的发病速度，氯化锌和荧光素的浓度越高，导致发病的速率越快，死亡率越高。均添加了荧光素和氯化锌第4种、第8种实验处理中，二龄幼虫死亡率高，舞毒蛾二龄幼虫死亡率变化由图6可见。3.1.3小结本实验通过运用正交实验方法对添加荧光素和氯化锌对核型多角体病毒的增效作用进行了研究。共做了上述的9种处理，并且对每种实验处理的不同结果进行了比较，在病毒中添加荧光素和氯化锌后会影响舞毒蛾幼虫发病的速度，荧光素和氯化锌的浓度越高，发病率越快，死亡率越高。未添加复配剂舞毒蛾感病幼虫的死亡率为23.3%；处理M2、M3、M5、M6和M9的死亡率较单独病毒（M1）低，它们的死亡率分别为3.7%、10.3%、10.3%、16.7和25.7；处理M4、M7及M8的死亡率较单独病毒高。处理M4病毒中添加1%浓度的荧光素和0.1%的氯化锌，并伴有6h紫外灯照射，其死亡率比较高，比单独病毒的死亡率提高了3倍，为最佳增效剂配比。最有效的实验处理为第M4种和第M8种实验处理。说明这种配比可以显著提高LdNPV对舞毒蛾幼虫的致死作用。9种实验处理，对二龄幼虫死亡率和幼虫死亡率的不同结果进行了对比，在病毒的添加荧光素和氯化锌会影响舞毒蛾二龄幼虫的发病速度，氯化锌和荧光素的浓度越高，导致发病的速率越快，死亡率越高。蒸馏水对照组的舞毒蛾幼虫在二龄期是5.6d。未添加荧光素和氯化锌，仅单独病毒，舞毒蛾感病二龄幼虫的死亡率为12.9%。病毒中添加1%浓度的荧光素和0.1%的氯化锌，并伴有6h紫外灯照射，其死亡率比较高，比单独病毒的死亡率提高了48.2%，为最佳增效剂配比。说明用添加荧光素和氯化锌的舞毒蛾核型多角体病毒处理过的人工饲料对舞毒蛾幼虫发育影响大。3.2舞毒蛾核型多角体病的复配剂对舞毒蛾幼虫的致病力3.2.1最佳病毒复配剂对舞毒蛾二龄幼虫的死亡率的分析表10复配剂中LdNPV不同浓度对舞毒蛾幼虫死亡率的影响Tab.10AfterdispensingLdNPVdifferentconcentrationsofgypsymothlarvamortalityLdNPV浓度供试虫数死亡虫数（头）平均死亡率（%）（OBs/µL）dMA3900014413795.3±1.3cMB390014411781.3±3.7cMC39014411076.3±2.4bMD391447048.6±4.7aMF3.914496.0±2.0 30舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响aCK014432.0±0.0注：添加1%VBL和0.1%氯化锌的病毒浓度为3.9,39,390,3900,39000OBs/µL的正常人工饲料。由表10可知，舞毒蛾幼虫取食添加浓度为1%VBL和0.1%ZnCl2人工饲料的最终死亡率。取食添加1%VBL,0.1%ZnCl2和不同浓度病毒感染的舞毒蛾幼虫死亡率与病毒浓度均呈正相关关系，当病毒浓度越高时,死亡率也越高。取食了添加1%VBL和0.1%ZnCl2的不同病毒浓度人工饲料的舞毒蛾幼虫，在病毒浓度为3.9OBs/µL时，死亡率为最低，为6％，病毒浓度为39000OBs/µL时,死亡率达最高，为95%。图7取食最佳病毒复配剂舞毒蛾幼虫的累计死亡率与时间的关系Fig.7TherelationshipbetweenthecumulativemortalityandthetimeoffeedingthebestmixtureGypsymothlarvaeVBL、ZnCl2和不同浓度LdNPV感染的舞毒蛾的感病幼虫死亡率如图7，可见舞毒蛾幼虫死亡率随着病毒浓度的增加会受影响；提高了舞毒蛾幼虫发病遠度，浓度越高发病越快。病毒浓度为39000OBs/µL时，处理MA，最早，最快死亡，为舞毒蛾幼虫在给毒后的第4d开始死亡，第10d开始死亡量增加，第13d死亡率达到最高值，第14d的时候死亡终止；处理MB,MC,MD,MF时，第6d开始死亡，第11-12d死亡率达到最高，第12-14d的时候死亡终止。 内蒙古农业大学博士学位论文313.2.2最佳病毒复配剂对舞毒蛾二龄幼虫的致死中浓度LC50表11最佳病毒复配剂对舞毒蛾2龄幼虫的致死中浓度Tab.11ThelethalconcentrationsLCth50ofthebestvirusmixtureonthegypsymoth2instarlarvae2处理斜率±SELC50及95%置信限LC90及95%置信限（0Bs/µL）Xdf（0Bs/µL）106.416457.41%VBL+0.1%ZnCl2+V0.719±0.04838.7813（48.13~213.67）(2561.52~25340.06)注：添加1%VBL和0.1%氯化锌的病毒浓度为39,390OBs/µL的正常人工饲料。由表11可知，荧光素与氯化锌对LdNPV对舞毒蛾２龄幼虫致死中浓度（LC50）的影响结果是：106.410Bs/µL的LdNPV对取食添加氯化锌，荧光素和病毒感染的舞毒蛾幼虫LC50，在95%的置信区间时，结果为48.13-213.670Bs/µL，浓度（LC90）为6457.40Bs/µL，95%的置信区间时，结果为2561.52-25340.060Bs/µL。3.2.3不同浓度LdNPV舞毒蛾幼虫的致死中时间LT50表12最佳病毒复配剂对舞毒蛾2龄幼虫的致死中时间LT50Tab.12DeadTimeoftheBestVirusComplexonGypsyMoth2ndInstarLarvae(LT50)2LdNPV浓度（OBs/µL）斜率±SELT50及95%置信限(d)LT90及95%置信限(d)Xdf393.5±0.2713.12(11.8-15)29.9(23.6-44)88.29223905.29±0.39.37(8.46-10.28)16.37(14.37-19.99)105.622注：添加1%VBL和0.1%氯化锌的病毒浓度为39,390OBs/µL的正常人工饲料。由表12可知，舞毒蛾幼虫取食了添加荧光素与氯化锌人工饲料，ＬｄＮＰＶ浓度为390Bs/µL时，致死中时间LT50为13.12(11.8-15)d，LT90为29.9(23.6-44)；浓度为3900Bs/µL时，LT509.37(8.461-10.278)d，LT90为16.367(14.369-19.999)d。3.2.4小结取食添加1%VBL,0.1%ZnCl2和不同浓度病毒感染的舞毒蛾幼虫死亡率与病毒浓度均呈正相关关系，当病毒浓度越高时,死亡率也越高。取食了添加1%VBL和0.1%ZnCl2的不同病毒浓度人工饲料的舞毒蛾幼虫，在病毒浓度为3.9OBs/µL时，死亡率为最低，为6％，病毒浓度为39000OBs/µL时,死亡率达最高，为95%。病毒浓度为39000OBs/µL时，处理MA，最早，最快死亡，为舞毒蛾幼虫在给毒后的第4d开始死亡，第10d开始死亡量增加，第13d死亡率达到最高值，第14d的时候死亡终止；处理MB,MC,MD,MF时，第6d开始死亡，第11-12d死亡率达到最高，第12-14d的时候死亡终止。LdNPV的最佳复配剂对舞毒蛾２龄幼虫致死中浓度（LC50）106.410Bs/µL，在95%的置信区间时，结果为48.13-213.670Bs/µL，浓度（LC90）为6457.40Bs/µL， 32舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响95%的置信区间时，结果为2561.52-25340.060Bs/µL。ＬｄＮＰＶ的最佳复配剂浓度为390Bs/µL时，致死中时间LT50为13.12(11.8-15)d，LT90为29.9(23.6-44)；浓度为3900Bs/µL时，LT509.37(8.461-10.278)d，LT90为16.367(14.369-19.999)d。3.3舞毒蛾幼虫取食VBL、ZnCl2和不同浓度LdNPV感染的人工饲料后对舞毒蛾幼虫发育历期的影响用不同浓度：3.9OBs/µL，39OBs/µL，390OBs/µL，3900OBs/µL，39000OBs/µL的舞毒蛾核型多角体病毒感染，取食添加荧光素和氯化锌人工饲料并24ｈ饥饿处理的舞毒蛾２龄幼虫，24h后转入正常人工饲料，比较幸存者幼虫期、蛹期、蛹重、单雌产卵量、蛹数、羽化率、性比，比较分开雌雄幼虫，结果如表13－表16。3.3.1舞毒蛾幼虫取食VBL、ZnCl2和不同浓度LdNPV感染的人工饲料对舞毒蛾雄幼虫发育历期的影响表13最佳病毒复配剂对舞毒蛾雄幼虫发育历期的影响Tab.13EffectsofthebestmixturevirusonthedevelopmentalstagesofmalelarvaeofGypsyMothLdNPV浓各龄发育历期developmentaldurationofdifferentinstar（d）度幼虫期（d）（OBs/2龄3龄4龄5龄6龄µL）aaaaaa390006.5±0.54.5±0.54.5±0.54.5±0.511.0±0.037.0±0.0aaabaa39005.7±0.14.5±0.54.9±0.48.5±0.510.3±0.1635.1±1.0aa,babca3906.4±0.24.8±0.14.6±0.28.9±0.313.2±0.4738.3±0.8ababaa395.7±0.15.7±0.24.7±0.28.1±0.810.9±0.336.9±0.8aa,baba,ba3.95.7±0.14.9±0.14.9±0.27.7±0.411.4±0.236.8±0.4aa,babba05.9±0.35.1±0.35.0±0.37.2±0.412.4±0.440.1±3.4注：添加1%VBL和0.1%氯化锌的病毒浓度为3.9,39,390,3900,39000OBs/µL的正常人工饲料。小写字母不同表述同列数据经Dancun’多重比较差异显著（Ρ<0.05）。舞毒蛾雄性幼虫发育历期如表13，可见，添加荧光素和氯化锌不同浓度病毒感染的幸存的舞毒蛾雄幼虫在各龄的生长发育期与对照差异不显著，对照的幼虫期平均是40.1d，病毒复配剂处理的雄幼虫历期较短，但尚未达到统计学上的显著性（Ρ=0.456>0.05）。五龄龄期有差异（Ρ=0.003<0.05），且和病毒浓度有关，在病毒浓度为39000OBs/uL浓度下，其发育历期为4.5d，对照的五龄历期是7.2d，缩短了2d左右。六龄幼虫历期在不同病毒浓度下差异显著，但无明显的规律性，其原因可能与幸存者数量有限，不能代表总体情况，今后还需进一步加大样本数量，进行研究分析[图8]。 内蒙古农业大学博士学位论文33图8舞毒蛾雄性幼虫发育历期关系Fig.8Relationshipbetweenthemalelarvaldevelopmentscheduleofthegypsymoth3.3.2舞毒蛾幼虫取食VBL、ZnCl2和不同浓度LdNPV感染的人工饲料对舞毒蛾䧳幼虫发育历期影响表14最佳病毒复配剂对舞毒蛾雌幼虫发育历期的影响Tab.14EffectofbestmixturevirusonthedevelopmentaldurationofGypsymothfemalelarvaeLdNPV浓度各龄发育历期developmentaldurationofdifferentinstar（d）幼虫期（d）（OBs/µL）2龄3龄4龄5龄6龄caaaaa390007.0±0.06.0±1.05.0±1.07.0±0.012.0±1.042.5±2.5baaaaa39006.0±0.05.6±0.65.0±0.07.0±1.013.0±1.042.6±.33aaaaaa3905.3±0.35.3±0.34.6±0.65.3±0.314.3±0.641.0±1.0baaaaa396.0±0.05.3±0.35.0±0.06.3±0.314.3±0.842.6±0.8baaaaa3.96.0±0.05.0±0.05.0±0.06.3±0.314.3±0.342.0±0.57baaaaa06.0±0.05.3±0.34.6±0.36.3±0.314.3±0.342.3±0.6注：添加1%VBL和0.1%氯化锌的病毒浓度为3.9,39,390,3900,39000OBs/µL的正常人工饲料。小写字母不同表述同列数据经Dancun’多重比较差异显著（Ρ<0.05）舞毒蛾雌性幼虫的发育历期如表14可见，复配剂不同病毒浓度对幸存的舞毒蛾雌幼虫的生长发育期的影响没有显著差异。对照的二龄历期是6d，比较感染高浓度病毒的雌幼虫历期长，但尚未达到统计学上的显著性（Ρ=0.427>0.05）。其他龄期的幼虫与对照没有显著差异(图9)。 34舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响图9最佳病毒复配剂对舞毒蛾雌幼虫发育历期的关系Fig.9Therelationshipbetweenthebestmixtutrevirusandthedevelopmentalperiodofgypsymothfemalelarvae3.3.3最佳病毒复配剂对舞毒蛾蛹的影响表15最佳病毒复配剂对舞毒蛾蛹的影响Tab.15EffectofthebestmixturevirusongypsymothpupaLdNPV浓度存活蛹数(头)蛹期（d）蛹重量（g）（OBs/µL）雄雌雄雌雄雌abba390004216±013.5±0.50.8±0.011.36±0.205aaaa3900101315±0.711.3±0.30.71±0.011.56±0.064aaaa,b390141914±0.711.6±0.80.73±0.031.59±0.0506aaaa,b39333814.3±0.411.3±0.30.72±0.021.589±0.0588aaaa,b3.9606814.7±0.411±0.00.72±0.0071.6043±0.0401aaab0696214.6±0.511±0.00.71±0.0091.543±0.047注：添加1%VBL和0.1%氯化锌的病毒浓度为39,390OBs/µL的正常人工饲料。