小球藻病毒与宿主间两种相互作用现象的研究

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密级：学校代码：10075分类号：学号：20151613硕士专业学位论文学位申请人：贾红玉指导教师：康明教授学位类别：理学硕士学科专业：微生物学授予单位：河北大学答辩日期：二〇一八年六月 ClassifiedIndex:CODE:10075U.D.C.:NO:20151613TwoTypesofVirus-HostInteractionbetweenChlorovirusandChlorellavariablisAdissertationpresentedtotheFacultyoftheGraduateSchoolofHebeiUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterofScienceCandidate:JiaHongyvSupervisor:Prof.KangMingAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpecialty:MicrobiologyUniversity:HebeiUniversityThesisDefence:June2018 河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料一■？与我Ｎ工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。暫“作者签名：曰期：年＜月／Ｉ日学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，Ｓ卩：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于１、保密□，在年月日解密后适用本授权声明。２、不保密Ｙ。“”（请在以上相应方格内打Ｖ）作者签名：：年《月／＞日日期导师签名：Ｍ＾日期：＞１３年６月日＿＿ 一ｎ＾保护知识产权声明斗谢本人为帽河北大学学位所提交的题目为滅＆為卷与甸ｉ柯畸的学位论文，是我个人在导师，）指导并与导师合作下取得的研究成果研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并严保知产权所制定格遵守中华人民共和国为护识、行政法的各项法律规以及河北大学的相关规定。本人声如：论文的成归北大学所有，末经征得指导教师和河北大明下本果河和科研工的面同意和，本人证不以何形式公开和播科研成果作内学书授权保任传。。如违本声，愿意承担相法容果反明本人应律责任ｐＨ玉＜夂：日如月／曰声：年明人期 摘要摘要小球藻病毒模式株PBCV-1是藻类DNA病毒科第一株基因组全长测序的藻类DNA病毒，而其宿主小球藻Chlorellavariablis基因组也已全长测序，因此小球藻病毒-宿主体系是研究病毒-宿主相互作用的良好试验系统。本试验对PBCV-1编码的泛素连接酶复合体E3组分vSkp1和vANK参与或劫持宿主泛素蛋白酶体系的可能性，以及病毒编码的、可能具有压制宿主ROS防御系统功能的铜锌超氧化物歧化酶(tcvCu,Zn-SOD)酶学性质进行了初步探讨。本研究通过构建病毒vSkp1和A607R(vANK)蛋白表达载体，获得了vSkp1的可溶性蛋白表达；用后者与小球藻Chlorellavariablis藻株NC64A经过或未经病毒感染的细胞解液上清进行Pulldown实验，将试验结果进行质谱分析得到29种蛋白，其中包括宿主的25种F-Box蛋白、2种Cullin蛋白、1种Ringbox蛋白和病毒的1种F-Box蛋白。选取其中覆盖率较高的上述蛋白进行酵母密码子优化并人工合成，将蛋白编码基因进行扩增后，与酵母双杂交体系中的激活结构域连接，构成“prey”质粒；将优化过的病毒和宿主Skp1蛋白基因片段与结合结构域连接，构成“bait”质粒，将相应的bait与prey质粒共转化酵母株Y2HGold中，进行了蛋白-蛋白相互作用验证，结果显示5个蛋白均与chSkp1和cvSkp1有不同程度的相互作用。在本实验室前期已证明小球藻病毒PBCV-1表达的tcvCu,Zn-SOD蛋白具有清除超氧负离子、压制宿主ROS防御系统的功能的基础上，利用邻苯三酚自氧化法，测得重组tcvCu,Zn-SOD比活力为16050U/mg。并对其酶学性质进行了初步的研究，得出当酶质量浓度为1µg/mL时，受温度、pH、变性剂的稳定性影响较小；当质量浓度为0.1µg/mL时，温度和SDS对vSOD有较强的影响；当质量浓度为0.05µg/mL时，温度、pH、变性剂对酶活均有强烈影响。关键字小球藻泛素蛋白酶体系统病毒宿主相互作用酵母双杂交超氧化物歧化酶I AbstractAbstractPBCV-1,thetypespeicesofchloroviruses,isthefirststrainthathasbeenfullysequencedinphycodnsviruses;Chlorellavariabilis,thehostofthevirus,hasalsobeensequencedforitsfull-lengthofgenome,thusthechlorovirus-hostsystemisagoodmodelsystemforstudyingalgalvirus-hostinteractions.Inthisstudy,weconductedaseriesofpreliminarydiscussionsforthepossibilitythatPBCV-1encodestheubiquitinligasecomplexE3components,vSkp1andvANK,tohijackubiquitin-proteasomesystemofthehost,andtheenzymaticpropertiesofthecopper-zincsuperoxidedismutase(tcvCu,Zn-SOD)thatencodedbythevirusandmayhavethefunctionofsuppressingitshostROSsystem.Inthisstudy,theproteinexpressionvectorsvSkp1andA607Roftheviruswereconstructed,andobtainthesolubleexpressionofproteinvSkp1.PulldownexperimentswereperformedbetweentheproteinvSkp1andthesupernatantofChlorellavariablisNC64Awithorwithoutvirusinfection.Theresultswereanalyzedbymassspectrometryandobtain29proteins,includetwentyfiveofF-Boxproteins,twoofCullinproteins,oneofRingboxproteinofthehostandoneofF-Boxproteinofthevirus.Theproteinwithhighcoveragewasselectedtooptimizedandsynthesizedbasedonyeastcodon,thenamplifyingtheproteinfragmentsandlinkingthemwiththeactivationdomainintheyeasttwo-hybridsystemtoforma"prey"plasmid;theoptimizedSkp1proteingenefragmentofvirusandhostwasligatedwiththebindingdomaintoformthe"bait"plasmid.Thebaitandpreyplasmidswereco-transformedintoyeaststrainY2HGoldandY187toverifyprotein-proteininteractions.TheresultsshowedthatallfiveproteinsinteractedwithchSkp1andvSkp1.Inourlaboratory,thetcvCu,Zn-SODproteinexpressedbythechlorellavirusPBCV-1hasbeenshowntohavethefunctionofeliminatingsuperoxideanionandsuppressinghostROSdefensesystem.UsingpyrogallolautoxidationmethodtomeasurethespecificenzymeactivityofSOD,andtheresultis16050U/mg.Apreliminarystudywasconductedonitsenzymaticpropertiesanditwasfoundthatwhenthemassconcentrationoftheenzymewas1μg/mL,thetemperature,pH,anddenaturantshavelittleeffectontheactivityofvSOD;whenII Abstractthemassconcentrationwas0.1μg/mL,thetemperatureandSDShaveastronginfluenceontheactivityofvSOD;whenthemassconcentrationis0.05μg/mL,thetemperature,pH,anddenaturantshaveastronginfluenceontheactivityofvSOD.Keywords:chorella;Ubiquitinproteasomesystem;virus-hostinteraction;Yeasttwo-hybrid;SuperoxidedismutaseIII 目录目录第1章绪论..............................................................11.1前言.............................................................................................................................11.2小球藻病毒及其宿主.................................................................................................11.3泛素-蛋白酶体系统...................................................................................................31.4泛素连接酶E3...........................................................................................................51.5酵母双杂交技术.........................................................................................................61.6超氧化物歧化酶.........................................................................................................71.7CU,ZN-SOD活性的测定方法....................................................................................81.8邻苯三酚自氧化法.....................................................................................................81.9国内外研究进展.........................................................................................................91.10研究意义...................................................................................................................9第2章病毒PBCV-1的感染分离与纯化......................................112.1试验材料...................................................................................................................112.1.1藻株与病毒株................................................................................................112.1.2培养基与试剂................................................................................................