小檗碱抑制小肠葡萄糖吸收降低糖尿病餐后高血糖及其机制

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分类号R3UDC616.1密级公开小檗碱抑制小肠葡萄糖吸收降低糖尿病餐后高血糖及其机制张敏培养类别全日制学位类型学术学位一级学科(专业类)基础医学二级学科(专业)系统医学生物学研究方向糖尿病损伤与防护指导教师董玲副教授培养单位航空航天医学系二O一八年五月 独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解空军军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位为空军军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文等使用本论文工作成果时第一署名单位仍然为空军军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文；学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》等，并可浏览和下载，同时享受《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定的相关权益。论文作者签名：导师签名：日期： 空军军医大学硕士学位论文目录缩略语表..............................................................................................................................1中文摘要..............................................................................................................................3Abstract................................................................................................................................7前言............................................................................................................................12文献回顾............................................................................................................................13正文............................................................................................................................221材料.............................................................................................................................231.1实验动物和细胞...............................................................................................231.2主要仪器...........................................................................................................231.3主要试剂...........................................................................................................242方法.............................................................................................................................262.1糖尿病动物模型的制备...................................................................................262.2实验分组...........................................................................................................262.3血糖测定（FBG，OGTT，IPGTT）.............................................................262.4动物组织取材和血清提取...............................................................................272.5ELISA检测血清内分泌激素...........................................................................272.6荧光法检测糖尿病模型小鼠小肠葡萄糖转运...............................................282.7糖尿病模型小鼠粪便葡萄糖检测....................................................................282.8荧光法检测小肠葡萄糖转运...........................................................................282.9荧光法检测IEC-6细胞葡萄糖吸收...............................................................292.10蛋白免疫印迹.................................................................................................292.11实时定量PCR.................................................................................................302.12组织和细胞的细胞膜蛋白提取......................................................................312.13小肠组织免疫荧光实验.................................................................................312.14小肠组织和IEC-6细胞免疫电镜实验.........................................................322.15IEC-6细胞培养...............................................................................................32 空军军医大学硕士学位论文2.16IEC-6细胞转染siRNA...................................................................................332.17统计学分析.....................................................................................................333结果.............................................................................................................................343.1小檗碱灌胃6周降低糖尿病小鼠空腹血糖，改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性...........................................................................................................................343.2小檗碱降低餐后血糖依赖于其在小肠局部抑制葡萄糖吸收.......................363.3小檗碱通过抑制小肠黏膜上皮细胞GLUT-2降低小肠葡萄糖吸收...........383.4小檗碱抑制小肠黏膜上皮细胞GLUT-2转位至刷状缘...............................403.5小檗碱灌胃6周纠正糖尿病小鼠小肠组织局部IGF系统异常...................433.6小檗碱抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2通路降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取..........................................................................................................453.7小檗碱激活AMPK抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2通路，进而降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取..........................................................................513.8小檗碱降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取与PI3K-Akt信号通路无关...........................................................................................................................554讨论.............................................................................................................................57小结............................................................................................................................65参考文献............................................................................................................................66个人简历和研究成果........................................................................................................76致谢............................................................................................................................77 空军军医大学硕士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称2-Deoxy-2-[(7-nitro-2,1,2-NBDG荧光标记葡萄糖3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucoseAktProteinkinaseB蛋白激酶BAdenosine5'-monophosphate(AMP)-AMPK腺苷单磷酸活化蛋白激酶activatedproteinkinaseBBRBerberine小檗碱BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白FBGFastingbloodglucose空腹血糖GLP-1Glucagon-likepeptide1胰高血糖素样肽-1GLP-2Glucagon-likepeptide2胰高血糖素样肽-2GLUT-2Glucosetransporter2葡萄糖转运体2HGHighglucose高糖Homeostasismodelassessment-稳态模型评估-HOMA-IRinsulinresistance胰岛素抵抗指数IGF-1Insulin-likeGrowthFactors1胰岛素样生长因子1IGF-1RInsulin-likeGrowthFactors1receptor胰岛素样生长因子1受体胰岛素样生长因子IGFBP-3Insulin-likeGrowthFactorsbindingprotein3结合蛋白3IPGTTIntraperitonealglucosetolerancetest腹腔注射糖耐量实验OGTTOralglucosetolerancetest口服葡萄糖耐量试验PI3KPhosphatidylinositide3-kinases磷脂酰肌醇-3-羟激酶-1- 空军军医大学硕士学位论文PLC-β2PhospholipaseCβ2磷脂酶C-β2苯甲基磺酰氟PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride（蛋白酶抑制剂）PVDFPolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯膜RIPARadioimmunoprecipitationassaybuffer组织细胞裂解液SGLT-1Sodiumglucosecotransporter1钠-葡萄糖共转运体1siRNASmallinterferingRNA小片段干扰核糖核酸STZStreptozocin链脲佐菌素T2DMType2diabetesmellitus2型糖尿病-2- 空军军医大学硕士学位论文小檗碱抑制小肠葡萄糖吸收降低糖尿病餐后高血糖及其机制硕士研究生：张敏导师：董玲副教授空军军医大学航空航天医学院，西安，710032资助基金项目：国家自然科学基金（No.81470412）陕西省卫生科研基金（No.2016A001）中文摘要研究背景流行病学研究显示，糖尿病餐后高血糖的发生率高达50%，糖尿病前期约70%为单纯性葡萄糖耐量。研究发现餐后高血糖与多种糖尿病慢性并发症密切相关，而控制餐后血糖升高是防治糖尿病的重要策略之一。近年来，作为营养物质吸收的主要器官的小肠在餐后高血糖发生和糖尿病发病过程中的作用逐渐受到重视。研究认为糖尿病小肠葡萄糖吸收功能病理性增强，与餐后血糖升高密切相关。小肠葡萄糖吸收主要由SGLT-1（钠-葡萄糖共转运体1）和GLUT-2（葡萄糖转运体2）介导，其中，GLUT-2介导的葡萄糖转运是餐后小肠吸收葡萄糖的主要方式。进食后，GLUT-2由小肠黏膜上皮细胞胞浆转位至刷状缘，以异化扩散形式将葡萄糖由肠腔转运到血液中。而当罹患糖尿病时，GLUT-2在小肠黏膜上皮细胞刷状缘持续性定位，这可能是糖尿病小肠葡萄糖吸收功能增强及餐后高血糖的原因。因此，纠正糖尿病小肠葡萄糖吸收功能病理性增强成为治疗糖尿病餐后高血糖的重要策略。小檗碱是中药黄连的有效成分，是异喹啉类生物碱。因在治疗腹泻患者时偶然发现低血糖反应而引起糖尿病相关研究者的关注。小檗碱治疗糖尿病的作用机制包括改善糖尿病心血管功能、改善糖脂代谢、改善糖尿病和降低心血管疾病的危险因-3- 空军军医大学硕士学位论文素等诸多方面。但因小檗碱的生物利用度低，其多项药理学作用机制及临床应用存在争议。尽管有研究表明小檗碱在肠道浓度高，可在肠道局部发挥代谢调节作用，包括抑制二糖酶的功能；促进GLP-1（胰高血糖素样肽1）释放；调节肠道菌群结构等。但小檗碱能否缓解糖尿病小肠葡萄糖吸收能力增强和餐后高血糖的直接证据依然缺乏。针对上述问题，我们课题组在以往研究的基础上，对小檗碱降低糖尿病餐后高血糖的肠道机制做了深入研究。实验目的探讨小檗碱改善糖尿病血糖是否与其在小肠局部影响葡萄糖转运有关，并探讨其作用机制。实验方法采用链脲佐菌素（STZ）联合高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠模型。利用随机数表法分组，小檗碱灌胃（200mg/kg，BW，每日）6周过程中，检测体重、空腹血糖变化情况。通过OGTT、IPGTT（口服葡萄糖耐量、腹腔注射葡萄糖耐量实验）实验检测葡萄糖耐量变化，采用ELISA方法检测血清中GLP-1、GLP-2和胰岛素水平，并检测血清和小肠组织局部IGF-1（胰岛素样生长因子1）、IGFBP-3（胰岛素样生长因子结合蛋白3）水平。离体条件下，采用小肠组织和大鼠小肠黏膜上皮细胞系（IEC-6细胞）进行荧光葡萄糖转运和葡萄糖摄取实验，观察小檗碱对葡萄糖转运和摄取的影响。提取组织、细胞总蛋白和细胞膜蛋白，通过蛋白免疫印迹技术分析小肠葡萄糖转运蛋白的表达和转位情况。进一步，利用免疫荧光、免疫电镜等技术观察小檗碱对GLUT-2蛋白转位的影响。进而，综合利用药物抑制剂和siRNA技术探讨小檗碱对葡萄糖转运蛋白作用进行分子机制的研究。两组间比较采用Dunnett-t检验，多个处理组两两之间比较采用SNK-q检验。实验结果1.与正常对照组相比，STZ联合高脂饮食诱导的2型糖尿病组小鼠体重显著性增加，空腹血糖水平升高，糖耐量异常。