小写字母不同表述同列数据经Dancun’多重比较差异显著（Ρ<0.05）舞毒蛾蛹发育历期和蛹重如表15，可见，复配剂不同病毒浓度对幸存的舞毒蛾雄蛹发育历期的影响没有显著差异。雌蛹发育历期有差异（Ρ=0.244>0.05），且和病毒浓度有关，在病毒浓度为39000OBs/uL浓度下，雌蛹发育历期为13.5d，对照的雌蛹发育历期是11d，增高了2d左右。复配剂不同病毒浓度对幸存的舞毒蛾雌蛹量的影响没有显著差异。雄蛹量有差异（Ρ=0.462>0.05），且和病毒浓度有关，在病毒浓度为39000OBs/uL浓度下，雄 内蒙古农业大学博士学位论文35蛹量为0.8g，对照的雄蛹量是0.7g，增高了0.1g左右。舞毒蛾蛹期雄蛹的14-16d,雌蛹的11-13.5d，蛹重量是雄蛹0.71-0.8g，雌蛹1.36-1.59g.3.3.4VBL、ZnCl2和不同浓度病毒对舞毒蛾的产卵量及性比的影响表16最佳病毒复配剂对舞毒蛾雌雄性比，羽化率及成虫产卵质量的影响Tab.16Effectofoptimalvirusmixtureagentonmale-maleratio,emergencerateandadultovipositionqualityofgypsymothLdNPV浓度蛹（OBs/µL）羽化率（%）雌雄性比产卵量(粒/雌)卵块重量(g/块)数aa39000785.7422254.5±29.50.265±0.01aa,b39002592.010130.76290.6±22.90.3±0.03a,ba,b3903497.114190.74307.5±5.90.315±0.03a,ba,b397397.333380.87322.4±26.90.294±0.02a,ba,b3.913495.560680.88318±29.00.307±0.01bb0131100.069621.11375.6±17.30.349±0.01注：添加1%VBL和0.1%氯化锌的病毒浓度为39,390OBs/µL的正常人工饲料。小写字母不同表述同列数据经Dancun’多重比较差异显著（Ρ<0.05）可知表16，VBL、ZnCl2和不同浓度病毒感染的舞毒蛾羽化率，雌雄性比，蛹数，单雌产卵量，卵块重量的结果如表16，随病毒浓度的升高，复配剂使舞毒蛾雌雄化蛹率，羽化率，产卵量,卵块重量降低，而且浓度越高，降低越明显。单独取食正常人工饲料的舞毒蛾单雌产卵量与病毒浓度为3.9，39，390，3900，39000OBs/µL的病毒感染的添加VBL、ZnCl2人工饲料的舞毒蛾单雌产卵量差异显著（Ρ=0.794>0.05），分别减少57粒，53粒，68粒，85粒和121粒。单独取食正常人工饲料的舞毒蛾单雌卵块重量与病毒浓度为3.9，39，390，3900，39000OBs/µL的病毒感染的添加VBL、ZnCl2人工饲料的舞毒蛾单雌卵块重量有显著差异（Ρ=0.45>0.05），分别减轻0.042g，0.055g，0.034g，0.049g和0.084g。3.3.5小结最佳复配剂不同浓度病毒感染的幸存的舞毒蛾雄幼虫在各龄的生长发育期与对照差异不显著，对照的幼虫期平均是40.1d，病毒复配剂处理的雄幼虫历期较短，但尚未达到统计学上的显著性（Ρ=0.456>0.05）。五龄龄期有差异（Ρ=0.003<0.05），且和病毒浓度有关，在病毒浓度为39000OBs/uL浓度下，其发育历期为4.5d，对照的五龄历期是7.2d，缩短了2d左右。六龄幼虫历期在不同病毒浓度下差异显著，但无明显的规律性，其原因可能与幸存者数量有限，不能代表总体情况，今后还需进一步加大样本数量，进行研究分析。 36舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响复配剂不同病毒浓度对幸存的舞毒蛾雌幼虫的生长发育期的影响没有显著差异。对照的二龄历期是6d，比较感染高浓度病毒的雌幼虫历期长，但尚未达到统计学上的显著性（Ρ=0.427>0.05）。其他龄期的幼虫与对照没有显著差异。复配剂不同病毒浓度对幸存的舞毒蛾雄蛹发育历期的影响没有显著差异。雌蛹发育历期有差异（Ρ=0.244>0.05），且和病毒浓度有关，在病毒浓度为39000OBs/uL浓度下，雌蛹发育历期为13.5d，对照的雌蛹发育历期是11d，增高了2d左右。复配剂不同病毒浓度对幸存的舞毒蛾雌蛹量的影响没有显著差异。雄蛹量有差异（Ρ=0.462>0.05），且和病毒浓度有关，在病毒浓度为39000OBs/uL浓度下，雄蛹量为0.8g，对照的雄蛹量是0.7g，增高了0.1g左右。舞毒蛾蛹期雄蛹的14-16d,雌蛹的11-13.5d，蛹重量是雄蛹0.71-0.8g，雌蛹1.36-1.59g.VBL、ZnCl2和不同浓度病毒感染的舞毒蛾羽化率，雌雄性比，蛹数，单雌产卵量，卵块重量的结果如表16，随病毒浓度的升高，复配剂使舞毒蛾雌雄化蛹率，羽化率，产卵量,卵块重量降低，而且浓度越高，降低越明显。单独取食正常人工饲料的舞毒蛾单雌产卵量与病毒浓度为3.9，39，390，3900，39000OBs/µL的病毒感染的添加VBL、ZnCl2人工饲料的舞毒蛾单雌产卵量差异显著。单独取食正常人工饲料的舞毒蛾单雌卵块重量与病毒浓度为3.9，39，390，3900，39000OBs/µL的复配剂舞毒蛾单雌卵块重量有显著差异（Ρ=0.45>0.05）。3.4舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾4龄幼虫酶的影响3.4.1血淋巴的谷胱肽S转移酶表17不同成分对舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的影响Tab.17EffectsofdifferentcomponentsontheactivityofglutathioneS-transferaseinhaemoLymphofthegypsymothlarvae处理不同时间的谷胱肽S转移酶活性（mmoL/mgpro）24h48h72h96h对照0.03±0.062a,b(a)0.058±0.017a(a)0.063±0.018a,b(a)0.056±0.018b(a)VBL0.059±0.007b(a)0.047±0.033a(a)0.035±0.003a(a)0.078±0.011b(a)ZnCIa,b(a)a(a)a(a)a,b(a)20.049±0.0110.022±0.0090.035±0.0110.044±0.015LdNPV0.024±0.004a(a)0.064±0.033a(a)0.033±0.011a(a)0.049±0.038a,b(a)VBL+V0.039±0.011a,b(a,b)0.056±0.02a(a,b)0.063±0.022a,b(b)0.006±0.006a(a)ZnCLa,b(a)a(a)b(b)b(a)2+V0.037±0.0090.039±0.0110.139±0.0390.058±0.023ZnCLa,b(a)a(a)c(b)b(a)2+VBL+V0.036±0.0170.027±0.1380.26±0.0520.057±0.025注意：对照（正常人工饲料+蒸馏水）；VBL：（正常人工饲料+VBL），ZnCL2：（正常人工饲料+ZnCL2），LdNPV：（正常人工饲料+病毒），VBL+V：（正常人工饲料+VBL+病毒），ZnCL2+V：（正常人工饲料+ZnCL2+病毒）， 内蒙古农业大学博士学位论文37ZnCL2+VBL+V：（正常人工饲料+VBL+ZnCL2+病毒），括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著，括号外不同的小写字母表述同列Dancun’的多重比较差异显著，可见表17取食不同处理的舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST表现差异性。对照血淋巴GST在72h后表现最高，在24h后最低。在24h时，血淋巴GST的影响对VBL，与对照差异显著（Ρ=0.794>0.05）。增高0.029mmoL/mgpro。在48h时，各处理对血淋巴GST的影响没有显著差异。在72h时，添加ZnCl2感染病毒和添加VBL和ZnCl2感染病毒对血淋巴GST影响更大，与对照差异显著，分别增高0.076、0.197mmoL/mgpro，而它们在第1、2和4d没有显著差异。在96h时，。血淋巴GST的影响对VBL，与对照差异显著（Ρ=0.086>0.05）。增高0.022mmoL/mgpro，ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫血淋巴GST的影响在第72h时表现为活性增加，与24h时的血淋巴GST显著差异，增高3.7倍。VBL、ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫血淋巴GST的影响在第72h时表现为活性增加，与24h时的血淋巴GST显著差异，增高7.2倍。3.4.1.1不同成分对舞毒蛾幼虫血淋巴GST的比较图10单独添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应Fig.10ThetimeeffectoftheactivityofthehemoLymphglutathioneinthelarvaeofgypsymothlarvaewasaddedseparately.注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图10）。单独荧光素VBL在第24h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.041），其活性为0.049mmoL/mg 38舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响pro，比对照增加0.03mmoL/mgpro。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.207），其活性为0.035mmoL/mgpro，比对照减少0.028mmoL/mgpro。在第96h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.319），其活性为0.078mmoL/mgpro，比对照增高0.022mmoL/mgpro。取食单独添加荧光素人工饲料的的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性在第96h活性最高，与对照差异显显著增高0.022mmoL/mgpro，在第72h最低，与对照差异显著，减少0.028mmoL/mgpro。图11单独添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应Fig.11ThetimeeffectoftheactivityofthehemoLymphglutathioneinthelarvaeofgypsymothlarvaewithzincchlorideartificialfeed.注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图11）。单独氯化锌ZnCl2在第24h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0,210），其活性为0.059mmoL/mgpro，比对照增加0.019mmoL/mgpro。在第48h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.135），其活性为0.022mmoL/mgpro，比对照减少0.036mmoL/mgpro。在第72h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.274），其活性为0.035mmoL/mgpro，比对照减少0.028mmoL/mgpro。在第96h时，与对照没有差异显著。取食单独添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性在24h活性最高，与对照差异显显著，增高0.019mmoL/mgpro，在48h最低，与对照 内蒙古农业大学博士学位论文39差异显显著，减少0.036mmoL/mgpro。血淋巴GST对照ckLdNPVc0.08(a)(a)*(a)0.07(a)(a)0.06GSTActivity）0.05*(a)0.04(a)(a)0.030.02转移酶活力mmol/mgproS（0.01024h48h72h96h谷胱甘肽病毒感染时间Treattime(h)图12单独病毒感染的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱肽S转移酶活性的时间效应Fig.12LdNPVinfectionofgypsymothlarvahemoLymphasglutathioneStransferaseactivitytimeeffect注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图12）。