112.1.3仪器................................................................................................................122.2试验方法...................................................................................................................122.2.1小球藻NC64A培养.....................................................................................122.2.2病毒PBCV-1感染........................................................................................122.2.3病毒提取与纯化............................................................................................132.2.4病毒效价的测定............................................................................................132.3试验结果...................................................................................................................142.3.1病毒感染结果................................................................................................142.3.2病毒纯化结果................................................................................................142.3.3病毒效价测定结果........................................................................................152.4本章小结...................................................................................................................15IV 目录第3章病毒蛋白的表达及与宿主蛋白的PULLDOWN实验........................163.1试验材料...................................................................................................................163.1.1菌株................................................................................................................163.1.2培养基与试剂................................................................................................163.1.3仪器................................................................................................................173.2试验方法...................................................................................................................173.2.1PCR扩增cvSkp1和A607R片段................................................................173.2.2PCR产物与载体pET23a(+)的酶切与连接.................................................183.2.3连接产物的转化和质粒提取........................................................................183.2.4菌体感受态的制备........................................................................................193.2.5质粒转化........................................................................................................203.2.6菌体活化........................................................................................................203.2.7蛋白小量诱导表达（50mL）.....................................................................203.2.8蛋白纯化........................................................................................................203.2.9cvSkp1蛋白的大量制备...............................................................................213.2.10病毒PBCV-1感染的小球藻NC64A裂解液的制备................................213.2.11Pulldown实验.............................................................................................213.2.12快速银染实验..............................................................................................213.2.13质谱检测......................................................................................................223.3试验结果...................................................................................................................223.3.1pET23a(+)-cvSkp1、pET23a(+)-A607R基因克隆和质粒构建..................223.3.2pET23a(+)-cvSkp1和pET23a(+)-A607R蛋白表达和纯化......................233.3.3Pulldown实验...............................................................................................243.4本章小结...................................................................................................................25第4章酵母双杂交验证试验...............................................264.1试验材料...................................................................................................................264.1.1菌株和质粒....................................................................................................264.1.2培养基和试剂................................................................................................27V 目录4.1.3引物................................................................................................................274.2试验方法...................................................................................................................284.2.1融合蛋白基因优化合成以及片段的扩增....................................................284.2.2PCR产物与载体的酶切与连接...................................................................294.2.3连接产物的转化和质粒提取........................................................................304.2.4酵母感受态的制备及酵母转化....................................................................304.2.5选择培养基验证............................................................................................304.3试验结果...................................................................................................................314.3.1融合蛋白基因优化合成以及片段的扩增....................................................314.3.2酵母双杂交工作质粒的构建........................................................................324.3.3酵母转化........................................................................................................324.4本章小结...................................................................................................................34第5章病毒PBCV-1的SOD酶的表达纯化及活性测定..........................355.1实验材料...................................................................................................................355.1.1菌株................................................................................................................355.1.2培养基和试剂................................................................................................355.1.3实验仪器........................................................................................................365.2实验方法...................................................................................