西藏地区牦牛三种肠道原虫分子流行病学研究及人兽共患风险分析

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河南扈ｉ农业大学学术硕士学位论文题目西藏地区牦牛三种肠道原虫分子流行病学研究人兽共患风险分析学位申请人姓名毋亚运导师姓名张龙现教授学科专业预防兽医学研究方向人兽共患原虫病学中国郑州２０１８年５月 分类号密级河南农业大学学术硕士学位论文论文题目：西藏地区牦牛三种肠道原虫分子流行病学研究及人兽共患风险分析英文题目：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙＳｔｕｄｙａｎｄＺｏｏｎｏｔｉｃＲｉｓｋＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＴｈｒｅｅＥｎｔｅｒｉｃＰｒｏｔｏｚｏａｉｎＹａｋｉｎＴｉｂｅｔ，Ｃｈｉｎａ学位申请人：毋亚运导师：张龙现教授专业：预防兽医学研宄方向：人兽共患原虫病学论文提交学位授予曰期：日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论西藏地区牦牛三种肠道原虫分子流行病学研学位ＩＩ文题目宄及人兽共患风险分析类别ＳｉｆＲ学牛举科ＪＨ毋亚运Ｈ预防兽医学张龙；现教授否如需保密？Ｓ否‘論，解密时间年月曰独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定一。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。ｊ、特此声。明ｉ／：研宄生签名导师签名：变Ｉ４ｐ’冰心佟多曰：期年月曰年曰曰期月彡ｙ学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全南农业大学关于保存、使必须按照了解河用学位论文的规定，即学生学校要求提交学位论文的刷本和版本论文的和印电子；学校有权保存提交印刷本电，并提供子版本目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩或扫描等复制手段保存、印。本人、汇编学位论文同意河南农业大学可同方式在不同媒体上发表传播学以用不位论文全部或部分。的内容本人完全《河了解南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南农业大一，就在校学后期间从事的科研工作发表的所有论文，第署名单位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报专利等知识产权均归河南农业大学所有的，否Ｉ。Ｊ，承担相应的法贝律责任注：保密学位论文在解密后适用于本授权研宄生签名報般鮮：」心：０曰《曰曰期曰期：期糾宑月月曰年月曰Ｇ 本论文受到下述项目资助：国家基金重点项目：微小隐孢子虫IId亚型家族起源及区域独特性遗传机构形成机制（31330079）十三五国家重大研发计划：畜禽重要人兽共患寄生虫病源头防控与阻断技术研究（2017YFD0501300-5）十二五国家重大科技专项子课题：重要寄生虫病监测技术研究（2012ZX10004220-011） 致谢日月不淹，春秋代序。毕业的脚步越来越近，三年的硕士研究生时光转瞬即逝，此刻的我百感交集，除了不舍，更多的是感谢。在河南农业大学度过的本科和硕士七年时光里，我早已把这里当成了家。感谢母校为我们提供了良好的学习氛围和发展空间，让我们能够更好的专心科研，认真学习。值此硕士毕业论文付梓之际，我要向所有关心、支持和帮助过我的老师们和同学们致以崇高的敬意和真挚的感谢！首先，我要感谢我的导师张龙现教授。三年来张老师无论是科研试验还是学习生活上都给与我极大的关心和帮助。科研上张老师为我开启一扇大门，让我从一名懵懂的本科毕业生得以尽快适应硕士研究生的角色。课题设计、开题直至顺利完成课题试验都离不开张老师认真负责深刻细致的指导。从他身上，我看到一位大学教授严于治学，勤勤恳恳的精神，为促进河南农业大学兽医学科的进步和发展，张老师身先士卒紧跟国际生命科学前沿，每年都邀请数名国内外知名学者和专家到我校作学术报告，开拓学生思路。从他身上我也看到了一名导师纯善于心、诲人不倦的的追求，张老师眼界高远，每当试验或论文写作上遇到瓶颈，张老师总能给我指点迷津，循循善诱，提出前瞻性的解决方案来帮助我理清思路，抽丁拔楔。无形中他以言传的、身教的人格力量深深教育着我，鼓舞着我，鞭策着我。细节之处见真情，生活上张老师同样给予我细致的关心和鼓励，教会我许多做人做事的道理，这些宝贵的经验使我获益匪浅，受益终生。从2015年7月给张老师领的第一件快递开始，从顺丰韵达到中通圆通，从文化路校区近邻宝到龙子湖校区菜鸟驿站，三年来给张老师领的快递多达数百件，作为学生有机会在张老师科研和教学的繁忙中尽微薄之力实乃幸事。细细品读三年在张老师门下求学的时光，切身感受到恩师给予的爱亘古绵长，无私无求，不因季节更替，不随名利浮沉。在今后的求学之路上，学生自当勤勉不怠，珍惜时间，对待科研严谨认真，牢记恩师教给的做人做事道理，不负恩师教诲。撰文致谢之辞，如梗在咽，万千感激之语涌上心头，惟愿恩师身体健康，平平安安。其次，我衷心感谢河南农业大学兽医寄生虫学实验室宁长申教授、菅复春教授、张素梅教授、王荣军副教授、董海聚副教授、刘红英老师和赵青玉老师在学习和生活上给予的关怀和帮助。宁老师和蔼可亲、平易近人，时刻教育大家团结一致，积极主动想方设法去解决课题遇到的各种困难。日常的实验室生活中他鼓励大家养成良好的习惯，方方面面去提升自己的综合能力。菅复春老师和张素梅老师集知性稳健、美貌气质和温柔优雅于一身，是实验室每个女生学习的榜样。王荣军老师年轻有为，科研思维敏捷而开阔，最近又喜得千金，拼劲十足。王老师告诫我们要进入科研的状态，加强锻炼自己的论文写作能力并注重英语知识的学习。三年来课题组老师们给予的谆谆教诲仍回响在耳边，在此向课题组的各位老师致以诚挚的祝福。 祝愿各位老师身体健康，工作顺利。特别感谢师姐王海燕、梁楠和王艳歌，师兄齐萌在试验和论文写作上的指导和帮助。非常感谢实验室的师兄李俊强、黄建营、崔朝晖、曹树轩、余复昌、王臣荣、张振杰、曹建科，师姐张燕、崔艳艳、史珂、王晓星、李玉婉、张璐在生活学习中兄弟姐妹般的鼓励与关怀。感谢三年来一起为梦想奋斗的同学们，感谢常艳凯、胡苏辉、闫亚群、王璐、刘珍珍、刘莹莹和党冰怡三年来的陪伴。感谢艳凯一起出差采样日子里对我的照顾，和亚群一起邻桌考研、复试并一起被河南农大录取的时光仍历历在目。感谢师弟张向前、郑双健、李东方、陈远才、景纪春、曹乐天和王璐阳，师妹张贵玲、赵姗姗、李松瑞、陈凯丽学习和生活上对我的帮助。