单独LdNPV在第24h时，与对照没有差异显著。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.226），其活性为0.033mmoL/mgpro，比对照减少0.03mmoL/mgpro。在第96h时，与对照没有差异显著。单独病毒感染的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性在48h活性最高，与对照差异显显著，增高0.006mmoL/mgpro，在24h最低，与对照差异显显著，减少0.006mmoL/mgpro。血淋巴GST对照ckVBL+Vd0.08(b)(a,b)(a)0.07(a)*(a)0.06a,b(a,b)）0.05GSTActivity(a)0.040.03*(a)0.02mmol/mgpro0.01（024h48h72h96h谷胱甘肽S转移酶活力病毒感染时间Treattime(h)图13毒感染添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应Fig.13VirusaddfluorescentfeedgypsymothlarvahemoLymphGSTactivitytimeeffect注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著 40舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图13）。病毒感染添加荧光素在第24h时，与对照没有差异显著。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，与对照没有差异显著。在第96h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.047），其活性为0.006mmoL/mgpro，比对照减少0.05mmoL/mgpro。病毒感染添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性在72h活性最高，与对照差异显显著，一样0.063mmoL/mgpro，在96h最低，与对照差异显显著，减少0.05mmoL/mgpro、与24h时的血淋巴GST显著差异（Ρ=0.125），减少5.6倍。图14病毒感染添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应Fig.14AddzincchloridevirusmixturefeedgypsymothlarvahemoLymphGSTactivitytimeeffect注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图14）。病毒感染添加氯化锌在第24h时，与对照没有差异显著。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.153），其活性为0.139mmoL/mgpro，比对照增加0.076mmoL/mgpro。在第96h时，与对照没有差异显著。病毒感染添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性在72h活性最高，与对照差异显显著，增高0.076mmoL/mgpro，与24h时的血淋巴GST显著差异（Ρ=0.05），增加1.5倍。在24h最低，与对照差异显显著，增高 内蒙古农业大学博士学位论文410.007mmoL/mgpro。血淋巴GST对照ckZnCL2+VBL+Vf0.35*(b)0.30.25）GSTActivity0.20.15(a)(a)转移酶活力mmol/mgpro0.1(a)S（(a)*(a)(a)0.05(a)谷胱甘肽024h48h72h96h病毒感染时间Treattime(h)图15病毒感染添加荧光素和氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应Fig.15AddfluoresceinandzincchloridevirusmixturefeedofgypsymothlarvahemoLymphGSTactivitytimeeffect注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图15）。病毒感染添加荧光素和氯化锌在第24h时，与对照没有差异显著。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.001），其活性为0.26mmoL/mgpro，比对照增加0.197mmoL/mgpro。在第96h时，与对照没有差异显著。病毒感染添加荧光素和氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性在72h活性最高，与对照差异显显著，增高0.179mmoL/mgpro，与24h时的血淋巴GST显著差异（Ρ=0.00），增加7.2倍。在48h最低，与对照差异显显著，减少0.031mmoL/mgpro。3.4.1.2小结对照血淋巴GST在72h后表现最高，在24h后最低。在24h时，VBL对血淋巴GST的影响，与对照差异显著（Ρ=0.794>0.05）。在48h时，各处理对血淋巴GST的影响没有显著差异。在72h时，添加ZnCl2感染病毒和添加VBL和ZnCl2感染病毒对血淋巴GST影响更大，与对照差异显著，分别增高0.076、0.197mmoL/mgpro，而它们在第1、2和4d没有显著差异。在96h时，。血淋巴GST的影响对VBL，与 42舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响对照差异显著（Ρ=0.086>0.05）。增高0.022mmoL/mgpro，ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫血淋巴GST的影响在第72h时表现为活性增加，与24h时的血淋巴GST显著差异，增高3.7倍。VBL、ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫血淋巴GST的影响在第72h时表现为活性增加，与24h时的血淋巴GST显著差异，增高7.2倍。单独荧光素VBL在第24h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.041），其活性为0.049mmoL/mgpro，比对照增加0.03mmoL/mgpro。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.207），其活性为0.035mmoL/mgpro，比对照减少0.028mmoL/mgpro。在第96h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.319），其活性为0.078mmoL/mgpro，比对照增高0.022mmoL/mgpro。单独氯化锌ZnCl2在第24h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0,210），其活性为0.059mmoL/mgpro，比对照增加0.019mmoL/mgpro。在第48h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.135），其活性为0.022mmoL/mgpro，比对照减少0.036mmoL/mgpro。在第72h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.274），其活性为0.035mmoL/mgpro，比对照减少0.028mmoL/mgpro。在第96h时，与对照没有差异显著。单独LdNPV在第24h时，与对照没有差异显著。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.226），其活性为0.033mmoL/mgpro，比对照减少0.03mmoL/mgpro。在第96h时，与对照没有差异显著。单独病毒感染的舞毒蛾幼虫血淋巴谷胱甘肽S转移酶活性在48h活性最高，与对照差异显显著，增高0.006mmoL/mgpro，在24h最低，与对照差异显显著，减少0.006mmoL/mgpro。病毒感染添加荧光素在第24h时，与对照没有差异显著。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，与对照没有差异显著。在第96h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.047），其活性为0.006mmoL/mgpro，比对照减少0.05mmoL/mgpro。病毒感染添加氯化锌在第24h时，与对照没有差异显著。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.153），其活性为0.139mmoL/mgpro，比对照增加0.076mmoL/mgpro。在第96h时，与对照没有差异显著。病毒感染添加荧光素和氯化锌在第24h时，与对照没有差异显著。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫血淋巴GST酶活性 内蒙古农业大学博士学位论文43（单因素方差分析，Ρ=0.001），其活性为0.26mmoL/mgpro，比对照增加0.197mmoL/mgpro。在第96h时，与对照没有差异显著。3.4.2中肠的谷胱甘肽S转移酶表18不同成分对舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的影响Tab.22EffectsofdifferentcomponentsonglutathioneStransferaseactivityinmidgutofthegypsymothlarvae处理不同时间的谷胱肽S转移酶活性（mmoL/mgpro）24h48h72h96h对照0.290±0.047a(a)0.268±0.129a(a)0.547±0.119a,b(a,b)0.841±0.113b,c(b)VBL0.240±0.121a(a)0.326±0.137a(a)0.502±0.082a(a)1.170±0.029d(b)ZnCI20.080±0.019a(a)0.496±0.119a(b)0.684±0.179a,b(a,b)1.093±0.129c,d(c)LdNPV0.075±0.022a(a)0.556±0.086a(b)0.455±0.150a(a,b)0.708±0.163b(b)VBL+V0.124±0.068a(a)0.275±0.070a(a)0.314±0.085a(a)0.196±0.038a(a)ZnCL2+V0.120±0.112a(a)0.365±0.019a(a)1.182±0.134c(c)0.648±0.105b(d)ZnCL2+VBL+V0.206±0.079a(a)0.511±0.009a(b)0.948±0.121b,c(c)0.268±0.0502a(a,b)注意：对照（正常人工饲料+蒸馏水）；VBL：（正常人工饲料+VBL），ZnCL2：（正常人工饲料+ZnCL2），LdNPV：（正常人工饲料+病毒），VBL+V：（正常人工饲料+VBL+病毒），ZnCL2+V：（正常人工饲料+ZnCL2+病毒），ZnCL2+VBL+V：（正常人工饲料+VBL+ZnCL2+病毒），括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著，括号外不同的小写字母表述同列Dancun’的多重比较差异显著，谷胱甘肽S转移酶活性(GST)表现差异性（表18）。取食正常人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性在96h后表现为最高，在48h后表现为最低。在24h时，各处理对中肠GST的影响没有显著差异。在48h时，各处理对中肠GST的影响没有显著差异。在72h时，添加ZnCl2感染病毒和添加VBL和ZnCl2感染病毒对中肠GST影响更大，与对照差异显著，增高分别0.635、0.401mmoL/mgpro。在96h时，VBL、ZnCl2对中肠GST影响表现为活性增加，与对照差异显著，分别增高0.329、0.225mmoL/mgpro。同时，VBL，ZnCl2和病毒及VBL、ZnCl2和病毒对中肠GST影响表现为活性低，与对照差异显著，分别减少0.645、0.193、0.573mmoL/mgpro。VBL对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第96h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，增高4.8倍。