................................365.2.1病毒Cu,Zn-SOD蛋白的纯化......................................................................365.2.2酶活的测定....................................................................................................365.3实验结果...................................................................................................................375.3.1邻苯三酚在Tris-HCl缓冲液中自氧化吸收峰的确定................................375.3.2邻苯三酚自氧化速率的确定........................................................................385.3.3病毒SOD活性测定结果..............................................................................385.4本章小结...................................................................................................................39第6章病毒CU,ZN-SOD部分酶学性质的测定..................................406.1实验材料...................................................................................................................406.2实验方法...................................................................................................................40VI 目录6.3实验结果...................................................................................................................406.3.1温度对vSOD活性的影响............................................................................406.3.2pH对vSOD活性的影响..............................................................................416.3.3SDS对vSOD活性的影响............................................................................416.3.4尿素对vSOD活性的影响............................................................................426.3.5盐酸胍对vSOD活性的影响..........................................................................426.4本章小结...................................................................................................................43第7章结论与讨论.......................................................44参考文献.................................................................45致谢...................................................................50攻读学位期间取得的科研成果...............................................51VII 第1章绪论第1章绪论1.1前言泛素蛋白酶体系统是细胞内防御系统的一部分，可以降解体内大部分蛋白质，平衡新陈代谢，进而参与许多细胞过程，是细胞维持生命的重要环节。小球病毒会通过参与藻类细胞内的泛素蛋白酶体系，降解特定的蛋白质，以创造利于病毒自身复制生长的环境，从而达到寄生繁殖的效果。目前猜测小球藻病毒可能通过劫持宿主体内泛素蛋白酶体系统，来降解相关的蛋白质，但是关于病毒操纵其宿主藻类泛素化系统的机制，目前还不是很清楚。据报道，病原微生物如病毒编码自己的E3连接酶用于调节宿主的诸多细胞过程如细胞分裂，细胞凋亡，免疫逃避等，或劫持宿主E3连接酶用于降解宿主的[1]免疫因子及其它蛋白以利于感染和复制,而痘病毒科(Poxviridae)的众多病毒是一个很好的例子。实验证明，几种痘病毒的ANK蛋白中存在的PRANC(poxproteinrepeatsofankyrin[ANK]atC-terminal)结构域与细胞SCF复合物相互作用，从而控制泛素连接酶[2-9]活性。尽管在真核生物和细菌中很常见，但是在病毒中，除痘病毒外，33个残基的ANK序列相对较少。研究病毒的感染机制，为了解病毒蛋白模拟，底物识别，和控制选择性蛋白降解等领域提供信息，为进一步了解其他大型DNA病毒进化奠定了基础。1.2小球藻病毒及其宿主小球藻病毒最初是在水螅和草履虫内共生的“类小球藻”或者“动物小球藻”中发现的，分为两类，一类是HVCV型，与水螅内共生；一类是PBCV型，与草履虫内共生。其中PBCV-1是chloroviruses（Phycodnaviridae科）的模式株。PBCV-1是一类较大的、二十面体的、可形成空斑的双链DNA病毒，感染淡水中chlorella类绿藻。PBCV-1可感染草履虫Parameciumbursaria的自然内共生体单细胞绿藻C.variabilis。当绿藻存在于Parameciumbursaria内时，其对PBCV-1的感染具有耐受性。淡水生态中chloroviruses的角色一直难以捉摸，而这些病毒的存在通过季节性变化[10]的滴定浓度在全世界范围内被找到。依据实验室中6到16小时敏感的宿主裂解，以及每个细胞超过100PFU的爆炸性增长，自然界中病毒转换的影响潜在地推动了微生物[11]多样性和演化。1 河北大学理学硕士学位论文PBCV-1缺少编码可识别的RNA聚合酶或其一个亚基的基因，在PBCV-1病毒颗粒中无法检测到RNA聚合酶活性。因此，病毒DNA和病毒相关蛋白可能迁移到细胞核中，早期的转录在感染后5~10min被检测到，推测通过劫持宿主RNA聚合酶（可能为RNA[12-13]聚合酶II）。PBCV-1病毒颗粒包裹的限制性内切酶介导的宿主染色体降解发生于[14]感染后2~5min。病毒DNA复制起始在感染后60到90min之间，之后晚期基因开[15]始转录。240min时，PBCV-1感染的细胞被hyaluronan覆盖。病毒组装发生于感染后3~5小时，组装发生于细胞质中的病毒组装中心。6~8小时后，宿主细胞裂解，后代病毒释放（图1）。每个细胞释放约1000个颗粒，其中30%具有感染活力。A.在病毒细胞接触点消化细胞壁（1-3minp.i.）；B.病毒内物质释放到细胞中（3-5minp.i.）；[16]C.细胞质病毒组装中心（3-5hp.i.）；D.通过裂解宿主细胞释放后代病毒（6-8hp.i.）。图1PBCV-1感染ChlorellavariabilisspeciesNC64AFig1InfectionofChlorellavariabilisstrainNC64AbyPBCV-1PBCV-1(Parameciumbursariachlorellavirus-1)作为代表种是藻类DNA病毒科中第1个基因组全长测序的成员，331kb线性基因组预期编码416个蛋白质，其中40%与已知[17]蛋白相似。序列分析表明PBCV-1至少编码5个ANK基因，其中4个含有C端F-Box结构域，同时编码1个与已知序列高度同源的Skp1基因；小球藻病毒属3个种的另外[18]34个病毒株的基因组最近也得到了全长序列，每一病毒株都编码1个Skp1和1-5个ANK蛋白基因。我们选取PBCV-1Skp1(cvSkp1)与4个F-Box蛋白中的1个cvANK2进行酵母双杂交(yeasttwohybrid,Y2H)试验，证明它们之间有很强的蛋白质-蛋白质相互作用；缺失全部7个ANK重复，只保留C端100aa残基，包括37aa残基的F-Box结2 第1章绪论构域的突变基因cvANK2Δ1具有与野生型cvANK2同样强度的蛋白质相互作用；而只缺失C端37aaF-Box结构域的cvANK2Δ2则完全丧失与cvSkp1相互作用的能力。cvANK2，cvANK2Δ1及cvANK2Δ2与人类(Homesapiens)hsSkp1、粘菌(Dictyosteliumdiscoideum)ddSkp1的蛋白质相互作用模式几乎与cvSkp1相同(康明等，待发表资料)。我们用与PBCV-1同一个种的小球藻病毒NY-2A及不同种的病毒ATCV-1所编码的Skp1和ANK基因重复上述试验，结果相同，证明在不同的小球藻病毒株中广泛存在的Skp1和F-Box蛋白ANK均为有功能的SCF泛素连接酶组分。作为这个星球上最大量也最为古老的生物，绿藻是全球能量转换和生物地球化学循[19]环的主要贡献者。由于其在传统农业中利用不可用的陆地和水体以降低有害大气CO2释放、产生O2、制造有价值的生物量方面多样的功能，藻类一直得到了全世界的关注。由于其快速繁殖的能力，许多藻类已经可以通过有效地吸收其他来源的固定的有机化合物来获取能量以通过光合作用促进生长。由于藻类仅仅需要光照、简单的盐和生长所需的氮源，对实验室需求较小，培养并维护相对廉价。藻类是一个多样的光合生物的集合体，从多细胞的海藻到单细胞的属例如Chlorella。Chlorella属（Chlorophyta门）的一种是个体小（直径~2到10μm）、球状、不运动、[20]单细胞的绿藻，是全世界淡水最广布的藻类。大多数的Chlorella物种是自由生活的，而C.variabilis是P.bursaria的内共生生物。事实上，在自然环境中很少能够分离到细胞质中没有绿藻的P.bursaria。据了解，在P.bursaria中被吸入的藻类在保护性的环藻[21]微泡中建立居所，以防止单细胞生物的消化。幸运的是，C.variabilis在实验室中可以独立于P.bursaria进行繁殖。[20]C.variabilis的全长约46.2Mb的基因组已被测序，预测含有9791个蛋白编码基因（CDS）并有很高的平均GC含量（67.2%）。这些基因编码一些减数分裂特化蛋白，表明C.variabilis可能含有二倍体世代和未知的有性生殖期。基因注释显示了一些可能与蛋[22]白蛋白相互作用和细胞壁代谢有关的蛋白编码基因，是其适应内共生的标志。同时拥有宿主和病毒的全序列使得chloroviruses成为一个吸引人的模式系统。1.3泛素-蛋白酶体系统3 河北大学理学硕士学位论文真核细胞的蛋白需要不断的进行更新，即不断地被降解，并被新合成的蛋白质取代来维持正常的细胞功能。真核细胞蛋白的降解主要通过两个途径:泛素-蛋白酶体途径和[23]自噬途径。自噬是一种由溶酶体介导的以膜蛋白和胞外蛋白为主的的蛋白降解机制，其比例占降解蛋白的10-20%；泛素-蛋白酶体系统是由泛素介导的一种高度复杂的蛋白[24]降解机制，它参与降解细胞内80-90%蛋白的降解，并且其过程具有高度特异性。泛素-蛋白酶体系统通过参与真核细胞蛋白质的降解来调节许多细胞过程，包括细胞周期与细胞分裂、细胞凋亡，转录，信号转导，蛋白质质量控制，多种代谢途径的调控，及[25]病原生物的感染反应等。图2泛素蛋白酶体系统Fig2Theubiquitin-proteasomesystemofproteindegradation.泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)主要由6部分组成：泛素(ubiquitin,Ub)、泛素活化酶(ubiquitinactivatingenzyme,E1)、泛素结合酶(ubiquitinconjugatingenzyme,E2)、泛素连接酶(ubiquitinproteinligase,E3)、26S蛋白酶体及其底物（图2）。被泛素标记的靶蛋白降解涉及以下3个连续的过程：(1)E1消耗ATP将泛素活化；(2)泛素通过硫酯化由E1转移给E2；(3)E3将泛素由E2的转移到靶蛋白或连接在靶蛋白上的泛素赖氨酸残基上。上述过程可重复进行使靶蛋白被多价标记而形成泛素链，进而被26S蛋白酶体识别而降解成寡肽，最后由其它蛋白酶降解成氨基酸用于蛋白[22]的重新合成，而泛素分子则被循环用于降解蛋白的标记。真核细胞内只表达一种E1；4 第1章绪论[26]而E2约有30-50种；E3在细胞内则大约有500-1000个。由于具有对底物蛋白高度的特异选择性及负责将泛素分子转至底物的功能，再加上繁多的种类和复杂的结构，E3在上述靶蛋白泛素标记的串联反应中显得尤为重要而成为研究的重点。