新城疫病毒FMW毒株治疗大鼠C6胶质瘤的研究

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、—．广－．？：、－．、＇、＇、亡心－：，－户一．＞：立？．‘Ｖ，＇，：？＇＇ＶＶ密级硕±学位论文？新城疫病毒ＦＭＷ毒株治疗大鼠０６胶质瘤的研究作者嫂名：窦新枉指导教师：宋飞教授学科专业：外科学大连医科大学 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行的研究工作及所取得的研究成果。除了文中特别加化标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医一科大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期／心年＾月＞Ｈ：＞ 关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保。留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅本人授权大连医科大学可＾＾＾将本学位论文的全部或部分巧容编入有关数据库进＇行检索、缩印或妇描等复制手段保存和汇编本学位论文。，可１＾＾采用影印＂＂本学位论文厲于（请在＾＾＾下相应方框内打Ｖ）：１。．保密□年解密后适用本授权书，在＾２□。．不保密作者签名期：／／曰：种０２＞心备月导师签绿名日期：＾年６月；＂日／会 中图分类号密级新城疫病毒FMW毒株治疗大鼠C6胶质瘤的研究TheResearchfortheTreatmentofC6GliomaRatModelsTreatedbyNewcastleDiseaseVirusFMWStrains窦新柱计：学位论文：34页表格：4个插图：5幅指导教师：宋飞教授申请学位级别：硕士学位学科（专业）：外科学培养单位：大连医科大学完成时间：二○一六年二月答辩委员会主席： 目录一、摘要…………………………………………………………….….....1（一）中文摘要……………………………………………….…..…...1（二）英文摘要…………………………………………………...…...2二、正文…………………………………………………….……….…....3（一）前言………………………………………….…………….…....3（二）材料及方法………………………………………………..…....51.实验材料......……………………....……………………..….…...52.实验方法......………………………………………………..…....52.1动物模型的建立………………………………………..…....52.2大鼠模型的筛选及实验分组……...………………………….....72.3大鼠行为状态观察…………………………..……………....…82.4病理切片的制作及细胞凋亡的检测……..………........….....….82.5统计方法……..………..………..………..………..………..…8（三）结果…………………………………………………..……..….91动物模型一般状态及存活期观察……………...................……..92.建模后大鼠的MRI表现………………................................…113.C6胶质瘤大鼠脑组织切面观察……………….....................…114.C6胶质瘤组织病理学图片………………….............................115.TUNEL检测动物模型的肿瘤细胞凋亡…………………........126.流式细胞术检测NDV引起大鼠C6胶质瘤细胞凋亡………12（四）讨论………………..................................................…............13 （五）结论……………......................................................................19（六）参考文献…………………......................................................20三、综述…………………......................................................................24（一）综述………………………………………………..................24（二）参考文献…………………………………………....…............29四、附录…………………………………………………...…...............30五、致谢……………………………………………………..................31 新城疫病毒FMW毒株治疗大鼠C6胶质瘤的研究硕士生姓名：窦新柱指导教师：宋飞教授专业名称：外科学摘要目的：研究新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus，NDV）FMW毒株对SD大鼠C6胶质瘤模型的生长抑制作用。为临床应用NDV治疗脑胶质瘤提供理论依据。方法：首先培养C6胶质瘤细胞，收集、浓缩后经过立体定向装置接种到SpragueDawley(SD)大鼠颅内（右侧基底核区），建立100只动物肿瘤模型，7天后行MRI扫描并计算大鼠颅内肿瘤体积，排除建模失败的大鼠，并筛选肿瘤体积和生存状态皆相近的大鼠36只，随机分成3组，每组12只。A组：阴性对照组，大7鼠颅内只接种C6胶质瘤细胞；B组：经尾静脉向大鼠注入将10TCID50的NDV；7C组：将10TCID50的NDV通过立体定向注入大鼠胶质瘤瘤体内。记录并比较各组大鼠存活期，做肿瘤病理切片观察，TUNEL法及流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡。结果：（1）建成、筛选大鼠C6胶质瘤模型；（2）两个实验组的C6胶质瘤大鼠的生存期均得到延长，且局部治疗组生存期更长；（3）TUNEL法检测及流式细胞术显示新城疫病毒FMW毒株可以引起C6胶质瘤细胞凋亡。结论：（1）肿瘤切片TUNEL法及流式细胞术证实NDVFMW毒株能够导致C6胶质瘤细胞凋亡；（2）TUNEL法检测到局部治疗组的细胞凋亡数更多，进行瘤内原位注射治疗组的大鼠生存期也比经尾静脉注射病毒行全身治疗的大鼠生存期要更长,这都说明经立体定向瘤体内原位注射给药的治疗效果优于经尾静脉注入病毒行全身治疗。