经小檗碱（200mg/kg/d，BW）灌胃6周治疗后，相较于糖尿病组，糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠体重降低、空腹血糖水平下降、葡萄糖耐量得到改善、HOMA-IR降低。-4- 空军军医大学硕士学位论文2.糖尿病组小鼠小肠葡萄糖转运能力较正常组小鼠增高，糖尿病组小鼠单位进食量所产生的粪便中葡萄糖含量降低。小檗碱（200mg/kg/d，BW）灌胃6周后，与糖尿病组相比，糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠葡萄糖转运能力降低，糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠单位进食量所产生的粪便中葡萄糖含量升高。采用正常动物给予单次灌胃小檗碱（200mg/kg，BW），观察到单次灌胃小檗碱仅对OGTT实验后的血糖变化具有抑制作用，而对IPGTT实验后血糖变化无降低作用，检测OGTT实验后各时间点的血清胰岛素水平，发现小檗碱单次灌胃组血清胰岛素水平显著性降低，提示小檗碱通过其在小肠局部的直接作用抑制小肠葡萄糖吸收，降低餐后血糖水平。3.离体条件下，利用小肠组织和IEC-6细胞研究小檗碱降低小肠葡萄糖转运。与正常组相比，小檗碱组小肠葡萄糖转运和细胞葡萄糖摄取呈现浓度依赖性降低，GLUT-2抑制剂phloretin（0.5mM）和siRNA敲低GLUT-2表达均能阻断小檗碱降低小肠组织葡萄糖转运和细胞葡萄糖摄取。结果提示，小檗碱降低小肠葡萄糖转运是通过抑制GLUT-2来实现的。4.在糖尿病模型小鼠中，相较于正常对照组，糖尿病小鼠小肠GLUT-2表达增加，采用提取细胞膜进行蛋白免疫印迹分析、免疫荧光实验和免疫电镜实验等方法均观察到：糖尿病小鼠小肠黏膜上皮细胞GLUT-2向刷状缘转位增多。小檗碱（200mg/kg/d，BW）灌胃6周后，相较于糖尿病组，糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠GLUT-2表达降低。同时，GLUT-2向刷状缘转位降低。高浓度葡萄糖（50mM）处理IEC-6细胞模拟肠腔餐后高浓度葡萄糖的条件下，小檗碱处理可浓度依赖性降低IEC-6细胞GLUT-2转位。以上结果提示，小檗碱降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2转位至刷状缘。5.与糖尿病组相比，小檗碱灌胃6周组小鼠小肠局部IGF-1、IGFBP-3水平降低，同时，小肠组织中IGF-1R和PLC-β2表达分别降低21.5%，23.1%，提示小檗碱灌胃6周可纠正糖尿病小鼠小肠局部IGF水平异常。6.小檗碱下调IEC-6细胞IGF-1R磷酸化，IGF-1R抑制剂AG1024和siRNA敲低IGF-1R表达均可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位。同时，小檗碱下调IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位，进一步使用PLC-β2抑制剂U73122可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位。使用IGF-1R抑制剂AG1024和-5- 空军军医大学硕士学位论文siRNA敲低IGF-1R表达均可阻断小檗碱降低细胞PLC-β2胞膜定位。提示小檗碱通过抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取。7.小檗碱上调IEC-6细胞AMPK磷酸化，AMPK抑制剂CompoundC（10μM）可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位。同时，AMPK抑制剂CompoundC可阻断小檗碱降低细胞IGF-1R磷酸化。提示小檗碱通过激活AMPK抑制IGF-1R，最终降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取。8.小檗碱未上调IEC-6细胞Akt磷酸化水平，PI3K抑制剂Wortmannin（10μM）未阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2、PLC-β2胞膜定位，提示小檗碱降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取可能与PI3K-Akt信号通路无关。结论1.小檗碱降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2向刷状缘转位，从而抑制小肠葡萄糖的吸收，最终降低糖尿病小鼠餐后血糖水平2.小檗碱通过激活AMPK抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路，进而降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2刷状缘转位关键词：小檗碱；2型糖尿病；餐后血糖；小肠；葡萄糖转运体2-6- 空军军医大学硕士学位论文BerberinedecreasesintestinalglucoseabsorptionandimprovespostprandialhyperglycemiccontrolindiabeticmiceCandidateformaster:ZhangMinSupervisor:DongLingDepartmentofAerospaceMedicine,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,ChinaSponsoredPrograms:TheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81470412)HealthScienceFoundationofShaanxiProvince(No.2016A001)AbstractBackgroundEpidemiologicalstudieshavedemonstratedhighproportionofpostprandialhyperglycemiainpatientswithclinic-diagnosedT2DM,andover70%patientswithpre-diabetesaremanifestedasimpairedglucosetolerance.Postprandialhyperglycemiaisanimportantinjuryfactorindiabetespathogenesisandmanyotherdiabeticchroniccomplications,controllingpostprandialglycemiccomestobethemainstrategytopreventandcurediabetesanditschroniccomplications.Asthemajororganfunctioningasnutrientabsorption,intestine’sspecificrolesinpathogenesisofpostprandialhyperglycemiaanddiabeteshavebeenvaluedmuchinrecentyears.PathologicalenhancementofintestinalglucoseabsorptionhasbeenobservedinpatientssufferingfromT2DM,whichiscloselyrelatedtopostprandialhyperglycemia.Therearetwoglucosetransportersrelatedtointestineglucoseabsorption,sodiumglucoseco-transporter1(SGLT-1),andglucosetransporter2(GLUT-2).Intestinalglucoseconcentrationrisesuptoover30mMafter-7- 空军军医大学硕士学位论文eating,then,GLUT-2translocatesfromintestinalepithelialcellcytoplasmtobrushbordermembrane,andthen,GLUT-2-dominatedglucoseabsorptionmakesthemajorcontributiontopostprandialglycemia.Whenitcomestodiabetes,intestinalGLUT-2wouldbepermanentlylocatedatbrushbordermembrane,whichleadstotheenhancementabilityofintestinalglucoseabsorptionandpostprandialhyperglycemiainpatientswithT2DM.ItturnsouttobeamoreurgentmatterthatrectifyingtheenhancementabilityofintestinalglucoseabsorptionintheprocessofpathogenesisofT2DM.Berberine，asmallmoleculederivedfromCoptidisrhizome,isusedinthetreatmentofdiabetessinceitwasfoundtocausehypoglycemiainpatientswithdiarrhea.Berberine’santi-diabeticeffectsaremainlymanifestedasimprovementofcardiovascularfunctionandglycolipidmetabolism,rectifyingriskfactorsofdiabetesanddiabeticcomplications.However,duetothelowbioavailabilityofberberine,anditsunclearanti-diabeticmechanism,itsclinicalapplicationremainscontroversial.Somestudiessuggestthatberberinecanexertlocaleffectsinintestinaltract,includinginhibitingthefunctionofdisaccharide,promotingthereleaseofGLP-1toexerteffectsofregulatingmetabolism,andregulatingthecomponentpartofintestinalmicrobiota.Nonetheless,thestudyonwhetherberberinecanimproveglucoseabsorptioninthesmallintestineandpostprandialglycemiainT2DMisstillablank.Inviewoftheproblemmentionedabove,ourresearchgrouphasmadeabrand-newexplorationontheintestinalmechanismoftheanti-diabeticpostprandialhyperglycemiceffectofberberineonthebasisofpreviousstudies.AimsToinvestigatewhetherberberinecouldrectifypostprandialhyperglycemiathroughaffectingintestinalglucoseabsorptioninT2DM,andfigureoutunderlyingmechanismsthathowberberineimpactsintestinalglucoseabsorptionMethodsDiabeteswasinducedinmaleC57BL/6micebyfeedingahigh-fatdietandadministrationofalowdoseofstreptozotocin.Wegroupmiceaccordingtothemethodofrandomnumbertable.Thesediabeticmiceweretreatedwithberberine(200mg/kg/day,BW,gavage)for6weeks.Bodyweightandfastingbloodglucoseweremonitoredinthe-8- 空军军医大学硕士学位论文processofberberinetreatment.OGTTandIPGTTwereappliedtoreflecttheglucosetolerance.Seruminsulin,GLP-1,GLP-2andIGFsystemweredetectedbyELISAkit.IntestinetissueandIEC-6cellwasusedininvitrostudiestoinvestigateberberine’seffectsonintestinalglucosetransportandcellularglucoseuptake.Theintestinalandcellularmembraneproteinswereextractedandwesternblottingwasusedtoevaluateglucosetransporterproteinexpressionlevels.Immunofluorescenceandimmuneelectronmicroscopywasappliedtoobservetheberberine’seffectsondistributionofGLUT-2inintestinalepithelialcells.ChemicalinhibitorsandsmallinterferenceRNAknockingdownwereappliedtoinvestigatemechanismofberberine.Dunnett-ttestwasusedtoevaluatethestatisticalsignificanceofdifferencebetweenexperimentalandcontrolgroups,whileSNK-qtestwasusedbetweendifferentexperimentalgroups.Results1.Comparedwiththecontrolgroup,thesignificantincreasementinmice'sbodyweightandfastingbloodglucoselevels,andtheabnormalglucosetolerancewereseenintheDMgroup.Afterberberinegavagetreatmentfor6weeks,comparedwiththeDMgroup,thebodyweightandthefastingbloodglucosewassignificantlydecreasedinDM+BBRgroup,andtheimpairedglucosetolerancewasimproved,moreovertheHOMA-IRwassignificantlydecreasedinDM+BBRgroup.2.Comparedwithcontrolgroup,DMgroupmiceshowedenhancedabilityofintestinalglucoseabsorption,anddecreasedglucoselevelinfecesexcretedbyunitfeedintake.Afterberberinegavagetreatmentfor6weeks,comparedwithDMgroup,DM+BBRgroupmiceshoweddecreasedabilityofintestinalglucoseabsorption,andincreasedglucoselevelinfecesexcretedbyunitfeedintake.Additionally,berberineinstantgavagedecreasedpostloadbloodglucoseinOGTTinnormalanimals,butithadnoinfluenceonpostloadbloodglucoseinIPGTT,andseruminsulinlevelwasdecreasedinberberineinstantgavagegroupafterOGTT.Theseresultsindicatedthatberberinedecreasedpostprandialglycemiclevelbydecreasingintestinalglucoseabsorption,whichisthedirectpharmacologicaleffectofberberineinintestinetissue.3.IntestinetissueandIEC-6cellsinvitrowereappliedtostudypreliminarymechanism-9- 