泛素-蛋白酶体系统通过将细胞内的相关蛋白降解成寡肽，重复参与到新蛋白的合成，是真核细胞的重要调节方式，因此此系统是否正常运行与疾病的出现有着密切的关系[27]。其作用主要表现在两方面：一方面，识别降解细胞内不必要的蛋白质，维持细胞的质量；另一方面，分解相关功能的蛋白质，使降解产物参与到一些特定的循环过程，维持细胞的基本生命活动，最终保证组织和器官能够按照其应有的功能运作。相关研究表明泛素-蛋白酶体系统在心血管疾病中起着重要的调节作用，例如动脉粥样硬化、家族性心肌病和心脏衰竭等。此外，最新的研究显示，毒素、脂肪、癌细胞等对人体有损伤的物质，其部分会参与泛素-蛋白酶体系统的代谢过程，被降解为易于排出体外或者可[28]以参与其他代谢途径的物质，并释放能量，供给人体细胞的自我复制和自我修复。1.4泛素连接酶E3图3SCF复合物的结构Fig3StructureoftheSCFcomplex.泛素连接酶E3既可是单亚基又可形成多亚基复合体，大体上可划分[23]HECT(HomologoustoE6-APCarboxy-Terminus)和环指(RINGFingerLigases)两大类。环指类E3中CRLs(Cullin-RingLigases)是最大的泛素连接酶家族，其中研究最多的是SCF复合体(Skp1-Cul1-F-Boxcomplex)。SCF复合体具有4个核心亚基：Skp1(S-phasekinaseassociatedprotein)，Cul1(Cullin1)，F-Box，和RBX1(RINGBox1)。Cul1是整个多亚基复合体的“基座”，其一端与E2和RBX1结合，另一端与“接头”亚基Skp1结合；真核细胞的F-Box蛋白有2个结构域：C端的约50个氨基酸残基组成的F-Box结构域与Skp1结合，N端的重复序列结构域，如LRR，WD40负责特异性的与靶蛋白结合，由5 河北大学理学硕士学位论文[23,29]相互接近的RBX1催化靶蛋白的Ub标记(图3)。Skp1（S-phasekinase-associatedprotein1）为Cul1/Rbx1和F-box之间的衔接蛋白，其中N-terminalregion（1~70aa）与Cul1相互作用，C-terminalregion（100~163aa）与[30]F-box蛋白相互作用，细胞内的Skp1作为SCF复合物的一个亚基，具有调控细胞周期的功能。F-box蛋白为SCF泛素E3连接酶底物靶向亚基，含有约45-50个氨基酸的与Skp1相结合的保守区域，同时含有一个介导与多样底物结合独立的蛋白蛋白相互作用结构域。与F-box结合的蛋白被靶向地加上多泛素链，并被26S蛋白酶体降解。F-box[31]还能介导通过有限的泛素依赖的蛋白降解使得一些蛋白前体分解为分裂产物的过程。F-box蛋白的多样性使得SCFE3连接酶是最大的E3连接酶家族，已报道的多样的有机体中的F-box蛋白数量差异巨大：人类（69），酵母（11），Caenorhabditiselegans（326），[32]水稻（600）和Arabidopsis（700）。然而，许多F-box蛋白包含并不标准的F-box结[33]构域，在这种情况下利用蛋白数据库中的标准序列鉴定可能的F-box蛋白十分困难，将这样的蛋白归入F-box家族依赖于证明其与SCF复合物其他组分的相关性以及其对某一特定蛋白底物的活性。Rbx1的存在使得SCF复合物具有多聚泛素化活性，并高度保守，同时其还具有连接E2conjugatingenzyme与Cul1的功能。[34]一直认为只有痘病毒才编码病毒型F-Box蛋白ANK，但这一结论由于小球藻病毒编码同一类型的F-Box蛋白而打破。小球藻病毒属于藻类DNA病毒科(Phycodnaviridae)，此科6个属，包括小球藻病毒属在内，均为感染淡水与海洋单细胞[35]或多细胞真核藻类的大型双链DNA病毒，基因组大小从170-560kb不等。藻类病毒通过裂解宿主释放碳素及其它营养物质参与水体的生物地球化学循环(GlobalBiogeochemicalCycling)，控制水华(algalbloom)与赤潮(redtide)的爆发，作为水体中的[36]生态调节因子之一具有重要的理论与应用研究价值而受到越来越多的重视。但这一大类病毒的重要性远远超出上述范畴。1.5酵母双杂交技术酵母双杂交技术是检测蛋白质-蛋白质间的相互作用最常用的方法之一，始于1989年Fields等研究的真核基因转录调控。真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4包括两个结构域：DNA结合结构域(DNAbindingdomain，DNA-BD)和转录激活结构域(Activationdomain,AD)，这两个结构域在真核细胞中是分别起作用的，但也是DNA转6 第1章绪论录必不可少的两部分。BD能够识别并结合于基因的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS)；AD则是通过结合其他成分，靠近BD，激活DNA启动子，以启动UAS下游的一系列相关基因进行转录。图4酵母双杂交原理Fig4Thetwo-hybridprinciple.酵母双杂交是通过将“bait”蛋白与BD融合，“pray”蛋白与AD融合，如果两种蛋白能够相互作用，相应的AD和BD就会形成一定的空间距离，并表现出活性，激活DNA上相应的启动子，进而启动下游一系列可以表现出不同性状的报告基因的表达，验证“bait”蛋白和“pray”蛋白是否有相互作用，如图4。随着生物学的发展，为了尽可能的排除酵母双杂交的假阳性结果，出现了越来越多的报告基因，如His3、Ade2、AURI-C等，增加了结果的可靠性。酵母双杂交的优点：（1）真实性。因为反应是在酵母细胞内进行的，避免了蛋白分离纯化过程的诸多问题；（2）简捷性。可能相互作用的蛋白序列可直接从文库中获得，然后根据酵母偏好的密码子进行优化合成即可；（3）灵敏性。通过各种报告基因的表达，可以敏锐的探测出蛋白蛋白之间微弱的相互作用；（4）普遍性。能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，等等。缺点：有假阳性出现，但是随着报告基因的优化，尽量避免了此情况的出现；转化效率偏低，通过优化转化过程，可利用飞鱼精子DNA将融合蛋白质粒转化至酵母中，可大大提高转化效率。1.6超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）是细胞防御体系的一个重要组成部分，7 河北大学理学硕士学位论文它可以通过歧化反应，将生物体内的活性氧自由基清除；此类酶在自然界分布广泛，几[37]乎遍布于所有的生物体。作为一类金属酶，SOD主要分为3种类型，即Cu,Zn-SOD、[38][39]Mn-SOD和Fe-SOD，其中Cu,Zn-SOD最为常见。生物体正常的生理代谢会产生一2-2-些超氧阴离子自由基(O)，适量的O对生物体本身是有益的，参与体内的细胞信号传2-导,还可以防止病原体的入侵；但是过量的O会损坏体内的大分子物质和细胞结构。生2-2-物体内的SOD可以使O发生歧化反应,产生过氧化氢和分子O2，这样可以减小O对生[40-41]物体的有害影响，具有抗肿瘤、抗炎和提高免疫力等药用功效。由于SOD这一特[42]殊的功能，它在食品，医药和日化等相关领域得到广泛的关注。1.7Cu,Zn-SOD活性的测定方法SOD活性的测定方法可分为直接法和间接法。像脉冲辐射裂解法(PulseRadiolysis)2-和停流法(StoppedFlowTechnique)等直接测定法可在毫秒或微秒水平检测底物O瞬间[43]变化来计算SOD活性，准确性高，但需要复杂的设备和繁琐的实验方法；间接测定2-法可利用黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤或利用光还原核黄素产生超氧离子O，用对超氧离子敏感的指示剂如硝基四氮唑蓝或细胞色素C进行显色反应，当SOD存在于反应体系2-[44]时通过降解O使显色反应受到抑制从而间接计算酶活性；一些指示剂如邻苯三酚、肾上腺素等在碱性条件下可以进行自氧化反应，产生有色的中间产物。利用SOD可以[45-46]抑制上述自氧化过程，从而抑制有色中间产物的积累的能力间接测定SOD的活性。1.8邻苯三酚自氧化法[45]Marklund等利用邻苯三酚自氧化法建立的SOD活性间接测定方法，简单灵敏，[47]得到了普遍的应用，自1974年文章发表以来，引用已超过5000次。由于原文使用毒性强的二甲砷酸作为反应缓冲液，引用者多对此方法进行修改。但此后衍生出的各种酶活测定条件多有不同，例如使用Tris-HCl、Tris-琥珀酸、磷酸盐等各种不同缓冲液；在325、405、412、420、440nm等不同波长下测定自氧化产物的光吸收；以及不同浓度[39,45,47-49]的邻苯三酚，在碱性条件下发生自氧化反应，会产生不同的自氧化速率等，给此方法的应用造成了混乱；本研究采用较为常用的50mmol/LTris-HCl，pH8.2和0.2mol/L磷酸盐，pH8.0作为反应缓冲液，对邻苯三酚法SOD活性测定条件，如反应体系、产物紫外-可见光吸收光谱等进行了系统分析，确定了准确有效的反应条件，目的是为此方法的应用提供可靠数据。8 第1章绪论1.9国内外研究进展一些小球藻病毒编码的基因或调控元件早就引起研究者的高度关注和兴趣，例如首次在病毒中发现的，目前已商业化的，原来只在原核生物细胞中存在的多种II型限制性[50]内切酶；比人体中同类酶切割速度快30倍，有望作为强抗癌药物的小球藻病毒DNA[51]拓扑异构酶；由夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)表达的，能增强病毒抗辐射能力而达[52]到昆虫防治效果的小球藻病毒嘧啶二聚体糖基酶；作为唯一由病毒编码的，目前已知最小的K+通道蛋白，小球藻病毒钾离子通道蛋白是研究与疾病有关的复杂K+通道蛋白[53]的模式蛋白；早就知道多种小球藻病毒基因启动子在细菌和植物中有强启动活性而有[54]望应用于生物工程领域，最近则发现这类启动子在酵母和哺乳动物细胞中同样有强启动功能(康明等，待发表资料)。[55]E3基因突变能引起多种人类疾病，而一些药物的开发也将E3作为靶位点。痘病毒科不但编码E3连接酶，而且几乎此科的所有病毒都编码多个称为ankyrinrepeat(ANK)的F-Box蛋白；例如金丝雀痘病毒(Canarypox)编码51个ANK基因，占基因组[56]的21%。痘病毒ANK蛋白中结构域的排序与细胞型的F-Box蛋白相反，它们具有C端F-Box结构域，N端ANK重复序列用于结合底物蛋白，而且与细胞型的F-Box结构[34]域相比，痘病毒型的F-Box结构域缩短而完全缺失部分缺失第三α螺旋。痘病毒ANK蛋白通过与宿主细胞中SCFE3复合体相互作用而抑制NF-κB的活化来抑制宿主免疫系[57]统，但它在细胞中的直接结合底物并不清楚。1.10研究意义综上所述，小球藻病毒是痘病毒以外的另一组编码病毒型F-Box蛋白的DNA病毒，也是目前为止唯一一组同时编码Skp1和F-Box蛋白的病毒。试验结果表明cvSkp1有可能通过干扰或劫持宿主的SCFE3连接酶复合体来帮助病毒感染和复制。但是cvSkp1如何劫持宿主的SCFE3，有病毒组分参与的宿主泛素连接酶E3的新底物蛋白是什么，抑制或去除病毒编码的E3组分对病毒复制的影响如何等问题目前均没有答案。近年来国[58-59]际上大规模培养包括小球藻在内的单细胞绿藻来生产生物燃料以成为热点，但一个存在的隐患就是病毒感染给大规模培养造成的损失。因此阐明病毒编码基因如何修饰藻类宿主的泛素-蛋白酶体以逃避宿主的防御系统，利于病毒感染与复制，不但有可能建9 河北大学理学硕士学位论文立一种有病毒参与主导的泛素-蛋白酶体新模式，还可筛选小分子抑制剂来干扰病毒的E3蛋白成分以抑制病毒复制。因此这一研究具有很高的理论和应用价值。由于小球藻[60]病毒的宿主之一ChlorellavariabilisNC64A基因组已全长测序和注释，也为本研究的实施提供有力的技术保障。邻苯三酚自氧化法在测定SOD活性中表现出的优点为：简捷，灵敏，因此得到广泛的应用。但在使用过程中人们不断对此方法进行修改，衍生出许多各不相同的邻苯三酚自氧化法测定条件。本文深入研究了该反应的特征吸收峰、缓冲液体系以及2种不同来源的Cu,Zn-SOD对反应的抑制特性，厘清了复杂多样的邻苯三酚自氧化反应条件。10 第2章病毒PBCV-1的感染分离与纯化第2章病毒PBCV-1的感染分离与纯化本章通过感染小球藻NC64A，扩增病毒PBCV-1，由于病毒个体微小，因此须将宿主细胞裂解液上清进行多次超速离心，再经蔗糖密度梯度离心才能获得纯病毒悬液。2.1试验材料2.1.1藻株与病毒株小球藻藻株ChlorelavariabilisNC64A与小球藻病毒株PBCV-1，由UniversityofNebraska的JamesVanEtten教授提供，本实验室保藏。2.1.2培养基与试剂2.1.2.1MBBM（ModifiedBold’sBasalMedium）培养基：1.BBM储存液（1）25.0gNaNO3，蒸馏水定容至1L；（2）2.5gCaCl2·2H2O，蒸馏水定容至1L；（3）7.5gMgSO4·7H2O，蒸馏水定容至1L；（4）7.5gK2HPO4，蒸馏水定容至1L；（5）17.5gKH2PO4，蒸馏水定容至1L；（6）2.5gNaCl，蒸馏水定容至1L；（7）50.0gNa2EDTA，31.0gKOH，蒸馏水定容至1L；（8）4.98gFeSO4·7H2O，酸化水定容至1L(酸化水是999.0mL蒸馏水+1.0mL浓硫酸)；（9）11.42gH3BO3，蒸馏水定容至1L；（10）8.82gZnSO4·7H2O,1.44gMnCl2·4H2O,0.71gMoO3,1.57gCuSO4·5H2O和0.49gCoNO3·6H2O，蒸馏水定容至1L。