长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）+成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）

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分类号ｔＲ３巧单松代码：１０４２７巧级Ｉ公开学号Ｉ２Ｍ３Ｕ０５Ｓ９诗ｉ娇？爭硕古学ｔｆｃ论文长链非编码ＲＮＡ在成骨不全中的差异表达分祈（Ｉ）成骨不全患者流行病学分析＾（ＩＩ）号？？．．研究生巧名；勝元伟巧：、、，＇—、导师姓名；－：二；鲁艳芹副研究员、＇：＾学科（领域）．药学．；－．扁馬＇．＇一＾巧奔南欠等想：－．所在学綺医学与虫飾学寺庚為：：山东学舞学Ｒ＞．、、ＩＩＩ，申请学位级測疫学硕壬答辩时间２０化年５月‘‘一？－一，＇．．．．？＇＊，Ｖ． 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进巧研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中明确方式禄明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担论文作者签名；曰期：弘衫岸句文矣ｄ勝；ｉ关于学位论文使用授权的声明本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家宵关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被蒼阅巧借鉴；本人授权济南大学ＲｆｌＵ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或其他复制手开段保存论文和汇编本学位论文。□保密（＿＿＿年，解密后应遵守此规定）论丈作者證名导师签名；日期：ｉｆ． 分类号：R319单位代码：10427密级：公开学号：2013210559硕士学位论文长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）研究生姓名滕元伟导师姓名鲁艳芹学科（领域）药学济南大学医学与生命科学学院所在学院山东省医学科学院申请学位级别医学硕士答辩时间2016年5月 Thedifferentialexpressionoflongnon-codingRNAsinosteogenesisimperfectandtheepidemiologicalanalysisofOIpatients（I）TheEpidemiologicalanalysisofOIPatients（II）ByYuanweiTengUndertheSupervisionofProf.YanqinLuAThesisSubmittedtotheUniversityofJinanInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofMedicineUniversityofJinanJinan,Shandong,P.R.ChinaMay,2016 济南大学硕士学位论文目录摘要...............................................................................................................................VAbstract............................................................................................................................VI英文缩略语.....................................................................................................................VII第一章前言..................................................................................................................11.1LncRNA生物学特性与功能..............................................................................11.1.1LncRNA及分类.......................................................................................11.1.2LncRNA的生物学特性...........................................................................11.1.2.1LncRNA的稳定性................................................................................11.1.2.2LncRNA的保守性................................................................................21.1.3LncRNA的生物学功能...........................................................................21.2LncRNA与疾病的关系......................................................................................41.2.1LncRNA与神经系统疾病.......................................................................41.2.2LncRNA与癌症.......................................................................................51.2.2.1作为诊断的LncRNA标志物..............................................................51.2.2.2作为癌症预后的LncRNA标志物......................................................51.2.3LncRNA与心血管疾病...........................................................................51.2.4LncRNA与自身免疫性疾病...................................................................61.2.5LncRNA与骨相关疾病...........................................................................71.3LncRNA与miRNA的相互作用........................