空军军医大学硕士学位论文ofberberine’seffectsonintestinalglucoseabsorption.Comparedwithcontrolgroup,abilityofintestinalglucoseabsorptionandcellularglucoseuptakewasdecreasedincontrol+BBRgroupinadosedependentmanner.Furthermore,bothGLUT-2inhibitorphloretinandsiRNAknockingdownGLUT-2expressioncouldblocktheberberine’seffectsonintestinalglucoseabsorptionandcellularglucoseuptake,whichindicatesthatberberinedecreasedintestinalglucoseabsorptionandcellularglucoseuptakebydepressingGLUT-2function.4.BerberinedecreasedGLUT-2localizationatbrushbordermembraneofintestinalepithelialcells.Comparedwithcontrolgroup,intestinalGLUT-2expressionwasincreasedinDMgroup,andweconfirmedthatGLUT-2localizationatbrushbordermembraneofintestinalepithelialcellswasincreasedbymembraneproteinwesternblotting,immunofluorescenceandimmuneelectronmicroscopytests.Afterberberinegavagetreatmentfor6weeks,comparedwithDMgroup,bothGLUT-2expressioninintestineandGLUT-2localizationatbrushbordermembraneofintestinalepithelialcellsweredecreasedinDM+BBRgroup.Additionally,highconcentrationofglucosewasappliedtocultureIEC-6cellstosimulateintestinalhighconcentrationofglucoseafterfoodintake,andwefoundthatberberinecouldalsodecreaseIEC-6cellsGLUT-2translocation.5.ComparedwithDMgroup,intestinalIGF-1andIGFBP-3weredecreasedinDM+BBRgroup,andintestinalIGF-1RandPLC-β2expressionwerealsodecreasedinDM+BBRgroup,whichindicatedthatberberinegavagetreatmentfor6weekscouldrectifyintestinalabnormalIGFsystemcausedbydiabetes.6.Berberinedown-regulatedphosphorylationofIGF-1RinIEC-6cells,IGF-1RinhibitorsAG1024andsiRNAknockingdownIGF-1Rexpressioncouldblockberberine’seffectsoncellularglucoseuptakeandGLUT-2translocation.Berberinealsodown-regulatedPLC-β2localizationatcellmembraneinIEC-6cells,PLC-β2inhibitorsU73122couldblockberberine’seffectsoncellularglucoseuptakeandGLUT-2translocation.Furthermore,wefoundthatPLC-β2localizationatcellmembraneinIEC-6cellscouldbeblockedbyIGF-1RinhibitorsAG1024andsiRNA-10- 空军军医大学硕士学位论文knockingdownIGF-1Rexpression.TheseresultsindicatedthatberberinedecreasedcellularglucoseuptakeandGLUT-2translocationbysuppressingIGF-1R-PLC-β2-GLUT-2signalpathway.7.Berberineup-regulatedphosphorylationofAMPKinIEC-6cells,AMPKinhibitorsCompoundCandsiRNAknockingdownAMPKexpressioncouldblockberberine’seffectsoncellularglucoseuptakeandGLUT-2translocation.Furthermore,wefoundthatphosphorylationofIGF-1RinIEC-6cellscouldbeblockedbyAMPKinhibitorsCompoundCandsiRNAknockingdownAMPKexpression.TheseresultsindicatedthatberberinedecreasedcellularglucoseuptakeandGLUT-2translocationthroughAMPKdependentsuppressionofIGF-1R.8.Berberinedidn’tup-regulatephosphorylationofAktinIEC-6cells,PI3KinhibitorsWortmannincouldn’tblockberberine’seffectsoncellularglucoseuptakeandGLUT-2translocation.TheseresultsindicatedthatPI3K-Aktsignalingpathwaydidn’tpariticipantinberberine’seffectsofdecreasingcellularglucoseuptakeandGLUT-2translocation.Conclusions1.BerberinedecreasesintestinalglucoseabsorptionandimprovepostprandialhyperglycemiccontrolinT2DMthroughdecreasingGLUT-2localizationatbrushbordermembraneinintestinalepithelialcells.2.BerberinedecreasesGLUT-2localizationatbrushbordermembraneinintestinalepithelialcellsthroughAMPKdependentsuppressionofIGF-1R-PLC-β2-GLUT-2signalpathway.Keywords:Berberine;Type2DiabetesMellitus;Postprandialhyperglycemia;Intestine;Glucosetransporter2-11- 空军军医大学硕士学位论文前言糖尿病是威胁人类健康的重大疾病。截止2012年，世界糖尿患病人口为3.66亿[1][2]。中国成年人糖尿病患病率高达11.6%，患病人数位居全球首位。糖尿病给患者个人和国家带来了巨大经济负担。糖尿病的低知晓率和低控制率极大制约着糖尿病的预防和有效控制。因此，针对糖尿病，尤其是糖尿病前期，如何进行有效治疗一直以来都是基础研究和临床研究的重要方向。流行病学研究显示，中国2型糖尿病伴有餐后血糖升高的患者比例高，而糖尿[3]病前期患者中约70%为单纯性葡萄糖耐量受损。餐后血糖升高往往是引起糖尿病慢性并发症的主要因素，控制餐后血糖达标是防治糖尿病和糖尿病慢性并发症的重要策略。小肠在糖尿病发生发展过程中扮演着重要的角色，小肠葡萄糖吸收功能的病理性增强是糖尿病前期餐后血糖升高和机体胰岛素抵抗发生的重要原因。糖尿病状态下，存在于小肠黏膜上皮细胞内的葡萄糖转运蛋白GLUT-2在小肠黏膜上皮细胞[4]刷状缘持续性定位，这可能与糖尿病小肠葡萄糖吸收功能增强及餐后高血糖密切相关。纠正小肠葡萄糖吸收功能的病理性增强对预防和治疗餐后高血糖具有重要意义。[5]小檗碱是一类异喹啉生物碱，其抗糖尿病作用被广泛研究。小檗碱的抗糖尿病作用主要表现在小檗碱具有改善糖尿病心血管功能、改善糖脂代谢、纠正糖尿病和心血管疾病的危险因素等诸多方面，对机制的研究已经较为深入，其中最重要的是[6]小檗碱激活AMPK进而发挥调节代谢和减轻糖尿病心血管损伤的积极作用。但小[7]檗碱极低的生物利用度成为其临床应用的主要障碍。有研究表明，小檗碱在肠道局[8]部浓度高，并且提出了小檗碱改善脂代谢紊乱从而治疗糖尿病的肠道机制，主要作[9][10]用机制包括优化肠道菌群结构和促进肠促胰岛素释放发挥调节代谢的功能等。这些成果部分的解释了小檗碱在生物利用度极低的情况下依然能够改善糖尿病的机制。但是，针对与糖尿病进展密切相关的餐后血糖升高的相关研究鲜有报道，小檗碱针对糖尿病的这一发病机制是否具有治疗作用的研究依然是空白，针对上述问题，我们课题组在以往研究的基础上，从影响小肠葡萄吸收功能和调节餐后血糖的角度，对小檗碱降低糖尿病餐后血糖的肠道机制做了深入研究。-12- 空军军医大学硕士学位论文文献回顾一、2型糖尿病与餐后血糖升高2型糖尿病（T2DM）是一种复杂的慢性疾病，是以高血糖为特征的代谢性疾病。美国糖尿病协会关于2型糖尿病的诊断标准为：空腹血糖≥7.0mM；或口服葡萄糖耐量实验（OGTT)2小时血糖≥11.1mM；具有高血糖典型症状或存在高血糖危象[11]者，随机血糖≥11.1mM；糖化血红蛋白（HbA1c）≥6.5%。1.糖尿病发病机制2型糖尿病是一种多病因综合征，其发病原因尚未完全阐明，与肥胖、遗传因素、[11]不良饮食习惯等多种因素有关。其中，胰岛素抵抗是多种病因所致2型糖尿病发[12]病的共同病理基础。胰岛素是目前已知的机体唯一降低血糖的激素，胰岛素抵抗是指机体组织器官，主要包括骨骼肌、肝脏、脂肪等与利用葡萄糖维持血糖稳态密切相关的组织器官，对胰岛素的反应性和敏感性下降，从而出现胰岛素不能有效促[13]进机体对葡萄糖吸收而血糖持续维持较高水平的状态。2.糖尿病的治疗方法美国糖尿病协会推荐的2型糖尿病治疗原则和方案包括：血糖控制、药物治疗和总体治疗方案、医学营养治疗、糖尿病自我管理和支持，体力活动、心理评估与[14]治疗以及并发症的预防和治疗等诸多方面。其中，糖尿病患者的自我管理和支持是糖尿病血糖控制的基础，而依赖于药物治疗和总体治疗方案实现对血糖的精准有效控制是治疗2型糖尿病的重要方面。药物治疗原则包括：对于没有禁忌症和良好胃肠道耐受性的2型糖尿病患者，最佳的一线治疗是二甲双胍；如果非胰岛素单药以最大耐受剂量治疗3个月仍不能达到或维持HbA1c目标，则需要加用第二种药物联合治疗，主要包括GLP-1受体激动剂、胰高血糖素样肽或胰岛素以及其他口服降糖药物。二线口服药物主要包括噻唑烷二酮类药物、胰岛素促泌剂和DPP-4抑制剂。降糖药物治疗的主要机制包括提高外周组织的胰岛素敏感性、增加胰岛素的分泌、增加外周组织器官摄取葡萄糖、减少肝糖原的输出、降低肝脏糖异生作用、延迟葡萄糖在肠道吸收、抑制多糖和二糖在小肠内分解为单糖等。其中，如DPP-4抑制剂[11]以及α-糖苷酶抑制剂等以肠道作为靶器官的药物得到越来越广泛的应用。-13- 空军军医大学硕士学位论文3.中国2型糖尿病餐后高血糖餐后高血糖的定义是进食后1-2h餐后血糖高于7.8mM。目前研究认为餐后高血糖的主要病理生理基础与第一时相胰岛素分泌不足、外周组织胰岛素敏感性下降、胰高血糖素水平升高及餐后肝糖原输出的持续增高有关。中国大部分2型糖尿病患者均同时伴有餐后血糖升高，在2型糖尿病患者中，单纯性餐后高血糖患者比例高[3]达50%，糖尿病前期患者中约70%为单纯性葡萄糖耐量受损。餐后高血糖是导致[15]糖化血红蛋白（HbA1c）升高的主要原因之一，餐后血糖升高与糖尿病并发症发生发展密切相关，因此，降低餐后高血糖是使HbA1c水平达标以防治糖尿病慢性并发症的重要策略。餐后或负荷后高血糖与多种疾病相关，包括：餐后高血糖与糖尿病大血管和微血管并发症的发生风险增高密切相关，餐后或者负荷后血糖升高与心血管疾病发生[16]风险及其结局相关，流行病学观察性研究表明：2h餐后血糖是全因死亡的独立危[16-18]险因素，是心血管疾病死亡的预测因素。餐后高血糖参与糖尿病慢性并发症发生的机制可能与血糖波动有关，降低餐后血糖可以减轻炎症、改善氧化应激水平和[19]内皮细胞功能，并可以降低血栓形成的风险。此外，餐后高血糖还与其他多种心血管疾病的危险因素相关，包括心肌血容量和血流降低、餐后血液高凝状态、以及[20]颈动脉内-中膜增厚等。餐后血糖升高恶化胰岛β细胞功能。也有研究认为，餐后[21]高血糖与神经系统退行性改变相关。控制餐后高血糖可带来较好的临床收益，包括有助于降低心血管事件发生风险、[19]HbA1c水平达标、纠正心血管疾病危险因素等。餐后血糖的管理包括生活方式干[3]预以及降糖药物的应用等手段。其中，以降低餐后血糖为主的口服降糖药物包括二肽基肽酶-4抑制剂、α-糖苷酶抑制剂、短效磺脲类促泌剂、格列奈类促泌剂；以降低餐后血糖作用为主的注射制剂包括短效胰高血糖素样肽-1受体激动剂、速效胰岛素类似物、短效胰岛素等。这些药物的作用机制可归为两类：促进胰岛素释放或增加胰岛素敏感性从而降低血糖；抑制小肠局部碳水化合物消化和吸收降低餐后血糖。其中，小肠作为葡萄糖吸收的最主要场所，在餐后血糖升高的发生和临床控制中均扮演重要角色，而就糖尿病状态下小肠葡萄糖吸收功能开展的研究较少，以此为靶点控制餐后血糖的可能性有待进一步研究予以证实。-14- 空军军医大学硕士学位论文二、小肠葡萄糖吸收与2型糖尿病1.小肠葡萄糖吸收过程1.1小肠葡萄糖转运蛋白研究表明，小肠葡萄糖吸收由两种葡萄糖转运蛋白介导：钠-葡萄糖共同转运体[4]1（SGLT-1）以及葡萄糖转运体2（GLUT-2）。SGLT-1介导的主动转运：既往研究认为，小肠葡萄糖的吸收是由小肠上皮细胞刷状缘SGLT-1通过主动转运来实现，由基底膜的钠钾-ATP酶供能。在肠腔葡萄糖浓度低于血液葡萄糖浓度时，SGLT-1逆浓度梯度转运葡萄糖至小肠黏膜上皮细胞。在小肠黏膜上皮细胞基底侧，葡萄糖经GLUT-2以易化扩散的方式最终进入血液。果糖则是由在上皮细胞刷状缘定位的GLUT-5以易化扩散方式吸收，这在整个小肠[22]都具有特异性。在小肠黏膜上皮细胞基底侧，果糖通过GLUT-2转运进入血液。GLUT-2介导的易化扩散：Debnam和Levin进行的在体小肠葡萄糖吸收动力学分析显示：主动转运途径介导的糖吸收在葡萄糖浓度为30mM时达到饱和，而扩散[23]转运介导的糖吸收在葡萄糖浓度为30-100mM时呈现非饱和线性动力学趋势。通[24]过果糖吸收实验，Corpe等证明了扩散途径的实质是由GLUT-2介导的易化扩散，由此，小肠葡萄糖的吸收机制基本阐明：在肠腔葡萄糖浓度小于30mM时，上皮细胞吸收葡萄糖主要由SGLT-1以继发性主动转运的方式介导；当葡萄糖浓度大于30mM时，吸收主要依赖于GLUT-2，此时，上皮细胞基底侧及胞浆中以囊泡形式存在的GLUT-2向刷状缘转位，以易化扩散的方式转运葡萄糖进入上皮细胞；定位在基[25]底侧的GLUT-2进一步将葡萄糖转运至血液。1.2GLUT-2转位调节机制GLUT-2转位介导的葡萄糖吸收是小肠葡萄糖吸收的主要贡献因素，而调控GLUT-2转位的因素间接影响小肠吸收功能，对于维持机体葡萄糖稳态具有重要意义。[26]1.2.1.胞内信号分子：Helliwell等的研究提示胰岛素信号通路在GLUT-2转位的调控中起重要作用：磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）可降低GLUT-2转位，并增加其活性。细胞外信号调节激酶（ERK）可以降低GLUT-2内在活性，而对GLUT2转位影响不明显。P38分裂原激活的蛋白激酶（P38MAPK）增加GLUT-2内在活性，促-15- 空军军医大学硕士学位论文[27]进转位，最终可促进果糖吸收。Zheng等研究发现，PKCβⅡ与GLUT-2转位呈正[28]相关关系。此外，Walker等的研究表明，激活AMPK可促进GLUT-2向刷状缘转位并增加由GLUT2介导的葡萄糖转运。GLUT-2转位至刷状缘并介导葡萄糖吸收，依赖于P38MAPK对GLUT-2内在活性的调节作用。1.2.2.上皮细胞细胞膜葡萄糖敏感性受体：小肠上皮细胞膜存在有多种葡萄糖感受器，能够将外界的糖刺激传递至上皮细胞内，引起GLUT-2转位，这些感受器包括甜味受体（TIR2/3）、GLUT5、SGLT-1、和ATP敏感性的钾通道（KATP）。这些葡萄糖感受器对葡萄糖吸收的调节作用均是通过调控胞膜的葡萄糖依赖性非经典长开放型电压敏感性钙通道（Cav1.3），促进钙离子内流，通过引起细胞骨架蛋白改变，[29]促进GLUT-2转位来实现的。餐后肠腔葡萄糖浓度升高，一方面，葡萄糖通过SGLT-1转运进入细胞，此时，由于胞内葡萄糖充足，生成ATP增多，胞膜KATP呈关闭状态，钾离子外流降低，细胞膜电位复极时相延长，电压敏感性钙通道开放，钙离子内流，GLUT-2向胞膜转位。另一方面，葡萄糖激活甜味受体T1R2/3，进而磷脂酶C的β2亚基（PLC-β2）异构，激活磷脂酰肌醇，生成IP3与DAG，IP3进一步激活使肌质网上的钙离子通道开放，胞内钙离子浓度增多，激活PKCβⅡ，后者通过关闭KATP而使细胞膜处于去极化状态，[30]进而激活胞膜Cav1.3，引起钙离子内流，最终胞内钙离子升高，促进GLUT-2转位。1.2.3.内分泌激素：影响小肠黏膜上皮细胞GLUT-2转位的内分泌激素包括：胰岛素、GLP-1、GLP-2、GIP、瘦素、糖皮质激素等。（1）胰岛素：餐后胰岛素大量分泌，促使外周胰岛素敏感的靶器官中GLUT4向胞膜转位，进而将葡萄糖转运进入组织器官，降低血糖。在小肠，胰岛素的作用是使GLUT-2脱离刷状缘及基底膜，即胰岛素对GLUT-2具有“内化”作用。内化作用在餐后肠腔高糖的情况下依然存[31]在，这表明胰岛素可以降低小肠葡萄糖吸收，从而降低餐后血糖。（2）肠道内分泌激素：GIP是由小肠K细胞分泌的，GLP-1、GLP-2是由L细胞分泌的。GIP与GLP-1具有相似的功能，可以促进胰岛素的分泌，进而胰岛素内化GLUT-2；并且可[32]抑制胃排空。GLP-2与小肠GLP-2受体结合，可在肠腔低糖、肠系膜血管内灌流[33,34]GLP-2的情况下在极短时间内促进GLUT-2转位。（3）瘦素：瘦素是在营养物质摄入时，脂肪组织释放的一种激素，瘦素受体表达在肠上皮细胞的刷状缘和基底侧。瘦素与其受体结合可以抑制由SGLT-1介导的葡萄糖转运，但对于刷状缘GLUT-2-16- 空军军医大学硕士学位论文介导的葡萄糖吸收无明显作用。肠道内分泌细胞同时表达瘦素受体和甜味受体，随着血清瘦素浓度增高，肠道内分泌细胞的甜味受体对甜味剂的反应性降低，但这一[35]现象与小肠GLUT-2转位作用的关系缺乏直接证据。(4)应激和糖皮质激素：多种形式的应激会引起糖皮质激素释放增多，进而引起不同程度的胃肠功能障碍。由环境改变引起的应激状态会抑制GLUT-2介导的葡萄糖吸收，但SGLT-1介导的葡萄糖吸收不受影响，这种效应可以通过给予动物地塞米松诱导。在禁水应激情况下，SGLT-1的活性被抑制，这是由于上皮细胞的钠钾-ATP酶的活性受到抑制，而此时刷状缘GLUT-2的定位呈现倍数升高。在禁食应激时，肠腔内糖的吸收主要依靠SGLT-1完成；复食后，GLUT-2会迅速向刷状缘转位。由此可见，不同应激环境因素会通过[4]不同机制影响GLUT-2的转位，最终影响小肠葡萄糖的吸收。[36]图1餐后GLUT-2转位至刷状缘介导小肠葡萄糖吸收及转位主要调控机制2.糖尿病小肠葡萄糖吸收功能病理性增强糖尿病发病与过度摄入高能量营养物质密切相关。