ZnCl2对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第48h和96h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高6.2、13.6倍。病毒对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第48h和96h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高7.4、9.4倍。ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第72h和96h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高9.85和5.4倍。VBL、ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第48h和72h时表现 44舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高2.4和4.6倍。3.4.2.1不同成分对舞毒蛾幼虫中肠GST比较中肠GST对照ckVBLa1.6（*(b)1.41.2*(b)1）(a,b)GSTActivity0.8(a)0.6a(a)(a)(a)(a)0.4转移酶活力mmol/mgproS0.2024h48h72h96h谷胱甘肽病毒感染时间Treattime(h)图16单独添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应Fig.16addVBLfeedthegypsymothlarvaemidguteGSTactivitytimeeffect注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼中肠巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图16）。取食单独添加VBL在第24h时，与对照没有差异显著。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，与对照没有差异显著。在第96h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.048），其活性为1.17mmoL/mgpro，比对照增加0.329mmoL/mgpro。取食正常人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性在96h后表现为最高，在48h后表现为最低；取食单独添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱肽S转移酶活性在96h后活性最高，与对照差异显显著，增高0.329mmoL/mgpro，与24h时的中肠GST显著差异（Ρ=0.01），增加4.8倍。在24h最低，与对照差异显显著，减少0.05mmoL/mgpro。 内蒙古农业大学博士学位论文45中肠GST对照ckZnCI2b1.4(c)1.2(b)1(a,b)）(a,b)GSTActivity0.8(b)0.6*(a)(a)转移酶活力mmol/mgpro0.4S*(a)（0.2谷胱甘肽024h48h72h96h病毒感染时间Treattime(h)图17单独添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应Fig.17addzincchlorideartificialfeedthegypsymothlarvaeofmidguteGSTactivitytimeeffect注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼中肠巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图17）。取食单独添加氯化锌ZnCl2在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.015），其活性为0.08mmoL/mgpro，比对照减少0.21mmoL/mgpro。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，与对照没有差异显著。在第96h时，与对照没有差异显著。取食了单独添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性在96h后活性最高，与对照差异显显著，增高0.252mmoL/mgpro，在24h最低，与对照差异显显著，减少0.11mmoL/mgpro。中肠GST对照ckLdNPVc1.2(b)1(b)GSTActivity）0.8(a,b)*(b)(a,b)0.6*(a)*(a)转移酶活力mmol/mgpro0.4S（*(a)0.2谷胱甘肽024h48h72h96h病毒感染时间Treattime(h)图18单独病毒感染的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应Fig.18virusinfectionofgypsymothlarvaeinthemidguteGSTactivitytimeeffect 46舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼中肠巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图18）。取食单独添加LdNPV在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.014），其活性为0.075mmoL/mgpro，比对照减少0.215mmoL/mgpro。在第48h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.139），其活性为0.556mmoL/mgpro，比对照增加0.288mmoL/mgpro。在第72h时，与对照没有差异显著。在第96h时，与对照没有差异显著。取食单独病毒感染的舞毒蛾幼虫中肠谷胱肽S转移酶活性在96h后活性最高，与对照组有显著差异，减少0.033mmoL/mgpro，在24h最低，与对照差异显显著，减少0.115mmoL/mgpro。图19病毒感染添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱甘肽S转移酶活性的时间效应Fig.19AddVBLvirusmixturefeedthegypsymothlarvaeofmidguteGSTactivitytimeeffect注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼中肠巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图19）。取食LdNPV感染添加荧光素VBL在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.115），其活性为0.124mmoL/mgpro，比对照减少0.166mmoL/mgpro。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.186），其活性为0.314mmoL/mgpro，比对照减少0.233mmoL/mgpro。在第96h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ 内蒙古农业大学博士学位论文47=0.006），其活性为0.196mmoL/mgpro，比对照减少0。645mmoL/mgpro。取食病毒感染添加荧光素人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱肽S转移酶活性在72h后的活性最高，与对照差异显显著，减少0.233mmoL/mgpro，在24h最低，与对照差异显显著，减少0.166mmoL/mgpro。图20病毒感染添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱肽S转移酶活性的时间效应Fig.20AddzincchloridevirusmixturefeedgypsymothlarvaeinthemidguteGSTactivitytimeeffect注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼中肠巴谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图20）。取食LdNPV感染添加氯化锌ZnCl2在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.024），其活性为0.120mmoL/mgpro，比对照减少0.17mmoL/mgpro。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.024），其活性为1.182mmoL/mgpro，比对照增高0.635mmoL/mgpro。在第96h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.279），其活性为0.648mmoL/mgpro，比对照减少0.193mmoL/mgpro。取食病毒感染添加氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱肽S转移酶活性在72h后的活性最高，与对照差异显显著，增高0.635mmoL/mgpro，在24h最低，与对照差异显显著，减少0.17mmoL/mgpro。 48舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响图21病毒感染添加荧光素和氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱肽S转移酶活性的时间效应Fig.21AddVBLandzincchloridevirusmixturefeedthegypsymothlarvaeinmidguteGSTactivitytimeeffect注：*：单因素方差分析差异显著、括号里不同的小写字母表述同行Dancun’的多重比较差异显著舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾四龄幼中肠谷胱甘肽S转移酶活性表现差异性（图21）。取食LdNPV感染添加荧光素VBL和氯化锌ZnCl2在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.408），其活性为0.206mmoL/mgpro，比对照减少0.084mmoL/mgpro。在第48h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.136），其活性为0.511mmoL/mgpro，比对照增高0.243mmoL/mgpro。在第72h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.077），其活性为0.948mmoL/mgpro，比对照增高0.401mmoL/mgpro。在第96h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.01），其活性为0.268mmoL/mgpro，比对照减少0.573mmoL/mgpro。病毒感染添加荧光素和氯化锌人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠谷胱肽S转移酶活性在72h活性最高，与对照差异显显著，增高0.401mmoL/mgpro，在24h最低，与对照差异显显著，减少0.084mmoL/mgpro。3.4.2.2小结取食正常人工饲料的舞毒蛾幼虫中肠GST活性的影响:在96h后表现为最高，在48h后表现为最低。在24h时，各处理对中肠GST的影响没有显著差异。在48h时，各处理对中肠GST的影响没有显著差异。在72h时，添加ZnCl2感染病毒和添加VBL和ZnCl2感染病毒对中肠GST影响更大，与对照差异显著，增高分别0.635、0.401mmoL/mgpro。 内蒙古农业大学博士学位论文49VBL对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响:在第96h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，增高4.8倍。ZnCl2对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第48h和96h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高6.2、13.6倍。病毒对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第48h和96h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高7.4、9.4倍。ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第72h和96h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高9.85和5.4倍。VBL、ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第48h和72h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高2.4和4.6倍。取食单独添加氯化锌ZnCl2的影响：在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.015），其活性为0.08mmoL/mgpro，比对照减少0.21mmoL/mgpro。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，与对照没有差异显著。在第96h时，与对照没有差异显著。取食单独LdNPV的影响：在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.014），其活性为0.075mmoL/mgpro，比对照减少0.215mmoL/mgpro。在第48h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.139），其活性为0.556mmoL/mgpro，比对照增加0.288mmoL/mgpro。在第72h时，与对照没有差异显著。在第96h时，与对照没有差异显著。取食LdNPV感染添加荧光素VBL的影响：在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.115），其活性为0.124mmoL/mgpro，比对照减少0.166mmoL/mgpro。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.186），其活性为0.314mmoL/mgpro，比对照减少0.233mmoL/mgpro。在第96h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.006），其活性为0.196mmoL/mgpro，比对照减少0。645mmoL/mgpro。取食LdNPV感染添加氯化锌ZnCl2的影响：在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.024），其活性为0.120mmoL/mgpro，比对照减少0.17mmoL/mgpro。在第48h时，与对照没有差异显著。在第72h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.024），其活性为1.182mmoL/mgpro，比对照增高0.635mmoL/mgpro。在第96h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.279），其活性为0.648mmoL/mgpro，比对照减少0.193mmoL/mgpro。取食LdNPV感染添加荧光素VBL和氯化锌ZnCl2的影响：在第24h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.408），其活性为0.206mmoL/mgpro，比对照减少0.084mmoL/mgpro。在第48h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.136），其活性为0.511mmoL/mgpro，比对照增高0.243mmoL/mgpro。在第72h时，显著增加了舞毒蛾四龄幼虫中 50舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.077），其活性为0.948mmoL/mgpro，比对照增高0.401mmoL/mgpro。在第96h时，显著减少了舞毒蛾四龄幼虫中肠GST酶活性（单因素方差分析，Ρ=0.01），其活性为0.268mmoL/mgpro，比对照减少0.573mmoL/mgpro。4.结论与讨论4.1结论(1)核型多角体病毒的最佳复配剂是添加1%浓度的荧光素和0.1%的氯化锌，对LdNPV有增效和光保护作用。(2)核型多角体病毒的最佳复配剂对舞毒蛾二龄幼虫死中浓度（LC50）为106.40Bs/µL，LC90为6457.40Bs/µL，浓度为390Bs/µL时，致死中时间LT50为13.12d，浓度为3900Bs/µL时，LT50为9.37(8.461-10.278)d。(3)LdNPV的最佳复配剂对舞毒蛾雄有一定的亚致死作用。羽化率，产卵量,卵块重量降低，而且浓度越高，降低越明显。显著缩短雄性幼虫历期。(4)VBL、ZnCl2、病毒和ZnCl2及单独病毒对舞毒蛾4龄幼虫的中肠，血淋巴GST酶有显著差异，特别是在第72h时活性显著增加。VBL，ZnCl2和病毒对舞毒蛾4龄幼虫中肠GST的影响比血淋巴GST的影响显著差异。VBL、ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫血淋巴GST的影响在第72h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，增高3.7和7.2倍。VBL、ZnCl2和病毒对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第48h和72h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高2.4和4.6倍。4.2讨论（1）有关荧光素对病毒的增效机理研究较少，Sheppard等认为TinopalLPW对[121]。根据相关实验研究LdMNPV的增效作用可能与其使昆虫中肠pH值下降有关结果表明，荧光增白剂具有病毒增强剂的功用。比较具有代表性的证明就是荧光增[65]白剂可以有效降低昆虫病毒的LT50和LC50值。研究表明，昆虫病毒系统的不同导[96-102]致荧光增白剂所起到的效果也不同。NeelamNarang等于使用新泽西株L.dispar进行的昆虫体内生物测定研究表明，将法国、韩国和北美的L.disparMNPV（LdMNPV）[59]对菌株的对比显示，北美菌株的活性最高，而法国菌株的活性最低。在1％荧光增白剂的作用下，实验中所有菌株的病毒效力均提高了200至1300倍。昆虫肠中存在的荧光增白剂能有效抑制细胞死亡和推动抑制感染的中肠细胞脱落，从而促进病[58]毒复制，并且会提高舞毒蛾幼虫中LdMNPV活性。1%的TinopalLPW作为增效剂，其毒力可增加24-33倍。TinopalLPW可明显增加LdMNPV对紫外线的耐受力，在30W的紫外灯下40cm处照射16h可保持原有致病力的36%-53%[75]。实验结果表明,当病毒中添加1%浓度的荧光增白剂和0.1%浓度的氯化锌时，对舞毒蛾的杀伤 内蒙古农业大学博士学位论文51率比正常人工饲养时高3倍，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为67.7%，相较之下，该浓度的荧光增白剂和氯化锌对提高舞毒蛾感病幼虫死亡率最有效。处理M1，未添加荧光素和氯化锌，仅单独利用病毒，即在正常人工饲料的情况下，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为23.3%；处理M2，病毒中添加0.5%浓度的荧光素，并伴有6h紫外灯照射，因紫外线不利于病毒生长，所以，此情况下，病毒对舞毒蛾的死亡率比正常人工饲料的情况降低7倍，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为3.6%；处理M3，病毒中添加1%浓度的荧光素，并伴有12h紫外灯照射，病毒对舞毒蛾的死亡率比正常人工饲料的情况降低2倍，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为10.3%；说明荧光素的浓度对病毒增效起到了作用，并且紫外线对病毒生长起到阻碍作用。处理M4，病毒中添加1%浓度的荧光素和0.1%的氯化锌，并伴有6h紫外灯照射，此情况下，病毒对舞毒蛾的杀伤率比正常人工饲料的情况提高3倍，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为67.7%。说明此种结构配置的实验处理对提高舞毒蛾感病幼虫死亡率最有效。处理M5，病毒中添加0.1%浓度的氯化锌，并伴有12h紫外灯照射，病毒对舞毒蛾的杀伤率比正常人工饲料的情况降低2倍，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为10.3%。实验处理5与处理3的结果数据相同，由此可知，病毒中添加1%的荧光素和添加0.1%浓度的氯化锌的实验效果相同。处理M6，病毒中添加0.5%浓度的荧光素和0.1%的氯化锌，无紫外灯照射，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为16.7%，说明此种处理时病毒对舞毒蛾的杀伤率比正常人工饲料略有降低，这与所添加荧光素和氯化锌的浓度降低有关。处理M7，病毒中添加0.5%浓度的荧光素和1%的氯化锌，并伴有12h紫外灯照射，此情况下，病毒对舞毒蛾的杀伤率比正常人工饲料的情况提高10%，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为33.3%，稍有提高。处理M8，病毒中添加1%浓度的荧光素和1%的氯化锌，无紫外灯照射，此情况下，病毒对舞毒蛾的杀伤率比正常人工饲料的情况提高2.3倍，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为55.7%。处理M9，病毒中添加1%的氯化锌，并伴有6h紫外灯照射，此情况下，舞毒蛾感病幼虫的死亡率为25.6%，与正常人工饲料的情况相似，略有提高。（2）张丽红、韩金等的研究证明，添加荧光增白剂的FB-28病毒感染3龄末甜菜4-17-1夜蛾幼虫,其LC50为5.18×10mL,而单剂感染甜菜夜蛾幼虫的LC50为2.31×10mL,7-1后者比前者增效约448倍，当病毒浓度为1.55×10mL时,加有FB-28的LT50为4.6d,[45]单剂量的病毒感染3龄幼虫的LT50为7.0d,死亡时间加快了34.3%。阿地力等研567究表明，在8.3×10、8.3×10、8.3×10PIB/mL3个浓度的VBL荧光增白剂加入后，[71]春尺蠖的死亡率分别提高了20%、35%、30%,死亡高峰期提前1d左右。LdMNPVD、J和H3个地理品系的亚洲型舞毒蛾幼虫食用了添加过1%浓度TinopalLPW的青杨后，LC50比不添加TinopalLPW的LC50分别降低了33、24和61倍。添加1%浓度的TinopalLPW在距离40cm的紫外灯下照射16h后,它们保持的病毒活性比未添加[75]TinopalLPW的分别高1.8、2.6和1.8倍。绿原酸对ＬｄＮＰＶ对舞毒蛾２龄幼 52舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响虫致死中浓度（LC50）为161.80Bs/µL，对取食正常人工饲料的舞毒蛾幼虫LC50为264.40Bs/µL，二者LC50及ＬＣ5095％的置信区间重叠度均小于50%，说明二者之间差异显著，添加绿原酸使ＬｄＮＰＶ的毒力提高了1.6倍[80]。但在本实验舞毒蛾幼虫取食添加1%荧光增白剂VBL与0.1%氯化锌（ZnCl2）的LdNPV对舞毒蛾２龄幼虫致死中浓度（LC50）为106.40Bs/µL，LC90为6457.40Bs/µL，对他们研究的正常人工饲料的舞毒蛾幼虫ＬＣｓｏ差异显著，添加复配剂使ＬｄＮＰＶ的毒力提高了2.5倍。舞毒蛾幼虫取食添加绿原酸人工饲料，ＬｄＮＰＶ浓度为5900Bs/µL时，致死中时间LT50为9.9ｄ，但我们研究添加复配剂的病毒浓度为3900Bs/µL时，LT50为9.37d，说明二者之间没有差异显著。荧光素VBL-LdNPV地理品系-舞毒蛾种型-寄主植物系统中各因素间的相互作用及其机理还有待深入研究。（3）添加荧光增白剂和氯化锌的不同浓度病毒对舞毒蛾幼虫各龄的发育历期、产卯数量、蛹重、雌雄数量与酪酸物质的浓度、剂量，发育阶段、健康状况、性别、龄期，人工饲料的成分含量均存在关系。LDNPV感染不同的昆虫种类，性比会表现出很大的变化，其中也有一些种类的性比变化不显著，实验结果表明这种现象与昆虫的种类、发育状况及病毒感染剂量都有关系。Martemyanov等对舞毒蛾的3龄幼虫取食添加了多角体病毒混合物与单宁酸的禅树叶片，导致幼虫的体重有所增加；取食了单独用单宁酸处理过的白枠叶片舞毒蛾3龄幼虫，过一段时间后，雌性幼虫[106]数量增加。在核型多角体病毒对西加州天幕毛虫Malacosomacalifornicum的亚[107]致死作用的研究中发现，龄期大的幼虫被感染后，雌性蛹重明显降低。棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫的感染会因绿原酸结合与病毒阻塞体而明显降低。