2.MBBM培养基：10.0mL储存液1,2,3,4,5and6；1.0mL储存液7,8and9；11 河北大学理学硕士学位论文2.0mL储存液10；1.0gofbacto-peptone；5.0g蔗糖；蒸馏水定容至1L。MBBM固体培养基加1.5%琼脂，MBBM软固体培养基加0.75%琼脂。2.1.2.2其它溶液配制20%TritonX-100：20mlTritonX-100，去离子水定容至100mL。50mmol/LTris-HCl（pH7.8）：称取3.028gTris，溶于400mL去离子水，用盐酸调pH至7.8，定容至500mL。10%~40%蔗糖：分别称取10、20、30、40g蔗糖，溶于适量去离子水，定容至100mL。2.1.3仪器电子恒温水浴锅：北京市医疗设备总厂；超净工作台：苏静集团安泰公司，BHC-1300IIA/B3型；台式高速微量小型离心机：大龙兴创实验仪器（北京）有限公司，D2012型；超速离心机：日立Hitachi制备型超速离心机HimacCP100WX；冷冻离心机：BeckmanCoulter微控高效大容量冷冻离心机AvantiJ-26XP；超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-IID。2.2试验方法2.2.1小球藻NC64A培养分别取10×10mL小球藻NC64A培养液接种到10×500mL的三角瓶中，瓶中含有200mL的MBBM液体培养基，在连续光照培养箱中，25ºC震荡培养2-3天，用血球计6数板测定小球藻的浓度，直到浓度达到3×10cells/mL，即生长对数期。2.2.2病毒PBCV-1感染11分别加入10μL滴度为1.5x10PFU/mL的PBCV-1，使m.o.i(multiplicityofinfection)为3；在连续光照培养箱中25ºC震荡培养2~3天，直至培养液变澄清，小球藻全部裂解。12 第2章病毒PBCV-1的感染分离与纯化对裂解液进行抽滤，去除小球藻细胞碎片。2.2.3病毒提取与纯化向裂解液中加入20%TritonX-100至终浓度为1%，旋转混匀，通过超速低温离心机，在4ºC，转速为17000rpm，离心60min，弃上清，沉淀用1~5mL50mmol/LTris-HCl（pH7.8）重悬，放于4ºC备用。准备10~40%的密度蔗糖梯度，置于4ºC过夜，不同浓度的蔗糖须用50mmol/LTris-HCl（pH7.8）配制。将病毒平铺于密度蔗糖梯度上，4ºC，20000rpm，离心30min，病毒大概在蔗糖梯度的1/2~2/3的位置处，显白色，将其用针管取出，合并于一个离心管中，4ºC，27000rpm，离心3小时，弃上清。病毒沉淀用约2mL的50mmol/LTris-HCl（pH7.8）重悬，通过0.45μm的滤膜过滤除菌，保存于4ºC，不可冷冻。2.2.4病毒效价的测定(1)准备MBBM培养基平板。培养基平板最好是用现制的，因为现制的平板形成的版块大小比较均匀，而旧的平板可能会带来不稳定因素，影响试验结果。(2)将MBBMsoftagar融化，分装2.5mLMBBMsoftagar到5mL无菌离心管中，50ºC水浴保温。50ºC为小球藻NC64A能承受的最高温度，同时MBBMsoftagar还可保持液态。(3)将NC64A小球藻培养至生长对数期，在无菌条件下，4ºC，转速为5000rpm离心5min，弃上清，沉淀用适量的新鲜的MBBM液体培养基重悬，将小球藻浓度浓缩至84.0×10cells/mL，再用MBBM重悬沉淀。(4)梯度稀释病毒。在无菌条件下，取10μL病毒PBCV-1加入1.5mL的离心管中，-2管中含有990μL50mmol/LTris-HCl（pH7.8），混合均匀，将病毒稀释10倍，同样依-4-6-8次将病毒稀释10，10和10，共四个梯度，备用。(5)在准备好的MBBM培养基平板上依次做上每个梯度的标记。(6)效价的测定。根据需要依次将盛有2.5mLMBBM软琼脂培养基的5mL无菌离心管从水浴中移出，快速用75%的酒精将管外消毒，擦拭干净，放到试管架上。每管加入0.3mL浓缩小球藻和0.1mL稀释病毒，迅速混合后（上下颠倒4~5次），倒入MBBM13 河北大学理学硕士学位论文平板中，轻摇至培养基平铺均匀（这需要快速完成，因为软琼脂一旦被倾倒到平板上就会快速凝固）。待培养基凝固后（几分钟），将平板倒置（避免水分蒸发凝结滴回培养基造成染菌），置于25ºC连续光照条件下培养，培养时平板不可堆得太高，否则会影响光照，造成小球藻长势不好，最多只能堆放两个。3~4天后即可计算形成的空斑个数，从而计算病毒原液的效价。2.3试验结果2.3.1病毒感染结果培养至对数生长期的小球藻NC64A经病毒PBCV-1感染3天后，小球藻基本裂解完全，病毒已经从宿主细胞内释放出来，培养液由鲜绿色变为白色澄清，如图5-a,b。aba,感染前;b,感染2天后图5病毒PBCV-1感染结果Fig5TheresultofPBCV-1infection2.3.2病毒纯化结果将小球藻NC64A的病毒裂解液经滤膜抽滤，经多次超速离心和蔗糖密度梯度分离后（图6-a），得到病毒悬液如图6-b。aba,蔗糖密度梯度离心结果;b,病毒PBCV-1纯化重悬液图6病毒PBCV-1纯化过程Fig6PurificationofvirusPBCV-114 第2章病毒PBCV-1的感染分离与纯化2.3.3病毒效价测定结果将病毒梯度稀释后，与浓缩的小球藻NC64A混合，涂板，25℃光照培养2天后，11得到病毒空斑，如图7所示，计算的病毒效价为3×10/mL。病毒于4℃保存备用。图7病毒PBCV-1效价测定结果Fig7TheresultofvirusPBCV-1titerdetermination2.4本章小结由于病毒自身不能进行复制，只能通过寄生繁殖，通过附着在小球藻的细胞壁上，将自身遗传物质释放到细胞内，在胞内进行装配繁殖，直至宿主细胞死亡裂解，病毒得到释放。本章中通过接种病毒PBCV-1到小球藻NC64A中，使病毒充分复制释放后，11进行过滤离心等一系列过程，得到了病毒的纯化重悬液，并测得其效价为3×10/mL，为后期的Pulldown实验做准备。15 河北大学理学硕士学位论文第3章病毒蛋白的表达及与宿主蛋白的Pulldown实验小球藻病毒可能通过参与或劫持宿主的泛素蛋白酶体系统，从而调节若干细胞过程，创造利于自身复制的环境。但是有关病毒如何操纵其宿主泛素化系统，目前还不是很清楚，推测病毒可能通过模仿宿主中泛素连接酶E3的相关组分，进而控制泛素化系统。我们首先表达病毒PBCV-1的Skp1和F-Box重组蛋白，利用重组蛋白对小球藻NC64A经病毒感染或未感染的细胞裂解液上清中的蛋白进行吸附，筛选出亲和蛋白，进一步通过酵母双杂交试验对病毒-宿主泛素连接酶E3组分间可能存在的相互作用进行体外验证。3.1试验材料3.1.1菌株菌株EscherichiacoliDH5α；菌株E.coliRosetta（DE3）；质粒pET23a(+)均由本实验室保存。3.1.2培养基与试剂LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10；SOC培养基（使用前配制）（g/L）：胰蛋白胨20，酵母浸粉5.0，NaCl0.5，KCl0.186，MgCl20.95，MgSO41.2，葡萄糖3.6，pH7.0±0.2；转化缓冲液：10.88gMnCl2·4H2O，2.20gCaCl2·2H2O，18.65gKCl，20mLPIPES(0.5mol/L,pH6.7)，蒸馏水定容至1L。结合缓冲液：Tris-HCl20mmol/L，咪唑10mmol/L，氯化钠0.5mol/L，pH8.0；洗涤缓冲液：Tris-HCl20mmol/L，咪唑50mmol/L，氯化钠0.5mol/L，pH8.0；洗脱缓冲液：Tris-HCl20mmol/L，咪唑0.5mol/L，氯化钠0.5mol/L，pH8.0；染色液：0.1%考马斯亮蓝R250，10%冰乙酸，40%甲醇；脱色液：20%甲醇，10%冰乙酸；SDSgel-loadingbuffer（5×）：250mmol/LTris-HCl（pH6.8），10%（w/v）SDS，0.5%bromophenolblue，50%glycerol，0.5mol/LDTT（dithiothreitol）；固定液：25mmol/L乙酸，100mL乙醇，用去离子水定容到250mL；增敏液：硫代硫酸钠0.5g，三水合乙酸钠28.19g，甲醇75mL，用去离子水定容到250mL；硝酸银染色液：硝酸银0.625g，去离子水定容到250mL；显影液：碳酸钠6.25g，甲醛100uL定容到250mL；16 第3章病毒蛋白的表达及与宿主蛋白的Pulldown实验停影液：Na2EDTA3.65g，定容到250mL。3.1.3仪器稳压稳流电泳仪：北京市六一仪器厂，DYY-III-5型；超净工作台：苏静集团安泰公司，BHC-1300IIA/B3型；台式高速微量小型离心机：大龙兴创实验仪器（北京）有限公司，D2012型；冷冻离心机：BeckmanCoulter微控高效大容量冷冻离心机AvantiJ-26XP；超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-IID。3.2试验方法3.2.1PCR扩增cvSkp1和A607R片段根据cvSkp1和A607R片段基因，以pET23a(+)为载体，NdeⅠ、XhoⅠ为酶切位点设计引物，PBCV-1genome为模版，通过PCR扩增基因片段，PCR反应体系和反应条件如表1，2。表1PCR反应体系Table1PCRreactionsystem组分体积(μL)模板3.0引物12.0引物22.02×Buffer25.0dNTPMix1.0DNA聚合酶1.0H2O16总体积5017 河北大学理学硕士学位论文表2PCR反应程序Table2PCRreactionprocedure温度时间预变性98℃2min变性98℃10s30cycles退火60℃30s延伸72℃30s最终延伸72℃10minPCR程序结束后，体系中加5μLloadingbuffer，通过枪头吸打混匀。取5μL产物进行琼脂糖凝胶检测，若条带大小正确，则按照康为世纪Gel/PCRExtractionKit的说明书回收剩余PCR产物（注：回收用琼脂糖凝胶须是现配的，TBE缓冲液也要换新）。回收后，保存于-20℃，备用。3.2.2PCR产物与载体pET23a(+)的酶切与连接利用双酶切，将质粒pET23a(+)分别与PCR产物cvSkp1和A607R进行粘性末端连接。已NdeⅠ和XhoⅠ为酶切位点，配制酶切体系，置于37℃孵育2小时，进行胶回收，然后将回收产物pET23a(+)分别与cvSkp1和A607R配制相应的连接体系，置于16℃反应过夜。3.2.3连接产物的转化和质粒提取分别取10μL连接产物pET23a(+)+cvSkp1和pET23a(+)+A607R加入到50μL大肠杆菌DH5α的感受态细胞中（质粒扩增专用菌株，保存于-80℃），轻摇混合至均匀，放于冰中孵育30min。孵育完成后，放于42℃的金属浴中热激45秒，然后重新放回冰中，2min后，在无菌条件下加入950μLLB培养基，于37℃摇床震荡培养1小时。准备2个LB+Amp100μg/mL(终浓度，缩写为Amp100,下同)培养基平板，待培养结束后，将菌体于7500rpm离心2min，弃上清，用50~100μL的LB培养基重悬，分别涂布于准备好的抗性平板上，做好标记，置于37℃培养箱培养过夜。18 第3章病毒蛋白的表达及与宿主蛋白的Pulldown实验分别挑取1个转化子，接种到5mLLB+Amp100液体培养基中，培养10-16小时，根据康为世纪PlasmidMiniprepKit试剂盒的说明书分别提取两个质粒，取5μL进行质粒酶切检测，琼脂糖凝胶检测结果正确后，质粒放于-20℃保存备用。3.2.4菌体感受态的制备(1)0.5mol/LPIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸；1,4-Piperazinediethanesulfonicacid，PIPES)：称取15.1gPIPES的溶于80mL的纯化水中，用5mol/LKOH将溶液的pH调节至6.7，定容至100mL。溶液经0.45μm的过滤器进行过滤消毒后，分装，-20℃保存备用。(2)Inoue转化缓冲液：将转化缓冲液经0.45μm的过滤器进行过滤消毒后，分装，-20℃保存备用。(3)将菌株进行平板划线，37℃培养16~20小时，挑取单菌落，接种到盛有25mLSOB培养基250mL的三角瓶中，37℃震荡培养6~8小时。(4)晚上六点左右，将上述菌液接种到3个1L的三角瓶中，瓶中含有250mLSOB培养基，接种量分别为10mL、4mL、2mL，置于18~22℃摇床中过夜培养。(5)次日，测量三瓶菌液的OD600，每45min测一次，当其中一瓶菌液的OD600值达到0.55时，将其转移至冰中孵育10min。其余两瓶放弃。（实验室昼夜温度和时间的波动取决于一年中的时间、晚上实验室中工作人员数量等变化因素。由于这种可变性，很难预测过夜菌体培养基的生长速度，使用三种不同浓度的接种量可增加培养过夜后其中一种培养物处于正确密度的机会。）(6)在4℃条件下，转速为5000rpm，离心10min收集菌体，尽量去除所有上清。(7)菌体用80mLInoue缓冲液轻轻地重悬（细胞最好通过旋转重悬而不是吸打或涡旋）。(8)在4℃条件下，转速为5000rpm，离心10min收集菌体，尽量去除所有上清。(9)菌体用20mLInoue缓冲液轻轻地重悬。(10)加入1.5mL的DMSO，轻轻混合悬液，冰浴10min。(11)立即将悬浮液分装到1.5mL冷冻无菌离心管中，每管100μL，通过液氮快速冷冻感受态细胞，储存在-80ºC，在液氮中迅速冷冻可将转化效率提高5倍。(12)需要时，将感受态细胞从-80ºC冷冻箱中取出，常温解冻细胞后，再放于冰上10min，即可使用。