................................................71.3.1MicroRNA引起LncRNA降解...............................................................81.3.2LncRNA作为miRNA分子诱饵.............................................................81.3.3LncRNA和miRNA竞争与mRNA作用的位点...................................81.3.4LncRNA可以产生miRNA......................................................................81.4LncRNA常用数据库........................................................................................101.5本课题的研究内容...........................................................................................10第二章骨组织总RNA提取.........................................................................................112.1实验材料...........................................................................................................112.1.1实验样本................................................................................................11I 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）2.1.2实验试剂................................................................................................112.1.3实验耗材................................................................................................112.1.4实验仪器................................................................................................112.2实验方法...........................................................................................................122.2.1样本的采集.............................................................................................122.2.2骨组织RNA的提取流程......................................................................122.3引物的合成.......................................................................................................132.4RNA逆转录反应..............................................................................................142.5实时荧光定量PCR反应.................................................................................152.5.1反应体系的配置....................................................................................152.5.2实时荧光定量PCR反应条件............................................................152.6实验结果...........................................................................................................162.7讨论...................................................................................................................17第一章前言................................................................................................................191.1成骨不全概述...................................................................................................191.2Ⅰ型胶原蛋白突变及成骨不全分型.................................................................191.3成骨不全的诊断与治疗...................................................................................201.3.1成骨不全的临床分型............................................................................201.3.2成骨不全的诊断....................................................................................221.3.3成骨不全的治疗.....................................................................................221.3.3.1成骨不全的手术治疗.........................................................................221.3.3.2成骨不全的药物治疗..........................................................................