关键词：胶质瘤大鼠模型新城疫病毒凋亡1 TheResearchfortheTreatmentofC6GliomaRatModelsTreatedbyNewcastleDiseaseVirusFMWStrainsAbstractObjective:ThisstudyaimstoinvestigatewheatherNewcastleDiseaseVirus(NDV)FMWstrainshavetheabilityofsuppressinggrowthofC6cellglioma,andprovidingatheoreticbasisforclinicaltreatment.Methods:100SDratmodelshasbeenestablishedbystereotacticapparatusaftercluturing,collectingandconcetratingtheC6cells.Eachoftheratsmodelhadbeeninoculatedthecellsintotherightbasalganglia.7dayslater,themodelswereexaminedbyMRIandcalculatedthevolumeofthem.Discardingthefailedmodelsandscreeningout36modelswhichtumorvolumeandsurvivalconditionaresimilar,thendividedallthe36modelsinto3groups,everygroup12rats.GroupA:groupAisanagtivecontrolgroupandtheratsmodelinthisgroupinoculateC6cellsonly.GroupB:ratsinthis7groupwereinjected10TCID50NDVthroughthetailvein.GroupC:ratsinthisgroup7werereceivedintratumoralinjectionwith10TCID50NDVbystereotacticapparatus.Recordandcomparethesuvivaltimeoftheratsofeachgroup.Makeandobservetumourbiopsies,andTUNELassyandFCMwereusedtodetectapoptosis.Results:(1).TheC6gliomaratmodleshasbeenestablishedandscreened.(2).Thesurvivaltimeofratmodelsoftwotreatmentgrouparelongerthancontrolgroup,andinthesethreegroups,suvivaltimeoftheratsinthegroupwhichwerereceived7intratumoralinjectionwith10TCID50NDVbystereotacticapparatusisthelongest.TUNELassyandFCM’sresultshowthatNDVFMWcaninducetheC6gliomacellsapoptosis.Conclusion:(1).TUNELassyandFCMwereusedtodetectapoptosis,andtheresultsrevealedNDVcouldinducetheC6cellapoptosis.(2).TUNELassyresultsrevealedthatthenumberofapoptoticcelloftheratswhichusedlocaltreatmentaremorethansystemictreatmentgroup,andthesurvivaltimeoflocaltreatmentgroupislongerthansystemictreatmentgroup.TheseresultsindicatethatthetherapeuticeffectofinjectionNDVinsitubystereotacticapparatusisbetterthansystemictreatmentbyinjectingNDVthroughthetailvein.Keywords:glioma,ratmodel,NewcastleDiseaseVirus(NDV),apoptosis2 新城疫病毒FMW毒株治疗大鼠C6胶质瘤硕士研究生：窦新柱指导老师：宋飞教授专业方向：外科学前言神经胶质瘤(Glioma)由神经外胚层衍化而来，来源于神经胶质细胞及神经元细胞，占颅内肿瘤的40%-50%。胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，每年的发病率约[1]7/10万人。目前仍采取以手术治疗为主的治疗手段治疗胶质瘤。手术切除肿瘤是治疗胶质瘤的第一步，也是最重要的一步。对术后患者行磁共振增强扫描，切除之肿瘤达到影像学全切的患者生存期均有所延长，也证实了手术切除胶质瘤的有[2-6]效性，但恶性胶质瘤具有强侵袭性，呈浸润性性生长，肿瘤与正常脑组织的界限不清，在保证患者正常脑组织功能的前提下，想要达到全切恶性胶质瘤组织十分困难，约40%-45%的患者能够实现全切。术中使用显微外科技术及磁共振立体[7][8]定向技术也可提高全切患者的比例。有临床试验表明，肿瘤组织达到全切的患[9]者较次全切的患者预后更好。术后磁共振扫描证实，手术切除肿瘤瘤体的体积在78%以上，患者预后即可得到明显改善，但大面积切除瘤周组织虽然可以延长患者生存时间，但仍不能降低肿瘤复发。总之，随着神经影像学技术、显微外科技术、功能立体定向技术的不断发展，神经外科学取得了长足的进步，但手术完全切除肿瘤仍难以实现，总体治疗效果仍不理想。除采用常规综合疗法治疗胶质瘤外，现已经发现了一些能够特异感染、杀伤肿[10]瘤细胞，并且不损伤正常细胞的溶瘤病毒(oncolyticvirus)。溶瘤病毒的首次发现在上个世纪初，一位宫颈癌患者在感染狂犬病病毒后，肿瘤消退，此后又逐渐发现有极少数恶性肿瘤患者在感染病毒后出现肿瘤自发性消退。目前的研究已经发现多种病毒具备溶瘤的能力，对病毒杀伤肿瘤细胞的特异性，病毒杀伤肿瘤细胞的效率和病毒抗肿瘤效果以及生物安全性已经进入研究动物甚至人体模型阶段。溶瘤病毒是一种有效的肿瘤生物治疗制剂，2008年－2014年在全球范围内，注3 [11]册开展进行中的溶瘤病毒应用于临床研究的项目已经达50多项。新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是一种重要的溶瘤病毒。NDV可有选择性地在肿瘤细胞中增殖并起到特异杀伤作用毒株MTH-68/H和[12]NDV-HUJ已完成在脑胶质瘤的I期临床实验，并展示出有效的抗瘤作用。C6细胞是大鼠神经胶质瘤细胞,最初由Benda等用N-亚硝基甲脲诱导的大鼠胶质瘤克隆,并经过一系列的体外培养和动物传代交替后所得。本实验使用NDVFMW毒株治疗C6胶质瘤大鼠模型。比较使用NDVFMW毒株治疗后，C6胶质瘤大鼠的生存时间，对肿瘤切片行HE染色，用TUNEL法及流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡，为临床应用NDV治疗脑胶质瘤的提供理论依据。4 实验材料及方法1.