19 河北大学理学硕士学位论文3.2.5质粒转化取1μL质粒pET23a(+)-cvSkp1和pET23a(+)-A607R分别加入到两管50μLE.coliRosetta（DE3）的感受态中，轻摇混合至均匀，放于冰中孵育30min。以下试验过程同连接产物转化过程。3.2.6菌体活化分别挑取一个转化子，接种至5mLLB+Amp100μg/Ml+Cam25μg/mL(终浓度，缩写为Amp100+Cam25,下同)液体培养基中，37ºC震荡培养16~20小时。3.2.7蛋白小量诱导表达（50mL）取1mL过夜培养菌液至50mL5mLLB+Amp100+Cam25液体培养基中，37ºC震荡培养1.5小时，测OD600值，至OD600值达到0.4~0.6之间，停止培养。待菌液温度冷却至室温，将菌液平分成两三角瓶，其中一瓶加入一定量的1mol/LIPTG至终浓度为0.4mmol/L，另一瓶作为空白对照。25ºC震荡诱导培养3小时，低温离心收集菌体，放于-20ºC备用。3.2.8蛋白纯化将菌体从-20ºC冰箱拿出，放于冰上10min，待菌体溶解后，加入2.5mLLysisbuffer，混匀，将离心管放于冰上，使用超声波细胞粉碎机将细胞破碎完全（功率25%，开3S，停6S，时间10min），裂解液于4ºC，12000rpm离心25min，收集上清，标记为“S”“CS”，沉淀用500μLLysisbuffer重悬，标记为“P”“CP”。分别取100μL镍柱至1.5mL离心管中，加入1mLLysisbuffer，上下颠倒数次，4ºC，12000rpm离心1min，弃上清。重复4次。取1.5mL“S”“CS”加入镍柱中，置于4ºC旋转混匀仪上结合30min。4ºC，12000rpm离心1min，上清移至新的1.5mL离心管中，标记“F”“CF”。取1.5mLWashbuffer至镍柱中，上下颠倒数次，4ºC，12000rpm离心1min，弃上清。重复3次，保留最后一次上清，标记为“W”“WS”。取100μLElutionbuffer至镍柱中，置于4ºC旋转混匀仪上混合15min，4ºC，12000rpm离心1min，上清移至新的1.5mL离心管中，标记“E”“CE”。注：若为大量蛋白纯20 第3章病毒蛋白的表达及与宿主蛋白的Pulldown实验化则重复3次。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。3.2.9cvSkp1蛋白的大量制备将带有cvSkp1蛋白基因的菌体E.coliRosetta（DE3）进行活化，按1/10的比例接种3瓶100mL的培养基，37ºC震荡培养1.5小时左右，待菌液OD值达到0.4~0.6，降至室温，加入适量的IPTG，25ºC诱导培养3小时，收集菌体。将菌体分别用10mLLysisbuffer悬浮，细胞经过超声波低温破碎（功率25%，开3S，停6S，时间20min），裂解液于4ºC，12000rpm离心25min，收集上清。将上清与平衡好的2个0.5mL镍柱混合，于4ºC结合1小时，离心，弃上清，镍柱放于4ºC备用。3.2.10病毒PBCV-1感染的小球藻NC64A裂解液的制备接种600mL小球藻NC64A，25ºC震荡培养至生长对数期，将细胞等分成3份，其中一份不加病毒，收集细胞，作为对照；另2份均用纯化的PBCV-1感染细胞使m.o.i达到3，其中一份在上述培养条件下感染30min，另一份感染180min，离心（8000rpm，4ºC，5min），收集细胞。细胞立即投入液氮冷冻，放入-80ºC待用感染和未感染的细胞化冻后分别用10mLLysisbuffer悬浮，加入适量玻璃珠和蛋白酶抑制剂，细胞经均质器破碎，离心（10000rpm，4ºC，20min），保留上清。3.2.11Pulldown实验将步骤3.2.10得到的小球藻NC64A裂解液加入到步骤3.2.9的相应的镍柱中，于4ºC结合1小时，离心，弃上清。镍柱中接着用20倍的Washbuffer清洗，去除杂蛋白和结合不紧密的蛋白，弃上清，加入0.3mL的Elutionbuffer，于4ºC混旋20min，离心，上清4ºC保存备用。3.2.12快速银染实验(1)将步骤3.2.11得到的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)将胶用去离子水洗5min；(3)将胶完全侵入固定液中，15min；21 河北大学理学硕士学位论文(4)重复步骤2一次；(5)将胶完全浸入增敏液中，轻摇30min；(6)水洗5min，三次；(7)将胶完全浸入新配置的硝酸银染色液中，避光轻摇20min；(8)水洗1min，2次；(9)将胶玩去浸入新配置的显影液中，轻摇并观察显影情况；(10)将胶玩去浸入停影液中，轻摇10min；(11)水洗5min，三次。注：所有试剂均须现配，且硝酸银溶液须棕色瓶避光，低温保存；硝酸银染色过程(7)必须用锡箔纸包裹，避光染色，直至开始显影，避免背景太深。3.2.13质谱检测将银染得到的结果利用QExactive组合四级杆Orbitrap质谱仪进行分析，并重复两次，合并两次得到的结果，并根据对照结果排除非特异性蛋白，得到亲和蛋白。3.3试验结果3.3.1pET23a(+)-cvSkp1、pET23a(+)-A607R基因克隆和质粒构建M12M:SuperDNAMaker;1:pET23a(+)-A607R;2:pET23a(+)-cvSkp1图8连接质粒酶切电泳结果Fig8Electrophoreticresultsoflinkedplasmids通过PCR扩增cvSkp1、A607R基因片段，得到大小正确的基因片段（cvSkp1、A607R片段大小分别为453bp、1176bp）。将回收的片段cvSkp1、A607R和载体pET23a(+)双酶22 第3章病毒蛋白的表达及与宿主蛋白的Pulldown实验切回收后，分别进行低温过夜连接。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个转化子，提取质粒，经双酶切检测验证，结果如图8所示，两个质粒酶切后的大小片段正确，于-20℃保存。3.3.2pET23a(+)-cvSkp1和pET23a(+)-A607R蛋白表达和纯化为了得到可溶性的蛋白cvSkp1、A607R，用于Pulldown实验，在本试验中，分别将两个质粒pET23a(+)-cvSkp1和pET23a(+)-A607R转化到蛋白表达宿主E.coliRosetta（DE3）中，经IPTG诱导表达，通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化，得到了cvSkp1蛋白的可溶性表达，A607R蛋白未能得到可溶性结果。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测如图9所示。图9中所展示的是每一种蛋白的诱导与非诱导结果的对比，A图显示A607R蛋白仅在诱导沉淀中有明显诱导条带，所代表的大小与理论值43kd相近，但是在样品上清中没有明显的诱导条带，猜测在诱导过程中可能形成包涵体，之后经更换表达载体，表达菌株，诱导温度，IPTG诱导浓度等各种可尝试的条件，最终都未能得到可溶性结果。B图为cvSkp1蛋白的分离纯化结果，在最后洗脱后的样品中，得到了单一条带，且可溶性非常高，所示大小与理论值（cvSkp1蛋白的大小约为15kd）也相近，成功得到了cvSkp1蛋白的可溶性表达。123456M78123456M78ab20kd45kd35kd15kda,为A607R蛋白的分离纯化结果;b,为cvSkp1蛋白的分离纯化结果;1,2:样品和对照沉淀;3,4:样品和对照上清;5,6:样品和对照上清;M:ProteinMaker;7,8:样品和对照目的蛋白.图9vSkp1和A607R蛋白的分离纯化电泳图Fig9SeparationandpurificationofvSkp1andA607Rproteins23 河北大学理学硕士学位论文3.3.3Pulldown实验将cvSkp1蛋白大量表达后，利用其6×His标签吸附在镍柱上，然后加载小球藻NC64A的病毒与非病毒裂解上清，吸附与cvSkp1有亲和作用的目标蛋白，再用3.1.2中的洗涤缓冲液洗脱杂蛋白，最终将留在柱子上的亲和蛋白洗下，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分别用考马斯亮蓝染色检测和快速银染检测，如图10所示。123456图10Pulldown实验银染和考染结果Fig10PulldownexperimentsofsilverstainingandCoomassiestaining对比实验结果，考染的结果有4条带，银染的结果相对于考染多出很多条带，将银染结果进行质谱检测，经查库得到29种可能与cvSkp1蛋白有相互做的蛋白(表3)。表3质谱检测结果Table3Resultsofmassspectrometrytest序号肽段对应蛋白编号NCBI蛋白功能1136916XP_005845385.1ChlNC64A_1|F-Box2138465XP_005844907.13140098XP_005843744.1452604XP_005847489.15141821XP_005842893.16142012XP_005850030.17143670XP_005849109.18133199XP_005851782.124 第3章病毒蛋白的表达及与宿主蛋白的Pulldown实验9134953XP_005846972.110134072XP_005847839.111141508XP_005843133.112137502XP_005845234.113141596XP_005843042.114145011XP_005848328.115141219XP_005843385.11649503XP_005852137.11752423XP_005847866.11855445XP_005843056.11957086XP_005850114.12057216XP_005849782.121142486XP_005842872.122137502XP_005845234.123142039XP_005850043.12454357XP_005844801.12558003XP_005847517.126138949XP_005844634.1ChlNC64A_1|Cullin2722706XP_005848189.12850422XP_005850711.1ChlNC64A_1|RingBox29A607RNP_048963.2VirusF-Box3.4本章小结本章成功构建了质粒pET23a(+)-cvSkp1、pET23a(+)-A607R，并转化至E.coliRosetta（DE3）中，进行蛋白诱导表达纯化，结果得到了cvSkp1的高效可溶性表达，但A607R蛋白没有得到可溶性的，之后经过调整各种条件均未成功。将蛋白cvSkp1进行大量表达，与小球藻NC64A的病毒裂解液进行Pulldown实验，并进行了银染考染检测，银染结果经质谱分析，结果得到29种亲和蛋白。25 河北大学理学硕士学位论文第4章酵母双杂交验证试验酵母双杂交法用于检测蛋白间相互作用快捷简便，具有高度的敏感性。本章将质谱检测得到的结果，经过筛选，将一部分具有F-Box结构域的目标蛋白经密码子优化后人工合成，构建成酵母双杂交工作质粒，进行bait与prey一对一的验证，在体外证明cvSkp1与宿主E3组分相互作用的可能性。4.1试验材料4.1.1菌株和质粒菌株菌株基因型来源E.coliDH5αfhuA2lac(del)U169phoAg本实验室lnV44Φ80'lacZ(del)M15gyrA96recA1relA1endA1thi-1hsdR17Y2HGoldYeastStrainMATa,trp1-901,leu2-3,112,ClontechLaboratoriesura3-52,his3-200,gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1UAS–Gal1TATA–His3,GAL2UAS–Gal2TATA–Ade2URA3::MEL1UAS–Mel1TATAAUR1-CMEL1Y187YeastStrainMATα,ura3-52,his3-200,ClontechLaboratoriesade2-101,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,gal80Δ,met–,URA3::GAL1UAS–Gal1TATA–LacZ,MEL126 第4章酵母双杂交验证试验质粒质粒来源pGBKT7-BD(BD)ClontechLaboratoriespGADT7-AD(AD)pGBKT7-LampGBKT7-53pGADT7-T4.1.2培养基和试剂本实验室所用的的20种氨基酸、肌醇(myo-Inositol)、尿嘧啶(Uracil)、腺嘌呤硫酸盐、无氨基酵母氮源、X-Gal、腺嘌呤硫酸盐购自生工生物工程有限公司；腺嘌呤(Adenine)、对氨基苯甲酸(p-Aminobenzoicacid)、LiAc、聚乙二醇、YNB购自Sigma；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、巯基乙醇购自保定华新试剂；液氮。LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10；固体培养基加1.5%的琼脂粉。YPDA培养基（g/L）：胰蛋白胨20.0，酵母提取物10.0，葡萄糖20.0，腺嘌呤硫酸盐0.03；固体培养基加1.8%的琼脂粉。10×LiAcstocksolution(200mL)：20.4glithiumacetate;20mL1mol/LTris-HCl(pH8.0);4mL0.5mol/LNa2EDTA(pH8.0)，过滤灭菌。