221.3.3.3成骨不全的细胞治疗.........................................................................241.3.3.4成骨不全的基因治疗.........................................................................241.4本实验课题的研究内容...................................................................................25第二章成骨不全患者流行病学调查及结果分析......................................................262.1材料...................................................................................................................262.2方法...................................................................................................................262.2.1病例收集.................................................................................................262.2.2纳入标准................................................................................................26II 济南大学硕士学位论文2.2.3排除标准................................................................................................262.2.4成骨不全患者临床信息采集表.............................................................262.2.5医学伦理................................................................................................272.3结果...................................................................................................................272.3.1成骨不全的患病情况............................................................................272.3.1.1患者基本信息.....................................................................................272.3.1.2患者临床信息.....................................................................................312.4讨论...................................................................................................................34参考文献..........................................................................................................................36攻读学位期间取得的研究成果......................................................................................44致谢..................................................................................................................................45III 济南大学硕士学位论文摘要长链非编码RNA（longnon-codingRNA,lncRNA）是一类转录本长度200～100,000个核苷酸的RNA，它们无编码蛋白质的能力或很少有编码蛋白质的能力。长链非编码RNA可通过表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等途径调控相关靶基因的表达。随着人类基因组内越来越多的长链非编码RNA被发现，长链非编码RNA与神经系统形成[3]、心血管形成[4]以及癌症发生、发展之间的关系也随之被报道。并且，其表达水平与疾病的发生发展阶段有紧密联系。成骨不全(osteogenesisimperfecta,OI)是一类Ⅰ型胶原蛋白合成和代谢障碍引起的遗传性结缔组织病。主要临床表现为易骨折、骨质疏松，部分患者会伴有蓝巩膜、牙本质发育不全、听力下降、肌肉薄弱、关节韧带松弛等症状。本研究拟分析14种长链非编码RNA在成骨不全患者骨组织中的差异表达，为研究骨相关长链非编码RNA及其功能奠定基础。目的：研究14种长链非编码RNA（Longnon-codingRNA,LncRNA）在成骨不全骨组织中的表达。方法:采用先天性骻关节脱位患者骨组织作为对照，应用RT-qPCR分析成骨不全骨组织中14种长链非编码RNA(ATB、EBIC、HEIH、hLACR1、HOTAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC、LSINCTS、Nbla10727、Nbla12061、PRNCR1与UC.388)的表达，使用REST-2009软件进行数据统计分析。结果：与对照组相比，14种长链非编码RNA中仅PRNCR1表达下调并具有显著性差异；ATB、EBIC、HOTAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC等7种长链非编码RNA表达差异均小于2倍，LSINCTS表达下调，HEIH、hLACR1、Nbla10727、Nbla12061与UC.388等5种长链非编码RNA表达上调，但均无统计学意义。结论：PRNCR1在成骨不全骨组织中低表达，其在成骨不全疾病的功能尚有待于进一步研究。