实验材料1.1主要试剂及设备C6胶质瘤细胞系购置于上海中科院细胞库1640+10%胎牛血清，胰蛋白酶，DMEM，青、链霉素GIBCO公司新城疫病毒毒株FMW由本实验室保存TUNEL试剂盒：KeyGEN江苏凯基生物台盼蓝:北京中生瑞泰科技有限公司CO2细胞培养箱:SANYO，日本24孔及96孔细胞培养板：COSTAR，德国超净工作台：苏州安泰有限公司高压蒸汽消毒器：山东新华医疗器械厂立体定向仪:75型，日本倒置显微镜:OLYMPAS，日本普通生物显微镜：北京电子光学设备厂石蜡标本切片机:LEICA，德国离心机:Siemens公司，德国微量注射器:上海精密光学仪器厂流式细胞仪:AccuriC6BD公司，美国Signa1.5TMR机:GE公司1.2实验动物SPF级雄性SD大鼠共115只，由大连医科大学SPF动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。2.实验方法2.1动物模型的建立2.1.1C6胶质瘤细胞培养C6胶质瘤细胞培养在含10%胎牛血清的1640培养基中，以体积比计算，添加1%的双抗与1%的谷氨酰胺，置37℃，饱和湿度，含5%CO2的细胞培养箱中培养，每隔2-3天，以0.25%胰酶消化，以1:2-l:4传代1次。5 2.1.2原代鸡胚成纤维（CEF）细胞的制备以照蛋器照蛋，取孵化、成长状态良好的9日龄SPF鸡胚。用苯扎溴铵消毒，标记气室，并在气室部用碘酊消毒，然后再以70%的酒精脱去碘。小心敲开气室部的蛋壳，仔细除去壳膜，以镊子取出鸡胚，而后除去鸡胚的头部、鸡爪和鸡胚的内脏，放入灭菌磷酸缓冲盐溶液清洗3次。将清洗完毕的鸡胚放进无菌小烧杯中，每个鸡胚加入8ml胰酶，放进CO2培养箱消化10-15分钟，温度设置370C。将消化好的细胞倒入离心管以停止消化，离心管中事先放入磷酸缓冲盐溶液(胰酶用量×0.05)。以1000转/每分钟离心15分钟，离心后弃除上清，加入培养基重悬细胞。用灭菌纱布过滤细胞，装入新的离心管，无菌吸管吸取分装入细胞培养瓶培养，次代细胞备用。2.1.3鸡胚尿囊腔接毒法扩毒FMW病毒尿囊原液1000转/分离心3分钟。将上清稀释成含抗生素的灭菌磷酸缓冲盐溶液(青霉素100-500U、链霉素100-500ug)1/105倍备用。照蛋排除死胚及非受精胚，取孵化、成长状态良好的9日龄SPF鸡胚。用苯扎溴铵消毒，标记气室，并在气室部用碘酊消毒，然后再以70%的酒精脱去碘。小心敲开气室部的蛋壳，仔细除去壳膜，在气室部轻轻敲出一个小孔，用一次性注射器吸取稀释后的病毒液，以垂直于敲出的小孔方向，将病毒稀释液注入鸡胚的尿囊腔，每个鸡胚胎注入0.2ml。然后以石蜡封住小孔，37℃培养。在鸡胚接种病毒24小时内即死亡的鸡胚为污染鸡胚或弱胚，须弃掉。在鸡胚接种病毒48小时后收毒，除掉蛋壳及壳膜，吸管须避开血管刺入尿囊腔中收获尿囊液。再离心去除杂质，而后用指型管分装收取的病毒液。采取TCID50法检测病毒滴度。灭菌磷酸缓冲盐溶液稀8释病毒至10TCID50/ml，-70℃保存备用。2.1.4大鼠注射NDV的安全性检测取6周龄SD大鼠15只，分成ABC三组。A组为阴性对照组，注射与B、C7两组等体积的生理盐水，B组经尾静脉注入10TCID50FMW病毒，C组通过立体7定向于每只大鼠颅内注射10TCID50FMW病毒，观察72h。结果发现，各组注射7当日大鼠即可自行觅食，各项体征均无明显变化，活动正常，说明10TCID50NDV剂量对实验小鼠无明显影。2.1.5大鼠C6胶质瘤模型的建立6 C6细胞接种前准备：室温下0.25％胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察，待细胞变成圆球形，胞质回缩，细胞间隙增大时，加入培养液终止消化；吸管吹打，移入离心管，1000转／分钟低速离心5分钟，去除上清后加入无血清DMEM培基，制成单细胞悬液，计数细胞。而后再次离心去除上清，准确加入无血清DMEM培养液凋整细胞浓度，制成细胞悬液待接种，台盼蓝排斥试验检测细胞活力,筛选活6力大于90%细胞待接种,接种的细胞量配制成1×10/15μl，备用。接种靶点：以大鼠右侧脑尾状核为靶点,坐标为大囟中点向前1.0mm,矢状缝向右旁开3-3.5mm,硬膜下6.0mm。接种方法：SD大鼠100只，术前12小时予禁食、水，以10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，用立体定位仪固定头部，两耳针深入外耳道对称固定，剪除头顶毛发，以碘酒、75%酒精消毒后铺洞巾。沿正中矢状线纵向切开头皮约1.5cm,分离暴露顶骨，即在头顶双侧眼裂连线后约1.5cm处横向切开头皮,暴露出前囟颅骨标志。按大囟中点向前1.0mm,矢状缝向右旁开3-3.5mm,硬膜下6.0mm定位,用颅骨钻钻一小孔,孔径大小约2.0mm,直到硬脑膜为止。微量注射器固定于立体定向6仪，进针深度达硬膜下6.0mm，后退回针1.0mm。于每只大鼠靶区注入1×10制备好的C6细胞悬液15μl，10min内匀速、缓慢注射完毕,留针5min,让注入的C6细胞充分下沉、聚集。缓慢拔针后，再用骨蜡封闭颅骨小孔,并以生理盐水冲洗术野，用1号丝线缝合头皮切口。2.2大鼠模型的筛选及实验分组2.2.1动物模型MRI检测使用GE公司signa1.5TMR机，表面线圈3英寸，矩阵512×256，FOV8cm×4cm。扫描序列T1WI(TR500ms，TE15ms);T2WI(TR3000ms，TE78ms);经鼠尾静脉注射0.2mmol/kg钆双胺行增强扫描。使用10%水合氯醛以3ml/kg的剂量于MRI检查时大鼠腹腔内注射麻醉。扫描时以嗅沟为标志在矢状定位像作鼠脑冠状面定位，扫描层厚3.0mm，间隔0.5mm。2.2.2大鼠模型的筛选及实验分组100只大鼠模型建立7天后，行MRI扫描并计算大鼠颅内肿瘤体积，即病灶体积测量。取强化病灶的最大冠状和矢状面，测量最大前后长度(L)、左右宽度(W)以及上下高度(H)，并按公式：V=(4/3×π×L×W×H)×1/8计算肿瘤体积。计算、7 筛选肿瘤体积和生存状态皆相近的大鼠36只，并将大鼠随机分为3组，每组12只。A组：只在大鼠模型建模时在颅内单纯注入C6胶质瘤细胞；B组在在模型建7立7天后，经右侧颈内动脉注入10TCID50的NDV；C组在模型建立7天后通过7立体定向原位瘤体内注入10TCID50的NDV。2.3大鼠行为状态观察记录大鼠进饮食水、活动、体重、症状、体征及死亡日期。2.4病理切片的制作及细胞凋亡的检测2.4.1HE染色病理组织形态学观察大鼠濒临死亡时用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，生理盐水和4%的多聚甲醛灌注固定取脑，并放到4%的多聚甲醛后固定过夜，然后石蜡包埋组织，切片的厚度为4μm，采用HE染色，在普通光镜下观察。2.4.2TUNEL法检测大鼠胶质瘤模型瘤细胞的凋亡大鼠濒死时予10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，再以生理盐水和4%的多聚甲醛灌注固定取脑，之后放到4%的多聚甲醛后固定过夜，石蜡包埋，制作石蜡切片，切片的厚度为4μm。