LiAcsolution(200mL)：20mL10×LiAcstocksolution;180mLdH2O，高温灭菌。50%PEGsolution(200mL)：100gPEG3350，dH2O定容至200mL。10×TEbuffer：50mL1mol/LTris-HCl(pH8.0);10mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，dH2O定容至500mL；Zbuffer：60mmol/LNa2HPO4，40mmol/LNaH2PO4，10mmol/LKCl，1mmol/LMgSO4，pH7.0；X-Gal试剂：100μLX-Gal溶液(0.1g/mLinDMF)，60μL巯基乙醇，10mLZbuffer。4.1.3引物引物名称引物序列chFBX03NdeIFrwGGTATTCCATATGTCAGCATCTGGTAGGAGAchFBX03XhoIRevATTCTCGAGTTATCTACCCAAGACAGCAGCchFBX02NdeIFrwGGTGCTCCATATGAGAGTTAATTCTATCTTTTTAGGTTTG27 河北大学理学硕士学位论文chFBX02XhoIRevCGTCTCGAGTTAATCAATTAACATAGCAGTTGCATCchFBX01NdeIFrwGGTATTGCATATGGTTGAATTGTTGGAGTTGGchFBX01XhoIRevATTCTCGAGTTAAACCAACCAAGGTGGTTchFBX04NdeIFrwCGTCTTCCATATGCATAAATTTTTTCCCGCTTTchFBX04XhoIRevAGTCTCGAGTTAATCCCATAAGACGACTGGA607RNdeIFrwGGTCGTGCATATGGAGATTACTAAAACTATTAAAGATAACGA607RXhoIRevGACCGCTCGAGTTAAAAAGTCTTTAATATAATATTGTTAATAATTTCTCTchSkp1NdeIFrwGGAGCACCATATGACTGAAAAAGTTAAATTGTTGTCTchSkp1PstIRevCTTCTGCAGTTATTCGAAAGCCCATTGGATTCCCGGGTTAGTAATCTTCGATTGGCACcvSkp1SmaIRevGTTCCATGGCTATCGTTTTCATCACATCTGcvSkp1NcoIFrw4.2试验方法4.2.1融合蛋白基因优化合成以及片段的扩增从3.3的质谱结果中选取5种覆盖率较高的亲和蛋白XP_005843385.1(chFBX01)、XP_005846972.1(chFBX02)、XP_005851782.1(chFBX03)、XP_005847489.1(chFBX04)、A607R，同宿主和病毒的chSkp1、cvSkp1蛋白的基因根据酵母偏好的密码子进行优化，并合成。以BD为载体，NdeⅠ，PstⅠ为酶切位点设计引物，用于扩增chSkp1片段；以AD为载体，NdeⅠ，PstⅠ为酶切位点设计引物，用于扩增亲和蛋白基因片段。PCR体系和程序如表4，5：28 第4章酵母双杂交验证试验表4PCR反应体系Table4PCRreactionsystem组分体积(μL)模板DNA1.0引物12.0引物22.02×Buffer25.0dNTPMix1.0DNA聚合酶1.0H2O18.0总体积50表5PCR反应程序Table5PCRreactionprocedure温度时间预变性98℃2min变性98℃15s退火60℃15s30cycles延伸72℃80s最终延伸72℃10minPCR产物加5μLloadingbuffer，混匀。取5μL产物进行琼脂糖凝胶检测，若条带大小正确，则按照康为世纪Gel/PCRExtractionKit的说明书回收剩余PCR产物（注：回收用琼脂糖凝胶须是现配的，TBE缓冲液也要换新）。回收后，保存于-20℃，备用。4.2.2PCR产物与载体的酶切与连接以NdeⅠ和PstⅠ为酶切位点，将质粒BD与PCR产物chSkp1进行粘性末端连接；将质粒AD分别与亲和蛋白的PCR产物进行粘性末端连接，步骤同3.2.2。29 河北大学理学硕士学位论文4.2.3连接产物的转化和质粒提取分别取10μL连接产物转化至50μL大肠杆菌DH5α（菌株保存于-80℃），轻摇混合至均匀，放于冰中孵育30min。以下步骤同3.2.3。挑取一个转化子，提取质粒，经琼脂糖凝胶检测结果正确后，放于-20℃保存备用。4.2.4酵母感受态的制备及酵母转化接种酵母Y187和Y2HGold至5mLYPDA液体培养基中，30℃震荡培养过夜，得到饱和培养液。将饱和培养液稀释，使其OD600为0.1(50mLYPDA液体培养基加1ml饱和培养液，6总细胞数量约为3×10).每个转化和对照需用到20ml细胞培养液。30℃震荡培养至7OD600为0.4~0.6(培养约4小时，总细胞数量约为1×10)将培养液转移至离心管中，6500rpm离心5min，获得细胞沉淀，加入10mL1×LiAc溶液，重悬混匀，离心弃上清。用适量1×LiAc溶液将沉淀重悬，每个转化需用100μL细胞重悬液，总细胞数量为82×10。对于每一个转化，分别在1.5mL的离心管中加入10μL的carrierDNA，开水浴1min使其变性，立即转移至冰中，待冷却后，分别加入1μg质粒DNA和100μL酵母感受态细胞。注意DNA的体积尽量小于20μL，如果超过20μL，需另加1/10总体系体积的10×LiAc溶液。如30μL的DNA和10μLcarrierDNA，加4μL10×LiAc。再加600μLPEG溶液，充分混匀，30℃连接培养30min，然后42℃热激15min，瞬离弃上清，沉淀用1mL无菌去离子水重悬混匀，取200μL涂布于SD-Leu-Trp固体培养基上，30℃培养2~5天，至长出转化子。4.2.5选择培养基验证每个板上分别挑取4个Y2HGold酵母转化子至5mLSD-Leu-Trp液体培养基中，30℃培养2~5天，待有菌体长出后，用接种环在SD-Leu-Trp-His固体培养基平板中间分区划线，同时在平板两边分别划线正负对照，30℃培养2~5天，观察是否有菌体长出。分别挑取Y187酵母转化子至SD-Leu-Trp液体培养基中，30℃培养2~5天，待有菌体长出后，用接种环在SD-Leu-Trp固体培养基平板中间分区划线，同时在平板两边分30 第4章酵母双杂交验证试验别划线正负对照，30℃培养2~5天，待菌体长出，将菌体影印到滤纸上，使用液氮冷冻20~30s，放在浸满X-Gal溶液的滤纸（2层）上，菌体朝上，盖上盖子，于37℃培养24小时，观察结果。4.3试验结果4.3.1融合蛋白基因优化合成以及片段的扩增将chFBX01，chFBX02，chFBX03，chFBX04，A607R，chSkp1，cvSkp17个蛋白基因根据酵母偏好的密码子进行优化后，合成，并设计引物，通过PCR的方法进行扩增，经琼脂糖凝胶检测，结果如图11所示，得到大小正确的基因片段，将其回收，-20℃保存备用。1-4:cvSkp1;chSkp1;chFBX01;chFBX02;M:SuperDNAMaker;5-7:chFBX03;A607R;chFBX04图11亲和蛋白基因片段扩增结果电泳图Fig11Theresultsofamplificationofaffinityproteingenefragments1-4:BD-cvSkp1;BD-chSkp1;AD-chFBX01;AD-chFBX02;M:SuperDNAMaker;5-7:AD-chFBX03;AD-A607R;AD-chFBX04图12酵母双杂交工作质粒构建结果电泳图Fig12theresultsofyeasttwo-hybridworkingplasmidconstruction31 河北大学理学硕士学位论文4.3.2酵母双杂交工作质粒的构建将载体BD分别与cvSkp1，chSkp1进行双酶切连接；将载体AD分别与chFBX01、chFBX02、chFBX03、chFBX04、A607R，进行双酶切连接，且分别转化至50μL大肠杆菌DH5α，挑取单个转化子，提取质粒，进行双酶切琼脂糖凝胶检测，结果如图12，对应的片段大小正确，至此得到质粒BD-cvSkp1，BD-chSkp1，AD-chFBX01，AD-chFBX02，AD-chFBX03，AD-chFBX04，AD-A607R。4.3.3酵母转化由图13(A)可得，将病毒与宿主的Skp1蛋白与亲和蛋白chFBX01、chFBX02、chFBX03、chFBX04、A607R一对一转化至酵母Y2HGold中后，在SD-Leu-Trp固体培养基中均有菌体长出，说明质粒成功转入Y2HGold中。将-Leu-Trp固体培养基上的菌落分别划线至SD-Leu-Trp-His筛选培养基中，由图13(B)可得，正对照和样品均有菌体长出，负对照没有长出菌体，证明病毒的Skp1蛋白与亲和蛋白chFBX01、、chFBX02、chFBX03、chFBX04、A607R均有相互作用。由图14(A)可得，将病毒与宿主的Skp1蛋白与亲和蛋白chFBX01、chFBX02、chFBX03、chFBX04、A607R一对一转化至酵母Y187中后，在SD-Leu-Trp固体培养基中均有菌体长出，说明质粒成功转入酵母中。将SD-Leu-Trp固体培养基上的菌体影印到滤纸上，通过液氮冻融使细胞破碎后，释放出β-半乳糖苷酶，然后将滤纸放在浸满X-Gal溶剂的滤纸上，X-Gal在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物，由图14(B)可得，病毒与宿主的Skp1与5种亲和蛋白的转化后的染色均呈现不同程度的蓝色，其中cvSkp1与宿主的4种F-Box蛋白表现出较强的相互作用，间接证明了病毒的Skp1蛋白参与到了宿主的SCF复合物中，进而涉及宿主的泛素蛋白酶体系统。32 第4章酵母双杂交验证试验(A)(B)(A)为cvSkp1和chSkp1与5种亲和蛋白一对一转入Y2HGold中后，菌体在SD-Leu-Trp培养基上的生长情况；(B)为菌体在SD-Leu-Trp-His培养基上的生长情况；图13酵母双杂交验证结果Fig13Preliminaryresultsofyeasttwo-hybrid(A)(B)(A)为cvSkp1和chSkp1与5种亲和蛋白一对一转入Y187中后，菌体在SD-Leu-Trp培养基上的生长情况；(B)为菌体通过破碎显色后的情况；图14酵母双杂交验证结果Fig14Preliminaryresultsofyeasttwo-hybrid33 河北大学理学硕士学位论文4.4本章小结本章PCR扩增获得了5个亲和蛋白及病毒和宿主的Skp1蛋白，并分别成功与GAL4激活结构域pGADT7-AD和DNA结合结构域pGBKT7-BD连接，将两种工作质粒一对一转入酵母Y2HGold中，进行酵母双杂交验证，试验结果表明病毒和宿主的Skp1蛋白均与亲和蛋白有不同程度的相互作用，同时也间接证明了病毒表达的Skp1蛋白涉及到了宿主的泛素蛋白酶系统。34 第5章病毒PBCV-1的SOD酶的表达纯化及活性测定第5章病毒PBCV-1的SOD酶的表达纯化及活性测定本实验室前期工作已证明PBCV-1编码的tcvCu,Zn-SOD（简称vSOD）基因在体外能表达有活性的超氧化物歧化酶；此酶存在于成熟病毒粒子外壳中，可能随病毒侵染进入宿主细胞中，对宿主产生的具有防御机能的活性氧自由基(ReactiveOxygenSpecies,[61]ROS)有淬灭作用，构成了病毒vSOD与宿主ROS之间的另一种病毒-宿主相互作用。本实验继续对PBCV-1编码的vSOD的酶学性质进行研究，以期对病毒-宿主间相互作用有进一步了解。邻苯三酚自氧化反应可以间接的测定SOD活性，此方法简捷，灵敏，得到广泛的应用。但在使用过程中人们不断对此方法进行修改，衍生出许多各不相同的邻苯三酚自氧化法测定条件，例如检测邻苯三酚自氧化产物就有325，405，412，420和440nm等多种测定波长；反应的缓冲体系同样有Tris-二甲砷酸，Tris-HCl，Tris-琥珀酸和磷酸缓[41,45,47-49]冲液等多种；以及不同浓度的底物产生不同邻苯三酚自氧化速率等。本章实验研究了邻苯三酚自氧化反应在Tris-HCl缓冲液中的特征吸收峰，厘清了复杂多样的邻苯三酚自氧化反应的测定波长和邻苯三酚浓度，并通过此法测定了vSOD酶的活性。5.1实验材料5.1.1菌株[61]菌株E.coliRosetta(DE3)；质粒pET23a(+)-vSOD均由本实验室保存。5.1.2培养基和试剂本实验所用邻苯三酚采购自Sigma，其余试剂均采购自和国药集团化学试剂有限公司(国药集团).LB培养基：（固体培养基加1.5%的琼脂粉）药品名称称量g/L胰蛋白胨10.0酵母提取物5.0NaCl10.0pH7.035 河北大学理学硕士学位论文50mmol/LTris-HCl：量取150mL0.5mol/LTris和91.7mL500mmol/LHCl,补加100mmol/L二乙三胺五乙酸15mL，最后用去离子水定容至1.5L，调整pH值得到pH8.2。45mmol/L邻苯三酚溶液：称取142mg邻苯三酚，用10mmol/LHCl溶解并定容至25mL，冷藏于棕色容量瓶内.5.1.3实验仪器UV-3802型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；H2O3-100C恒温金属浴，卡尤迪(北京)生物科技公司；电子天平，BELEngineering产品；ST3100实验室PH计，奥豪斯仪器(常州)有限公司；GI54DS自动压力蒸汽灭菌器，致微(厦门)仪器有限公司.5.2实验方法5.2.1病毒Cu,Zn-SOD蛋白的纯化将质粒pET23a(+)-SOD转化到蛋白表达菌株E.coliRosetta（DE3）中，挑取单个转化子活化，按1：10的比例将活化菌株接种到200mLLB+Amp100+Cam25液体培养基中，37℃震荡培养至菌液OD值为0.4~0.6，在25℃，0.4mmol/LIPTG的条件下诱导培养3小时，收集菌体。