关键词：成骨不全；长链非编码RNA；骨组织；PRNCR1V 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）AbstractLongnoncodingRNA(longnoncodingRNA,LncRNA)isakindofRNAtranscriptionofthislength200~200nucleotides,whichhavenocodingproteinabilityorrarelyhavetheabilityofencodingproteins.LncRNAthroughepigeneticregulationandtranscriptionregulationandtranscriptionregulationtoregulatetheexpressionofrelatedtargetgenes.AsagrowingnumberofLncRNAwasfoundinthehumangenome,lncRNAformwiththenervoussystemandcardiovascularformandcanceroccurrenceanddevelopmentistherelationshipbetweenwasreported.Anditsexpressionlevelstageofdevelopmentiscloselyassociatedwithdisease.Osteogenesisinsufficiency(osteogenesisimperfecta,OI)isatypeofⅠcollagensynthesisandmetabolicdisorderscausedbyahereditaryconnectivetissuediseases.Mainclinicalmanifestationiseasytofracture,osteoporosis,somepatientswithbluesclera,anddentindysplasia,hearingloss,muscleweakness,thesymptomsuchasjointligamentrelaxation.Thisstudyintendstoanalyze14kindsoflongchainnon-codingRNAinpatientswithosteogenesisdifferentiallyexpressedinbonetissue,layafoundationforthestudyofbonelncRNAanditsrelatedfunctions.Objective:Toexplorethedifferentialexpressionof14kindsoflongnon-codingRNAsinbonetissuesderivedfromosteogenesisimperfectapatients.Methods:RT-qPCRwasperformedtodetecttheexpressionlevelof14KindsoflncRNAsincludingATB,EBIC,HEIH,hLACR1,HOTAIR,PVT1,LET,Loc285194,SRHC,LSINCTS,Nbla10727,Nbla12061,PRNCR1andUC.388inbonetissuesderivefromosteogenesisimperfect(OI)patientswhoreceivedcorrectivesurgery.Bonetissuesfromdevelopmentaldysplasiaofthehip(DDH)wereusedascontrol.REST-2009wasperformedtoanalyzetheresults.Results:TheexpressionofPRNCR1wassignificantlydown-regulatedinOIbonetissues.There’snodifferentialexpressionwasobservedinotherthirteenlncRNAs,thoughtheexpressionofHEIH,hLACR1,Nbla10727,Nbla12061andUC.388wereup-regulatedandLSINCTSwasdown-regulated.TheexpressionofATB,EBIC,HOTAIR,PVT1,LET,Loc285194andSRHCwaslessthan2-foldofDDHcontrol.Conclusions:LowexpressionofPRNCR1wasobservedinbonetissuefromOIpatients.ThefunctionsofPRNCR1inOIneedfurtherstudy.KeyWords:osteogenesisimperfecta；LcnRNA;Bonetissue;PRNCR1VI 济南大学硕士学位论文英文缩略语缩略词英文全称中文全称OIOsteogenesisimperfecta成骨不全症DDHDevelopmentaldysplasiaofthehip发育性髋关节脱位DEPCDiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液ODOpticaldensity光密度值LncRNALongnon-codingRibonucleicAcid长链非编码核糖核酸Quantitativerealtimepolymerase实时定量聚合酶链式反RT-qPCRchainreaction应ADAutosomaldominantinheritance常染色体显性遗传ARAutosomalrecessiveinheritance常染色体隐性遗传COL1A1Collagen，typeⅠ，alpha1Ⅰ型前胶原α1链COL1A2Collagen，typeⅠ，alpha2Ⅰ型前胶原α2链丝氨酸蛋白酶抑制因子SERPINH1Serpinpeptidaseinhibitor，cladeH11FKBP10FK506bindingprotein10FK506结合蛋白10PPIBPrptidylprolylisomeraseB肽基脯氨酰异构酶BBMP1Bonemorphogeneticprotein1骨形态蛋白1DIDentinogenesisimperfecta牙本质发育不全VII 济南大学硕士学位论文第一部分长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析第一章前言1.1LncRNA生物学特性与功能1.1.1LncRNA及分类长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)是一类转录本长度200～100000个核苷酸的RNA，它们无编码蛋白质的能力或很少有编码蛋白质的能力[1]。长链非编码RNA主要由RNA聚合酶Ⅱ合成，大多数需要进行选择性剪切和加尾修饰，与mRNA不同，长链非编码RNA主要存在于细胞核中，少量存在于细胞质[2]。在人类全基因组中，能够编码蛋白质的RNA仅占2%，其余98%均为非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA）；ncRNA按照大小主要分为两类：长链非编码RNA（longnon-codingRNA，长链非编码RNA）和短链非编码RNA（包括piRNA,snRNA,snoRNA,miscRNA,scaRNA,rRNA,Srna,tRNA），其中长链非编码RNA占到非编码RNA的80～90%[3]。根据其与邻近蛋白编码基因的关系分为五类（如图1所示）：(1)正义长链非编码RNA,转录本与同链上的其他转录物的一个或几个外显子重叠;(2)反义长链非编码RNA，当与反义链的一个或几个转录物重叠;（3）双向长链非编码RNA,当起始表达位点与互补链的距离小于100kb时;（4）内含子长链非编码RNA，完全来自于转录物的一个内含子;（5）基因间的长链非编码RNA,当其位于基因组之间[4]。