检测方法参照TUNEL试剂盒(KeyGEN凯基生物)说明进行凋亡检测。2.4.3流式细胞仪检测C6胶质瘤细胞凋亡NDV与大鼠C6胶质瘤细胞按比例按照1:10（0.1MOI）病毒与C6胶质瘤细胞共同培养。采用AnnexinV和PI双染，设置阴性对照并进PI和AnnexinV补偿5（分别单染），其中阴性对照组含正常细胞约10个。流式上机操作：以无菌预冷的盐酸缓冲盐溶液清洗3次，离心机1000转/分,离心5分钟，再加入100μLBindingBuffer缓冲液重悬细胞，分别加入5μLAnnexinV-FITC和PIStainingSolution，轻轻混匀，常温、避光反应15分钟，再加入400μLBindingBuffer,混匀，冰上备用。以PI染色阴性，AnnexinV染色阳性为早期凋亡细胞；以PI染色阳性，AnnexinV染色阳性为晚期凋亡细胞；以PI染色阳性，AnnexinV染色阴性为死细胞；PI染色阴性，AnnexinV染色阴性为活细胞。2.5统计方法-采用SPSS22.0软件统计分析，实验结果用均数±标准差(x±s)表示，采用t检验及方差分析（F）检验，检验效能α=0.05，p<0.05为差异有显著性意义。8 结果1.动物模型一般状态及存活期观察两组试验鼠自接种后第1天就能自行觅食，但较正常鼠进饮食水稍减少，反应也略微迟钝。从接种后第4天开始，进饮食水正常，体重慢慢有所增加。A组实验鼠进食饮水减少，体重逐渐变轻，直到接种C6胶质瘤细胞后12天出现不同程度颅内压增高症状，部分大鼠存在眼眶周围出血，眼球向外突出、阵发性癫痫样发作和左侧肢体偏瘫等不同症状。从第14天开始出现实验鼠死亡的情况，19天后A组实验鼠全部死亡。B组实验鼠在第7天经右颈内动脉注入NDV，从第23天开始出现死亡，30天全部死亡。C组实验鼠在第7天瘤体内注入NDV，从第模型建立第8天开始，进食饮水逐渐增多，体重开始增加，平均生存期较A组明显延长，C组大鼠在第33天全部死亡。A组平均生存期16.17±1.403天，B组平均生存期25.42±2.275天，C组平均生存期30.75±1.215天。各组之间进行统计学分析，见P＜0.05（表1-4），均有统计学意义。表1A组与B组大鼠生存期比较A组B组生存期（天）152214251726162516241926152917241830162516261523平均生存期（天）16.17±1.40325.42±2.275P值0.000注：P＜0.05，差异有统计学意义，即A组与B组的大鼠生存期存在差异9 表2A组与C组大鼠生存期比较A组C组生存期（天）153014291731163216311933152917321830163116311530平均生存期（天）16.17±1.40330.75±1.215P值0.001注：P＜0.05，差异有统计学意义，即A组与C组的大鼠生存期间存在差异表3B组与C组大鼠生存期比较B组C组生存期（天）223025292631253224312633292924323030253126312330平均生存期（天）25.42±2.27530.75±1.215P值0.000注：P＜0.05，差异有统计学意义，即B组与C组的大鼠生存期间存在差异表4不同组大鼠生存期的方差（F）值MS组间MS组内FPAB653.3612.874227.3560.000C注：P＜0.05，差异有统计学意义，即不同组之间大鼠的生存期间存在差异10 2.建模后大鼠的MRI表现大鼠MRI检测发现，C6胶质瘤细胞颅内接种区均可见有圆形或椭圆形肿瘤团块形成，并呈浸润性生长，且有的肿瘤周围存在水肿带，有明显的占位效应，有的肿瘤中心可见坏死区，增强扫描见肿瘤不均匀强化(图1)。图1C6胶质瘤大鼠模型的MRI3.C6胶质瘤大鼠脑组织切面观察大体形态观察大鼠脑胶质瘤呈不规则形或椭圆形，肿瘤组织未见包膜包被，边界轮廓欠清，切面呈鱼肉样，随着肿瘤的进一步发展，肿瘤组织存在侵蚀硬脑膜及颅骨之倾向，并于肿瘤中心位置出现出血和坏死，大体解剖未见肿瘤颅外转移（图2）。图2荷瘤大鼠脑组织灌注固定取材后冠状切面图4.C6胶质瘤组织病理学图片HE染色可见生长旺盛的胶质瘤细胞成群密集分布，呈假栅栏样或珊瑚状排列，并且浸润正常的大脑组织；在胶质瘤组织与正常脑组织交界处可见到肿瘤细胞侵入脑实质，边界欠清。胶质瘤中心存在囊变、坏死并有肿瘤血管生成（图3）。11 图3C6胶质瘤组织典型的组织学图片生长旺盛的胶质瘤细胞呈珊瑚状排列，密集成群，向正常脑组织浸润，边界欠清。在胶质瘤中心可见坏死和肿瘤血管生成。(HE染色；×1倍)5.TUNEL检测动物模型的肿瘤细胞凋亡光学显微镜下观察，染色阳性的肿瘤细胞，胞核呈棕黄色，胞核固缩，有的呈碎片状，形态不规则，大小不一，染色质凝聚、浓缩、边缘化，呈凋亡细胞的形态学征象。也有胞体、胞核体积形态基本正常的染色阳性的肿瘤细胞。A组的肿瘤组织中很少有阳性细胞，实验组B组和C组的肿瘤组织中有较多的阳性细胞，以C组为最，TUNEL阴性对照均未见有染色阳性的细胞核。以DNaseI处理的TUNEL阳性对照整个载玻片显示为均匀一致的核染色阳性(图4)。图4TUNEL检测结果A：阴性对照组肿瘤内部×200;B:尾静脉注入NDV组肿瘤内部×200；C：原位瘤体内注入NDV组肿瘤内部×200；D：原位瘤体内注入NDV组肿瘤内部×400。6.流式细胞术检测NDV引起大鼠C6胶质瘤细胞凋亡应用流式细胞术可以对不同病毒感染时间和不同MOI值病毒对不同细胞发生凋亡进行分析。四个象限象限的含义是，左上象限(Q1区)为坏死细胞和细胞碎片，12 右上象限(Q2区)为晚期凋亡细胞，左下象限(Q3区)为正常存活的细胞，右下限(Q4区)为早期凋亡细胞。实验分两组，对照组单纯培养大鼠C6胶质瘤细胞，实验组以NDV与大鼠C6胶质瘤细胞按比例1:10，即0.1MOI病毒与C6胶质瘤细胞共同培养，AnnexinV和PI双染,流式细胞术检测凋亡程度，观察48小时内细胞凋亡情况。结果发现24小时、48小时,对应的死亡率分别是18.6±1.3%,31.6±2.9%，随着病毒感染细胞时间的增长，大鼠C6胶质瘤细胞的死亡率明显增加。且远多于对照照组凋亡的细胞数对照组，对照组24、48小时分别为10.8±0.8%和15.7±1.5%。（图5）图5对照组为单纯的C6细胞培养；实验组NDV与大鼠C6胶质瘤细胞按比例1:10共培养。结果表明NDV感染后24及48小时细胞凋亡增加更明显。讨论脑胶质瘤是颅内最常见的肿瘤之一。按病理类型分为星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤等。目前对胶质瘤的常规治疗方法是手术结合术后放疗和化疗。手术切除是首选的治疗方法。但因胶质瘤常呈浸润性生长，而且无清楚的边界，外科手术难以真正达到彻底切除，手术后患者复发率较高。传统的放射治疗对这种低放射性敏感的肿瘤细胞效果不佳，目前也没有较好的化疗药物能将肿瘤彻底根除。