当棉铃虫食用番茄叶片时，在碱性条件下，绿原酸作为一种氧化剂与棉铃虫多角体病毒阻塞体结合，使其溶解率、消化率明显降低，这种结合与减小感染性病毒在中肠的释放过程中相抵触，促进了核型多角体病毒的释放，取食NPV与绿原酸、芸香酸混合[108]饲料后，相较于单独感染病毒的棉铃虫的存活时间会延长。酪酸物质的含量与[109-110]棉铃虫和烟草天蛾幼虫的存活量、増长量均没有明显的相关性。Carlos等人证明，酪酸物质混合与单独敵酸处理相比，对幼虫、幼虫体重、蛹的发育历期、成虫的患病率、崎形率影响较大；而对化蛹率、蛹重、脖化率及死亡率影响不大；绿原酸与黄铜类物质混合后，虫重减小；绿原酸芸香巧、与儿茶酸结合，使幼盛蛹期缩短；绿原酸与香豆酸结合，使幼虫体重变最小。几种酪酸物质混合，模拟植物叶片中化合物的含量，在测定植物体或叶片敵类物质主要含量的基础上，研究几种组合[109]对植食性昆虫的生长发育的影响是否存在差异还需要进一步的研究。但在本研究表明加入荧光增白剂VBL和氯化锌（ZnCl2）的LdNPV对舞毒蛾幼虫有亚致死作用。雄性幼虫历期较对照缩短,不同病毒浓度下雄性幼虫历期较对照的缩短2-5d。随病毒浓度的升高，复配剂使舞毒蛾雌雄化蛹率、羽化率、产卵数量、卵块重量减少， 内蒙古农业大学博士学位论文53且浓度越高，减少的越明显。取食未添加荧光增白剂和氯化锌的人工饲料的舞毒蛾与已被病毒感染的舞毒蛾单雌产卵量差异明显，比对照显著降低。（4）杨海灵等认为谷胱甘肽S－转移酶是广泛分布在生物体内的一种重要的解毒酶，其主要的功能是，催化还原性谷胱甘肽(GSH)的硫醇基与某些内源性或外来有害物质的亲电性底物相结合，进而增加其可溶性，使其易于从细胞膜排出，保护核酸和蛋白质免受亲电基团攻击，从而达到解毒的目的[111]。已有研究显示，不同的次生物质对昆虫体内谷胱甘肽S－转移酶比活力有不同的影响，某些植物次生物质可以抑制谷胱甘肽S－转移酶的比活力，如苦豆子生物碱[112]，而某些植物次生物质可激活谷胱甘肽S－转移酶的活性，如芸香甙等[113]。鲁绍伟在研究中认为，随着时间的延长,谷胱甘肽S-转移酶的活性升高，可能是因为谷胱甘肽能与高反应性的化合物结合,使其解毒所导致。谷胱甘肽S-转移酶的功能是使有毒的内源性的GSH与亲电试剂相结合,保护其他的亲核的中心(如蛋白质和核酸等)。从而可能导致酶活性的升高。取食抗虫杨Pb33、Pb1和Pb47叶片24h后的舞毒蛾幼虫中肠内的谷胱甘肽S-转移酶的比活力，分别比取食正常叶片24h后的舞毒蛾幼虫中肠内的谷胱甘肽S-转移酶比活力下降了25.7%、27.7%和17.9%,其中Pb47的抗虫性较Pb1和Pb33的更低。另外,用抗虫杨树饲养过幼虫12、24、48h后,昆虫体内的酶的活力随着时间的延长酶的比活力升高[94]。冯春富用含烟碱、辣椒素、棉酚和番茄苷4种植物次生物质的人工饲料饲养棉铃虫5龄幼虫和烟青虫48h后发现，番茄苷能够有效的抑制烟青虫的取食和生长，但对幼虫体内谷胱甘肽S－转移酶活力没有影响[95]。当舞毒蛾幼虫暴露于镉环境下时，GST活性与包括幼虫质量，发育持续时间，死亡率和相对生长速率等健康成分之间的负相关性系数有很大影响[114]。一个可能的原因是能源分配的过程使其能够在这样的环境条件下生存。有两种可能的解释：首先，镉可能与谷胱甘肽形成复合物并影响酶的活性[115]；第二种解释是镉金属可能与GST蛋白相结合[116]。酶的变化意味着即使低浓度的镉和短期的影响会激活幼虫体内不同的防御机制（APOX，金属硫蛋白）或通过与谷胱甘肽结合间接减弱GST活性。研究表明，当4龄Lymantriadistar幼虫暴露于50µgCd/g的谷胱甘肽中，其APOX活性增加，谷胱甘肽浓度降低。通过抗坏血酸过氧化的反应，谷胱甘肽可被重新定义为一种更有效且更便宜的过氧化物消除方法[117]。镉与与谷胱甘肽结合引起的直接GST抑制作用更加明显。表型可塑性，是生物体应对环境变化的主要方式之一。相同条件下，具有较大的适应性和可塑性的物种有更好的存活机会。侵入性物种的可塑性比无创性物种大[118]。VesnaPERIĆ研究证明了生长素释放肽可以促进抗氧化酶和GST活性，并有效增加GSH含量。Ghrelin（胃饥饿素，一种胃肠道激素）可以增加吉普赛蛾的摄食量，同时通过保护中肠结构免受潜在的亲氧化性植物防御，参与提高抗氧化防御和GST活性。这些结果证明了Lymantriadispar中肠组织中抗氧化的方式与生长素释放肽之间的相关性，从而提供了将昆虫应用为简单模型系统，用于将来研究Ghrelin 54舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响在复杂生物体自由基保护中的潜在作用的可能[113]。MilenaVlahovi´c,在镉处理期间检测的20个种类中GST活性的可塑性响应通常是均匀的。表型可塑性的指标的负值指向镉在与之对应的可塑性方向[89]。张海玲等在研究中认为，烟青虫幼虫血淋巴中的体液免疫和细胞免疫在HeasNPV侵染防御中发挥了重要的作用，幼虫感染病毒后通过PO活性的升高和血细胞数量的增加来清除外来病原物[119]。本实验，VBL+ZnCl2+病毒复配剂和ZnCl2+病毒对舞毒蛾4龄幼虫的中肠、血淋巴GST酶活性有显著差异，比对照组（单独病毒）的酶活性增高，在第72h时表现为活性增加最大，达到显著差异。VBL+ZnCl2+病毒对舞毒蛾幼虫血淋巴GST的影响在第72h时表现为活性增加，24h时的血淋巴GST活性也显著增加，分别比单独病毒的增高3.7和7.2倍。VBL+ZnCl2+病毒复配剂对舞毒蛾幼虫中肠GST的影响在第48h和72h时表现为活性增加，与24h时的中肠GST显著差异，分别增高2.4和4.6倍。4.3论文的创新点（1）LdNPV添加荧光素和氯化锌的研究，在国内外尚未见有报道。（2）首次研究了舞毒蛾核型多角体病毒复配剂及其组分对舞毒蛾4龄幼虫的谷胱甘肽S转移酶活性的影响。 内蒙古农业大学博士学位论文55致谢光阴荏苒，时光飞逝，转眼间我博士的学习生活即将结束，在这4年的学习时间里，我受益匪浅，在认真学习汉语的同时，经过无数次的探讨与修改，终于完成了博士毕业论文，回首这段时间，从论文选题、实验设计，到实验的每一个进程、数据整理、调研、实验结构分析、思考才撰写、修改，我得到了许多人的关心和帮助，在此向他们表示我最诚挚的谢意。我首先要衷心感谢我的导师段立清教授，她带了我4年，从大一开始就悉心教导我，给了我极大的鼓励与支持，段老师总是不厌其烦的指点我，正因为老师的指点意见，使我在论文撰写过程中没有迷失方向，她严谨的治学之风和对事业孜孜追求将会影响和激励我的一生，借此机会我向老师说一声：您辛苦了！愿我亲爱的导师身体健康，工作顺利！其次我要感谢的是昆虫实验室的刘海晶，张波波，李婷，万炜，戴文昊等师弟师妹们对我实验的帮助和支持。祝福大家学业有成，快乐，幸福，好运！最后要感谢我的学校和学院，和在这4年中悉心教导培养过我的老师们，还有我的父母，丈夫，给我们这样一个机会，为我提供了一个好的学习环境，给予我很大的鼓励，使我可以进一步提升自己的能力和水平。有了你们的支持，今后我一定会更加努力，取得更多的成果，希望我的家人身体健康，平安快乐！ 56舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响参考文献1中国检验认证（集团）有限公司版权所有“亚洲型舞毒蛾（AsianGypsyMoth）基本知识”首都信息发展股份有限公司技术支持WWW.CCIC.COM2М.Цэрэнням.Бэлчээрийнхортоншавьжтайтэмцсэнаргынинноваци,түүнийчигхандлага[M].МонголулсынХөдөөажахуйнсургууль,2010.3王爱萍“食叶害虫舞毒蛾危险性分析”林业有害生物防治,2015,(1):41-42.4丁雪梅.伊犁河谷杨树舞毒蛾的防治技术[J].新疆农业科技,2017,(第1期)15-20.5丁峰,高宗川.舞毒蛾生物学特性观察及综合防治技术研究[J].中国林副特产,2016,15(144):36-37.6冉亚丽.北票市主要林业有害生物危害现状及防治对策[J].吉林林业科技,2017,46(3)26-28.7钟锋,韩宙,黄其亮.我国舞毒蛾防治技术的研究进展[J].世界农药,2015,37(3):33-53.8陈立坤,张永安,王玉珠,曲良建,张志林,严善春.Bt和LdNPV混用对舞毒蛾幼虫毒杀效果的研究[J].中国森林病虫,2013,32(3)36-39.9徐健，肖强，殷向东．苏云金杆菌与EoNPV混用的增效作用［J］．江苏农业学报，2006，22(3):243－247．10Doane,C.Primarypathogensandtheirroleinthedevelopmentofanepizooticinthegypsymoth[J].InvertebratePathology,1970,15:21–23.11Podgwaite,J.Reardon,R.Walton,G.Venables,L.Kolodny-Hirsch.EffectsofaeriallyappliedGypchekongypsymothpopulationsinMarylandwoodlots.[J].EconomicEntomoLogy,1992,85:1136–1139.12东北林学院.舞毒蛾核型多角体病毒的应用研究（内部资料）1982.13RichardReardon,JohnPodgwaite,RogerZerillo.GYPCHEKBioinsecticideforGypsyMothControlinForestedEcosystemsandUrbanCommunities[M].ForestHealthTechnologyEnterpriseTeam,2016.14Hajek,A.Fieldidentificationofthegypsymothnuclearpolyhedrosisvirus(NPV)[J].USDAForestServiceNA-PR-01-94.Radnor,PA,1994.15Podgwaite,J.;Shields,K.;Zerillo,R.;Bruen,R.1979.Environmentalpersistenceofthenucleopolyhedrosisvirusofthegypsymoth[J].EnvironmentalEntomoLogy,1979,8:523–536.16Woods,S.;Elkinton.Bimodalpatternsofmortalityfromnuclearpolyhedrosisvirusingypsymothpopulations[J].InvertebratePathology,1987,50:151–157.17Lautenschlager,R.;Podgwaite,J.Passageratesofnucleopolyhedrosisvirusbyavianandmammalianpredatorsofthegypsymoth[J].EnvironmentalEntomoLogy,1979,8:210–214.18Reardon,R.;Podgwaite,J.Disease-parasitoidrelationshipsinnaturalpopulationsofLymantriadisparintheNortheasternUnitedStates[J].Entomophaga,1976,21:333–341.19Raimo,B.;Reardon,R.;Podgwaite,J.VectoringgypsymothnucleopolyhedrosisvirusbyApantelesmelanoscelus[J].Entomophaga，1977，22:207–215. 内蒙古农业大学博士学位论文5720董仲生.荧光增白剂VBL国家标准GB/T10661-2003简介[M].化工标准.计量.质量,2004,10:7-31.21许夕峰，宋艳茹，竹百均，等．双三嗪氨基二苯乙烯类型荧光增白剂新结构品种[J]．精细化工原料及中问体，2007，(8):12－15．22宋艳茹，竹百均，蔡定汗，等．三聚氯氰在荧光增白剂工业中的应用与展望[J]．染料与染色，2006，43(5):34－38．23潘可亮，刘勇，杨利等．荧光增白剂VBL的荧光光谱及测定方法研究[J]．化学研究与应用，2010，22(9):1210－1211．24肖刚，王景国．染料工业技术[M]．北京:化学工业出版社，2004:204－248．25王海涛,张小慧,曲志勇,曲霞.荧光增白剂检测方法研究进展[J].化学分析计量,2016.26杜美霞.荧光增白剂VBL和β—胡萝卜素的分析方法研究[M].浙江工商大学，2011。27张红兵，吕荣文.日光照射对荧光增白剂VBL顺-反异构现象影响的研究[J]。染料与染色，2004，41（5）：259-278.28尚金燕,王冰,刘训理,崔为正,吴小锋,张志芳.荧光增白剂VBL增进重组植酸酶病毒食下感染率的研究[J].中国蚕学会,会议论文集,2004,11.29两种毒蛾核型多角体病毒病的初步观察[J].辽宁林业科技,1977,152(4):24-25.30中国林业科学研究院林业科学研究所,中国农业科学院原子能利用研究所.舞毒蛾核型多角体病毒的初步研究[J].中国林业科学,1978,(3):44-46.31B.Raimo,R.C.Rardon,J.D.Podgwait,王同学.黑绒茧蜂传播舞毒蛾核型多角体病毒[J].湖南林业科技,1978,(5):41-43.32许文儒,高三俊,李敬涛.