研究表明，患有肥胖、糖尿病人群的小肠葡萄糖吸收相较于正常人更加迅速和高效，这与小肠葡萄糖转运蛋白[37][31]功能异常密切相关。Tobin等发现对胰岛素敏感性好的小鼠，GLUT-2呈现在刷状缘一过性定位，在高果糖饮食30天或高脂饮食12周诱导成为胰岛素抵抗模型小鼠后，胰岛素不能使定位于刷状缘的GLUT-2内化，即使血糖异常升高，GLUT-2依[37]然持续性定位于刷状缘。Nguyen等在人体试验中发现，相较于正常人群，患有肥-17- 空军军医大学硕士学位论文胖及2型糖尿病的患者小肠葡萄糖吸收能力增强，这与SGLT-1蛋白表达上调有关。[38]Ait-Omar等的研究提示，肥胖、糖尿病患者小肠黏膜上皮细胞GLUT-2呈现为在刷状缘的持续性定位。此外，在糖尿病患者中，GLUT-2在刷状缘持续性定位与肠道++炎症有关。研究提示：CD3和CD8T细胞富集程度与GLUT-2刷状缘定位有关，表[39]明二者共同或互为因果地参与到糖尿病和肥胖发病过程。以上研究表明，GLUT-2向刷状缘转位是调节小肠葡萄糖吸收功能的关键因素，GLUT2转位异常参与糖尿病的发病过程。3.纠正小肠葡萄糖吸收异常是糖尿病治疗的重要方面一些研究者认为，纠正小肠GLUT-2刷状缘持续性定位可能成为糖尿病治疗的[40]一个方向。Abbasi等研究提示，燕麦β-葡聚糖可下调小肠上皮细胞（IEC-6）GLUT-2和SGLT-1的表达，进而降低其对葡萄糖的转运能力，表明燕麦β-葡聚糖可降低餐后[41]血糖、降低糖尿病患病风险。Yu等研究壳寡糖（go2ka1）的抗糖尿病作用时，发现其抗糖尿病效应与抑制小肠葡萄糖转运体功能有关。以上研究均仅在小肠黏膜上皮细胞模型上研究，而实验动物在体实验及其机制研究尚属空白，但以小肠葡萄糖转运体作为靶点对糖尿病进行干预和治疗的研究已经逐步开展和深入。三、IGF系统与2型糖尿病1.IGF系统概述IGF系统主要包括胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子受体和胰岛素样生长因[42]子结合蛋白等。IGF主要由肝脏内合成，具有调节代谢水平、促进组织和细胞生长以及胰岛素样作用，主要包括IGF-1以及IGF-2。IGFBP是一类与IGF具有高度亲和力的结合蛋白，具有延长IGF半衰期、储存和转运IGF以及调节IGF生物活性等[43-45]方面的作用。IGF-1主要在肝脏中合成和分泌，其在体内的作用包括促进细胞和组织的生长、[45]参与创伤愈合过程、调控细胞的分化和成熟等。因其与胰岛素具有同源性，因此[46]具有胰岛素样生物学效应，包括促进外周组织器官葡萄糖摄取等。血液中的IGF-1主要与IGFBP结合形成复合物而以非游离态存在，在组织器官中，IGF-1与IGFBP[47]解离后，与其受体IGF-1R结合，进而发挥生物学作用。IGF-1R由两个α亚基和-18- 空军军医大学硕士学位论文两个β亚基构成，α亚基位于细胞膜外，作用为提供配体结合的位点，β亚基位于细[48]胞膜内，具有酪氨酸蛋白激酶活性和传递跨膜信号的功能。根据与IGF亲和力的差别，IGFBP家族蛋白分为高亲和力结合蛋白IGFBP-1-6和低亲和力结合蛋白IGFBP-rP，如IGFBP-7等。其中，IGFB-3是机体内含量最多的IGFBP，90%IGF-1与IGFB-3结合形成复合物。此外，IGFB-3可以竞争性与IGF-1R结合，从而调节局[49]部IGF-1浓度。2.IGF-1、IGFBP与2型糖尿病经典观点认为，IGF-1是一种对细胞和组织增殖和生长至关重要的因素，实际上，[50]IGF-1同时具有重要的调节代谢的效应。胰岛素是葡萄糖代谢最重要调节激素，而IGF-1/IGFBP在维持葡萄糖稳态方面同样起到一定作用。许多研究已经证实，IGF-1可以促进外周组织葡萄糖摄取，减少肝脏糖异生过程，并且有研究发现在不同程度[50]的机体胰岛素抵抗存在时，局部IGF-1浓度与组织胰岛素敏感性具有相关性，外源性给予IGF-1治疗可显著降低葡萄糖耐量异常患者的血糖水平。这些发现提示血[51]清IGF-1和IGFBP水平可能会影响2型糖尿病相关的危险因素。IGFBP在葡萄糖[52]代谢的调节中也具有一定作用，在血清中含量最丰富的IGFBP-3可阻断IGF-1的[53,54]生物学效应，从而增加糖尿病患病风险。过表达IGFBP-3与空腹血糖升高和糖耐量受损关系密切。此外，IGF-1/IGFBP影响脂代谢，主要表现在：IGF-1可促进脂肪前体细胞向脂肪细胞分化，离体实验表明，IGF-1可促进脂肪细胞和肝细胞摄取游[46]离脂肪酸，使脂肪生成增加，外源性给予IGF-1可显著性降低游离脂肪酸水平。一系列研究证据表明IGF-1和IGFBP在维持正常葡萄糖稳态中起到重要作用[55][56]，IGFBP和IGF-1水平异常和2型糖尿病的发病密切相关。有研究表明：2型[57]糖尿病伴有IGFBP-3、IGF-1水平升高，IGFBP-1水平降低，但此结论目前尚存争议。一项大型的前瞻性研究表明，游离IGF-1水平和IGFBP-1,2,3与糖尿病发病具有[58]强相关性，提示IGF-IGFBP轴可以调节糖尿病的发病风险。四、小檗碱治疗2型糖尿病1.小檗碱概述小檗碱是中药黄连的有效成分，是异喹啉类的生物碱。口服小檗碱后，超过80%-19- 空军军医大学硕士学位论文的药物以原型经胃肠道排出体外，首过消除主要发生在小肠，最终进入血液循环的[7]部分不足10%，进入机体内小檗碱主要在肝脏富集，其次，在骨骼肌、肾脏、心脏[59]和胰腺中聚集。大量的研究发现小檗碱具备多重生物学效应，包括调节微生物、[60-62]降糖降脂、抗炎抗肿瘤等的作用。小檗碱通过多种机制发挥生物学效应，其中，[63]AMPK信号通路是小檗碱发挥作用的重要机制。腺苷单磷酸蛋白激酶(AMPK)是能量代谢的感受器和调节器，AMPK激活可以提高脂肪酸氧化，增加葡萄糖转运，改善外周组织对胰岛素的敏感性。在脂肪细胞研究中发现：小檗碱可上调AMP/ATP比值，上调AMPK磷酸化，增加线粒体生物合成并促进脂肪酸氧化，同时増加葡萄糖[64,65]摄取，促进其吸收和利用。2.小檗碱治疗2型糖尿病及机制[5,63,66]近年来，小檗碱的抗糖尿病效应得到越来越广泛的证实。在STZ联合高脂饮食诱导的2型糖尿病动物模型上证实，小檗碱可显著降低口服葡萄糖耐量实验[67]的血糖水平，减少糖尿病发生。与此同时，小檗碱可以降低空腹血糖、血清胆固[68-70]醇、甘油三酯以及游离脂肪酸水平，增加高密度脂蛋白及apoA-1水平。在四氧嘧啶配合高胆固醇饮食诱导的糖尿病动物模型实验中，小檗碱可以改善血糖和血脂，[71]在心肌组织中增加抗氧化酶水平，同时保护胰腺功能。小檗碱改善葡萄糖代谢的机制可能依赖于其可以促进GLP-1的释放，GLP-1由肠道内分泌细胞分泌，可以促[72,73]进胰岛β细胞增殖和释放胰岛素；增加肝脏和脂肪的胰岛素受体的表达水平。同时，小檗碱通过影响糖异生相关基因的功能从而以胰岛素非依赖的途径改善葡萄[74,75]糖代谢。在瘦素受体敲除的糖尿病动物模型上，小檗碱除可降低空腹血糖水平[76]和改善葡萄糖耐量之外，还可降低体重、改善肝脏脂肪代谢。同时，也有实验证据表明，小檗碱可以增加能量代谢、减轻体重，通过增加棕色脂肪含量增加寒冷耐[77]受，这也提示，小檗碱对于治疗肥胖症具有特殊作用。小檗碱所发挥的以上作用均部分的依赖于其对AMPK的激活作用，在肝脏组织中，小檗碱发挥的增加脂肪酸氧化、调节脂肪代谢相关基因功能等作用均与其激活AMPK相关。小檗碱可以改善[78,79]糖尿病动物模型氧化应激水平和炎症状态。例如，在心肌组织中，小檗碱可以改善高糖高胆固醇血症引起的心肌损伤，主要通过增加心肌脂肪酸转运蛋白的表达[80]水平、增加脂肪酸β氧化、葡萄糖转运体和PPARγ的表达，降低PPARα表达。小檗碱治疗能够改善糖尿病动物心脏功能、缓解缺血再灌注引起的心肌损伤。在肾-20- 空军军医大学硕士学位论文脏，小檗碱治疗可以改善糖尿病引起的肾小管功能异常，包括肾小球硬化、血液尿[81,82]素氮增加、肌酐清除率下降、蛋白尿等，预防糖尿病引起的肾脏组织结构改变。3.小檗碱在肠道局部的药理作用小檗碱生物利用度低，绝大部分小檗碱以原型形式存在于胃肠道并排出体外。近年来，小檗碱在肠道局部发挥抗糖尿病效应的机制逐步被揭示，但依然有诸多重要问题亟需解决。越来越多的研究证明，肠道菌群对于调节身体健康状况具有十分重要的意义，肠道菌群与糖尿病、肥胖以及心血管疾病等疾病的发生发展关系密切。就能量代谢而言，肠道菌群可以通过自身发酵作用产生短链脂肪酸，从而对宿主机体代谢水平[9,83]具有潜在益处。小檗碱可以调节肠道菌群结构，并且通过乙酰基辅酶A-丁酰辅[84]酶A-丁酸通路促进肠道菌群产生丁酸，进而发挥降低血脂降低血糖等生物学效应。此外，肠道细菌来源的脂多糖经过破损的小肠黏膜进入血液形成的代谢内毒素血症是引发机体炎症状态的重要方面。有研究表明，小檗碱可以通过调节肠道菌群，使[85]产生脂多糖的肠道细菌减少，进而减轻代谢内毒素血症，从而改善高脂饮食诱导糖尿病模型的肥胖和胰岛素抵抗状态。小檗碱可以增加小肠L细胞的数量，进而增加血清GLP-1水平，发挥改善糖尿病效应，同时小檗碱具有抑制二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）的作用，通过抑制GLP-1降[86]解，增加小肠局部和循环GLP-1水平。更进一步的研究表明，小檗碱可以增加回肠GLP-2的释放，从而增加小肠黏膜的增殖，改善由细菌脂多糖引起的炎症反应而[87]起到抗糖尿病的作用。更多的实验证据表明，小檗碱可以修复糖尿病模型动物受[88][89]损的小肠黏膜、保护小肠正常的渗透性、改善内毒素血症。也有研究认为，小[90]檗碱对小肠黏膜的修复作用与抗炎作用与其对IGF-1/IGFBP-3的调节作用相关。[91]此外，小檗碱可以降低小肠双糖酶活性，降低双糖酶mRNA水平，通过抑制碳水[92]化合物在小肠内的消化过程改善STZ诱导糖尿病大鼠的血糖。-21- 空军军医大学硕士学位论文正文糖尿病逐渐成为威胁人类健康的重要疾病，其发病机制复杂。近年来，大量研究提示：病理性小肠葡萄糖吸收能力增强在糖尿病发病中扮演重要角色。如何维持小肠葡萄糖吸收功能正常，成为预防和治疗糖尿病的新热点之一。既往研究认为，存在于小肠部位葡萄糖吸收主要由两种葡萄糖转运体介导，分别为钠-葡萄糖共转运体1（SGLT-1）以及葡萄糖转运体2（GLUT-2）。其中，餐前状态时的小肠葡萄糖吸收主要由SGLT-1介导，而GLUT-2由胞质向细胞刷状缘的转位是餐后小肠上皮细胞吸收葡萄糖的主要途径。刷状缘GLUT-2持续性定位引起的病理性小肠葡萄糖吸收增多是导致糖尿病患者餐后血糖升高的一个重要原因。因此纠正糖尿病状态下GLUT-2在小肠黏膜上皮细胞刷状缘的持续性定位对于降低糖尿病餐后血糖和治疗糖尿病尤为重要，目前关于这方面的研究仍然鲜有报道。小檗碱是异喹啉类生物碱，其抗糖尿病效应近年来逐渐受到重视。研究表明，小檗碱可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶及胰岛素受体信号通路改善糖尿病大鼠肠系膜血管胰岛素敏感性、改善糖尿病心肌缺血再灌注损伤。但因其生物利用度低，超过80%小檗碱以原型经肠道排出体外，小檗碱抗糖尿病效应的机制一直存在争议。小檗碱抗糖尿病效应的肠道机制已有一些研究进展，其中较为重要的包括肠道菌群机制、肠促胰岛素机制、抑制二糖酶机制等，但就糖尿病状态下病理性增强的小肠葡萄糖吸收功能而进行的相关研究尚属空白，明确小檗碱是否能够纠正刷状缘GLUT-2持续定位进而发挥抗糖尿病效应十分必要。本研究旨在探讨小檗碱对糖尿病小肠葡萄糖吸收功能的影响，尤其是对小肠葡萄糖转运蛋白的作用，并进行深入机制研究，进而从小檗碱纠正小肠葡萄糖吸收功能异常的角度解析小檗碱抗糖尿病效应的肠道机制。-22- 空军军医大学硕士学位论文1材料1.1实验动物和细胞4-6周龄的雄性C57BL/6J小鼠，平均体重为20g，购于第四军医大学实验动物中心。IEC-6细胞系：大鼠小肠黏膜上皮细胞系，购自广州吉妮欧生物科技有限公司（2代）。1.2主要仪器超纯水系统Millipore,USA磁力搅拌器（IKA）广州仪科实验室技术有限公司，中国CO2恒温孵箱ThermoElectronCorporation,USA高速低温离心机Biofuge,Germany电湿转系统Bio-Rad,USA恒温摇床（HQ-45）武汉科学仪器厂，中国精密电子天平北京赛多利斯科学仪器有限公司，中国酶标仪MolecularDevices,USApH计ThermoElectronCorporation,USA循环恒温水浴槽成都仪器厂，中国组织匀浆仪（Diax900）Heidolph,Germany血糖仪LifeScan,USA电泳仪Bio-Rad,USAPCR仪Bio-Rad,USA共聚焦显微镜ZEISS,Germany电子显微镜JEM-1230,Japan-23- 空军军医大学硕士学位论文1.3主要试剂45%fat高脂饲料江苏美迪森生物科技有限公司，中国AG1024MCE,USABCA蛋白定量试剂盒Pierce,USACompoundCSigma,USAECL发光液Millipore,USAHRP标记山羊抗兔二抗壮志生物科技有限公司，中国HRP标记山羊抗小鼠二抗壮志生物科技有限公司，中国Minute总膜和质膜提取试剂盒InventBiotechnologies,Inc.Phloretin,PhloridzinSigma,USAPMSF碧云天生物技术研究所，中国PVDF膜Millipore,USASDS-PAGE凝胶配制试剂盒科昊生物工程有限公司，中国Teneligiliptin(HY14806)MCE,USAU73122MCE,USA低糖DMEMGibco,USA高糖DMEMGibco,USA抗Akt抗体CellSignalingTechnology,USA抗AMPK抗体CellSignalingTechnology,USA抗GLUT-2抗体SANTACRUZE,USA抗GLUT5抗体SANTACRUZE,USA抗IGF-1R抗体CellSignalingTechnology,USA抗p-Akt抗体CellSignalingTechnology,USA-24- 空军军医大学硕士学位论文抗p-AMPK抗体CellSignalingTechnology,USA抗p-IGF-1R抗体CellSignalingTechnology,USA抗PLC-β2抗体SANTACRUZE,USA抗SGLT-1抗体Abcam,USA抗β-Actin抗体CellSignalingTechnology,USA牛血清白蛋白（BSA）科昊生物工程有限公司，中国葡萄糖测定试剂盒上海荣盛生物药业有限公司，中国胎牛血清（FBS）ZETA,USA吐温(Tween-20)博士德生物，中国戊巴比妥钠（粉剂）科昊生物工程有限公司，中国小鼠GLP-2ELISA试剂盒酶联生物，中国小鼠IGF-1ELISA试剂盒北京四正柏生物科技有限公司，中国小鼠IGFBP-3ELISA试剂盒上海西唐生物科技有限公司，中国小鼠胰岛素ELISA试剂盒依科赛生物科技有限公司，中国小鼠胰高血糖素样肽1ELISA试上海西唐生物科技有限公司，中国剂盒一抗/二抗去除液碧云天生物技术研究所，中国一抗稀释液碧云天生物技术研究所，中国组织细胞裂解液（RIPA）碧云天生物技术研究所，中国-25- 空军军医大学硕士学位论文2方法2.1糖尿病动物模型的制备4-6周的雄性C57BL/6J小鼠，隔夜禁食12小时，按30mg/kg，BW腹腔注射链脲佐菌素，注射后4小时复食高脂饲料。48小时后，再次空腹注射STZ。一周后测空腹血糖，以空腹血糖大于7.0为标准，判断造模是否成功。对于未造模成功的小鼠，补充注射一次STZ。链脲佐菌素配置方案：A液：2.1g柠檬酸+超纯水100mlB液：2.94g柠檬酸钠+超纯水100mlA液与B液按照1:1混合，调pH=4.2-4.4，作为STZ的溶剂避光条件下，配制10mg/ml的STZ溶液，30min内注射完毕2.2实验分组小鼠按照随机数表法随机分为4组：A．正常对照组（control）：每日灌胃生理盐水，灌胃6周B．正常+小檗碱灌胃组（control+BBR）：每日灌胃小檗碱200mg/kg，BW，灌胃6周C．糖尿病组（DM）：诱导模型成功后，每日灌胃生理盐水，灌胃6周D．糖尿病+小檗碱灌胃组（DM+BBR）：诱导模型成功后，每日灌胃小檗碱200mg/kg，灌胃6周。小檗碱灌胃溶液配制：配制20mg/ml的小檗碱悬浊液，溶于生理盐水，灌胃时，以0.1ml/10g体重灌胃。小檗碱灌胃浓度的确定：依据我们课题组对小檗碱治疗糖尿病浓度梯度的探索所得出的结论，即按照200mg/kg体重，每日灌胃小檗碱可以达到对糖尿病的最佳控制效果。2.3血糖测定（FBG，OGTT，IPGTT）空腹血糖（FBG）：各组小鼠隔夜禁食（22:00至次日8:00）10小时后，进行尾尖取血，为排除组织液大量渗出对测量结果的干扰，尾尖后第一滴血用棉球拭去，自尾根部向尾尖部轻轻挤压，第二滴血滴入试纸，血糖仪测量血糖值，并记录。-26- 空军军医大学硕士学位论文口服葡萄糖耐量实验（OGTT）、腹腔注射葡萄糖耐量实验（IPGTT）：各组小鼠隔夜禁食（22:00至次日8:00）10小时后，进行口服葡萄糖耐量实验和腹腔注射葡萄糖耐量实验：尾尖取血，利用血糖试纸测空腹血糖并称量体重；配置20%葡萄糖溶液，按照2g/kg体重的葡萄糖量进行灌胃（OGTT）或腹腔注射（IPGTT），即按照0.1ml/10g体重进行灌胃，分别于0、15、30、60、120min测量血糖水平。小檗碱单次给药的口服葡萄糖耐量实验：对照组给予20%葡萄糖溶液灌胃，对照+小檗碱组给予20%葡萄糖溶液+小檗碱灌胃，小檗碱给药200mg/kg体重。其余同上述口服葡萄糖耐量实验的方法。2.4动物组织取材和血清提取麻醉药品配置：1%戊巴比妥钠，称取0.1g戊巴比妥钠，加入10ml预冷生理盐水，震荡混匀后，置于冰上或4℃冰箱避光保存。给药剂量为：0.1ml/10g，BW。各组小鼠称重后，按2g/kg，BW剂量灌胃20%葡萄糖；25min后，进行麻醉。分离一侧颈总动脉，并取血，盛装全血的离心管中预先加入DPP-4抑制剂Teneligiliptin2μl，静置15min后，3500×g离心15min，取上清，分装100μl/支，标记编号后，-80℃冰箱保存。取材前，预先准备好电镜固定液（含0.5%戊二醛的4%多聚甲醛溶液）、组织固定液（4%甲醛溶液）、液氮。待动物麻醉、取血后，迅速打开腹腔，每只动物均以屈氏韧带为起点取1cm小肠肠段，迅速放入电镜固定液中，固定超过4小时后进行免疫电镜相关实验。迅速取2-3cm小肠肠段，放入组织固定液中，留待切片染色。取3-5cm小肠肠段，迅速放入液氮中冷冻，取材完成后所有冰冻组织统一放入-80℃冰箱冷冻保存。2.5ELISA检测血清内分泌激素小鼠血清胰岛素、GLP-1、GLP-2、IGF-1、IGFBP-3水平的检测均采用ELISA试剂盒进行。其中，胰岛素采用依科赛试剂盒，GLP-1采用西唐试剂盒，GLP-2采用酶联试剂盒，血清中和组织中的IGF水平检测采用四正柏ELISA试剂盒。