在胶质瘤的病理分型中，胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM)是最常见、侵袭性最强的恶性原发脑肿瘤(WHOIV[13]级)，其发病率可达2-3人/10万人。胶质母细胞瘤恶性程度高，易坏死，起源于白质，以额叶多见，肿瘤原发于小脑、脑干等部位的极少见。但高度浸润性的生长特点致使其可扩散到基底节区，甚至通过胼胝体侵犯对侧半球，常累及数个脑13 叶，颅高压症状明显。对于临床诊断，电子计算机断层扫描(ComputedTomography,CT)显示肿瘤边界模糊，瘤体内低密度为肿瘤囊变坏死，高密度为瘤内出血，瘤周水肿明显，中线明显移位，增强扫描可见肿瘤不均匀板块状或环状强化。在磁共振成像（MagneticResonanceImaging，MRI），肿瘤在T1加权呈低信号，可因流内存在较大坏死组织而成呈更低信号。T2加权肿瘤呈混杂信号，但瘤周存在明显的高信号，提示瘤周组织水肿严重。增强扫描发现肿瘤T1加权像肿瘤[14]强化明显，为特征性表现。正电子发射断层扫描(positronemissionstomography,PET)在明确诊断，计算肿瘤体积，瘤体内异质性以及监测治疗方面有独特的优势[15][16]。虽然PET诊断的效果很明显，但临床上还要考虑其较高的假阳性率，而且，因脑组织对FDG摄取率高和CT缺乏明确的病灶，故有遗漏病灶的可能。18FDG-PET-CT的敏感度较低，不建议作为检查复发的初级筛选手段，但可在MRI18检查出病灶后，再行FDG-PET-CT作一定的特性描述。PET成像的适用性有限，且花费较多，在一定程度上限制了其在临床的应用。病理学检查是诊断胶质母细胞瘤的金标准，并可待诊断明确后根据病理类型行进一步的放、化疗。目前对胶质瘤患者的治疗多采用综合治疗方案，综合治疗方法是指手术切除联合放射、化学药物及生物治疗等。大剂量的化疗和放疗法不但效率低下，而且具有很明显的[17]副作用。据统计，目前手术联合放化疗的治疗胶质母细胞瘤的方案治疗疗效极差，胶质母细胞瘤患者中位生存期仅12个月左右，其中20-44岁的患者，5年生存率低于17%，老年患者预后更差，是人类死亡率最高的肿瘤之一。新城疫病毒，也称禽副粘病毒-1(avianparamyxovirus-1,APMV-1)，属副豁病[18]毒科副粘病毒属。NDV最常感染、致死动物是家鸡，也可感染、致死其它家禽如鸭、鹅等甚至迁徙性的鸟类。NDV的感染性较强并且传播速度极为迅速。人类感染上NDV后潜伏期是48小时，通常因为直接接触病禽或者活毒疫苗而导致急性的结膜和淋巴腺炎等炎症，不具备在人与人之间传染的特性，多数患者能很[19]快康复。NDV的形态大多为球形，也可呈椭圆形或者长杆形等。成熟的NDV病毒直径约为100-500nm。NDV的囊膜具有由病毒宿主的细胞膜上的脂质和病毒糖蛋白生成的双层结构。内层是长螺旋状核衣壳；外层是糖蛋白纤突，长约12-15nm，具有溶血素、血凝素以及神经氨酸酶。RNA分子与蛋白质衣壳粒缠绕而成的核衣壳是NDV的中心，核衣壳直径约18nm。单股不分节段的负链RNA构14 [20]成NDV的基因组，基因组大小15186bp。NDV的基因组包括6种基因，在RNA编辑过程中可以至少编码8种蛋白，这其中就包括6种病毒结构蛋白:血凝素和神经氨酸酶活性的糖蛋白(Haemagglutininneuraminidase,HN)、融合蛋白(Fusionprotein,F)、基质蛋白(Matrixprotein,M)、核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,NP),磷蛋白(Phosphoprotein,P)和高分子量蛋白(Largeprotein,L)，以及另外2种非结构蛋白[21]。在这8种蛋白中HN蛋白与F蛋白是NDV的主要功能蛋白。HN蛋白拥有血凝素以及神经氨酸酶活性，在病毒侵袭、感染宿主的过程中能过准确的识别细胞[22,23][24]受体，并介导病毒吸附于宿主的细胞膜。有研究证实，抗体直接作用于HN蛋白能起到中和病毒粒子感染性的作用。F蛋白能够使宿主细胞膜与NDV囊膜发生融合，且能促进NDV进入细胞。最初，F蛋白以前体F0存在，并不具有活性。在F0蛋白吸附于细胞膜后，NDV所吸附宿主的细胞产生能将其水解成2条多肽链[25]的蛋白水解酶，水解形成的F1和F2就具有了强融合活性。NDV毒株的毒力强弱与F0蛋白的水解有关，强毒株因有碱性氨基酸附加于裂解点两侧，使其可被多种蛋白酶裂解，这样NDV强毒株型能够在多种组织、器官复制，并最终导致宿主的全身性感染。而弱毒株只能在含有胰蛋白酶样蛋白酶的部位复制，因其在裂解点两侧并无附加的碱性氨基酸。目前，人们从分子水平上确定NDV毒力的首要依据就是F蛋白的裂解位点，但是单纯依靠F蛋白的裂解是无法以引发融合过程的，[26-28]只是在与HN蛋白发生协同作用时才能引发融合。NDV溶瘤机制除凋亡外还包括细胞自噬、坏死和免疫性细胞死亡等途径。NDV在感染肿瘤细胞后并不依赖内源性线粒体途径，该途径由P53基因引发，而是直接改变线粒体内膜的通透性,通过释放细胞色素-c和膜间隙蛋白,激活下游caspase-9形成凋亡小体，并进一步激活caspase-3，从而介导肿瘤细胞发生凋亡。[29]Wu等研究证实，在一项体外实验中NDVFMW毒株成功诱导人肺癌A549细胞发生凋亡，并且NDVFMW毒株对采用人肺癌A549细胞建立的裸鼠肿瘤模[30]型进行治疗、观察，发现NDVFMW毒株同样具有良好的溶瘤效应。Bian等研[31]究表明，FMW通过激活caspase-8和caspase-9诱导A549细胞凋亡。Wei等也报道NDV毒株LaSota感染肺癌细胞引起线粒体自噬(mitophagy)，自噬抑制剂3-MA可以增强NDV的溶瘤效应。这一结果随后为Koks等的研究证实，他们发现NDV体内感染胶质瘤细胞GL261后引起细胞自噬。此外，NDV在胶质瘤细15 胞GL261上的溶瘤效应主要是通过坏死途径引起免疫性细胞死亡（immunogenic[32]celldeath,ICD）。ICD是近些年新发现的肿瘤细胞死亡方式，发生ICD的肿瘤细胞的钙网蛋白（Calreticulin，CRT）外翻，释放ATP和高迁移率族蛋白1[33]（HMGB1），通过旁分泌活化树突细胞，顺向启动细胞毒性效应器。ICD[34]触发适应性免疫反应,可提高治疗肿瘤的效果，为肿瘤的免疫治疗指明了新的[37]方向。研究表明，多种溶瘤病毒引起肿瘤细胞ICD，诱导ICD可以增强抗肿[35]瘤的免疫反应。最近Koks等报道NDV感染小鼠胶质瘤细胞来源的原位瘤以后发生坏死性的ICD，发生ICD的肿瘤细胞释放HMGB1等免疫识别分子，表达[36]PMEL17等肿瘤抗原，并引发抗肿瘤免疫应答。Jiangke等近期发现NDV诱导耐顺铂肺癌细胞释放HMGB1。这些研究表明，NDV可能引起一个新的癌细胞死亡形式——免疫性细胞死亡，但其分子机制尚不清楚，有待于进一步研究。[37]对于NDV溶瘤效应的研究可追溯至1965年，Cassel等首次报道了NDV的溶瘤作用，用NDV疫苗治疗晚期宫颈癌者，取得了一定的疗效。