用核型多角体病毒防治舞毒蛾的研究[J].蚕业科学,1979,5(3):130-133.33三种林木害虫病毒简报[J].林业科技通讯,1980,(3):26-27.34许文儒,高山俊,李敬涛,岳书奎,侯爱菊,刘惠敏,毕庶春,张兴达,齐仁礼,高尚士,阎聚环.午毒蛾核型多角体病毒防治柞树害虫午毒蛾的研究简报[J].辽宁农业科学,1980,(3)26-29.35韩龙雄,杨淑荣,武银莲,杨盛华.舞毒蛾核型多角体病毒的观察[J].延边大学农学学报,1983,1(13):15-18.36岳书奎,王志英.舞毒蛾核型多角体病毒NPV流行病的初步研究[J].东北林业大学学报,1984,12(A1):110-114.37徐硕,何纪.应用病毒防治舞毒蛾[J].新农业,1985,(8):29.38侯爱菊,岳书奎,王志英,张国财,安成才,许文儒,李敬涛,戚奎恩,裴玉燕,齐人礼,徐硕,高久芳,何纪.舞毒蛾(LymantriadisparL.)核型多角体病毒(NPV)的生产[J].东北林业大学学报,1985,3(A1):2-7.39岳书奎,候爱菊,王志英,毕遮春,张兴达,王丽霞.舞毒蛾核型多角体病毒对人和几种脊椎动物的安全试验[J].东北林业大学学报,1986,14(3):107-115.40R.A.Lautenschlager,J.,D.,Podgwaite,陈宏贞.鸟和高等动物对传播舞毒蛾核型多角体病毒的作用[J].林业实用技术,1986,(5).41陈昌洁,康建新.新疆舞毒蛾核型多角体病毒的发现与鉴定[J].林业实用技术,1986,(9).42丁翠,马可.用免疫金颗粒标记鉴定舞毒蛾核型多角体病毒的抗原[J].昆虫学报,1991,34(1):7-13. 58舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响43丁翠,马可.舞毒蛾核型多角体病毒亚致死剂量对舞毒蛾幼虫的影响[J].昆虫学报,1993,36(3):272-275.44周建华,赵蓉,郭亨孝,黄祖惠,孔玲,曾启湘.舞毒蛾核型多角体病毒毒力生物测定[J].四川林业科技,1999,20(3)15-17.45周建华.舞毒蛾核型多角体病毒杀虫剂对小白鼠的安全试验[J].四川林业科技,2000,21(3)43-47.46张传溪,林欣大,吴峻.棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶基因及杆状病毒几丁质酶基因的分子进化[J].昆虫学报,2000,43(3):233-241.47林同,刘宽余,王志英,于霞.舞毒蛾核型多角体病毒的基因及其在害虫防治中的应用[J].东北林业大学学报,2002,30(2):24-29.48张国财,王月杰,杨晓光.ControlofLymantriadisparL.byBiologicalAgents[J].林业研究(英文版),2005,6(2):158-160.49朱丽春,段立清,特木钦,宋钢.舞毒蛾核型多角体病毒3个地理品系的毒力比较[J].中国森林病虫,2008,27(5)4-6.50陶婧,韩崇选,张永安,王玉珠,曲良建,王青华.舞毒蛾核型多角体病毒PCR检测技术的建立[J].林业科学研究,2012,25(5):616-619.51田继丽,刘音,刘玥.舞毒蛾生物学特性及综合防治措施探讨[J].农民致富之友,2015,12(24):169.52Shaprio,M.andBell.R.A.(1982).EnhancedeffectivenessofLymantriadisper(Lepidoptera:Lymantriidae)nucleopolyhedrosisvirusformulatedwithboricacid.Ann.EntomoL.Soc.Am.75:346-349.53ShaprioM.Useofopticalbrightenersasradiationprotectantsforgypsymoth(Lepidoptera:Lymamtriidae)nuclearpolyhedrosisvirus[J].EconEntomoL,1992,85(5):1682-1686.54BischoffDS,SlavicekJM.moLecularanalysisofanenhancingeneinthelymantriadisparnuclearpolyhedrosisvirus[J].Virol,1997,71:8133-8140.55[BischoffDS,SlavicekJM.OverexpressionofLymantriadisparMNPVenhancingene.AbstractfromSociforInvertebrPathol30thAnnuMeeting.Canada.1997.56MagdaKhattab.ComparativestudyontheEfficacyofAgrotissegetumGranulosisvirus(AgseGVEG)againstAgrotisipsilonundersemi-fieldconditions[J].Egypt.Acad.J.Biolog.Sci.,2013,6(3):21-30.57Li,S.Y.andOtvos,I.S.Opticalbrightenersenhanceactivityofanuclearpolyhedrosisvirusagainstwesternsprucebudworm(Lepidoptera:Tortricidae).[J].Econ.EntomoL.,1999,92(2):335-339.58MartinShapiro,RobertArgauer.RelativeEffectivenessofSelectedStilbeneOpticalBrightenersasEnhancersoftheBeetArmyworm(Lepidoptera:Noctuidae)NuclearPolyhedrosisVirus[J].Econ.EntomoL.,2001,94(2):339-343.59NeelamNarang,FranckHerard,EdwardM.Dougherty,KimChen,FemandoE.Vega.Agypsymoth(Lymantriadispar.,Lepidoptera:Lymantriidae)multinucleocapsidnuclearpolyhedrosisvirusfromFrance:comparisonwithaNorthAmericanandaKoreanstrain[J].EntomoL,2001,98:189-194.60EdwardM.Dougherty,NeelamNarang,MarciaLoeb,DwightE.Lynn,MartinShapiro.Fluorescentbrightenerinhibitsapoptosisinbaculovirus-infectedgypsymoth 内蒙古农业大学博士学位论文59larvalmidgutcellsinvitroBiocontrolScienceandTechnology,2006;16(1/2):157-168.61马永平,欧洋,孟小林,徐进平,叶林柏.杆状病毒增效蛋白研究进展[J].中国病毒学,1999,14(3)185-189.62郭君慧,杨红,彭建新,洪华珠.荧光增白剂对芹菜夜蛾核型多角体病毒的增效作用[J].中国生物防治,2002,18(3):144.63郭慧芳,方继朝,韩召军.昆虫病毒增效剂研究进展[J].昆虫学报,2003,46(6):766-772.64郭君慧,彭建新,洪华珠.几种荧光增白剂对SfaMNPV的增效作用[J].植物保护学报,2004,31(1)111-112.65张丽红,韩金,金利容,彭建新,洪华珠.荧光增白剂对重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的增效作用[J].应用与环境生物学报,2004,10(5):609-613.66周建华,胡应之,肖育贵,肖银波,郭亨孝.荧光增白剂TinopalLPW对蜀柏毒蛾核型多角体病毒增效作用研究[J].中国病毒学,2006,21(3)：273-276.67徐健，肖强，殷向东．苏云金杆菌与EoNPV混用的增效作用［J］．江苏农业学报，2006，22(3):243-247．68杨孔，武红贤，李娟，葛春花，孙厚成，周建华，刘少英.荧光增白剂UBL对蜀柏毒蛾核型多角体病毒增效作用研究[J].四川动物2007，26（3）：638-640.69仲国立,龚玉梅,侯玉霞,张永安,曲良建,王玉珠.氧苦·内酯、荧光增白剂等对茶尺蠖核型多角体病毒杀虫活性的增效作用[J].中国森林病虫,2008,27(6):3-5.70陈涛,王俊平,李淑文,周洪旭,李国勋.荧光增白剂和增效蛋白对粘虫核型多角体病毒的增效作用[J].华北农学报,2008,23(4):23-27.71阿地力，沙塔尔，张新平，玛依拉.荧光增白剂对春尺蠖核型多角体病毒的增效作用研究[J].新疆农业大学学报,2008,31(2):67-70.72杨唯一,张永安,唐明,王玉珠,曲良建,薛建杰.三种荧光增白剂对HcNPV增效作用研究[J].林业科学研究,2009,22(5):736-739.73文亮,周建华,郭亨孝,刘应高.几种对蜀柏毒蛾核型多角体病毒增效的添加剂研究[J].林业科学研究,2009,22(6):878-882.74杨高鹏,段立清.,宫玉艳，杨帆，孙彦宏，荧光增白剂、寄主植物、LdNPV地理品系对舞毒蛾幼虫酚氧化酶的影响[J]，林业科学，ScientiaSilvaeSinicae，2010，9期.75王树娟,LdMNPV不同地理品系致病力及荧光素作用的研究[M].内蒙古农业大学,2011,76王树娟,段立清,李海平,马涛,OtvosI.S.,ConderN.荧光素对舞毒蛾核型多角体病毒不同地理品系的增效与光保护作用[J].生态学报,2012,32(6):1796-1802.77陈立坤,张永安,王玉珠,曲良建,张志林,严善春.Bt和LdNPV混用对舞毒蛾幼虫毒杀效果的研究[J].中国森林病虫,2013,32(3)36-39.78梁洪柱,陈倩,田会鹏,梁晓梅.舞毒蛾核型多角体病毒室内增殖的研究[J].林业科学研究,2013,26(5):593-597.79A.Mehrvar.荧光增白剂对伊朗核型多角体病毒分离株对棉铃虫幼虫的杀虫活性的增效作用[J].昆虫学报,2013,56(6):708－714.80刘海明,周洪旭,李长友.荧光增白剂与增效蛋白对美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)的增效作用[J].农药学学报,2013,15(2):153-158.81利广规,杨欣,徐树兰,李辉,陈其津.荧光增白剂OB对甜菜夜蛾核型多角体病毒增效作用的研究[J].广东农业科学,2013,(15):101-103. 60舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响82刘海晶,段立清,李海平,冯淑军,张波波.绿原酸提高舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)的致病力[J].昆虫学报,2016,59(5):568-572.83王晓丽,李海平,贾程宇,段立清.茉莉酸诱导青杨抗性及核型多角体病毒对舞毒蛾幼虫食物利用的影响[J].林业科学,2016,52(10):96-101.84张波波,邵东华,冯淑军,策仁尼玛,段立清.丁香酸可增强LdNPV对舞毒蛾致死及亚致死作用[J].昆虫学报,2016,59(12):1348-1353.85赖创荣,徐树兰,郑常格,利广规,梁卿.荧光增白剂OB对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒增效作用的研究[J].广东化工,2017,44(350):86-87.86YangX，MargoliesDC，ZhuKY，etal．Hostplant-inducedchangesindetoxificationenzymesandsusceptibilitytopesticidesinthetwo-spottedspidermite(Acari:Tetranychidae)[J]．EconEntomoL，2001,94(2):381-387.87Yepiskoposyan,H.,Egli,D.,Fergestad,T.,Selvaraj,A.,Treiber,C.,Multhaup,G.,Georgiev,O.,Schaffner,W.,TranscriptomeresponsetoheavymetalstressinDrosophilarevealsanewzinctransporterthatconfersresistancetozinc.Nucl.AcidsRes,2006,34,4866–4877.88VesnaPERIĆ-MATARUGA,MilenaVLAHOVIĆ,MarijaMRDAKOVIĆ,DraganaMATIĆ,AnjaGAVRILOVIĆ,AleksandraMRKONJA,LarisaILIJIN.GhrelineffectsonmidguttissueantioxidativedefenseandglutathioneS-transferaseactivityinLymantriadispar(Lepidoptera)[J].TurkJBiol,2015,39:618-623.89MilenaVlahovi´c,LarisaIlijin,MarijaMrdakovi´c,DajanaTodorovi´c,DraganaMati´c,JelicaLazarevi´c,VesnaPeri´cMataruga.GlutathioneS-transferaseinthemidguttissueofgypsymoth(Lymantriadispar)caterpillarsexposedtodietarycadmium[J].EnvironmentalToxicologyandPharmacology,2006,44:13–17.90曹挥，刘素琪，王鸿雷，等．