实验流程均按照试剂盒要求的具体流程操作。血清样品避免反复冻融，组织中的内分泌激素采用总蛋白标准化后的组织裂解液进行检测。-27- 空军军医大学硕士学位论文2.6荧光法检测糖尿病模型小鼠小肠葡萄糖转运取各组小鼠屈氏韧带以下0-4cm的空肠，取材过程避免过度牵拉，保护肠道血管缘侧。迅速放入预冷的生理盐水中清洗肠壁，以丝线结扎肠段一端，另一端给药后立即结扎。给药即向肠腔中注射50mM葡萄糖+10μM2-NBDG溶液。反复冲洗后，将小肠肠段放入5ml，37℃，pH7.4的Krebs-Ringer碳酸氢盐（KRB）缓冲溶液中，液体预先通气（95%O2，5%CO2）。30min后测量KRB缓冲液中的荧光强度，测量结束后，去除肠段内容物，称量肠段质量。以荧光强度与肠段质量的比值代表肠道组织转运的葡萄糖的能力。2.7糖尿病模型小鼠粪便葡萄糖检测各处理组小鼠于实验前72小时统一更换为正常饲料饮食，实验前24小时更换垫料，统一加入相同质量的正常饲料，24小时后，捡取各组小鼠粪便20粒，称重，并称量剩余饲料质量，如此连续5日，收集粪便样本和进食量数据。利用烘干箱将粪便烘干，彻底碾碎后将粪便粉末混合均匀，称取相同质量的各处理组粪便粉末，加入同体积蒸馏水后，震荡混匀5min，离心1000×g10min，取上清，上清进一步离心2000×g10min，取上清，此时上清为透明的黄褐色液体，即为葡萄糖检测样本。葡萄糖检测利用上海荣盛生物药业有限公司的葡萄糖测定试剂盒进行，计算各组小鼠粪便葡萄糖，计算出的粪便葡萄糖与进食量（进食量/体重）的相对值即代表各组小鼠粪便葡萄糖含量。2.8荧光法检测小肠葡萄糖转运取6只大鼠（SD大鼠，6-8周龄，第四军医大学实验动物中心提供）屈氏韧带以下空肠：以屈氏韧带下缘为起点，取0-2cm、2-4cm、4-6cm、6-8cm、8-10cm肠段，同一只大鼠的5段肠段随机分为葡萄糖（50mM）组、葡萄糖+小檗碱（25μM）组、葡萄糖+小檗碱（50μM）组、葡萄糖+小檗碱（100μM）组。各组均加入2-NBDG终浓度为10μM。取材过程避免过度牵拉，保护肠道血管缘侧。迅速放入预冷的生理盐水中清洗肠壁，以丝线结扎肠段一端，另一端给药后立即结扎，反复冲洗后，将小肠肠段放入5ml，37℃，pH7.4的Krebs-Ringer碳酸氢盐（KRB）缓冲溶液中，液体预先通气（95%O2，5%CO2）。30min后测量KRB缓冲液中的荧光强度，测量结束后，去除肠段内容物，称量肠段质量。以荧光强度与肠段质量的比值代表肠道-28- 空军军医大学硕士学位论文组织转运的葡萄糖的能力。如上方案另取6只大鼠屈氏韧带以下空肠，随机分为葡萄糖组、葡萄糖+Phloridzin组、葡萄糖+Phloridzin+小檗碱组、葡萄糖+Phloretin组、葡萄糖+Phloretin+小檗碱组。肠段给药浓度如下：葡萄糖50mM，小檗碱50μM，Phloretin、Phloridzin浓度为0.5mM。各组均加入2-NBDG终浓度为10μM，测定各处理组肠道葡萄糖转运。2.9荧光法检测IEC-6细胞葡萄糖吸收在给予细胞药物处理时，控制细胞密度在80%左右。给予相应的处理（包括蛋白抑制剂、siRNA等）后，用37℃预热的DPBS轻柔洗涤贴壁细胞3次，加入含有10μM2-NBDG的DMEM培养基（用于溶解2-NBDG的DMEM培养基与细胞给药处理时的DMEM培养基的葡萄糖浓度保持一致）；将细胞放入培养箱中孵育20min；用预冷的PBS迅速、轻柔洗涤贴壁细胞，向六孔板中每孔加入细胞裂解液+蛋白酶抑制剂（100:1）120μl，细胞刮刮取细胞，冰上避光裂解15min，离心12000r/s，15min，取上清。90μl的上清液加入避光96孔板内，检测荧光强度（激发光485nm，发射光590nm）。BCA法蛋白定量确定蛋白浓度，以荧光强度与蛋白浓度的比值作为反应细胞葡萄糖吸收能力的指标。2.10蛋白免疫印迹2.10.1组织及细胞蛋白提取将各处理组小肠组织的血管缘一侧脂肪修剪干净，横切并称取小肠组织50mg，放入2ml离心管中，加入预冷PBS，剪碎肠道组织，在预冷至4℃离心机中以3500r/s，离心15min，去上清。向沉淀中加入蛋白裂解液（PIPA）+蛋白酶抑制剂（PMSF，工作浓度为1mM）500μl；利用QIGEN高通量组织匀浆器震荡匀浆5min，匀浆后将组织裂解液静置于冰上裂解15min，将裂解液移至1.5ml离心管中，预冷离心机离心12000r/s，15min，取上清，即为蛋白原液。对于细胞样品，将处理好的贴壁细胞用预冷PBS轻柔洗涤3次，吸干PBS后，加入蛋白裂解液（RIPA）+蛋白酶抑制剂（PMSF，工作浓度为1mM）；细胞刮刮取细胞，收集细胞于1.5ml离心管中，冰上静置裂解15min；4℃预冷离心机离心12000r/s，15min，取上清。即为提取的细胞蛋白原液。-29- 空军军医大学硕士学位论文2.10.2BCA法蛋白定量配制BCA蛋白定量工作液：A液：B液按50：1的比例配制，震荡混匀；蛋白标准品的配制：20mg牛血清白蛋白中加入10ml预冷的超纯水配制为2mg/ml的标准品，用PBS稀释标准品，分别配制浓度梯度的蛋白标准品（浓度分别为2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625、0mg/ml），配制完成后放在冰上待用；将待测蛋白样品用PBS稀释10倍（8μl样品+72μlPBS）；96孔板每孔加入工作液200μl，将蛋白标准品及样品彻底混匀后按照20μl/孔加入工作液中，每个标准品和样品设置3个复孔；37℃恒温摇床避光孵育15min；酶标仪测定562nm波长的OD值；用标准品的浓度梯度和相应的OD值做出标准曲线，并以此计算样品蛋白浓度；利用蛋白裂解液、5X上样缓冲液将样品浓度调至一致；金属浴100℃煮沸10min使蛋白变性，待降至室温后-20℃冰箱保存。2.10.3westernblot分析配制10%的SDS/PAGE的分离胶和和5%浓缩胶；上样：样品提前于冰上融化，充分混匀后按照总蛋白30μg上样；电泳：上层浓缩胶按80V、30min条件电泳，下层分离胶按照120V、90min的条件电泳；转膜：提前配制并预冷转膜液，将分离胶放入转膜液中静置10min，用甲醇溶液活化PVDF膜，按照超厚滤纸-PVDF膜-凝胶-超厚滤纸的顺序组装转膜夹子，以PVDF膜面向负极的方向插入湿转转膜装置，转膜条件为恒流0.3A、2h；封闭：5%的脱脂牛奶（用PBST配制）室温封闭2h；一抗孵育：封闭好的膜按照分子量的位置孵育相应的抗体（抗GLUT-2、抗SGLT-1、抗β-Actin、抗GLUT5、抗IGF-1R、抗PLC-β2、抗p-AMPK、抗AMPK），4℃孵育至少12h；二抗孵育：用PBST洗去未与蛋白结合的一抗，而后将膜与一抗相对应的辣根过氧化物酶标记的二抗于室温孵育2h，孵育完成后，用PBST洗去未结合的二抗；化学发光：在目的条带所在位置均匀滴加ECL化学发光液，用Bio-Rad成像系统采集成像。对结果采用QuantityOne软件进行灰度分析与比较。2.11实时定量PCR提取细胞总RNA的方法按Trizol试剂盒：PBS洗涤细胞样品两次，加入1mlTrizol试剂，刮取细胞并静置裂解。向细胞裂解液中加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使溶液水相和有机相充分混匀，室温条件静置5min。低温离心14000×g，15-30- 空军军医大学硕士学位论文min，小心将上层水相的RNA移至另一个新的无RNA酶的EP管。加入等体积异丙醇后，轻柔地充分混匀（颠倒6~8次），室温静置10min。低温离心14000×g，10min，RNA沉淀收集后，以75%乙醇清洗两次并分别以12000×g离心5min，去上清，超净台风干并加入适量DEPC水将沉淀溶解。按照反转录试剂盒说明书进行逆转录，通过实时定量PCR检测mRNA水平。实时定量PCR引物见表1。表1实时定量PCR引物序列GenesForwardprimerReverseprimer5’-AAGTCGAGGATCAGCGGGAA-3’5’-GGCCGTATAGTTCCCTGGGT-3’1RatIGF-1R5’-CGGTTGCCATCCTGCTGATT-3’5’-CCCGAGCTACCTCCCATTCA-3’2RatIGF-1R2.12组织和细胞的细胞膜蛋白提取利用Minute总膜和质膜提取试剂盒进行细胞膜蛋白的提取。A缓冲液以及B缓冲液在冰上融化后分别混匀。预冷离心管柱以及接收管套管。组织样品处理：将冰冻组织（20-30mg）放置于离心管柱上，剪碎，加入200μl缓冲液A，用塑料棒反复研磨组织后再加入300μl缓冲液A，用吸头吹打混匀后，开盖冰上孵育5min；细胞样品：细胞给药处理完毕后，预冷PBS洗涤贴壁细胞，吸干PBS后，加入200μl缓冲液A，冰上孵育5-10min，大力震荡10-30秒，细胞悬液移至离心管柱中；盖上盖子，16000×g离心2min；弃去离心管柱，大力震荡10秒后重悬细胞；700×g离心1min，上清移至到新的1.5ml离心管中，低温离心16000×g30min；弃掉上清，保存沉淀，向沉淀中加入200μl缓冲液B，用吸头反复吹打重悬总膜蛋白组分；低温条件，7800×g离心5min，小心将上清移至新的2.0ml离心管中，加入1.6ml预冷PBS后充分混匀；低温条件16000×g离心30min，弃掉上清，留存沉淀，即为细胞膜蛋白。用100μl0.5%TritonX-100的PBS溶液溶解即获得细胞膜蛋白原液，定量后进行后续分析实验。2.13小肠组织免疫荧光实验固定于4%甲醛溶液中的小肠组织进行冰冻切片；PBS清洗后，用5%BSA封闭30min；吸干BSA，每块组织滴加50μl一抗（GLUT-2抗体按照1:50溶于2%BSA溶液），并孵育至少12h；PBS洗涤组织4次，每次持续4min；37℃恒温摇床避光进行二抗（抗兔荧光二抗按照1:100溶于PBS溶液）孵育2h；PBS洗涤组织4次，-31- 空军军医大学硕士学位论文每次持续4min；DAPI细胞核染色15min；PBS洗涤组织4次，每次持续4min；配制50%甘油，封片，-20℃保存。2.14小肠组织和IEC-6细胞免疫电镜实验将各处理组空肠组织放于含有0.5%戊二醛的4%多聚甲醛溶液中固定4h，将空肠组织横切并修剪成小圆环状。对于细胞样品，将处理好的细胞用胰酶消化后，离心1000r/min，10min，细胞沉淀为片状，加入含0.5%戊二醛的4%多聚甲醛溶液固定4h，用细针将片状的细胞沉积轻挑至悬浮于固定液中；吸干固定液，用PBS清洗各组小肠组织5-10次；将组织或细胞完全浸入含有0.05%TritonX-100以及5%牛血清白蛋白封闭液中，室温条件下封闭3h；PBS反复洗涤15min后，放置于含有兔抗GLUT-2抗体（1:50）的一抗稀释液中，一抗稀释液是含有0.05%TritonX-100以及1%BSA的PBS溶液，室温孵育至少24h；经PBS洗涤后，各组小肠组织或细胞加入含有纳米金标记的抗兔IgG（1:100）二抗稀释液（同一抗稀释液），室温条件孵育至少12h；PBS反复洗涤组织或细胞15min，加入含有2%戊二醛的PBS溶液固定45min；PBS反复洗涤15min，再用去离子水反复冲洗10次，在避光调价下用银加强试剂盒显色，时间约10-15min。显色后，吸出显色剂，经去离子水、磷酸缓冲液反复洗涤干净后，将组织或细胞完全浸入0.5%锇酸中固定1.5h。PB反复洗涤组织或细胞后，经酒精梯度脱水、丙酮浸透、Epon812平板包埋、60℃聚合12h后，选取阳性标记较好的部位，粘贴于空白包埋块上，进行组织超薄切片，厚度约50nm，经铅铀双染后，JEM-1230透射电镜下观察结果。2.15IEC-6细胞培养采用4-10代的IEC-6细胞进行细胞实验。复苏：将冻存细胞于37℃中迅速解冻化开，将1ml解冻的冻存细胞溶于10ml含90%低糖DMEM培养基和10%胎牛血清的细胞培养基中。离心条件为1000r/min，5min，用细胞培养基轻柔重悬细胞，而后将细胞均匀铺在10cm无菌培养皿上，最后放在37℃细胞培养箱中培养，次日换液，待细胞密度长至约80%时进行传代。细胞传代培养：吸出培养皿中原有培养基，DPBS轻柔洗涤贴壁细胞2-3次，将1ml含EDTA的0.25%胰酶加入培养皿中，室温条件放置约4min，镜下观察细胞形态变为圆形时，加入含血清的培养基终止消化过程，用胶头滴管反复轻柔吹散细胞，离心条件为1000r/min，5min，再使用细胞培-32- 空军军医大学硕士学位论文养基重悬，按照1:3-4的比例均匀铺在新的10cm细胞培养皿内，待到细胞面积占培养皿面积的80%时进行传代或者下一步实验。2.16IEC-6细胞转染siRNATM接种细胞密度为30-50%。转染前准备：使用无血清DMEM稀释LipofectamineiMAX转染试剂（100μl无血清DMED+6μliMAX转染试剂）；使用无血清DMEM稀释siRNA（100μl无血清DMED+2μlsiRNA），轻柔均匀混合。而后将已经稀释的转染试剂和siRNA混合，室温条件下共孵育10min。转染：将共孵育的混合物加入到细胞培养基中，六孔板细胞为1800μl细胞培养基+200μl转染试剂和siRNA混合物。轻柔摇晃六孔板混匀培养基，将细胞移至细胞培养箱孵育6h后换液，48h进行转染后的其他实验部分。siRNA序列见表2。表2siRNA序列表Genessenseanti-sense5’-GCACCUCAAGAGGUAAUAA-3’5’-UUAUUACCUCUUGAGGUGC-3’GLUT-2-1Rat5’-CCCUCUGCUUCCAGUACAU-3’5’-AUGUACUGGAAGCAGAGGG-3’GLUT-2-2Rat5’-GCAUAUGCUGCAGGUAGAU-3’5’-AUCUACCUGCAGCAUAUGC-3’AMPKα-1Rat5’-CGUCAUUGAUGAUGAGGCU-3’5’-AGCCUCAUCAUCAAUGACG-3’AMPKα-2Rat5’-UUGUAGUAGUAGUGUCGGCTT5’-GCCGACACUACUACUACAATT-3’IGF-1R-1Rat-3’5’-CCUGUGAAAGUGAUGUUCUCCG5’-AAACGGAGAACAUCACUUUCIGF-1R-2RatUUU-3’ACAGG-3’5’-AAGAGAAAAAGCGAAGAGCCA-5’-UGGCUCUUCGCUUUUUCUCUnon-functionalmutant3’U-3’2.17统计学分析实验数据均以均数±标准误（mean±SEM）表示。采用GraphPadPrism5.0软件进行统计学分析，两组之间比较采用Dunnett-t检验，多个处理组两两之间比较采用SNK-q检验，以P<0.05表示为有显著统计学差异。-33- 空军军医大学硕士学位论文3结果3.1小檗碱灌胃6周降低糖尿病小鼠空腹血糖，改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性糖尿病小鼠模型诱导成模后，给予小檗碱200mg/Kg体重灌胃6周，监测体重及空腹血糖水平。结果提示：与正常组和糖尿病组小鼠相比较，小檗碱灌胃显著性降低正常+小檗碱灌胃组及糖尿病+小檗碱灌胃组的体重（control+BBRvs.control：2周22.55±0.67vs.25.18±0.47g，4周23.27±1.02vs.26.37±0.37g，6周24.23±1.1vs.27.74±0.333g；DM+BBRvs.DM：2周23.12±0.37vs.25.82±0.60g，4周24.00±0.82vs.27.73±0.97g，6周25.08±0.81vs.28.08±0.86g，n=6，均P<0.05，图1A）；与糖尿病组相比，小檗碱灌胃显著改善糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠空腹血糖水平（2周8.68±0.54vs.9.5±0.78mM，4周9.36±0.61vs.11.82±1.23mM，6周10.52±1.27vs.14.77±1.50mM，n=6，均P<0.05，图1B）；灌胃6周后，检测各组小鼠葡萄糖耐量情况以及全身胰岛素敏感性，结果提示，在OGTT实验及IPGTT实验中，与糖尿病组相比，小檗碱灌胃能够显著降低糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠各个时间点的血糖水平（图1C-D），并且小檗碱灌胃同样能够降低正常+小檗碱灌胃组动物在15min时的血糖水平（OGTT10.50±0.24vs.13.08±0.85mM，IPGTT13.80±1.08vs.18.11±1.20mM，n=6，均P<0.05，图1C-D），提示小檗碱灌胃6周能够显著改善糖尿病动物的葡萄糖耐量。与此同时，我们检测了小檗碱灌胃6周后，各组小鼠血清GLP-1和胰岛素水平，并计算了HOMA-IR值，结果表明，小檗碱灌胃6周可显著改善糖尿病小鼠全身胰岛素敏感性（HOMA-IR：DM+BBRvs.DM3.06±0.63vs.4.60±0.94，n=6，P<0.05，图1F），并能够显著提高GLP-1的分泌（DM+BBRvs.DM0.94±0.09vs.0.41±0.09ng/ml，n=6，P<0.05，图1G）。-34- 空军军医大学硕士学位论文图1.小檗碱灌胃6周降低糖尿病小鼠体重，降低空腹血糖并改善葡萄糖耐量和全身胰岛素敏感性A-B图：小檗碱灌胃6周过程中，各组小鼠体重变化和空腹血糖的变化。C-D图：小檗碱灌胃6周对各组小鼠葡萄糖耐量的影响。E-F图：小檗碱灌胃6周对各组小鼠血清胰岛素水平、HOMA-IR的影响。G图：小檗碱灌胃6周对各组小鼠血清GLP-1的影响。Control，对照组；Control+BBR，正常灌胃小檗碱（200mg/Kg，BW）组；DM，糖尿病组；DM+BBR，糖尿病灌胃小檗碱（200mg/Kg，BW）组；OGTT，口服葡萄糖耐量测定；IPGTT，腹腔注射葡萄糖耐量测定。正常小檗碱灌胃组与正常组相比：*P<0.05，**P<0.01，正常组与糖尿病组相比：#P<0.05，##P<0.01，糖尿病小檗碱灌胃组与糖尿病组相比：†P<0.05，††P<0.01，n=6/组。-35- 空军军医大学硕士学位论文3.2小檗碱降低餐后血糖依赖于其在小肠局部抑制葡萄糖吸收小檗碱经口服途径进入胃肠道后，超过80%未经小肠吸收进入机体，因此，研究小檗碱在小肠局部发挥的作用非常重要。而小肠葡萄糖吸收功能的异常在糖尿病的发展过程中扮演重要角色，我们通过离体的小肠荧光葡萄糖转运实验证明，与正常组相比，糖尿病组小肠葡萄糖转运能力显著性增强（2.19±0.07vs.1.00±0.06，n=6，P<0.05，图2A），与之对应的，糖尿病组小鼠单位进食量所产生的粪便中的葡萄糖含量较正常组显著性减少（0.70±0.03vs.1.00±0.08，n=6，P<0.05，图2B），以上结果提示，糖尿病状态下的小肠葡萄糖吸收功能呈现病理性增强。