如今NDV的[48]溶瘤作用已应用于多种肿瘤细胞的研究，并且随着研究的深入呈现给药方式的多样化，在同一种或不同的临床试验中可以应用不同的给药方式，如雾吸、口服、[39]注射甚至灌肠等途径直接将NDV病毒注入患者体内，已达到治疗目的。然而抗[40]病毒抗体的生成以及肿瘤细胞的再生很大程度上限制了NDV的应用。有研究发[41]现，把在体外感染肿瘤细胞后的NDV制成NDV溶瘤剂，注入进行手术治疗的肿瘤患者体内已作辅助治疗作用，结果腺NDV溶瘤剂使患者免疫反应得到增强。[42]Cassel等用NDV毒株感染经手术切除而来的恶性黑色素瘤细胞，而后进一步制成溶瘤剂，再把注射溶瘤剂到该患者体内，通过35个月的持续观，超过90%接受过溶瘤剂注射的患者黑色素瘤未发生进一步的扩散，而超过90%的手术对照组患[10]者的黑色素瘤发生了扩散。Nelson等使用经NDV修饰过的瘤苗辅助治疗乳腺癌及肾癌患者患者，通过持续观察发现患者生存率提高，5年生存率乳腺癌患者可达[43]到79%，而肾癌患者也可达到57%。最近KeJiang等报道NDV诱导耐顺铂和耐紫杉醇A549肺癌细胞发生自噬，同时阐述了其分子机制，调节自噬可促进其体内外溶瘤能力。NDV治疗脑胶质瘤的研究已有二十多年历史。Naujocks等最早于1995年开[44]展NDV治疗脑胶质瘤的研究。2004年CsataryLK等报道NDV毒株MTH-68/H16 [45]治疗4例常规治疗无效的脑胶质瘤病人，疗效显著，生存期在5-9年。2006年Wagner等将NDV毒株MTH-68/H与丙戊酸联合治疗一例12岁男孩的晚期脑胶[46]质瘤，肿瘤体积减少85%。免疫组化证实，NDV在胶质瘤细胞中增殖，并引起细胞凋亡。目前，NDV溶瘤毒株MTH-68/H和NDV-HUJ已完成在脑胶质[47]瘤的I期临床实验。2010年，则开展了另一项关于HUJ静脉内给药治疗多形性成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤及肉瘤的Ⅰ/Ⅱ期临床研究(NCT01174537)。近期，[48]KeJiang等研究发现NDV体外感染胶质瘤细胞U251激发细胞自噬，促进自噬增强病毒复制。尽管其它溶瘤病毒如腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒等,在治疗脑胶质瘤的研究中也取得一定的疗效，但NDV具有其他溶瘤病毒所不具备的优势：1）NDV是一种禽类病毒，极少跨种属感染，对人体无明显副作用，相对安全；2）NDV是一种RNA病毒，只会在细胞的胞质内复制，而不会与所依附宿主的细胞的染色体整合，不存在导致原癌基因活化的风险。而且与DNA先比，RNA不够稳定，使得NDV不会长期依附于宿主细胞之内；3）NDV无需插入外源基因即显示出强大的溶瘤能力，这其中也包括不同耐药特性的肿瘤细胞，而其他溶瘤病毒通常需要另外插入外源基因来增强其溶瘤能力。C6胶质瘤动物模型是目前广泛使用且较为理想的胶质瘤实验模型，具有胶质瘤的生物学特性，包括呈肿瘤呈侵袭性生长、无包膜、新生血管形成、很少出现[49]颅外种植生长等，并且具有成瘤快、成瘤率高、成活率高等优点，成功建立、筛选可靠的大鼠模型是本实验的基础。本实验在C6细胞培养完成后，以大鼠右侧脑尾状核为靶点,固定大鼠于立体定向仪，经剪发、消毒等术前准备后，沿着SD大鼠正中矢状线做纵向切口，切口长度约1.5cm,分离暴露顶骨，按坐标定位,颅骨钻钻孔,孔径2.0mm,深达硬脑膜。微量注射器固定于立体定向仪，进针深度达硬膜下6.0mm，后退回针1.0mm,制造出小罅隙，以使得细胞接种后能尽可能全部沉聚。整个注射过程应缓慢进行，太快则会使细胞悬浮液从脑内溢出，可通过脑脊液播散，致种植细胞数量不足，难以成瘤，导致大鼠模型制作失败，溢出的C6细也生6长于头皮下，同样导致模型制作不成功。本实验选择每只大鼠靶区注入1×10细胞悬液15μl，因细胞数目过少模型成功率低，过高虽能明显提高造模成功率但大鼠生存状态差、生存期短，不利用于进行下一步研究。另外注射点选择鼠脑右侧尾壳核，深度为距硬脑膜约5．5mm-6.0mm，但不可超过6.0mm，否则会导致17 大鼠死亡。细胞在10min内缓慢、匀速注射完毕,留针5min,以使细胞充分沉积在穿刺道底部。缓慢拔针，以防止胶质瘤细胞通过虹吸效应通过针孔溢出。注射完成后采用骨蜡封闭骨孔,并以生理盐水冲洗术野，用1号丝线缝合头皮切口，定期消毒，预防感染。100只大鼠模型建立3天后，即有个别大鼠出现出现饮食、运动量下降，攻击性降低的现象。在模型建立后3-7天这段时间，部分大鼠可能因种植操做不规范、大鼠自身免疫机制低下以及相互撕咬等原因出现死亡。接种C6细胞7天后使用GE公司signa1.5TMR机对大鼠模型进行扫描，筛选肿瘤体积相当的大鼠，扫描序列T1WI(TR500ms，TE15ms);T2WI(TR3000ms，TE78ms)，经鼠尾静脉注射0.2mmol/kg钆双胺行增强扫描。MRI检查时使用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉。扫描时以嗅沟为标志在矢状定位像作鼠脑冠状面定位，扫描层厚33.0mm，间隔0.5mm。磁共振扫描完成后筛选肿瘤体积相当(127.63±25．04)mm和生存状态皆相近的大鼠24只，并将大鼠随机分为3组，每组8只。A组为阴性对照组，大鼠颅内单纯注入C6胶质瘤细胞；B组和C组分别经尾静脉脉注入和通7过立体定向原位瘤体内注入10TCID50的NDV，继续观察、测量大鼠进食饮水、活动、体重、症状、体征等并记录死亡日期。通过观察A组实验鼠接种C6细胞7天后，逐渐出现进食饮水减少，体重开始明显下降，直到接种C6细胞后第12天出现不同程度颅内压增高症状，部分鼠出现眶周出血、眼球外突、癫痫样发作和偏瘫等症状，并在第14天开始出现实验鼠死亡，19天后A组实验鼠全部死亡。B组实验鼠在C6细胞后第7天经右颈内动脉注入NDV，从第23天开始出现死亡，29天全部死亡。C组实验鼠在第7天经立体定向仪，原位瘤体内注入NDV，进食饮水逐渐增多，体重开始增加，平均生存期较A、B两均组明显延长，C组大鼠在第33天全部死亡。经统计分析得：A组平均生存期16.13±1.55天，B组平均生存期25.13±1.98天，C组平均生存期30.88±1.46天。各组之间进行统计学分析，P值均小于0.05，有统计学意义。考虑导致B、C两组存在差异的原因，可能是受到B组大鼠血脑屏障未彻底破坏，以及病毒在大鼠体内代谢的影响，导致NDV治疗效果受到一定的限制，使得B组大鼠生存期短于C组。通过对肿瘤组织切片进行TUNEL法检测，光学显微镜下观察，染色阳性的肿瘤细胞，胞核呈棕黄色，胞核固缩，有的呈碎片状，形态不规则，大小不一，染色质出现凝聚、浓缩、边缘化等现象，细胞呈凋亡的形态学征象。也有胞体、胞核体积形态基本正常的染色阳18 性的肿瘤细胞。C组的阳性细胞数较B组为多。而A组的肿瘤组织中很少有阳性细胞。流式细胞术检测结果表明：与对照组相比，C6细胞在NDV感染后24小时及48小时细胞凋亡增加更明显。