感谢河南农业大学本科实习生张奇、相权珈、陈雪阳等在试验过程中给予的大力帮助。特别要感谢的是我的室友郭志鹏、卫瑞阳、肖小帅、王冬雨和崔颖磊同学，天气晴朗时会帮我晒被子，生病时你们总会陪我去看医生，帮我打水、买饭。很高兴能够拥有这样一帮亲密无间的兄弟，谢谢你们的陪伴和帮助，也谢谢你们带给我的快乐和感动，愿我们都有一个美好的未来！衷心感谢父母家人对我求学的理解和对完成学业的倾力支持。是他们无微不至的关怀和疼爱让我在外顺利求学，我将带着家人的祝福和鼓励走好自己的人生道路，做一个善良的有益于社会的人。我将铭记与实验室这份弥足珍贵的缘分，衷心祝愿河南农业大学寄生虫学实验室越来越好。毋亚运2018年4月河南农业大学龙子湖校区 目录摘要...............................................................................................................................................................1缩略词表.......................................................................................................................................................3图表清单.......................................................................................................................................................5第一部分文献综述....................................................................................................................................71隐孢子虫..............................................................................................................................................71.1命名与分类...................................................................................................................................71.2隐孢子虫流行病学.......................................................................................................................71.3隐孢子虫群体遗传学.................................................................................................................102十二指肠贾第虫.................................................................................................................................112.1命名与分类..................................................................................................................................112.2十二指肠贾第虫流行病学.........................................................................................................113毕氏肠微孢子虫.................................................................................................................................133.1命名与分类..................................................................................................................................133.2毕氏肠微孢子虫流行病学.........................................................................................................133.3毕氏肠微孢子虫群体遗传学.....................................................................................................164研究目的与意义.................................................................................................................................17第二部分西藏地区牦牛肠道寄生虫感染情况调查..............................................................................191引言.....................................................................................................................................................192材料与方法........................................