而经小檗碱灌胃6周后，我们发现，与糖尿病组相比，糖尿病+小檗碱灌胃组小肠荧光葡萄糖转运能力降低（1.19±0.08vs.2.19±0.07，n=6，P<0.05，图2A）。同时，糖尿病+小檗碱灌胃组单位进食量所产生的粪便中的葡萄糖含量较糖尿病组显著性升高（1.21±0.06vs.0.70±0.03，n=6，P<0.05，图2B），表明小檗碱可以纠正糖尿病状态下小肠葡萄糖吸收功能的病理性增强。在小檗碱灌胃6周过程中，大量滞留于肠道的小檗碱在局部可能发挥生物学作用，同时，少量进入血液循环中的小檗碱长期作用于机体组织，将会改善糖尿病小鼠肝脏、脂肪等组织器官胰岛素敏感性，因此，在第一部分结果中小檗碱改善糖尿病动物葡萄糖耐量的效应可能由其在肠道的局部机制和改善机体胰岛素敏感性机制共同促成，因此，为了进一步明确小檗碱在小肠局部的效应，我们采用单次灌胃小檗碱，观察不同途径负荷葡萄糖后，小檗碱对血糖变化的影响。通过小檗碱单次灌胃后的OGTT和IPGTT实验发现，当小檗碱以灌胃途径单次给药时，只能对经灌胃途径给予葡萄糖后引起的血糖升高具有降低作用，而并不能降低腹腔注射葡萄糖（直接经肠系膜静脉吸收入血）后引起的血糖升高，即在OGTT实验中，相较于对照组，小檗碱单次灌胃组的血糖显著性降低（15min时8.38±0.63vs.9.43±0.67mM；30min时7.88±0.52vs.8.52±0.26mM；60min时7.15±0.26vs.7.92±0.56mM，n=6，均P<0.05，图2C），而在IPGTT实验中，相较于对照组，小檗碱单次灌胃组的血糖并未出现显著性变化（n=6，图2D）。监测OGTT实验中各时间点血清ELISA水平，结果显示，相较于对照组各时间点，小檗碱灌胃组血清胰岛素水平降低，差异有统计学意义（15min时79.51±31.82vs.168.01±44.20；30min时61.81±43.19vs.130.90±19.13；60min时32.69±28.76vs.80.21±41.01；120min-36- 空军军医大学硕士学位论文时20.93±8.49vs.53.80±34.47(pM)，n=6，均P<0.05，图2E），而30min时间点，两组间GLP-1变化无统计学差异（图2F），结果表明小檗碱灌胃后血清胰岛素水平与GLP-1并未显著性提高，提示小檗碱抑制肠道葡萄糖吸收与胰岛素无关，而可能是小檗碱具有直接抑制葡萄糖吸收功能的作用。综合以上实验结果表明，小檗碱的降血糖效应依赖于其在小肠局部发挥的生物学效应。图2小檗碱灌胃6周降低糖尿病小鼠小肠葡萄糖吸收，小檗碱单次灌胃降低口服葡萄糖途径负荷后血糖水平-37- 空军军医大学硕士学位论文A图：小檗碱灌胃6周后，各组小鼠小肠葡萄糖转运能力的变化。B图：小檗碱灌胃6周后，各组小鼠单位进食量所产生的粪便的葡萄糖含量变化。C-D图：以不同途径给予葡萄糖的条件下，小檗碱单次灌胃对正常动物血糖的影响。E图：OGTT条件下，小檗碱单次灌胃对正常动物血清胰岛素水平的影响。F图：OGTT30min时间点，小檗碱单次灌胃对正常动物血清GLP-1水平的影响。Control，对照组；Control+BBR，正常灌胃小檗碱（200mg/Kg，BW）组；DM，糖尿病组；DM+BBR，糖尿病灌胃小檗碱（200mg/Kg，BW）组；OGTT，口服葡萄糖耐量测定；IPGTT，腹腔注射葡萄糖耐量测定。正常小檗碱灌胃组与正常组相比：*P<0.05，**P<0.01，正常组与糖尿病组相比：#P<0.05，##P<0.01，糖尿病小檗碱灌胃组与糖尿病组相比：†P<0.05，††P<0.01，n=6/组。3.3小檗碱通过抑制小肠黏膜上皮细胞GLUT-2降低小肠葡萄糖吸收小肠黏膜上皮细胞中参与葡萄糖吸收的功能蛋白包括钠-葡萄糖共转运体1（SGLT-1）和葡萄糖转运体2（GLUT-2）。通过离体的小肠荧光葡萄糖转运实验，我们研究了小檗碱降低小肠葡萄糖转运的作用：相较于单纯葡萄糖组，小檗碱浓度梯度25、50、100μM处理后肠道葡萄糖转运分别下降15.5%、38.5%、52.9%，（高糖组葡萄糖转运：1.00±0.03，小檗碱浓度梯度25、50、100μM葡萄糖转运分别为：0.84±0.05、0.62±0.04、0.47±0.04，均P<0.05，n=6，图3A），通过使用两种与葡萄糖转运相关的功能蛋白的抑制剂作为工具药，我们发现：相较于Phloretin（GLUT-2抑制剂）组，Phloretin+BBR组葡萄糖转运变化无统计学差异（0.60±0.02比0.58±0.02，P>0.05，n=6，图3B），而相较于Phloridzin（SGLT-1抑制剂）组，Phloridzin+BBR组肠道葡萄糖转运进一步降低，差异有统计学意义（0.42±0.02vs.0.68±0.03，P<0.05，n=6，图3B），提示GLUT-2抑制剂可以阻断小檗碱降低小肠葡萄糖转运，而SGLT-1抑制剂则不能阻断小檗碱降低小肠组织葡萄糖转运。在IEC-6细胞模型上，利用荧光葡萄糖摄取实验，我们发现，小檗碱能够浓度依赖性的降低细胞对荧光葡萄糖的摄取（高糖组葡萄糖摄取：1.00±0.04，小檗碱浓度梯度25、50、100μM葡萄糖摄取分别为：0.67±0.06、0.54±0.05、0.36±0.03，均P<0.05，n=6，图3C），并且，GLUT2抑制剂能够阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取：相较于相较于Phloretin组，Phloretin+BBR组葡萄糖转运变化无统计学差异（0.69±0.08vs.0.68±0.05，P>-38- 空军军医大学硕士学位论文0.05，n=6，图3D）。利用siRNA敲低GLUT-2的表达（图3E），结果提示，相较于GLUT-2敲低组，GLUT-2敲低+小檗碱组葡萄糖摄取并未显著性降低（0.65±0.04vs.0.60±0.04，P>0.05，n=6，图3F），表明敲低GLUT-2的表达能够阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取。以上实验结果提示，小檗碱降低小肠葡萄糖吸收是通过抑制小肠黏膜上皮细胞GLUT-2来实现的。图3小檗碱剂量依赖性降低小肠葡萄糖转运和IEC-6细胞葡萄糖摄取，抑制GLUT-2可阻断小檗碱降低葡萄糖转运A图浓度梯度小檗碱处理对小肠荧光葡萄糖转运的影响。B图两种葡萄糖转运蛋白抑制剂对小檗碱降低小肠荧光葡萄糖吸收的影响。C图浓度梯度小檗碱处理对IEC-6细胞荧光葡萄糖摄取的影响。D图两种葡萄糖转运蛋白抑制剂对小檗碱降低IEC-6细胞荧光葡萄糖摄取的影响。E图siRNA敲低GLUT-2表达。F图siRNA敲低GLUT-2表达后，小檗碱对IEC-6细胞荧光葡萄糖摄取影响的变化情况。HG：高糖（葡萄糖50mM）组，Phloridzin：根皮苷（SGLT-1抑制剂，0.5mM）组，Phloridzin+BBR组：根皮苷+小檗碱（50μM）组，Phloretin：根皮素（GLUT-2-39- 空军军医大学硕士学位论文抑制剂，0.5mM）组，Phloretin+BBR组：根皮素+小檗碱（50μM）组。ScramblesiRNA：阴性对照组，ScramblesiRNA+BBR：小檗碱（50μM）处理组，siGLUT-2：GLUT-2敲低组，siGLUT-2+BBR：GLUT-2敲低+小檗碱（50μM）处理组。各组与高糖组相比：*P<0.05，**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01；ns：两组比较差别不具有统计学差异，n=6/组。3.4小檗碱抑制小肠黏膜上皮细胞GLUT-2转位至刷状缘3.4.1小檗碱灌胃6周降低糖尿病小鼠小肠小肠黏膜上皮细胞GLUT-2表达和GLUT-2转位至刷状缘给予正常组和糖尿病组小鼠小檗碱灌胃6周后，检测小肠组织中与葡萄糖转运相关的蛋白表达情况以及葡萄糖转运体2在小肠黏膜上皮细胞细胞膜定位的情况。结果显示：相较于正常组，糖尿病组小鼠小肠GLUT-2和SGLT-1表达显著性上升（GLUT-2：1.83±0.15vs.1.00±0.11，SGLT-1：1.28±0.15vs.1.00±0.11，均P<0.05，n=6，图4A），同时，小肠黏膜上皮细胞转位至胞膜的GLUT-2也显著性增多（1.48±0.10vs.1.00±0.09，P<0.05，n=6，图4A），而在给予小檗碱灌胃6周后，相较于糖尿病组，糖尿病+小檗碱灌胃组小肠GLUT-2和SGLT-1表达显著性下降（GLUT-2：1.09±0.09vs.1.83±0.15，SGLT-1：1.01±0.11vs.1.28±0.15，均P<0.05，n=6，图4A），小肠黏膜上皮细胞转位至胞膜的GLUT-2也显著性降低（0.92±0.05vs.1.48±0.10，P<0.05，n=6，图4A）。GLUT5的变化在各组之间不具有显著性差异。SGLT-1仅表达在细胞刷状缘，其总蛋白水平即为刷状缘蛋白水平，所以本实验没有进一步区分细胞膜和总SGLT-1。小檗碱灌胃6周后，给予各组小鼠灌胃葡萄糖30min，取小肠组织，进行免疫荧光实验。结果显示，糖尿病组小鼠GLUT-2（绿色荧光）显著分布于小肠黏膜上皮细胞管腔一侧的刷状缘上（图4B），而在给予小檗碱灌胃6周后，GLUT-2（绿色荧光）的分布位置发生改变：刷状缘上较少分布，而更多的在胞浆中分布（图4B）。免疫电镜的结果显示：糖尿病组小鼠小肠黏膜上皮细胞内，胶体金颗粒在刷状缘的微绒毛上和靠近微绒毛的胞浆中分布广泛（图4C），这代表着当肠腔葡萄糖浓度增高时，定位在这些部位的GLUT-2将很快发挥转运功能，将葡萄糖大量转运吸收入血。而在小檗碱灌胃6周后，胶体金颗粒在刷状缘的微绒毛上和靠近微绒毛的胞浆中分布明显减少（图4C），这代表糖尿病小肠黏膜上皮细胞增强的葡萄糖转运吸收功能被小檗碱抑制和改善。-40- 空军军医大学硕士学位论文图4小檗碱减少糖尿病小鼠小肠GLUT-2表达和在小肠黏膜上皮细胞刷状缘定位A图小檗碱灌胃6周对各组小鼠小肠葡萄糖转运蛋白表达及定位的影响。B图各组小鼠小肠免疫荧光染色（右下角标尺为20μm），绿色荧光：GLUT-2蛋白，蓝色荧光：DAPI，细胞核。C图免疫电镜方法反应各组小鼠小肠黏膜上皮细胞内GLUT-2在刷状缘的分布情况（右下角标尺为0.5μm）。Control，对照组；Control+BBR，正常灌胃小檗碱（200mg/Kg，BW）组；DM，糖尿病组；DM+BBR，糖尿病灌胃小檗碱（200mg/Kg，BW）组；m-GLUT-2：细胞膜定位的葡萄糖转运体2；t-GLUT-2：总的葡萄糖转运体2；t-SGLT-1：总的钠-葡萄糖共转运体1；t-GLUT5：总的葡萄糖转运体5；正常小檗碱灌胃组与正常组相比：*P<0.05，**P<0.01，正常组与糖尿病组相比：#P<0.05，##P<0.01，糖尿病小檗碱灌胃组与糖尿病组相比：†P<0.05，††P<0.01，n=6/组。-41- 空军军医大学硕士学位论文3.4.2小檗碱浓度依赖性降低IEC-6细胞GLUT-2转位葡萄糖浓度为50mM条件下，给予IEC-6细胞浓度梯度的小檗碱（25、50、100μM）处理2h，检测细胞GLUT-2和SGLT-1的定位和表达情况（SGLT-1仅表达在细胞刷状缘，其总蛋白水平即为刷状缘蛋白水平，所以本实验没有进一步区分细胞膜和总SGLT-1）。结果显示：与高糖组相比，小檗碱浓度梯度处理后，GLUT-2转位呈现浓度依赖性显著性降低（高糖组：1.00±0.06，小檗碱25、50、100μM组分别为0.67±0.05、0.56±0.03、0.55±0.04，均P<0.05，n=6，图5A），而IEC-6细胞GLUT-2和SGLT-1在小檗碱单次处理的实验条件下并未发生显著性改变。免疫电镜发现，小檗碱处理后，IEC-6细胞贴近胞膜或定位于胞膜的GLUT-2显著减少（图5B）。以上实验结果在细胞水平上表明了小檗碱单次给药处理条件下抑制GLUT-2向小肠黏膜上皮细胞细胞膜转位。图5小檗碱降低IEC-6细胞GLUT-2转位A图葡萄糖浓度为50mM条件下，浓度梯度的小檗碱单次给药处理对IEC-6细胞细胞膜GLUT-2定位及GLUT-2和SGLT-1表达的影响。B图高浓度葡萄糖（50mM）和小檗碱（50μM）单次处理对IEC-6细胞GLUT-2（胶体金颗粒）定位的影响（低倍镜图右下角标尺为2μm，高倍镜图右下角标尺为400nm）。HG：高糖（葡萄糖50mM）组；HG+BBR：高糖+小檗碱（小檗-42- 空军军医大学硕士学位论文碱50μM）组。m-GLUT-2：细胞膜定位的葡萄糖转运体2；t-GLUT-2：总的葡萄糖转运体2；t-SGLT-1：总的钠-葡萄糖共转运体1。各组与高糖组相比：*P<0.05，**P<0.01，n=6/组。3.5小檗碱灌胃6周纠正糖尿病小鼠小肠组织局部IGF系统异常IGF系统对于糖代谢具有重要调节作用，当血清或组织器官局部的IGF-1和IGFBP-3水平发生病理性改变时，会引起局部甚至全身的糖代谢紊乱、胰岛素抵抗，甚至最终进展为糖尿病。我们发现，相较于正常组，在STZ配合高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠模型中，血清IGF-1和IGFBP-3水平变化并不具有显著性差异（图A-C）。而在小肠局部，相较于对照组，糖尿病组小鼠小肠中的IGF-1和IGFBP-3水平显著性升高（IGF-1：1.76±0.32vs.1.03±0.13；IGFBP-3：1.79±0.06vs.1.00±0.07，均P<0.05，n=6，图6D-E），与此同时，小肠IGF-1受体水平在糖尿病组同样显著性升高（1.21±0.10vs.1.00±0.08，P<0.05，n=6，图6G）。而在给予小檗碱灌胃6周处理后，相较于糖尿病组，糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠局部IGF-1和IGFBP-3水平显著性降低（IGF-1：0.38±0.09vs.1.76±0.32；IGFBP-3：1.19±0.04vs.1.79±0.06；IGF-1/IGFBP-3：0.32±0.01vs.0.98±0.04，均P<0.05，n=6，图6D-F），小肠IGF-1受体水平在糖尿病组同样显著性降低（0.95±0.05vs.1.21±0.10，P<0.05，n=6，图6G）。以上结果提示，小肠局部的IGF-1和IGFBP-3激素水平的升高以及IGF-1受体水平的升高与糖尿病发病具有一定的相关性。而小檗碱可纠正糖尿病状态下小肠局部IGF系统的异常。IGF-1受体与G蛋白偶联受体及其下游信号通路，尤其是PLC家族蛋白的相互调节关系近年来被广泛探究，有关肿瘤转移和代谢性疾病的相关研究证实了IGF-1R-PLC信号通路扮演着十分重要的角色。我们检测了小肠局部与GLUT-2转位密切相关的中间信号分子PLC-β2，相较于对照组，糖尿病组小鼠小肠组织PLC-β2表达显著性升高（1.17±0.09vs.1.00±0.04，P<0.05，n=6，图6G）；在小檗碱灌胃6周治疗后，相较于糖尿病组，糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠中PLC-β2表达显著性下降（0.90±0.05vs.1.17±0.09，P<0.05，n=6，图6G）。结果提示，小肠PLC-β2表达水平与小肠局部IGF系统的改变相关。此外，我们检测了血清GLP-2水平，血清GLP-2水平在各组差别不具有显著性。-43- 空军军医大学硕士学位论文图6小檗碱灌胃6周降低糖尿病小鼠小肠局部IGF-1与IGFBP-3，降低小肠IGF-1受体及PLC-β2表达A-C图小檗碱灌胃6周对各组小鼠血清IGF-1、IGFBP-3、IGF-1/IGFBP-3的影响。D-F图小檗碱灌胃6周对各组小鼠小肠局部IGF-1、IGFBP-3、IGF-1/IGFBP-3的影响。G图小檗碱灌胃6周对各组小鼠小肠IGF-1受体及PLC-β2表达的影响。H图小檗碱灌胃6周对各组小鼠血清GLP-2的影响。Control，对照组；Control+BBR，正常灌胃小檗碱（200mg/Kg，BW）组；DM，糖尿病组；DM+BBR，糖尿病灌胃小檗碱（200mg/Kg，BW）组；IGF-1R：IGF-1受体；正常组与正常+小檗碱灌胃组相比：*P<0.05，**P<0.01，正常组与糖尿病组相比：#P<0.05，##P<0.01，糖尿病组和糖尿病+小檗碱灌胃组相比：†P<0.05，††P<0.01，n=6/组。-44- 空军军医大学硕士学位论文3.6小檗碱抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2通路降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取3.6.1小檗碱通过下调IEC-6细胞IGF-1R磷酸化，降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位葡萄糖浓度为50mM条件下，给予IEC-6细胞小檗碱（50μM）处理2h，检测细胞IGF-1R磷酸化及mRNA水平。结果提示，相较于高糖组，高糖+小檗碱组的细胞IGF-1R磷酸化显著性降低（0.68±0.02vs.1.00±0.03，P<0.05，n=6，图7A），同时，IGF-1RmRNA水平的变化无显著性差异（图7B）。以上结果提示，小檗碱可抑制IEC-6细胞IGF-1R磷酸化。我们利用IGF-1R抑制剂AG1024和siRNA敲低蛋白表达的技术来抑制或下调IEC-6细胞IGF-1R的功能，通过荧光葡萄糖摄取实验研究其对小檗碱降低细胞糖摄取效应的影响。结果提示，与AG1024组相比，AG1024+BBR组IEC-6细胞葡萄糖摄取的变化无显著性差异（0.70±0.03vs.0.76±0.01，P>0.05，n=6，图7D）；siRNA可以敲低IEC-6细胞IGF-1R表达水平（图7C）。与siIGF-1R相比，siIGF-1R+BBR组IEC-6细胞葡萄糖摄取的变化亦无显著性差异（0.58±0.03vs.0.59±0.06，P>0.05，n=6，图7F）。结果提示，抑制IGF-1R可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取，表明小檗碱降低IEC-6细胞葡萄糖摄取是通过抑制IGF-1R来实现的。进一步研究抑制或下调IEC-6细胞IGF-1R的功能对小檗碱降低细胞GLUT-2转位效应的影响。相较于AG1024组和siIGF-1R组，AG1024+BBR组和siIGF-1R+BBR组IEC-6细胞的GLUT-2转位的变化无显著性差异（图E，图G），即抑制IGF-1R可阻断小檗碱降低IEC-6细胞GLUT-2转位，结果提示，小檗碱抑制IEC-6细胞GLUT-2转位是通过IGF-1R介导的。-45- 空军军医大学硕士学位论文图7小檗碱下调IEC-6细胞IGF-1R磷酸化，抑制IGF-1R可阻断小檗碱降低葡萄糖摄取和GLUT-2转位A图葡萄糖浓度为50mM条件下，小檗碱（50μM）单次给药处理2h对IEC-6细胞IGF-1R磷酸化的影响。