根据临床观察，影响NDV治疗效果的关键因素之一就是给药方式，研究证[50]实NDV局部给药时溶瘤效果更好。本次实验也证实了这一点，经立体定向注入胶质瘤瘤体内的的大鼠的存活时间较经颈动脉注入NDVFMW的延长，并且TUNEL法检测观察到经立体定向注入胶质瘤瘤体内的的大鼠胶质瘤内凋亡的阳性[51]细胞数更多。YLing等进行实体瘤内注射NDV-D90的实验，发现NDVD90对肿瘤组织起到了抑制增长的作用，但是肿瘤并没有完全溶解。本实验也出现同样的现象：通过立体定向颅内原位注入NDVFMW的大鼠，虽然生存时间有所延长，但最终仍然死亡。原因可能是:经过NDVFMW病毒感染的细胞发生了凋亡，而增殖的NDVFMW病毒却并没有能及时感染新的肿瘤细胞，使NDVFMW不能在大鼠胶质瘤中扩增，新生成的NDVFMW病毒因无生存环境而死亡，胶质瘤仍继续生长，最终导致大鼠死亡；而且RNA病毒的不稳定性也决定了NDV不会在宿主体内持续存活。故寻求可通过血脑屏障，能将病毒靶向输送入胶质瘤体内的病毒载体，并实现重复治疗是需要进一步解决的问题。19 结论（1）能够成功建立、筛选稳定可靠的C6胶质瘤细胞大鼠模型是实验的基础；（2）肿瘤切片TUNEL分析及流式细胞术检测证实NDVFMW毒株能够导致C6胶质瘤细胞凋亡；（3）单次注入NDVFMW毒株虽然能够抑制C6胶质瘤生长，但肿瘤实体仍然存在而且继续生长，最终导致大鼠死亡；（4）经立体定向瘤体内局部注射给药的治疗效果于经尾静脉注入病毒行全身治疗。20 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综述大脑胶质瘤诊疗进展窦新柱综述宋飞教授审校神经胶质瘤(Glioma)由神经外胚层衍化而来，来源于神经胶质细胞及神经元细胞，占颅内肿瘤的40%-50%。胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，每年的发病率[1]约7/10万人。按病理类型分为星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤等。传统治疗方式为手术切除联合放化疗。近年来，影像学的发展为提高胶质瘤诊断的准确率、术中应用、评估预后及制定进一步治疗方案提供了保障。而随着分子技术水平及生物工程技术的进步，人们对脑胶质瘤的治疗有了进一步的了解，对治疗方式的选择提出了新的治疗策略。1.影像学进展：（1）MRS单一代谢形式对肿瘤类型诊断依然有限，而在常规磁共振成像（MagneticResonanceImaging，MRI）的基础上借助于磁共振波谱(magneticresonancespectroscopy，MRS)MRS信息而诊断正确的病例不断增加。MRS是目前唯一可测得活体组织代谢物的化学成分和含量的检查方法，氢质子(1H)波谱技术当前最常使用。对于患者来说，MRI的增强对比、水肿、异质性、囊肿或坏死皆为评估要素且成为MRS的分组标准，再依据MRS数据计算每个代谢物在病变和侧体素之间的比值，相对MRS定量线性判别分析，将诊断正确率由87%提升至91%。MRS通过检测特定代谢变化可帮助MRI影像进一步精确诊断颅内病变的性质，合理的应用MRS能在临床实践中提高诊疗效率，同时可避免不必要的手术，减少手术并发症的发生。（2）PET-CTPET-CT将精密的PET扫描仪与CT设备联合，实现功能的一体化，医学界公认的革命性突破，被称为称“现代医学高科技之冠”。在脑胶质瘤PET影像诊断25 中，以18F标记的脱氧葡萄糖(18F-FDG)，安全方便，是目前临床上最常用的显像剂。18FDG-PET-CT对于脑胶质瘤术前诊断、分级，术后残余灶或复发病灶检测的检测均有重要意义。它能有效地区分反射性坏死和治疗导致的其他损伤。FDG-PET可确认机体代谢活动的损害情况，故能鉴别复发肿瘤和放射后或是手术后的改变。有研究显示18FDG-PET-CT的准确度（80.85%）高于增强MRI（68.09%），且18FDG-PET-CT对WHOⅢ级复发肿瘤有较高的诊断准确度（91.43%）和特异度（94.74%），但这仍需要增大亚组样本量，做进一步研究。18FDG-PET-CT的优点还在于早期描述肿瘤的活动情况，有效地指导手术及放疗。虽然18FDG-PET-CT诊断的效果很明显，但临床上还要考虑其较高的假阳性率，而且，因脑组织对FDG摄取率高和CT缺乏明确的病灶，故有遗漏病灶的可能。18FDG-PET-CT的敏感度较低，不建议作为检查复发的初级筛选手段，但可在MRI检查出病灶后，再行18FDG-PET-CT作一定的特性描述。2.治疗方案新进展（1）外科手术治疗手术治疗为临床首选治疗方法，也是治疗胶质瘤最基本、最直接的方式，是[2]最关键的一步。MIKUNI等通过对手术治疗的胶质瘤患者分析表明，在保证正常脑组织功能的前提下，最大程度地切除胶质瘤肿瘤能取得比较好的治疗效果。目前在术前采用的新技术主要包括：MRS、PET-CT、功能性磁共振成像（FunctionalMRI，fMRI）等；术中采用的技术包括：术中应用神经导航；术中采用唤醒麻醉技术；术中MRI、术中超声等术中成像技术；术中脑功能定位，如直接皮层电刺激技术；术中使用荧光造影和荧光显微镜。（2）化学治疗近年来，烷化剂药物在临床方面的研究正在逐渐增多，其中最为代表性的药[3]物为替莫唑胺(TMZ)。有研究表明，替莫唑胺联合放疗和延长患者生存期。但在临床用药治疗胶质母细胞瘤时发现，耐药性是不可回避的问题，因此在一定程[4]度上限制了TMZ的应用。（3）射频热疗技术在脑胶质瘤治疗中的应用进展射频（RF）热疗技术的出现已经有一百多年历史。目前已应用临床治疗的多个方面，如实体肿瘤、心血管系统、骨骼系统、妇科疾病、疼痛医学、以及医学26 美容等领域，但在神经外科肿瘤方面，尤其是对发病率最高、预后差的脑胶质瘤的治疗，还处于试验摸索阶段。热疗联合放疗具有协同增敏作用，可增强对肿瘤细胞的杀伤效应，临床效果显著。热疗联合化疗药物技术也可增强灭活肿瘤细胞效果，有研究显示，单独通过动脉内用药可延长生存期，但单独通过静脉内化疗无效，联合热疗则可增强静脉内及动脉内化疗的效果。热感受性脂质体：作为药物载体，热感受脂质体拥有良好的通透性和靶向性等优良特性。而且在保护包裹的药物同时还能够降低药物毒性，降低化疗药物对人体的危害程度，目前，临床上对于热感受性脂质体的应用正逐渐开展。热敏脂质体是一种全新的脂质体靶向策略,通过与肿瘤热疗结合，应用对温度变化敏感的脂质体搭载药，局部提升肿瘤温度达到靶向投递治疗药物的目的。在采用热疗的方法治疗胶质瘤的过程中，将抗癌药存封进热感受性脂质体并加热到设定温度以上，在热疗杀死肿瘤的同时，封存药物的脂质体打开并释放出抗肿瘤药，靶向性地在加热的肿瘤处释放高浓度的抗肿瘤药。射频消融技术不断的改进，加之人们对脑胶质瘤发病机理研究的深入，以及对热敏脂质体的不断应用、探索，射频热疗技术联合热敏脂质体为基础的靶向热化疗技术有望成为一种新的且能够有效治疗脑胶质瘤的方法。（4）氩氦刀冷冻消融治疗脑胶质瘤进展冷冻疗法治疗恶性胶质瘤，最早见于20世纪60年代。