................................................................................................192.1样品采集与处理.........................................................................................................................192.2材料与设备.................................................................................................................................192.3光学显微镜检查.........................................................................................................................203结果与分析........................................................................................................................................213.1牦牛肠道寄生虫的感染情况.....................................................................................................213.2牦牛肠道寄生虫混合感染情况.................................................................................................214结论与讨论.........................................................................................................................................22第三部分西藏地区牦牛隐孢子虫分子流行病学研究..........................................................................251引言.....................................................................................................................................................25 2材料与方法........................................................................................................................................252.1样品采集与处理.........................................................................................................................252.2主要试剂与设备.........................................................................................................................252.3粪便样品全基因组DNA提取..................................................................................................262.4样品PCR扩增............................................................................................................................272.5扩增产物琼脂糖凝胶电泳.........................................................................................................272.6阳性样品测序.............................................................................................................................272.7核苷酸序列分析及虫种鉴定.....................................................................................................272.8统计学分析.................................................................................................................................283结果与分析........................................................................................................................................283.1基于SSUrRNA基因PCR扩增..............................................................................................283.2隐孢子虫虫种和基因型鉴定.....................................................................................................284结论与讨论........................................................................................................................................29第四部分西藏地区牦牛十二指肠贾第虫分子流行病学研究..............................................................311引言.....................................................................................................................................................312材料与方法........................................................................................................................................312.1样品采集与处理.........................................................................................................................312.2主要试剂与设备.........................................................................................................................312.3粪便样品全基因组DNA提取..................................................................................................312.4样品PCR扩增............................................................................................................................322.5扩增产物琼脂糖凝胶电泳.........................................................................................................322.6阳性样品测序.............................................................................................................................322.7核苷酸序列分析及集聚体类型鉴定.........................................................................................322.8统计学分析.................................................................................................................................333结果与分析........................................................................................................................................333.1基于SSUrRNA基因PCR扩增..............................................................................................333.2十二指肠贾第虫集聚体类型.....................................................................................................334结论与讨论........................................................................................................................................34第五部分西藏地区牦牛毕氏肠微孢子虫分子生物学鉴定..................................................................371引言.....................................................................................................................................................37 2材料与方法........................................................................................................................................372.1样品采集与处理.........................................................................................................................372.2主要试剂与设备.........................................................................................................................372.3粪便样品全基因组DNA提取..................................................................