B图葡萄糖浓度为50mM条件下，小檗碱（50μM）单次给药处理2h对IEC-6细胞IGF-1RmRNA水平的影响。C图IGF-1R抑制剂AG1024对小檗碱降低葡萄糖摄取效应的影响。D图IGF-1R抑制剂AG1024对小檗碱降低GLUT-2转位效应的影响。E图siRNA敲低-46- 空军军医大学硕士学位论文IGF-1R表达对小檗碱降低葡萄糖摄取效应的影响。F图siRNA敲低IGF-1R表达对小檗碱降低GLUT-2转位效应的影响。HG：高糖（葡萄糖50mM）组；HG+BBR：高糖+小檗碱（小檗碱50μM）组；AG1024：IGF-1R抑制剂；ScramblesiRNA：阴性对照组，ScramblesiRNA+BBR：小檗碱（50μM）处理组，siIGF-1R：IGF-1R敲低组，siIGF-1R+BBR：IGF-1R敲低+小檗碱（50μM）处理组。m-GLUT-2：细胞膜定位的葡萄糖转运体2；t-GLUT-2：总的葡萄糖转运体2；p-IGF-1R：磷酸化IGF-1R；t-IGF-1R：总的IGF-1R；各组与高糖组相比：*P<0.05，**P<0.01；ns：两组比较差别不具有统计学差异，n=6/组。3.6.2小檗碱通过抑制IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位，降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位葡萄糖浓度为50mM条件下，给予IEC-6细胞小檗碱（50μM）处理2h，检测细胞PLC-β2胞膜定位。结果提示，相较于高糖组，高糖+小檗碱组IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位显著性下降（0.55±0.03vs.1.00±0.02，P<0.05，n=6，图8A）。PLC-β2是一种G蛋白偶联受体下游的G蛋白效应器，当其在细胞中定位于细胞膜上时，代表其处于激活状态，通过下游信号通路最终发挥促进GLUT-2转位的作用。以往大量研究已经证实，PLC-β2是调节GLUT-2转位的最重要中间信号分子。我们的实验发现，在葡萄糖浓度为50mM条件下，给予IEC-6细胞PLC-β2抑制剂U73122处理后，相较于U73122组，U73122+BBR组IEC-6细胞葡萄糖摄取的变化无显著性差异（0.68±0.05vs.0.73±0.03，P>0.05，n=6，图8B），同时，U73122+小檗碱组IEC-6细胞的GLUT-2转位的变化无显著性差异（0.60±0.05vs.0.64±0.03，P>0.05，n=6，图8C），即抑制PLC-β2可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位，结果提示，小檗碱降低IEC-6细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位是通过其抑制PLC-β2介导的。-47- 空军军医大学硕士学位论文图8小檗碱下调IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位，抑制PLC-β2可阻断小檗碱降低葡萄糖摄取和降低GLUT-2转位A图葡萄糖浓度为50mM条件下，小檗碱（50μM）单次给药处理2h对IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位的影响。B图PLC-β2抑制剂U73122对小檗碱降低葡萄糖摄取效应的影响。C图PLC-β2抑制剂U73122对小檗碱降低GLUT-2转位效应的影响。HG：高糖（葡萄糖50mM）组；HG+BBR：高糖+小檗碱（小檗碱50μM）组；U73122：PLC-β2抑制剂；m-GLUT-2：细胞膜定位的葡萄糖转运体2；t-GLUT-2：总的葡萄糖转运体2；m-PLC-β2：细胞膜定位的PLC-β2；t-PLC-β2：总的PLC-β2；各组与高糖组相比：*P<0.05，**P<0.01；ns：两组比较差别不具有统计学差异，n=6/组。-48- 空军军医大学硕士学位论文3.6.3小檗碱通过下调IGF-1R磷酸化，降低细胞PLC-β2胞膜定位为进一步明确和验证IGF-1R和PLC-β2的关系，我们利用IGF-1R的特异性抑制剂AG1024和siRNA敲低蛋白表达的技术来抑制或下调IEC-6细胞IGF-1R的功能，通过检测IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位的改变明确IGF-1R对PLC-β2的调控作用。结果提示，与AG1024组相比，AG1024+BBR组IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位的变化无显著性差异（0.71±0.03vs.0.69±0.02，P>0.05，n=6，图9A）；与siIGF-1R相比，siIGF-1R+BBR组IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位的变化亦无显著性差异（0.62±0.03vs.0.65±0.03，P>0.05，n=6，图9B）。结果提示，抑制IGF-1R可阻断小檗碱降低IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位，表明小檗碱降低IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位是通过抑制IGF-1R受体实现的。综合以上实验，我们得出了：小檗碱通过抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路，进而降低IEC-6细胞膜GLUT-2定位和细胞葡萄糖摄取。-49- 空军军医大学硕士学位论文图9抑制IGF-1R可阻断小檗碱降低细胞PLC-β2胞膜定位A图IGF-1R抑制剂AG1024对小檗碱降低PLC-β2胞膜定位的影响。B图siRNA敲低IGF-1R表达对小檗碱降低PLC-β2胞膜定位的影响。HG：高糖（葡萄糖50mM）组；HG+BBR：高糖+小檗碱（小檗碱50μM）组；AG1024：IGF-1R抑制剂；ScramblesiRNA：阴性对照组，ScramblesiRNA+BBR：小檗碱（50μM）处理组，siIGF-1R：IGF-1R敲低组，siIGF-1R+BBR：IGF-1R敲低+小檗碱（50μM）处理组。m-PLC-β2：细胞膜定位的PLC-β2；t-PLC-β2：总的PLC-β2；*P<0.05，**P<0.01；ns：两组比较差别不具有统计学差异，n=6/组。-50- 空军军医大学硕士学位论文3.7小檗碱激活AMPK抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2通路，进而降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取3.7.1小檗碱通过上调IEC-6细胞AMPK磷酸化，降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位葡萄糖浓度为50mM条件下，给予IEC-6细胞小檗碱（50μM）处理2h，检测细胞AMPK磷酸化。结果提示，相较于高糖组，高糖+小檗碱组的细胞AMPK磷酸化显著性升高（1.40±0.03vs.1.00±0.04，P<0.05，n=6，图10A）。结果提示，小檗碱可上调IEC-6细胞AMPK磷酸化。进一步，我们利用AMPK抑制剂CompoundC和siRNA敲低蛋白表达的技术来抑制或下调IEC-6细胞AMPK的功能，通过荧光葡萄糖摄取实验研究其对小檗碱降低细胞糖摄取效应的影响。结果提示，与CompoundC组相比，CompoundC+BBR组IEC-6细胞葡萄糖摄取的变化无显著性差异（0.81±0.04vs.0.84±0.02，P>0.05，n=6，图10C）；siAMPK可抑制IEC-6细胞AMPK表达（图10B），与siAMPK相比，siAMPK+BBR组IEC-6细胞葡萄糖摄取的变化亦无显著性差异（0.78±0.03vs.0.74±0.03，P>0.05，n=6，图10E）。结果提示，抑制AMPK可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取，表明小檗碱降低IEC-6细胞葡萄糖摄取是通过激活AMPK介导的。相较于CompoundC组和siRNAforAMPK组，CompoundC+BBR组和siAMPK+BBR组IEC-6细胞的GLUT-2转位的变化无显著性差异（图D，图F），即抑制AMPK可阻断小檗碱降低GLUT-2转位，结果提示，小檗碱抑制IEC-6细胞GLUT-2转位是通过激活AMPK介导的。-51- 空军军医大学硕士学位论文图10小檗碱上调IEC-6细胞AMPK磷酸化，抑制AMPK可阻断小檗碱降低葡萄糖摄取和GLUT-2转位A图葡萄糖浓度为50mM条件下，小檗碱（50μM）单次给药处理2h对IEC-6细胞AMPK磷酸化的影响。B图siRNA下调IEC-6细胞AMPK表达水平。C图AMPK抑制剂CompoundC对小檗碱降低葡萄糖摄取效应的影响。D图AMPK抑制剂CompoundC对小檗碱降低GLUT-2转位效应的影响。E图siRNA敲低AMPK表达对小檗碱降低葡萄糖摄取效应的影响。F图siRNA敲低AMPK表达对小檗碱降低GLUT-2转位效应的影响。HG：高糖（葡萄糖50mM）组；-52- 空军军医大学硕士学位论文HG+BBR：高糖+小檗碱（小檗碱50μM）组；CompoundC：AMPK抑制剂；ScramblesiRNA：阴性对照组，ScramblesiRNA+BBR：小檗碱（50μM）处理组，siRNAforAMPK：AMPK敲低组，siAMPK+BBR：AMPK敲低+小檗碱（50μM）处理组。m-GLUT-2：细胞膜定位的葡萄糖转运体2；t-GLUT-2：总的葡萄糖转运体2；p-AMPK：磷酸化AMPK；t-AMPK：总的AMPK；各组与高糖组相比：*P<0.05，**P<0.01；ns：两组比较差别不具有统计学差异，n=6/组。3.7.2小檗碱通过上调AMPK磷酸化，降低IEC-6细胞IGF-1R磷酸化为进一步明确AMPK和IGF-1R的关系，我们利用AMPK的抑制剂CompoundC和siRNA敲低蛋白表达的技术来抑制或下调IEC-6细胞AMPK的功能，通过检测IEC-6细胞IGF-1R磷酸化的改变明确AMPK对IGF-1R的调控作用。结果提示，与CompoundC组相比，ComoundC+BBR组IEC-6细胞IGF-1R磷酸化被逆转（1.24±0.04vs.1.30±0.03，P>0.05，n=6，图11A）；与siAMPK相比，siAMPK+BBR组IEC-6细胞IGF-1R磷酸化同样被逆转（（1.28±0.05vs.1.32±0.04，P>0.05，n=6，图11B）。结果提示，抑制AMPK可逆转小檗碱降低对IEC-6细胞IGF-1R磷酸化，表明小檗碱降低IEC-6细胞IGF-1R磷酸化是通过其激活AMPK来实现的。综合以上实验，我们得出了：小檗碱通过激活AMPK，进而抑制IGF-1R-PLC-β2-GLUT-2信号通路，最终降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取。-53- 空军军医大学硕士学位论文图11抑制AMPK可阻断小檗碱降低IEC-6细胞IGF-1R磷酸化A图AMPK抑制剂CompoundC对小檗碱降低IGF-1R磷酸化的影响。B图siRNA敲低AMPK表达对小檗碱降低IGF-1R磷酸化的影响。HG：高糖（葡萄糖50mM）组；HG+BBR：高糖+小檗碱（小檗碱50μM）组；CC,CompoundC,AMPK抑制剂；ScramblesiRNA：阴性对照组，ScramblesiRNA+BBR：小檗碱（50μM）处理组，siAMPK：AMPK敲低组，siAMPK+BBR：AMPK敲低+小檗碱（50μM）处理组。p-IGF-1R：磷酸化IGF-1R；t-IGF-1R：总的IGF-1R；*P<0.05，**P<0.01；ns：两组比较差别不具有统计学差异，n=6/组。-54- 空军军医大学硕士学位论文3.8小檗碱降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取与PI3K-Akt信号通路无关胰岛素是目前已知的机体内唯一可降低血糖的内分泌激素，餐后胰岛素大量分泌，促使胰岛素敏感的靶器官的GLUT4向胞膜转位，进而将葡萄糖转运进入外周组织器官，降低血糖。而在小肠局部，胰岛素可使GLUT-2脱离刷状缘及基底膜，即―内化‖作用。这种内化作用在肠腔高糖的情况下依然存在，这表明胰岛素可以减少经肠上皮细胞的葡萄糖吸收，进而降低餐后血糖。在前述实验结果2中，我们已经明确在小檗碱单次灌胃给药时，小檗碱降低餐后血糖效应并不是由胰岛素介导的，在本部分实验中，我们将利用IEC-6细胞模型，观察小檗碱处理对胰岛素信号通路中的关键分子Akt磷酸化的影响，利用PI3K抑制剂Wortmannin阻断胰岛素信号通路，观察其对GLUT-2和PLC-β2胞膜定位的影响。葡萄糖浓度为50mM条件下，给予IEC-6细胞小檗碱（50μM）处理2h，检测细胞磷酸化Akt水平。结果提示，相较于高糖组，高糖+小檗碱组IEC-6细胞p-Akt的变化无显著性差异（P>0.05，n=6，图12A）。，在葡萄糖浓度为50mM条件下，给予IEC-6细胞PI3K抑制剂Wortmannin处理后，相较于Wortmannin组，Wortmannin+BBR组IEC-6细胞葡萄糖摄取显著性降低（0.48±0.03vs.0.87±0.01，P<0.05，n=6，图12B），同时，Wortmannin+BBR组IEC-6细胞的GLUT-2和PLC-β2胞膜定位显著性下降（GLUT-2：0.50±0.04vs.0.95±0.02，PLC-β2：0.45±0.03vs.0.98±0.01，均P<0.05，n=6，图12C），即抑制PI3K-Akt并未阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2和PLC-β2胞膜定位，结果提示，小檗碱发挥降低IEC-6细胞葡萄糖摄取和GLUT-2胞膜定位与PI3K-Akt信号通路无关。-55- 空军军医大学硕士学位论文图12小檗碱对IEC-6细胞Akt磷酸化无影响，抑制PI3K并未阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2、PLC-β2胞膜定位A图葡萄糖浓度为50mM条件下，小檗碱（50μM）单次给药处理2h对IEC-6细胞p-Akt的影响。B图PI3K抑制剂Wortmannin对小檗碱降低葡萄糖摄取效应的影响。C图PI3K抑制剂Wortmannin对小檗碱降低GLUT-2和PLC-β2胞膜定位的影响。HG：高糖（葡萄糖50mM）组；HG+BBR：高糖+小檗碱（小檗碱50μM）组；Wm,Wortmannin,PI3K抑制剂；m-GLUT-2：细胞膜定位的葡萄糖转运体2；t-GLUT-2：总的葡萄糖转运体2；m-PLC-β2：细胞膜定位的PLC-β2；t-PLC-β2：总的PLC-β2；各组与高糖组相比：*P<0.05，**P<0.01；Wortmannin组与Wortmannin+小檗碱组相比：#P<0.05，##P<0.01，n=6/组。-56- 空军军医大学硕士学位论文4讨论流行病学研究显示，餐后高血糖与糖尿病及多种糖尿病慢性并发症有关，控制[3]餐后高血糖是防治糖尿病及糖尿病慢性并发症的重要策略。肠道作为营养物质吸收的主要器官，在餐后高血糖发生和糖尿病发病过程中的作用逐渐受到重视。近年来研究表明，小肠葡萄糖的吸收功能总是适应于饮食环境的改变，当罹患糖尿病时，[37]小肠葡萄糖吸收功能呈现病理性的增强，这与糖尿病整体血糖增高、餐后血糖升高和机体糖、脂代谢紊乱关系密切。小肠葡萄糖吸收主要由SGLT-1及GLUT-2介导，其中，GLUT-2由小肠黏膜上皮细胞胞浆转运至刷状缘以异化扩散形式进行的葡萄糖[93]转运是餐后小肠吸收葡萄糖的主要形式。在糖尿病状态下，GLUT-2表现为在小肠[31,38]黏膜上皮细胞刷状缘的持续性定位，这与糖尿病小肠葡萄糖吸收功能增强及餐后高血糖密切相关。纠正糖尿病发病过程中小肠葡萄糖吸收功能病理性改变的进程是治疗糖尿病餐后高血糖更重要的方向。本研究关注于传统中药黄连素的有效成分—小檗碱对小肠葡萄糖吸收功能的影响。小檗碱因其在治疗腹泻患者时出现低血糖反应而被认为可应用于治疗糖尿病。但因小檗碱的生物利用度低，其抗糖尿病机制依然存在争议。有研究认为小檗碱具[92]有肠道局部作用，包括抑制二糖酶的功能从而抑制多糖的消化；通过激活苦味受[10][62]体促进GLP-1释放发挥调节代谢的功能；调节肠道菌群结构等。但前期研究均关注于小檗碱在肠道的长期（大于6小时）药理作用，而小檗碱对糖尿病餐后血糖升高是否具有改善作用的研究依然是空白。针对上述问题，我们课题组在以往研究的基础上，对小檗碱抗糖尿病效应的肠道机制做了进一步探索，发现了小檗碱通过降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2在刷状缘的持续性定位发挥抑制小肠葡萄糖吸收的效应，进而起到改善糖尿病餐后血糖水平的药理作用。我们对小檗碱降低GLUT-2转位至刷状缘的分子机制做了进一步探究，发现了小檗碱通过激活AMPK抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路，最终降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2转位至刷状缘。本研究从小檗碱降低小肠葡萄糖吸收的视角解析了小檗碱抗糖尿病效应，为糖尿病的治疗提供了一种新的靶点，同时为小檗碱在临床上应用于糖尿病治疗提供更全面的基础研究证据。-57- 空军军医大学硕士学位论文4.1糖尿病状态下餐后或负荷后血糖升高，小肠葡萄糖吸收功能呈现病理性增强糖尿病是一组以血糖异常升高为特征的代谢疾病，罹患糖尿病时，长期高血糖状态是各种器官功能障碍以及组织慢性损害出现的主要原因，机体高血糖状态包括空腹血糖（FBG）升高和餐后血糖（PPG）升高，餐后高血糖是指摄食后1-2h血糖>7.8mM。我们的实验发现，以STZ联合高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠为研究对象，相较于正常组，糖尿病小鼠出现体重增加、空腹血糖升高、机体胰岛素抵抗等改变，通过OGTT和IPGTT实验发现，糖尿病组小鼠在葡萄糖负荷后出现明显的血糖升高。而在肠道局部，相较于正常组，糖尿病组小鼠小肠葡萄糖吸收功能显著性增强，同时糖尿病组小鼠单位进食量所产生的粪便中的葡萄糖含量显著性降低，这与以往研究的观点，即糖尿病小肠葡萄糖吸收功能呈现病理性增强相一致。