万寿菊根提取物对山楂叶螨几种酶活性的影响[J]．林业科学，2003，39(2):114－118．91黄琳瑞．甜菜夜蛾对虫酰肼抗药性选育和抗药性机理初探．中国农业大学硕士学位论文,2005．92兰亦全，赵士熙．甜菜夜蛾抗药性监测及机理[J]．福建农林大学学报:自然科学版,2004，33(1):26-29．93王建军，田大军．甲氧虫酰肼对斜纹夜蛾亚致死效应研究[J]．棉花学报，2009,21(3):212－217.94鲁绍伟，袁胜亮，周国娜，李明，马建昭，朱新玉.转双抗三倍体毛白杨对舞毒蛾幼虫中肠解毒酶的影响[J].安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(23):7200-7201,7204.95冯春富,严善春,鲁艺芳,胡晓.兴安落叶松诱导抗性对舞毒蛾幼虫解毒酶活性的影响[J].林业科学,2011,47(8)：102-107.96Adams,J.R.;Sheppard,C.A.;Shapiro,M.andTompkins,G.T.(1994).LightandelectronmicroscopicinvestigationsonthehistopathologyofthemidgutofgypsymothlarvaeinfectedwithLdMNPVplusafluorescentbrightener.J.Invertebr.Pathol.,64:156-159. 内蒙古农业大学博士学位论文6197Dougherty,E.M.;Guthrie,K.andShapiro,M.(1996).OpticalbrightenersprovidebaculovirusactivityenhancementandUVradiationprotection.BiologicalControl,7(1):71-74.98Hamm,J.J.andShapiro,M.(1992).Infectivityoffallarmyworm(Lepidoptera:Noctuidae)nuclearpolyhedrosisvirusenhancedbyafluorescentbrightener.[J].Econ.EntomoL.,85(6):2149-2152.99Shapiro,M.Useofopticalbrightenersasradiationprotectantsforgypsymoth(Lepidoptera:Lymantriidae)nuclearpolyhedrosisvirus.J.Econ.EntomoL.,1992,85(5):1682-1686.100Shapiro,M.andDougherty,E.M.EnhancementinactivityofhomoLogousandheterologousvirusesagainstthegypsymoth(Lepidoptera:Lymantriidae)byanopticalbrightener.J.Econ.EntomoL.,1994,87(2):361-365.101Shapiro,M.andRobertson,J.L.Enhancementofgypsymoth(Lepidoptera:Lymantriidae)baculovirusactivitybyopticalbrighteners[J].Econ.EntomoL.,1992,84(4):1120-1124.102Shapiro,M.andVaughn,J.L.EnhancementinactivityofhomoLogousandheterologousbaculovirusinfectioustocottonbollworm(Lepidoptera:Noctuidae)byanopticalbrightener.J.Econ.EntomoL.,1995,88(2):265-269.103DuanL,ISOtvos.InfluenceoflarvalageandvirusconcentrationonmortalityandsublethaleffectofaNucleopolyhedrovirusonthewesternSpruceBudworm(Lepidoptera:Tortricidae)[J].EnvironmentalEntomoLogy,2001,30:136-146.104董敬莎，孙晓燕，牛博英.正交和均匀实验设计方法的比较.科技视界,2013,22:78105曹传旺，高彩球编.昆虫生化与分子生物学实验室技术，哈尔滨，东北林学大学出板杜，2009，(1):50-53.106MartemyanovVV,BakhalovSA,RantalaMJ,DubovskiyIM,ShultsEE,LABelousova,StreinkovAG,andGlupovW.Theresponseofgypsymoth(LymantriadisparL.)larvaeinfectedwithnuclearpolyhedrosisvirustoinducedresistanceinbirch(BetulapendulaRoth.)[J].RussianJournalofEcology,2009,40(6):434-439.107MyersJH,PopulationoutbreaksinforestLepidoptera[J].Americanscientist,1993,81(3):240-251.108FeltonGW,DonatoK,DelVecchioR,DuffeySS.Activationofplantfoliaroxidasesbyinsectfeedingreducesnutritivequalityoffoliagefornoctuidherbivores[J].JournalofChemicalEcology,1989,15(12);2667-2694.109BiJL,FeltonGW,MurphyJB,HowiesPA,DixonRA,andLambCJ.Doplantphenolicsconferresistancetospecialistandgeneralistinsectherbivores?[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,1997,45:4500-4504.110SummersCB,FeltonGW.ProoxidanteffectsofphenolicacidsonthegeneralistherbivoreHelicoverpazea(Lepidoptera:Noctuidae):Potentialmodeofactionforphenoliccompoundsinplantanti-heerbivorechemistry[J].InsectbiochemistryandmoLecularbiology,1994,24(9):943-953.111杨海灵，聂力嘉．谷胱甘肽硫转移酶结构与功能研究进展[J]．成都大学学报，2006,25(1):19-24．112罗万春，张强．苦豆子生物碱对小菜蛾体内部分杀虫剂代谢酶活性的影响[J]．昆虫学报，2003,46(1):122-125． 62舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响113董向丽，高希武，郑炳宗．植物次生物质对棉铃虫谷胱甘肽S转移酶和乙酰胆碱酯酶的影响[J].植物保护学报，1998.25(1):72-78．114Vlahovi´c,M.,CadmiumEffectonGrowthandBiochemicalTraitsofGypsyMothLarvae(LymantriaDisparL.)[M].PhDDissertation.UniversityofBelgrade，2009.115Iscan,M.,Coban,T.,Eke,B.C.,DifferentialresponsesofhepaticmonooxygenasesandglutathioneS-transferasesofmicetoacombinationofcadmiumandnickel.Comp.Biochem.Physiol[J].CPharmacol.Toxicol.Endocrinol.1995，111,61–68.116Xu,Z.-B.,Zou,X.-P.,Zhang,N.,Feng,Q.-L.,Zheng,S.-C.Detoxificationofinsecticides:allechemicalsandheavymetalsbyglutathioneS-transferaseSlGSTE1inthegutofSpodopteralitura[J].InsectSci.2015，22,503–511.117Mircic,D.,Blagojevic,D.,Peri´c-Mataruga,V.,Ilijin,L.,Mrdakovi´c,M.,Vlahovi´c,M.,Lazarevi´c,J.,Cadmiumeffectsonthefitness-relatedtraitsandantioxidativedefenseofLymantriadisparLlarvae[J].Environ.Sci.Pollut.Res.2013，20,209–218.118Wilson,E.E.,Mullen,L.M.,Holway,D.A.Lifehistoryplasticitymagnifiestheecologicaleffectsofasocialwaspinvasion[J].Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2009,106,12809–12813.119张海玲，张玉波，周正湘.核型多角体病毒对烟青虫血淋巴的影响[J].江苏农业学报(JiangsuJ．ofAgr．Sci.)，2017，33(4):788-793.120BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinunitizingtheprincipleofproteindyebinding[J].AnalyticalBiochemistry,1976,72:248-254.121SheppardCA，ShapiroM．Physiologicalandnutritionaleffectsofafluorescentbrighteneronnuclearpolyhedrosisvirus-infectedLymantriadisparLlarvae(Lepidoptera:Lymantriidae)．BiologicalControl，1994，4(4):404-411． 内蒙古农业大学博士学位论文63附录附图1添加VBL和氯化锌感染病毒的舞毒蛾二龄幼虫附图2添加荧光素VBL感染病毒的舞毒蛾四龄幼虫附图4添加荧光素VBL和氯化锌感染病毒的舞毒蛾蛹附图2正常人工饲料（对照）的舞毒蛾四龄幼虫附图4添加荧光素VBL和氯化锌感染病毒的舞毒蛾雄成虫附图2对照的舞毒蛾四龄雄成虫附图2添加荧光素VBL和氯化锌感染病毒的舞毒蛾雌成虫附图2对照的舞毒蛾四龄雌成虫 64舞毒蛾LdNPV复配剂致病力及其对舞毒蛾GST酶活性的影响附图1感染病毒前的实验准备附图2感染病毒的人工饲料畏舞毒蛾幼虫附图1师妹，师弟们提取舞毒蛾酶液附图2测定舞毒蛾4龄幼虫谷胱甘肽S转移酶附图1舞毒蛾幼虫二龄的时候实验病毒致病力影响附图2舞毒蛾幼虫4龄的时候测定谷胱甘肽S转移酶 内蒙古农业大学博士学位论文65作者简介策仁尼玛，女，蒙古国，1986年10月出生蒙古国乌兰巴托市人,2008年毕业于蒙古国农业大学植物保护专业，害虫防治学士学位。2014年，开始攻读内蒙古农业大学林学院森林保护专业博士学位。在读博士生期间，参加相关学术课题研究，并一篇论文。功读博士学位期间发表的论文有：1、张波波，邵东华，冯叔军，策仁尼玛，段立清。丁香酸可增强LdNPV对舞毒蛾致死及亚致死作用[J],昆虫学报,2016，59(12):1348-1353. 内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不一实之处，本人承担切相关责任＝＞论文作者签名：Ｍ．ｉＡＪ日期：２〇＼ｇ．〇６．ｗ内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研宄生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：ｉ指导教师签名：取ｆ日期－Ｑ－：２＾＾
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