................................382.4样品PCR扩增............................................................................................................................382.5扩增产物琼脂糖凝胶电泳.........................................................................................................382.6阳性样品测序.............................................................................................................................392.7核苷酸序列分析及基因型鉴定.................................................................................................392.8种系发育关系分析.....................................................................................................................392.9统计学分析.................................................................................................................................393结果与分析........................................................................................................................................393.1基于ITS基因PCR扩增...........................................................................................................393.2毕氏肠微孢子虫基因型分析......................................................................................................393.3毕氏肠微孢子虫基因型种系发育关系分析..............................................................................404结论与讨论........................................................................................................................................40结论与创新点............................................................................................................................................43参考文献：.................................................................................................................................................45ABSTRACT................................................................................................................................................57个人简历.....................................................................................................................................................59 河南农业大学2018届硕士研究生学位论文摘要隐孢子虫(Cryptosporidium)、十二指肠贾第虫(GiardiaDuodenalis)和毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoonbieneusi)是常见的人兽共患肠道原虫，具有多种传播途径，在世界范围内广泛流行。大量研究表明家畜是人体隐孢子虫病的主要动物传染源，而牛又被认为影响最大。相对于中国内地，西藏地区养殖业以放牧为主，家畜资源丰富但集约化程度较低，牦牛是西藏地区畜牧业经济和牧民生活中不可缺少的重要畜种，与当地牧民接触频繁。因此对西藏地区牦牛隐孢子虫、十二指肠贾第虫和毕氏肠微孢子虫相关的流行病学及进化关系展开研究分析很有必要。本研究对西藏林芝、山南和日喀则三个地区的牦牛进行样品采集，采用分子生物学方法对西藏地区牦牛隐孢子虫虫种、十二指肠贾第虫集聚体类型和毕氏肠微孢子虫基因型进行鉴定，探明西藏地区三种肠道原虫的分布特征，是否和内地其他地区的相同，是否与西藏地区交通不便和病原重组机会少有关系，结合分子流行病学数据对三种肠道原虫的人兽共患风险和进化关系进行分析。第一部分：西藏地区牦牛肠道寄生虫感染情况调查采用水洗沉淀法、卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖漂浮法对西藏林芝、山南和日喀则牧区内577份放牧牦牛粪便样品中进行显微镜检查，肠道寄生虫总感染率为82.7%，46.4%的样品混合感染2-5种肠道寄生虫。共发现10种肠道寄生虫，十种肠道寄生虫的感染率分别为球虫45.4%、十二指肠贾第虫0.4%、隐孢子虫1.6%、圆线虫36.6%、鞭虫3.8%、吸虫1.6%、绦虫3.1%、阿米巴原虫53.4%、蛔虫3.6%和结肠小袋纤毛虫1.0%，以阿米巴原虫为优势感染种类。