更进一步，我们发现糖尿病状态下，小肠局部与葡萄糖吸收相关的两种葡萄糖转运蛋白：GLUT-2和SGLT-1的表达均显著性升高，其中与餐后或负荷后血糖升高密切相关的葡萄糖转运蛋白GLUT-2在小肠黏膜上皮细胞刷状缘上持续性定位。另外，相较于正常组，糖尿病组小鼠血清中肠促胰岛素GLP-1的水平显著性下降，小肠局部IGF-1、IGFBP-3、IGF-1R的水平显著性升高。以上实验结果系统的表明，在糖尿病状态下，机体出现餐后血糖升高，同时小肠葡萄糖吸收功能病理性增强，其中与餐后血糖密切相关的GLUT-2表现为在小肠黏膜上皮细胞刷状缘的持续性定位。4.2小檗碱降低糖尿病餐后高血糖的肠道机制：抑制GLUT-2在小肠黏膜上皮细胞刷状缘的持续性定位小檗碱是一类异喹啉生物碱，因其抗糖尿病、抗肿瘤等诸多裨益受到广泛关注，其在机体内发挥生物学效应的机制研究逐步深入，尤其是近年来，小檗碱在肠道局部发挥的抗糖尿病效应被广泛研究，业已阐明包括肠道菌群机制、肠促胰岛素GLP-1机制、抑制双糖酶机制等多种小檗碱在肠道局部发挥抗糖尿病的效应机制。但针对小檗碱能够改善糖尿病状态下餐后血糖升高和小肠葡萄糖吸收功能病理性增强的相关研究尚属空白，我们的实验发现，小檗碱灌胃6周治疗后，相较于糖尿病组，糖尿病治疗组小鼠体重水平、空腹血糖水平和全身胰岛素敏感性状态均得到改善，与此同时，反映餐后血糖水平的OGTT、IPGTT实验中，我们发现：小檗碱治疗可以降低糖尿病小鼠餐后血糖水平。餐后高血糖的主要病理生理基础与骨骼肌等外周胰岛素靶器官对胰岛素敏感性-58- 空军军医大学硕士学位论文降低、第一时相胰岛素分泌缺陷、胰高血糖素分泌在进餐后不受抑制及餐后肝糖原[3]输出持续增高相关。以往大量研究已经证实，小檗碱具有改善全身胰岛素抵抗进而增加外周组织对胰岛素的敏感性、增加葡萄糖摄取的生物学作用，同时，小檗碱可以促进GLP-1的分泌增加，一定程度可以通过增加胰岛素释放来控制餐后血糖升高[10,70,86]。我们的实验中同样观察到，小檗碱灌胃6周后，糖尿病小鼠血清GLP-1水平得到显著性改善。小檗碱灌胃6周治疗具有改善糖尿病餐后血糖升高的生物学效应可以部分的通过以上机制来阐明。但是，小肠葡萄糖吸收功能与餐后血糖升高同样密切相关，小檗碱是否也能够通过抑制小肠葡萄糖吸收发挥降低餐后高血糖的作用呢？由于给予糖尿病动物长期小檗碱灌胃治疗，小檗碱得以通过循环到达全身组织器官，势必会通过已经阐述的小檗碱在外周组织器官的抗糖尿病机制发挥药理作用，因此，以小檗碱灌胃6周的方法探究小檗碱在小肠局部的抗糖尿病效应存在着一定的局限性，故我们进一步关注于小檗碱对小肠组织本身的糖尿病病理性改变是否具有改善作用和小檗碱单次给药处理能否发挥降低餐后血糖的作用。我们的实验结果提示，相较于糖尿病组，经小檗碱灌胃6周的糖尿病治疗组小鼠小肠葡萄糖转运能力显著性下降，与此同时，糖尿病治疗组小鼠单位进食量所产生的粪便中葡萄糖含量显著性升高，结果提示，小檗碱能够改善糖尿病小肠葡萄糖吸收能力的病理性增强。通过小檗碱单次灌胃给药，观察其对口服葡萄糖经肠道吸收后引起的血糖升高（OGTT）和其对腹腔注射葡萄糖经肠系膜静脉吸收后引起的血糖升高（IPGTT）的作用有无差别，结果提示，小檗碱单次灌胃对经胃肠道葡萄糖吸收引起的血糖升高具有降低效应，而对经肠系膜静脉葡萄糖吸收引起的血糖升高不具有降低效应；进一步，我们观察了OGTT条件下，小檗碱单次灌胃对各时间点血清胰岛素水平和GLP-1水平的影响，发现小檗碱单次灌胃并未显著性促进GLP-1释放而增加血清胰岛素水平，以上实验从大体水平验证了单次灌胃小檗碱处理并不能通过增加外周组织糖摄取降低血糖，而能够通过抑制小肠葡萄糖吸收功能降低血糖。综合上述结论，我们得出了小檗碱可以通过改善小肠葡萄糖吸收功能发挥降低糖尿病餐后血糖的作用。小肠葡萄糖吸收与存在于小肠黏膜上皮细胞内的两种葡萄糖转运蛋白密切相关：钠-葡萄糖共转运体1（SGLT-1）和葡萄糖转运体2（GLUT-2），其中，餐前、肠腔葡萄糖浓度较低时（小于30mM）时，小肠葡萄糖吸收主要依赖于SGLT-1以主-59- 空军军医大学硕士学位论文动吸收的形式将肠腔葡萄糖转运到小肠黏膜上皮细胞内；餐后、肠腔葡萄糖浓度较高（30-300mM）时，小肠葡萄糖吸收主要依赖于GLUT-2转位至刷状缘以易化扩散的形式将肠腔高浓度葡萄糖迅速转运到小肠黏膜上皮细胞内。由此可见，GLUT-2转[93]位至刷状缘所介导的葡萄糖转运是餐后血糖升高的主要贡献因素。我们的实验研究发现，在以高浓度葡萄糖处理模拟餐后肠腔葡萄糖的实验条件下，离体小肠的荧光葡萄糖转运实验和大鼠小肠黏膜细胞IEC-6细胞荧光葡萄糖摄取实验均提示，小檗碱可以剂量依赖性的降低小肠和IEC-6细胞葡萄糖转运，且GLUT-2抑制剂以及siRNA技术敲低GLUT-2表达均可阻断小檗碱降低荧光葡萄糖转运，表明小檗碱主要通过抑制GLUT-2功能降低小肠和IEC-6细胞葡萄糖转运。而SGLT-1抑制剂不具备阻断小檗碱降低葡萄糖转运的作用，鉴于我们的实验条件为模拟餐后肠腔葡萄糖高浓度状态，因此，我们尚不能得出小檗碱是否具有对SGLT-1的抑制作用，亦或者，小檗碱对SGLT-1的抑制效应不足以影响到肠腔高浓度葡萄糖条件下小肠对葡萄糖摄取的转运作用，需进一步实验予以明确，而本研究则主要关注于小檗碱对GLUT-2的作用，因为相对而言，GLUT-2对餐后血糖的影响更为显著。更进一步，我们发现，小檗碱灌胃6周可以降低糖尿病小鼠小肠GLUT-2和SGLT-1的表达水平，结合前面实验结论和思考，我们接下来重点关注小檗碱是否通过影响GLUT-2转位至刷状缘进而发挥抑制GLUT-2功能的作用。通过分析小肠组织细胞胞膜蛋白，我们发现，小檗碱可以降低糖尿病小鼠小肠黏膜上皮细胞GLUT-2胞膜定位，免疫荧光实验中，更加直观的观察到代表GLUT-2蛋白的绿色荧光糖尿病状态下，广泛的分布在小肠黏膜上皮细胞刷状缘，而在小檗碱灌胃6周治疗后，GLUT-2的分布位置多位于胞浆中。免疫电镜的结果显示，糖尿病状态下，代表GLUT-2蛋白的胶体金颗粒在小肠黏膜细胞刷状缘和贴近刷状缘的胞膜一侧大量分布，代表糖尿病状态下，小肠黏膜上皮细胞葡萄糖吸收能力增强，而给予小檗碱灌胃6周治疗后，胶体金颗粒在上述位置的分布显著性降低。离体条件下，给予IEC-6细胞高葡萄糖浓度（50mM）模拟在体肠腔高浓度葡萄糖状态，我们发现小檗碱处理可剂量依赖性降低GLUT-2细胞膜定位，免疫电镜结果同样印证了这个结论。综合以上实验，我们认为小檗碱可以通过减少GLUT-2在小肠黏膜上皮细胞刷状缘的持续性定位进而抑制GLUT-2功能，发挥降低小肠葡萄糖转运功能进而降低糖尿病餐后血糖的作用。-60- 空军军医大学硕士学位论文4.3小檗碱通过激活AMPK抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路，降低IEC-6细胞GLUT-2胞膜定位以往研究表明，小肠黏膜上皮细胞内对GLUT-2转位有多种调节因素，包括内分泌因素、细胞膜受体蛋白因素以及胞内信号通路等。其中，各种因素引起的PLC-β22+活化，进而通过胞内Ca变化引起细胞骨架蛋白的改变是促进GLUT-2转位的最重[4,27]要因素。PLC-β2是一种G蛋白偶联受体下游的G蛋白效应器，当其在细胞中定位于细胞膜上时，代表其处于激活状态，通过下游信号通路最终发挥促进GLUT-2转位至细胞膜的作用。我们的实验发现，以高浓度葡萄糖（50mM）模拟餐后肠腔高浓度葡萄糖条件处理IEC-6细胞，小檗碱可以显著性降低IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位，PLC-β2特异性抑制剂U73122可阻断小檗碱对IEC-6细胞荧光葡萄糖摄取和对IEC-6细胞GLUT-2胞膜定位的降低作用，结果提示，小檗碱通过抑制PLC-β2的功能降低IEC-6细胞GLUT-2胞膜。近年来，大量研究发现，IGF系统对于糖代谢具有重要调节作用，当血清或组织器官局部的IGF-1和IGFBP-3水平发生病理性改变时，会引起局部甚至全身的糖代[50,94,95]谢紊乱、胰岛素抵抗，甚至最终进展为糖尿病。我们的实验研究发现，相较于正常组，在STZ联合高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠模型中，血清IGF-1和IGFBP-3水平变化并不具有显著性差异。而在小肠局部，糖尿病组小鼠小肠中的IGF-1和IGFBP-3水平显著性升高，与此同时，小肠IGF-1受体水平在糖尿病组同样显著性升高。而在给予小檗碱灌胃6周处理后，相较于糖尿病组，糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠局部IGF-1和IGFBP-3水平显著性降低，小肠IGF-1受体水平在糖尿病组同样显著性降低。以上结果提示，小肠局部的IGF-1和IGFBP-3激素水平的升高以及IGF-1受体水平的升高与糖尿病发病具有一定的相关性。而小檗碱具有纠正糖尿病状态下小肠局部IGF系统异常的生物学效应。IGF-1受体与G蛋白偶联受体及其下游信号通路，尤其是PLC家族蛋白的相互调节关系近年来被广泛探究，有关肿瘤转移和代谢性疾病的相关研究证实了[96]IGF-1R-PLC信号通路扮演着十分重要的角色。在进一步的实验中，我们检测了小肠局部与GLUT-2转位密切相关的中间信号分子PLC-β2，我们发现相较于对照组，糖尿病组小鼠小肠组织PLC-β2表达显著性升高；在小檗碱灌胃6周治疗后，相较于糖尿病组，糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠中PLC-β2表达显著性下降。结果提示，-61- 空军军医大学硕士学位论文小肠PLC-β2表达水平与小肠局部IGF系统的改变可能有一定相关性。为明确IGF-1R的变化是否介导了小檗碱对GLUT-2胞膜定位的抑制作用。我们进一步以高浓度葡萄糖（50mM）模拟餐后肠腔高浓度葡萄糖条件处理IEC-6细胞，给予小檗碱（50μM）处理2h，结果提示，相较于高糖组，高糖+小檗碱组的细胞IGF-1R磷酸化显著性降低，同时，IGF-1RmRNA水平的变化无显著性差异。以上结果提示，小檗碱可抑制IEC-6细胞IGF-1R磷酸化。进一步，我们利用IGF-1R的抑制剂AG1024和siRNA敲低蛋白表达的技术来抑制或下调IEC-6细胞IGF-1R的功能，通过荧光葡萄糖摄取实验研究其对小檗碱降低细胞糖摄取效应的影响。结果提示，抑制IGF-1R可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取，表明小檗碱降低IEC-6细胞葡萄糖摄取是通过其抑制IGF-1R受体来实现的。通过提取细胞膜蛋白进行westernblot分析研究抑制或下调IEC-6细胞IGF-1R的功能对小檗碱降低细胞GLUT-2转位效应的影响，结果提示，小檗碱抑制IEC-6细胞GLUT-2胞膜定位是通过IGF-1R介导的。在进一步实验中，我们发现抑制IGF-1R可阻断小檗碱降低细胞PLC-β2胞膜定位，即小檗碱降低IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位是通过其抑制IGF-1R受体来实现的。综合以上实验，我们得出了小檗碱降低IEC-6细胞GLUT-2转位、降低IEC-6细胞葡萄糖摄取是通过抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路来实现的结论。但小檗碱如何调控IGF-1R和PLC-β2之间的相互作用，在本实验中并未进行深入研究，通过查阅文献，我们发现有研究认为，IGF-1R属于酪氨酸受体激酶，而PLC-β2是G蛋白偶联受体信号通路的下游蛋白，两者可通过交互调控的方式进行调控，[97]GEF/GIV在其中发挥重要作用，小檗碱是否可能通过此机制发挥对IGF-1R-PLC-β2的调控作用有待进一步研究。小檗碱作为经典的AMPK激动剂，其通过激活AMPK发挥了多种生物学效应，[98]包括改善糖尿病机体胰岛素抵抗、保护糖尿病心肌损伤等。AMPK是一种细胞能量感受器，在小肠黏膜上皮细胞中，一份较早年代的研究认为激活AMPK可以促进[28]GLUT-2向刷状缘转位从而吸收葡萄糖以缓解细胞―饥饿‖状态，但该研究中是利用AICAR作为工具药，其弊端在于AICAR除激活AMPK外，还可以影响细胞离子转运，而后者对于GLUT-2的转位至关重要，因此对于其得出的AICAR通过激活AMPK促进GLUT-2转位的观点尚存疑点。我们的实验结果提示，以高浓度葡萄糖（50mM）模拟餐后肠腔高浓度葡萄糖条件处理IEC-6细胞，小檗碱处理可上调细胞AMPK磷-62- 空军军医大学硕士学位论文酸化，进一步，我们利用AMPK的特异性抑制剂CompoundC和siRNA敲低蛋白表达的技术来抑制或下调IEC-6细胞AMPK的功能，结果提示，抑制AMPK可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和IEC-6细胞GLUT-2转位，表明小檗碱降低IEC-6细胞葡萄糖摄取和IEC-6细胞GLUT-2转位是通过激活AMPK来实现的。为进一步明确AMPK和IGF-1R的关系，我们利用AMPK抑制剂CompoundC和siRNA敲低蛋白表达的技术来抑制或下调IEC-6细胞AMPK的功能，通过检测IEC-6细胞IGF-1R磷酸化的改变明确AMPK对IGF-1R的调控作用。结果提示，抑制AMPK可逆转小檗碱对IEC-6细胞IGF-1R磷酸化的降低作用，表明小檗碱降低IEC-6细胞IGF-1R磷酸化是通过激活AMPK来实现的。综合以上实验，我们得出了小檗碱降低IEC-6细胞GLUT-2转位、降低IEC-6细胞葡萄糖摄取是通过抑制激活AMPK进而抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路来实现的。胰岛素是目前已知的机体内唯一可以降血糖的内分泌激素，餐后胰岛素的分泌促使骨骼肌和脂肪组织等胰岛素敏感的靶器官的GLUT4向胞膜转位，进而将葡萄糖[99]转运进入外周组织器官，降低血糖。而在小肠局部，胰岛素结合小肠黏膜上皮细胞上的胰岛素受体，使GLUT-2脱离刷状缘及基底膜，即胰岛素对GLUT-2具有内化作用。这种内化作用在肠腔高浓度葡萄糖的情况下依然存在，这表明胰岛素可以减[31]少经肠上皮细胞的葡萄糖吸收，从而降低餐后血糖。在实验结果2中，我们已经明确在小檗碱单次灌胃给药时，小檗碱降低餐后血糖效应并不是由胰岛素介导的，进一步的细胞实验中，观察小檗碱处理对胰岛素信号通路中的关键分子Akt磷酸化的影响，利用PI3K抑制剂Wortmannin阻断胰岛素信号通路，观察其对GLUT-2和PLC-β2胞膜定位的影响。结果提示，在葡萄糖浓度为50mM条件下，小檗碱并未上调IEC-6细胞p-Akt水平，PI3K抑制剂Wortmannin并未阻断小檗碱对细胞葡萄糖摄取的降低作用和对细胞GLUT-2和PLC-β2胞膜定位的降低作用，结果表明，小檗碱发挥降低IEC-6细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位与PI3K-Akt信号通路无关。本研究对小檗碱降低糖尿病餐后血糖的肠道机制做了全新的探索，主要有以下两个发现：（1）小檗碱通过降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2在刷状缘的持续性定位抑制小肠葡萄糖吸收应，进而起到改善糖尿病餐后血糖水平的药理作用；（2）小檗碱通过激活AMPK抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路，最终降低GLUT-2向小肠黏膜上皮细胞刷状缘的转位。本研究的创新点在于从小檗碱降低小肠葡萄糖吸-63- 空军军医大学硕士学位论文收的视角解析了小檗碱抗糖尿病效应，为糖尿病的治疗提供了一种新的潜在靶点，同时为小檗碱在临床上应用于糖尿病治疗提供更全面的研究证据。-64- 空军军医大学硕士学位论文小结（1）小檗碱通过降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2向刷状缘转位，抑制小肠葡萄糖吸收，进而起到改善糖尿病餐后血糖水平的药理作用（2）小檗碱通过激活AMPK进而抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路，进而降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2转位至刷状缘-65- 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空军军医大学硕士学位论文致谢从未察觉时光已是这般匆匆，绿了枝丫又枯了落叶。当实验仪器的嗡鸣已仅存于记忆，心底流淌的是平静的感动与感恩。董玲副教授是我的导师，是我学习科研的启蒙老师。在董老师的鼓励支持和指导下，我从一个对科研无知的学生逐步成长。在这三年的时间里，董老师不仅教会我科研的方方面面，更重要的，我在董老师的身上学会了如何发现问题，并行之有效的解决问题，领悟了“思考”的巨大力量。老师开朗乐观的性格始终影响并改变着我，曾经的懵懂扭捏已经蜕变成无畏和进取。实验上无数次焦头烂额，生活上几经起伏，董老师一如既往的耐心、鞭策和鼓励始终温暖着我。得一良师如此，实为幸事！感谢高峰教授。高教授是一座灯塔，科研的海洋里起起伏伏，但前进方向和必达目标的决心是这座灯塔所标榜的。在硕士阶段学习过程中，高教授时刻关心着我，对课题方向总有深刻的建议指导，对科研问题总有及时的解决纠正。高教授儒雅的人格魅力和豁达的做人风格更让我理解并践行许多为人处世的道理。在此，深深地表达对高教授的敬仰和感恩。感谢高峰人才团队的各位老师，李嘉副教授、张星副教授、张圆讲师、邢文娟讲师，各位老师勤奋踏实的工作作风和热心细致的生活态度，让我受益良多，感谢各位老师在我课题进展中提供巨大的无私帮助，以及对我年资尚浅的包容和支持，Insteam始终是一个温暖而向上的团队和家庭。特别感谢秦兴华博士后，杨红燕师姐，李国华班长，徐杰师兄，侯作旭师兄，郭永正同学，赵强师兄。曾经无数日日夜夜，在实验室共同打拼，一个又一个困难在你们的直接帮助下被克服解决，每一个实验技术的掌握离不开你们的指导帮助，感谢你们和我一起分享着生活的酸甜苦辣和点点滴滴。感谢李婷婷师姐，邢媛师姐，李悠悠师姐，王臻师兄，以及吴洁同学，付子豪同学，田沛同学，武桂玲同学。铁打的营盘，流水的兵。匆匆忙忙的身影出现在实验室，又消失在实验室，最终每个人都会成为一段故事，感动并激励着后来者奋发有为，能在这匆匆时光中结识你们，-77- 空军军医大学硕士学位论文是我无比珍视和珍惜的。感恩实验室的每一个人！感谢我的爱人、父母，你们的理解和支持是我最大的助力，感谢多年来对我的疼爱和鼓舞。最后，感谢这些年来出现在我的生命中，曾经帮助、支持、爱护和鼓励我的亲人、师长和朋友，衷心的希望您们快乐每一天，美好永相伴！-78-