但因冷冻范围以及温度下降的速度难以控制，加之易出现并发症等多种因素，应用受到了很大的限制。而氩氦刀的应用则能较好的克服上述缺陷，并且在术中应用CT和MRI则可清楚的观测肿瘤范围，实时监控冰球的大小，使得CT或MRI引导下的氩氦刀技术成为一种新的治疗胶质瘤的方法。因手术可在局麻下进行，故对于微小病灶或患者无法耐受常规手术，CT或MRI引导下的微创微创氩氦刀冷冻消融治疗则是可供选择的治疗方法。氩氦刀正逐渐为神经外科医生所重视，氩氦刀与其他治疗方法联合应用，如放化疗、基因治疗等，是未来应用冷冻技术治疗胶质瘤的发展方向。（5）分子靶向治疗在2009年，美国食品及药物管理局（PureFoodandDrugAdministration，FDA）批准贝伐单抗用于在常规治疗后肿瘤仍继续进展的多形性胶质细胞瘤患27 者，但目前仍没有有力的临床研究结果证实其可显著的改善病情或延长患者生存时间。目前我国推荐使用贝伐单抗也同样是基于美国FDA的标准，尚存在争议。（6)基因治疗自杀基因治疗自杀基因治疗，又名酶-前药基因疗法，于瘤体内转染该基因后，其所编码的特异性酶类可将无毒、低毒的前药物质在瘤体内转变为有活性或[5]有毒性的产物，通过干扰细胞的DNA合成，达到杀死肿瘤细胞的目的。Ji等用5-氟胞嘧啶治疗大鼠胶质瘤模型，发现可以改善大鼠症状，延长大鼠生存期。免疫基因疗法免疫基因疗法就是利用免疫基因发挥抗肿瘤作用。即将抗肿瘤相关细胞因子或者是可以刺激机体激发出与肿瘤免疫有关的基因载入到肿瘤[6]内，使之在胶质瘤的局部表达增强以达到杀瘤目的。有Ⅰ期临床试验研究证实，在把复制缺陷腺病毒载体包被的人IFN-β基因注入复发的胶质瘤患者体内，发现脑胶质瘤细胞的凋亡数与给药浓度呈正相关。抗血管生成基因疗法是从基因水平对瘤体血管再生进行抑制和干预，从而阻断瘤体细胞增殖和转移的“通道”，达到诱导瘤体细胞凋亡的效果。相关资料证明，血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）在恶性肿瘤中[7]的表达可高达96%。胶质瘤细胞在持续表达抗VEGFcDNA的时间内，瘤体细胞生长速度明显下降，同时，内皮抑素(endostatin)以及血管抑制素(AS)可直接阻止瘤体“通道”的形成,而将反义VEGFcDNA导入瘤体，可以明显抑制肿瘤血管的增殖。溶瘤腺病毒治疗经研究发现，天然的病毒其致病力并不是很高，故可以通过基因工程技术将这种病毒进行基因改造，一方面可以使其成为一种基因载体，[8]另一方面使其具有杀伤肿瘤细胞的功能。Kurimoto等通过对胶质瘤的动物模型采用溶瘤腺病毒基因治疗，发现此胶质瘤动物模型的生存期明显被延长。有关溶[9]瘤腺病毒的治疗方案正在进行临床实验研究。溶瘤新城疫病毒溶瘤新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是一种重要的溶瘤病毒。NDV可有选择性地在肿瘤细胞中增殖并起到特异杀伤作用。[10]KeJiang等研究发现NDV体外感染胶质瘤细胞U251激发细胞自噬，促进自噬[11]增强病毒复制。毒株MTH-68/H和NDV-HUJ已完成在脑胶质瘤的I期临床实验，并展示出有效的抗瘤作用。28 基因芯片技术即通过与一组已知序列的核酸探针进行杂交，来测定核酸序列。在脑胶质瘤的发生、发展过程中都伴复杂的基因表达的改变。基因芯片技术可以快速筛查与肿瘤恶性程度相关的基因表达通路，揭示出新的重要肿瘤相关基因，并且能为进一步基因靶向个体化治疗寻求新的道路。(7)免疫治疗肿瘤的免疫治疗是通过激发以及调整的方式，来增强人体的自身免疫系统，使其对脑胶质瘤抗原进行识别，从而特异、有效地杀伤靶细胞的一种新的治疗策略。脑胶质瘤的免疫策略主要有三种:主动免疫疗法、被动免疫疗法以及过继免疫疗法。国际上目前有十几项应用DC疫苗进行治疗胶质瘤的临床研究，部分临床研究的结果表明肿瘤疫苗可以延长患者生存时间，但是免疫治疗尚未建立标准、有效的免疫学指标，且面临自身免疫性破坏、选择性免疫抵抗等多种难题。(8)光动力学疗法应用光动力疗法（PhotodynamicTherapy，PDT）治疗脑胶质瘤最好在术前12小时内静注能够被脑胶质瘤细胞最快吸收的光敏物质，如5-ALA和光卟啉，然后联合氧气应用激光辐射瘤体，使瘤体细胞发生光化学反应，同时生成单态氧和(或)大量的氧自由基，以达到加快瘤体细胞凋亡的目的。目前，国外对光化学治疗胶[12]质瘤已开展了广泛的基础和相关的临床研究，并且取得了良好的治疗效果。3.展望目前治疗胶质瘤最主要的方案仍是手术联合放化疗，其他治疗方法则作为辅助治疗手段，部分治疗方法仍在研究之中。现在仍没有能彻底根治恶性胶质瘤的治疗方案，但随着对脑胶质瘤生物学机制的不断研究与揭示，各种诊断及综合治疗策略的不断提高与完善，相信脑胶质瘤患者远期生存率和生活质量将会得到有效改进。29 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附录主要中英文缩略语对照表缩写英文全称中文NDVNewcastlediseasevirus新城疫病毒TCID50Tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染剂量CTComputedTomography电子计算机断层扫描MRIMagneticResonanceImaging磁共振成像PETpositronemissionstomography正电子发射断层扫描APMV-1avianparamyxovirus-1禽副粘病毒-1GBMGlioblastomamultiforme胶质母细胞瘤HNHaemagglutininneuraminidase血凝素和神经氨酸酶活性糖蛋白FFusionprotein融合蛋白MMatrixprotein基质蛋白NPNucleocapsidprotein核衣壳蛋白LLargeprotein高分子量蛋白PPhosphoprotein磷蛋白ICDimmunogeniccelldeath免疫性细胞死亡MOImultiplicityofinfection感染复数31 致谢光阴如白驹过隙，转眼三年时间又匆匆而过。站在毕业的门槛前，回首三年的学习生活，感触良多。在这里向指导和帮助过我的老师、同学们以及科里的每位护士表示诚挚的谢意！我的导师XX教授在这三年的时间里，在我的学业上和生活上给予的悉心指导和无私帮助。导师专业知识渊博，工作作风严谨，为我们树立了榜样。诲人不倦、朴实无华的人格魅力对我影响深远。经过导师的精心教导，在三年时间里我积累累了临床经验，掌握了基本的研究方法，明白了许多待人接物与为人处世的道理。从本论文选题到完成，导师的耐心指导指、多次审阅、逐字修改，并提供了许多宝贵的意见和建议。本文才得以完成。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢全体神经外科的教授、各位医生们及护士门们，在我实习期间给予的指导和帮助！最后，向关心我、爱护我、给予我帮助的家人和朋友们致以诚挚的谢意！32 版权属大连医科大学所有呀．