米林县、工布江达县、巴宜区、加查县和谢通门县感染率分别为95.2%、65.6%、85.1%、82.1%和93.1%，感染率统计学差异计学差异极显著(P<0.01)。第二部分：西藏地区牦牛隐孢子虫分子流行病学研究基于SSUrRNA基因，577牦牛粪便样品中发现隐孢子虫阳性样品8份，总感染率为1.4%。共发现两种隐孢子虫：安氏隐孢子虫C.andersoni和牛隐孢子虫C.bovis，安氏隐孢子虫感染率最高。不同地点牦牛隐孢子虫感染率为0-6.9%，感染率统计学差异极显著(P<0.01)。谢通门县感染率最高，为6.9%，米林县和加查县未发现隐孢子虫感染，巴宜区和工布江达县感染率均为0.8%。第三部分：西藏地区牦牛十二指肠贾第虫分子流行病学研究基于SSUrRNA和tpi基因，577牦牛粪便样品中发现十二指肠贾第虫阳性样品10份，总感染率为1.7%，鉴定结果显示10个分离株均为集聚体E。不同地点牦牛十二指肠贾第虫感染率为0%-3.6%，感染率统计学差异不显著(P>0.05)。加查县感染率最高，为3.6%，米林县未见十二指肠贾第虫感染，谢通门县、巴宜区和工布江达县和感染率分别为1.4%、1.5%和2.4%。第四部分：西藏地区牦牛毕氏肠微孢子虫分子生物学鉴定基于ITS基因，577份牦粪便样品中发现毕氏肠微孢子虫阳性样品29份，总感染率为5.0%，不同地点牦牛毕氏肠微孢子虫感染率为1.6%-12.9%，感染率统计学差异显著(0.010.05为统计学差异不显著，0.010.05)，见于表4-4。3.2十二指肠贾第虫集聚体类型基于SSUrRNA基因的10个扩增阳性样品均被成功测序，将测序结果拼接校对后，与GenBank序列进行初步搜索比对，利用ClustalX2.13将测序所得序列与从GenBank上获得的参考序列进行比对和编辑，序列比对分析显示10个分离株均属于集聚体E。图4-1十二指肠贾第虫SSUrRNA基因部分PCR扩增结果M：DL2000Marker；1-22：样品；N：阴性对照；P：阳性对照Figure4-1ThePCRamplificationofG.duodenalisbasedonSSUrRNAgeneM:DL2000Marker;1-22:samples;N:negativecontrol;P:positivecontrol31 西藏地区牦牛十二指肠贾第虫分子流行病学研究图4-2十二指肠贾第虫tpi基因部分PCR扩增结果M：DL2000Marker；1-22：样品；N：阴性对照；P：阳性对照Figure4-2ThePCRamplificationofG.duodenalisbasedonSSUrRNAgeneM:DL2000Marker;1-22:samples;N:negativecontrol;P:positivecontrol表4-4西藏不同地区牦牛十二指肠贾第虫感染情况Table4-4InfectionstatusofG.duodenalisinyakindifferentregionsofTibet采样地点样品数阳性数(%)集聚体类型(阳性样品数)LocationsNo.sampleNo.positive(%)Assemblage(No.)米林县Mainling6200工布江达县Gongbujiangda1253(2.4)E(3)巴宜区BayiDistrict2624(1.5)E(4)加查县Gyaca562(3.6)E(2)谢通门县Xietongmen721(1.4)E(1)合计Total57710(1.7)E(10)4结论与讨论以主要的牛科动物(奶牛、牦牛和肉牛)为研究对象，我国广东、黑龙江、吉林、辽宁、河南、新疆和青海等地区展开对牛十二指肠贾第虫的研究[77]。本研究共有10份牦牛粪便样品被成功扩增出的目的基因片段，西藏地区牦牛十二指肠贾第虫总感染率为1.7%(10/577)，不同地点牦牛十二指肠贾第虫感染率为0%-3.6%，米林县未见十二指肠贾第虫感染，加查县感染率最高，为3.6%，谢通门县、巴宜区和工布江达县和感染率分别为1.4%、1.5%和2.4%。Qi等对甘肃、西藏、四川和青海牦牛调查发现，其中西藏未牦牛感染十二指肠贾第虫，四川、青海和甘肃牦牛十二指肠贾第虫感染率分别为1.2%、3.3%和3.4%[124]。王光华等对93份青海牦牛进行镜检和免疫荧光试验，将所得的贾第虫阳性进行分子鉴定，结果发现感染率为8.6%[133]。利用同样的方法，王光华等又对297份青海牦牛鉴定进行结果发现牦牛感染率为7.4%[134]。Song等对甘肃白牦牛研究发现，白牦牛十二指肠贾第虫感染率1.8%[135]。Wang等对青海4-7月龄牦牛研究发现其感染率为5.4%[136]。Jin等对青海牦牛研究发现，牦牛十二指肠贾32 河南农业大学2018届硕士研究生学位论文第虫感染率10.4%[137]。感染率的差异可能与牦牛的年龄、饲养环境还有检测方法有关。大部分研究结果显示集聚体E为牛主要感染的集聚体类型，只有少数出现集聚体A或B感染的情况[79,83-84]。本研究本研究只鉴定出集聚体的类型为E，王光华等和Wang等对青海牦牛的研究、Song等对甘肃白牦牛的研究与本实验结果一致[124,135-136]。然而最近一篇关于Jin等对青海牦牛十二指肠贾第虫分子流行病学研究发现牦牛感染集聚体A的情况，并且有一份样品发现A和E混合感染[137]。截至目前，未见牦牛感染集聚体B的报道。集聚体E虽然具有宿主特异性，但在巴西和埃及住院病人体内曾有集聚体E感染的报道[138-139]。因此，需要更多的研究来评估十二指肠贾第虫集聚体E人兽共患风险。33 河南农业大学2018届硕士研究生学位论文34 河南农业大学2018届硕士研究生学位论文第五部分西藏地区牦牛毕氏肠微孢子虫分子生物学鉴定1引言人毕氏肠微孢子虫病呈世界范围分布，超过90%的人体微孢子虫病是由E.bieneusi引起的。微孢子虫可导致艾滋病等免疫缺陷患者长期致死性腹泻，一项研究表明艾滋病病人微孢子虫感染率高达50%[89]。免疫力正常的人感染该病原后不表现临床症状，但也会表现出自限性腹泻[90]。在北美洲、欧洲、澳洲、非洲等地多次报道目前，而我国关于人类感染微孢子虫的报道较少。同样的研究发现长期腹泻的病人微孢子虫病感染率显著高于健康人群。除人之外，毕氏肠微孢子虫其它宿主有非人灵长类、家畜、宠物、野生动物和鸟类等[94]。在德国首次报道了牛毕氏肠微孢子虫病，在腹泻牛的粪便鉴定出两个毕氏肠微孢子虫基因型I和J[100]。随后陆续有多个国家报道在牛体内发现毕氏肠微孢子虫感染，研究主要围绕奶牛展开。