菌体利用超声波破碎，通过500µLNi-NTA琼脂糖凝胶吸附作用将目的蛋白SOD从裂解液的上清中纯化出来，得到500µL的目的蛋白，放于4℃保存备用。5.2.2酶活的测定[47]邻苯三酚自氧化反应:在1.5mL离心管中加入999µLTris-HCl缓冲液，于25℃平衡20min，然后加入1μL45mmol/L邻苯三酚溶液，使邻苯三酚终浓度为0.045mmol/L；迅速混匀后在UV-3802型紫外可见分光光度计进行200~700nm波长扫描和动力学测定。空白为999µLTris~HCl缓冲液或磷酸缓冲液混合1µL10mmol/LHCl。Cu,Zn-SOD酶活性测定：在总体积为1mL反应体系中混合适量Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液和Cu,Zn-SOD蛋白样品(原始质量浓度0.1μg/μL)，在25℃平衡20min，加入1μL邻苯三酚溶液，迅速混匀后进行酶活测定，SOD酶活计算按[1-Rsample/Rcontrol]×100%进行，同时可进行酶活单位和比活力计算。36 第5章病毒PBCV-1的SOD酶的表达纯化及活性测定5.3实验结果5.3.1邻苯三酚在Tris-HCl缓冲液中自氧化吸收峰的确定据文献报道，邻苯三酚自氧化产物有3种，分别在320nm，440nm和600nm处有[49]明显吸收峰，但是也有文献中的波长扫描结果显示,只出现2个吸收峰，分别为320nm[62]和440nm。本实验对邻苯三酚自氧化反应进行了200~700nm的波长扫描。取1μL45mmol/L邻苯三酚分别在25℃平衡20min的Tris-HCl缓冲液体系中发生自氧化反应，反应总体积1mL，当反应发生0、0.5、3、5、10、30、60、90、180min时进行波长扫描。图15邻苯三酚自氧化反应的全波长吸收光谱图16邻苯三酚浓度与自氧化速率的关系Fig15TheabsorptionspectrageneratedfromFig.16Relationshipbetweenpyrogallolpyrogallolconcentrationandauto-oxidationrate如图15显示从0.5min开始，邻苯三酚自氧化产物在320nm处出现明显的吸收峰，反应进行30min时吸收峰达到最高值；30min后440nm附近出现吸收峰，且峰值随时间缓慢上升。与此同时320nm处的吸收峰开始下降(见图15的嵌入图)。在本实验条件下180min时440nm吸收峰达到最高值。一般认为出现320nm吸收峰是邻苯三酚自氧化产生积累中间产物红倍酚(purpurogallin)的结果，而红倍酚醌[49](purpurogallin-quinone)作为终产物在440nm处产生吸收峰。这一推断能较好解释随自氧化时间延长，320nm处光吸收减少而440nm处增加的原因.由于440nm处的吸收峰在反应进行30min后才开始出现，且变化幅度小，不能准确反应邻苯三酚自氧化速率，因此不适合作为自氧化反应测定波长。320nm处在反应开始0.5min出现吸收峰，3min时吸收显著增强，30min达到最高值；扫描结果显示，320nm处的自氧化速率变化与邻苯三酚浓度呈现良好线性(图16)，故选择320nm为邻苯三酚碱性环境下自氧化速率和SOD依赖型的自氧化抑制的测定波长，能满足准确快速测定SOD活性的目的。37 河北大学理学硕士学位论文5.3.2邻苯三酚自氧化速率的确定以反应时间t对自氧化产物的吸光值A作图得到自氧化反应曲线,如图17，并通过计算斜率ΔA/Δt得到自氧化速率rateofautoxidation(R)，单位为ΔA320/min。在Tris-HCl缓冲液中，邻苯三酚浓度为0.045mmol/L时，对反应进行时间扫描，时长为3min，计算得自氧化速率R=0.022.0.10.08R²=10.06A0.040.020050100150200t/s图17320nm处邻苯三酚自氧化速率Fig17Therateofauto-oxidationofpyrogallolat320nm5.3.3病毒SOD活性测定结果SOD能通过降低O2的消耗来抑制邻苯三酚自氧化反应中间产物的积累，因此可利用这一反应间接测定SOD的活性。作为SOD浓度依赖型过程，随着SOD的增加，邻[49]苯三酚自氧化反应的受抑制程度可达99%以上。本实验利用tcvCu,Zn-SOD在320nm波长下进行对邻苯三酚自氧化速率抑制的动力学测定，时长5min。在此时间范围内自氧化产物320nm处的吸光值与自氧化反应时间呈现正相关,随着tcvCu,Zn-SOD的加入及其浓度的升高320nm吸光值迅速降低，因此通过比较邻苯三酚在有无SOD存在时的[63]自氧化速率R的改变来计算SOD相对活性[1-(Rsample/Rcontrol)]×100%；SOD引起邻苯三酚自氧化速率的抑制达到最大抑制水平的50%所需的SOD作为一个活性单位，[64]也可同时计算SOD的比活性.在Tris-HCl缓冲液中分别加入不同质量浓度的tcvCu,Zn-SOD,分7个不同的质量浓度:0、0.5、1、1.5、2、4、5μg/mL。25℃平衡20min后加1μL45mmol/L邻苯三酚，最终反应体积为1mL，迅速混匀后进行时间扫描，测量反应进行3min时体系的吸光值。38 第5章病毒PBCV-1的SOD酶的表达纯化及活性测定由图18可得，vSOD对邻苯三酚自氧化有明显的抑制作用，抑制率最高可达97%，在vSOD质量浓度为0.2μg/mL时达到最大抑制(MaximalInhibition)。按前述SOD酶活力单位定义计算得到vSOD比活力为16050U/mg.12010080/%60抑制率vSOD4020000.20.40.60.811.2ρ(vSOD)/(μg·mL)图18vSOD对邻苯三酚自氧化反应的抑制曲线Fig18Thecurveofinhibitionofauto-oxidationofpyrogallolbyvSOD5.4本章小结本章确定了适宜邻苯三酚自氧化法的测定波长为320nm，适宜的自氧化速率为0.015~0.025/min；通过以上确定的测定条件，测定了小球藻病毒PBCV-1的vSOD的酶比活力，确定了vSOD的酶比活力为16050U/mg，可以总结出在大肠杆菌中获得了vSOD的高效表达，为研究其生物学功能及普遍运用奠定了基础。39 河北大学理学硕士学位论文第6章病毒Cu,Zn-SOD部分酶学性质的测定6.1实验材料同5.1。6.2实验方法温度：将5.2.1中得到的原酶液稀释至0.1μg/μL，取适量分别在4、25、37、42、55、65、75、90℃条件下处理30min，进行酶活测定，以考查在不同温度下对SOD活性的影响。pH：将适量原酶液分别用pH为4、6、8、10的缓冲液稀释至0.1μg/μL，25℃放置30min后，进行酶活测定，以考查在不同PH对SOD活性的影响。变性剂：将适量原酶液分别用不同浓度的变性剂（SDS:2、4、6、8、10%;尿素:2、4、6、8、10mol/L；盐酸胍:1、2、3、4mol/L）稀释至0.1μg/μL，25℃放置30min后，进行酶活测定，以考查在不同浓度的变性剂对SOD活性的影响。6.3实验结果6.3.1温度对vSOD活性的影响120100/%8060抑制率40200020406080100t/℃0.05μg/mL0.1μg/mL图19温度对vSOD活性的影响Fig19EffectoftemperatureontheactivityofvSOD如图19所示，当vSOD的质量浓度为1µg/mL时，随着温度的升高，酶活基本不变；当vSOD的质量浓度为0.05µg/mL和0.1µg/mL时，温度低于55℃，酶活随温度变40 第6章病毒Cu,Zn-SOD部分酶学性质的测定化不大，在超过55℃之后，活性迅速降低，到90℃时SOD酶基本丧失活性，可见该蛋白在质量浓度高于1µg/mL时，热稳定性比较好。6.3.2pH对vSOD活性的影响12010080/%60抑制率4020002468101214pH0.05μg/mL0.1μg/mL1μg/mL图20pH对vSOD活性的影响Fig20EffectofpHontheactivityofvSOD如图20所示，当vSOD的质量浓度为1、0.05、0.1µg/mL时，随着pH的升高，酶活基本不变，因此pH对vSOD酶的活性没有明显的影响。6.3.3SDS对vSOD活性的影响12010080/%60抑制率40200024681012c/%0.05μg/mL0.1μg/mL1μg/mL图21SDS对vSOD活性的影响Fig21EffectofSDSontheactivityofvSOD如图21所示，当vSOD的质量浓度为1µg/mL时，经浓度小于8%的SDS处理后，41 河北大学理学硕士学位论文酶活基本不变，经浓度为10%SDS处理后，对邻苯三酚自氧化的抑制率仍然还有81.7%；当vSOD的质量浓度为0.05µg/mL和0.1µg/mL时，不同浓度的SDS对酶活均有影响，且当SDS的浓度为10%时，SOD酶基本丧失活性。因此，该蛋白在质量浓度高于1µg/mL时，对SDS的稳定性比较好。6.3.4尿素对vSOD活性的影响12010080/%60抑制率40200051015c/mol·L0.05μg/mL0.1μg/mL图22尿素对vSOD活性的影响Fig22EffectofureaontheactivityofvSOD如图22所示，当vSOD的质量浓度为1µg/mL和0.1µg/mL时，随着尿素浓度的上升，vSOD的活性基本保持不变；当vSOD的质量浓度为0.05µg/mL时，不同浓度的尿素对酶活均有一定程度的影响，但是随着尿素浓度的升高，对酶活的抑制程度基本相同。因此，该vSOD在质量浓度高于0.1µg/mL时，对尿素的稳定性比较好。6.3.5盐酸胍对vSOD活性的影响12010080/%60抑制率40200012345c/mol·L0.05μg/mL0.1μg/mL1μg/mL图23盐酸胍对vSOD活性的影响Fig23EffectofGuanidinehydrochlorideontheactivityofvSOD42 第6章病毒Cu,Zn-SOD部分酶学性质的测定如图23所示，当vSOD的质量浓度为1µg/mL和0.1µg/mL时，随着严盐酸胍浓度的上升，vSOD的活性基本保持不变；当vSOD的质量浓度为0.05µg/mL时，不同浓度的盐酸胍对酶活均有一定程度的影响，当盐酸胍浓度为1mol/L时，对酶活性的抑制程度最大；当盐酸胍浓度高于2mol/L时，对酶活性的抑制程度基本不变。因此，该vSOD在质量浓度高于0.1µg/mL时，对盐酸胍的稳定性比较好。6.4本章小结本章对vSOD酶学性质进行了初步研究，确定当酶质量浓度为1µg/mL时，对温度，pH、SDS、尿素、盐酸胍的稳定性都比较好；当酶质量浓度为0.1µg/mL时，对pH、尿素、盐酸胍的稳定性比较好，但是温度、SDS对vSOD有一定的抑制；当酶质量浓度为0.05µg/mL时，温度、pH、SDS、尿素、盐酸胍对酶活均有不同程度的抑制。研究结果对于更好的保护vSOD的稳定性及生物活性，创造更好的经济效益具有较大的现实意义。43 河北大学理学硕士学位论文第7章结论与讨论本研究所讨论的小球藻病毒与宿主间的相互作用是复杂多样的，我们对其中的两种现象进行了深入研究，得到了以下结论。泛素-蛋白酶体系统是真核细胞中蛋白降解的主要途径，而小球藻病毒是唯一编码两种上述系统组分的病毒；它们有可能劫持宿主的泛素-蛋白酶体机制而有利于自身复制。实验结果支持小球藻病毒表达vSOD参与宿主活性阳基团淬灭，创造有利的环境完成自身的复制。本实验研究了vSOD的部分酶学性质，表明此酶有很强的超氧化物歧化活性。接下来我们将会继续对这两种现象进行研究分析，期望得到更多的相关信息。44 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河北大学理学硕士学位论文致谢时光荏苒，硕士研究生生涯已接近尾声，三年来，感谢康明老师对我的谆谆教导和悉心关怀。在实验中，康老师不畏艰辛的教会了我许多微生物相关的基本实验知识和技能，实验中遇到了许多困难和疑惑，康老师也总是会和我一起分析原因，帮助我找到正确的方法，并不耐其烦地认真地授予我实验中的实践知识，保证实验的顺利完成。在论文撰写过程中，康老师耐心地审阅我的论文，指出论文中的疏漏，提出详尽的修改建议，帮助我完成毕业论文的撰写工作。康老师开阔的视野，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，深深地感染和和激励着我，使我对自己以后所从事的工作有了一份敬畏之心。在此谨向康老师致以衷心的感谢和崇高的敬意，并祝愿康老师工作生活一切顺利。研究生期间，得到了张利平老师、吕志堂老师、葛欣老师、辛琪老师、汤辉老师、张秀敏老师、王谦老师、孙磊老师、张贺迎老师、武金霞老师等的许多帮助，感谢各种老师授予的宝贵知识，在实验与生活上给与指导与关怀，以及在开题答辩、中期答辩给予的宝贵意见和建议。同时，本篇论文还得到了邹琪琪、董旭、王秉均等各位同学的热情帮助，感谢实验室中的同学们、已经毕业的师兄师姐们、各位师弟师妹和在各个方面给与我帮助的小伙伴们，在我的生活和实验中都给予了我很多的帮助，心中表示由衷的感谢。另外，感谢校外的导师为我的论文提出了指导性的修改建议，在此请允许我向您表达诚挚的谢意。祝愿大家心想事成，万事如意！50 攻读学位期间取得的科研成果攻读学位期间取得的科研成果贾红玉,王亚森,田晓辉,等.邻苯三酚自氧化法在SOD活性测定中的应用[J].河北大学自然科学版,2018,3(38):284-290.51