截止目前，在牛体内鉴定出的毕氏肠微孢子虫基因型共有近30种，主要为D、I、J、M、N、TypeIV、EbpA、EbpC、Peru6、BEB3、BEB4、BEB6、BEB7、BEB8、BEB9、BEB10、CHN1、CHN3、CHN4、CEbA、CEbD、CEbF、PtEbXI，牛是人感染毕氏肠微孢子虫的重要来源[103-106]。其中人兽共患基因型有D、I、J、TypeIV、BEB4、BEB6和Peru6，其余为牛宿主特异基因型。大多数研究中牛最常感染的基因型是I、J和BEB4，尽管牛体内发现的基因型大多在2群中，但是也曾在人和其他动物体内发现，研究结果揭示了这些基因型具有毕氏肠微孢子虫人兽共患传播的潜在可能[104]。本研究对西藏林芝、山南和日喀则三个地区的牦牛进行样品采集，基于ITS基因，采用分子生物学方法对西藏地区毕氏肠微孢子虫基因型进行鉴定，结合分子流行病学数据对西藏地区毕氏肠微孢子虫的基因型分布特征进行分析，研究交通不便、养殖环境相对封闭是否影响毕氏肠微孢子虫基因型的分布和计划关系。同时为制定有效的疾病防控策略提供科学依据，并对保障公共卫生与健康具有重要意义。2材料与方法2.1样品采集与处理见第二部分2.12.2主要试剂与设备2.2.1主要试剂E.Z.N.A.®D4015-02粪便全基因组DNA提取试剂盒(OMEGABio-TekInc.,Norcross,GA,USA)，rTaqPCR扩增试剂盒(TaKaRa)，牛血清白蛋白BSA(Sigma)，6×LoadingBuffer(TaKaRa)，DL2000DNAMarker(TaKaRa)，琼脂糖(Invitroen)，绿如蓝®DNAGreen核酸染料(Tiandz)等。2.2.2主要设备见第三部分2.2.2。35 西藏地区牦牛毕氏肠微孢子虫分子生物学鉴定2.3粪便样品全基因组DNA提取见第三部分2.3。2.4样品PCR扩增扩增毕氏肠微孢子虫所需引物参考Buckholt等的方法[140]，扩增位点为核糖体RNA转录间隔区(InternalTranscribedSpacerregion,ITS)，目的片段长度约为392bp。第一轮：预变性94℃5min，1个循环；94℃30s，退火温度57℃30s，72℃40s，35个循环；延伸72℃10min，1个循环；4℃保温。第二轮：预变性94℃5min，1个循环；94℃30s，退火温度55℃30s，72℃40s，30个循环；延伸72℃10min，1个循环；4℃保温。两轮PCR反应均使用25uL体系，第一轮添加2uL试剂盒提取的粪样DNA做模板，第二轮添加2uL首轮产物作为模板。在首轮扩增过程中添加BSA以降低模板DNA中残留的抑制物对扩增效果的影响，第二轮扩增过程无需添加。PCR扩增酶为rTaqPCR扩增试剂盒(TaKaRa)，扩增产物于4℃冰箱保存(长期保存需置于-20℃冰箱)。PCR扩增引物和体系见表5-1与5-2。表5-1扩增微孢子虫的ITS基因引物[140]Table5-1PrimerusedinthecharacterizationoftheITSgeneofE.bieneusi[140]引物序列(5′-3′)目的片段长度退火温度Nucleotidesequencesofprimer(5′-3′)Expectedproductsize(bp)Annealingtemperature(ºC)EBITS3:GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT~43557EBITS4:TATGCTTAAGTCCAGGGAGEBITS1:AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG~39255EBITS2.4:AGTGATCCTGTATTAGGGATATT表5-2毕氏肠微孢子虫PCR反应体系(25uL)Table5-2PCRamplificationsystemofE.bieneusi(25uL)试剂浓度第一轮用量(uL)第二轮用量(uL)ReagentConcentrationVolumeforprimaryPCRVolumeforsecondPCRPCRBuffer102.52.5dNTPs2mMeach22上游引物25µM0.40.4下游引物25µM0.40.4rTaq酶5U·µL-10.20.2BSA10mg·mL-11-模板DNA2-首轮PCR产物-2灭菌双蒸水16.517.52.5扩增产物琼脂糖凝胶电泳见第三部分2.5。36 河南农业大学2018届硕士研究生学位论文2.6阳性样品测序见第三部分2.6。2.7核苷酸序列分析及基因型鉴定见第三部分2.7。2.8种系发育关系分析利用Mega7.0软件构建种系进化树(http://www.megasoftware.net)，种系发育关系分析采用邻接法(Neighbour-joining)，选用模型为Tamura-Nei，用bootstrap对进化树进行可靠性分析，1000个重复。进化树所需参考序列根据已经报道的文献从GenBank上获取。2.9统计学分析见第二部分2.3.5统计学分析。3结果与分析3.1基于ITS基因PCR扩增本研究对577份牦牛粪便样品进行全基因组提取和巢式PCR扩增，共29份西藏地区牦牛粪便样品被成功扩增出目的片段，总感染率为5.0%(29/577)，目的片段长度约为392bp，部分有代表性的扩增结果见图5-1。不同地点牦牛微孢子虫感染率为1.6%-12.9%，工布江达县感染率最低，为1.6%，米林县感染率最高，为12.9%，巴宜区、加查县和谢通门县感染率分别为4.9%、5.4%和5.6%。不同地点牦牛毕氏肠微孢子虫感染率统计学差异显著(0.010.05).Part4:MolecularCharacterizationofEnterocytozoonbieneusiinYakinTibet29sampleswerepositiveEnterocytozoonbieneusiwiththeoverallprevalencebeing5.0%in577samplesbasedonITSgene.TheinfectionratesofEnterocytozoonbieneusiwere1.6to12.9%indifferentregions.YaksinMainlinghadahighestinfectionrate,12.9%,whereasYaksinGongbujiangdahadalowestinfectionrate,1.6%.TheinfectionratesofBayiDistrict,GyacaandXietongmenwere4.9%,5.4%and5.6%.Statisticaldifferenceissignificant(0.01