图1长链非编码RNA的分类1.1.2LncRNA的生物学特性1.1.2.1LncRNA的稳定性LncRNA具有组织特异性和疾病特异性，且可以稳定存在于血浆、尿液等体液中[5]。使用常规的RNA实验研究分析鼠neuro-2a细胞株的大约800个LncRNA和12,000个mRNA发现，只有少数LncRNA是不稳定的。与mRNA相比，LncRNA有更短的半衰1 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）期和更多的可变性，这表明LncRNA有更复杂的代谢和更多的功能。基因间和反义LncRNA比基因内LncRNA更为稳定；拼接过的比未拼接的更稳定；位于细胞核的比在细胞器中的稳定[6]。mRNA的功能与其半衰期有相关性，而LncRNA半衰期与功能的关系需要被验证。1.1.2.2LncRNA的保守性通过计算鼠LncRNA和mRNA的表达量发现，LncRNA的启动子要比它们的外显子更为保守，并且大部分和编码蛋白的基因一样保守[7]。用鼠和鸟类研究在鼠中高度保守和脑部表达的LncRNA发现，与编码蛋白的基因相比，LncRNA在序列、转录起始位点、外显子结构和非编码基因的长度都有高度的可变性都具有高度可变性。但是，如果它们是位于启动区、跨越外显子和内含子的边界、以及在胎儿期和产后早期的大脑的基因表达则具有进化保守性[8]。1.1.3LncRNA的生物学功能随着新的LncRNA被发现，有越来越多的证据显示，LncRNA有着复杂的生物学功能,并且与人类疾病的发生、发展有着密切的联系。LncRNA的生物学功能几乎涉及生命周期的各个步骤和调控多种功能。LncRNA可以在各个水平调控基因表达，包括染色质修饰，转录和转录后加工[2]。(1)参与基因的表观遗传调控，例如LncRNA通过调节生物体内基因表达的上调或下调，例如剂量补偿效应、基因印记、染色质修饰、X染色失活、RNA的可变剪切调控、蛋白质的活性调控等，来参与机体的重要生命活动。(2)参与基因的转录调控，主要包括可变剪切、拼接、加工、代谢、成熟以及稳定性调节等。(3)参与基因转录后的加工。LncRNA部分生物学功能的具体作用机制如图2[1]，2 济南大学硕士学位论文图2LncRNA的作用机制LncRNA为蓝色，编码蛋白质的基因为粉红色，浅粉色代表启动子/增强子A）转录干扰。LncRNASRG1的转录是通过相邻SER3基因的启动子。B）染色质重塑起动。fbp1上游持续性的RNA聚合酶Ⅱ能够抑制Tup蛋白。但是，极少量LncRNA被转录。葡萄糖饥饿时，Atf1活化剂绑定到UAS1的元件上，促进染色质重塑，随后通过RNA聚合酶ⅡRst2绑定到第二个UAS2元件上。随着LncRNA的转录，染色质结构环绕在fbp1起始位点，随后允许基因发生诱导转录机制。C）绑定到基础转录因子灭活启动子。在LncRNA和启动子DHFR与TFⅡB形成一个复合物阻止正常转录起始。D）辅助蛋白的激活。在应激反应中，CCND1上游的LncRNA形成RNA结合蛋白复合物TLS（存在与脂肪肉瘤中），其不活跃的蛋白质的构象被替换，通过染色质结合蛋白（CBP）促进CCND1被抑制。E）激活转录因子。LncRNAEvf2与Dlx2同源结构域蛋白作用于Dlx5/6增强子。F）激活蛋白的聚合。在热休克反应中，LncRNA促进HSF1蛋白聚集形成一个复杂的转录起始复合物促进热休克蛋白的表达。G）转录因子的运输。去磷酸化NFAT阻止易位核和激活靶基因，导致LncRNANRON和输入素蛋白之间的相互作用。3 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）H）基因组通过LncRNA产生表观遗传沉默。LncRNAXist、Kcnq10t1和Air为基因组的基因沉默形成一个核域。这些LncRNA可以直接或间接的引起表观遗传改变，例如组蛋白甲基转移酶（G9a或Ezh2）在这个核域中带来表观遗传抑制。I）基因反义LncRNA产生表观遗传抑制。HOTAIR(HOXC家族转录产物)，与、PRC2（多梳抑制复合物2）交互作用，导致甲基化和在HOXD位点沉默了多个基因。1.2LncRNA与疾病的关系LncRNA参与调节机体的各种病理过程，诸多疾病的发生与LncRNA密切相关。如阿尔茨海默病[9]、Silver-Russell综合征[10]、绝经期骨质疏松症[11]、帕金森综合症[12]等。目前，有多种LncRNA已经被用做诊断的生物标志物和预后的生物标志物，并且是潜在的治疗分子。1.2.1LncRNA与神经系统疾病阿尔茨海默病的神经病理学的特点是渐进性突触损伤,随后神经元本身包括皮质回路（开始于内嗅皮层和海马）发生不同程度变化。导致阿尔茨海默病的原因很多，一个主要的原因是淀粉样斑块源于β位点淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE1)裂解聚集在神经元上的淀粉样前体蛋白(APP)。在正常情况下，Aβ-42和Aβ-40的比值是平衡的,在阿尔茨海默病患者大脑，Aβ-42升高的结果是导致淀粉样斑块。BC200在正常衰老的大脑的额叶皮质表达下调，但是在阿尔茨海默病患者中表达上调，严重程度BC200上调的水平成正比[12]。BACE1-AS（来自于反义蛋白编码BACE1基因的转录）会在阿尔茨海默病患者中过表达[9]。帕金森病(PD)是一种慢性渐进性运动障碍,属于运动系统疾病,这是由大脑中产生多巴胺的细胞的损失引起的。基因研究发现帕金森家族l相关基因，如α-突触核蛋白，帕金，PINK1(磷酸酶张力蛋白复合物诱导激酶1)，DJ-1(也称为帕金森病蛋白质7，PARK7)体内基因LRRK2和(富亮氨酸重复激酶2)，所有这些基因与线粒体功能相关，表明线粒体的内稳态特性对PD尤其重要[13]。PINK1基因可以反式激活抑癌基因PTEN(磷酸酶和张力蛋白复合物)，损失或过表达PINK1造成线粒体形态异常，损害多巴胺释放和造成运动缺陷。naPINK1是一种人类特有的非编码RNA（转录来自于反义PINK1基因），具有稳定表达svPINK1（PINK1拼接体，和PINK1有相同的羧基端调节域）的能力。naPINK1沉默导致svPINK1在神经元中减少，说明naPINK1和svPINK1共同调节线粒体的生物合成[14]。4 济南大学硕士学位论文1.2.2LncRNA与癌症LncRNA与癌症的关系是目前研究的热点，LncRNA的组织特异性和疾病特异性使其成为潜在的诊断生物标志物；同时，它参与肿瘤和抑制肿瘤的通路，又可以作为癌症预后的生物标志物。1.2.2.1作为诊断的LncRNA标志物LncRNA表达的组织特异性,通常高于编码蛋白质mRNAs，使它们成为潜在的特定高度特异性的诊断的标志物[15]。在人体液中的一些LncRNA已经作为潜在的生物标志物[16]。在这些生物标志物中PCA3是最突出的例子，它在前列腺癌中高度表达[17]。检测PCA3尿液中已被证明是诊断前列腺癌的一个更特异的标志物比常用的前列腺特异抗原(PSA)，并且已经广泛的应用到临床中[16]。同样,UCA1(尿路上皮癌相关1)在尿液中发现的转录本被证实是膀胱癌的一个高度敏感和特定的生物标志物[18]。HULC在肝细胞癌患者的血浆中被检测，其成为潜在的诊断肝癌的生物标志物[19]。一些研究还证明其他癌症的潜在标志物，如MALAT1被认为是前列腺癌血清标志物的检测片段[20]；胃液中的AA174084被认为是胃癌的标志物[21]；HOTAIR,NEAT-1和UCA1作为口腔鳞状细胞癌的潜在诊断标志物[22]。1.2.2.2作为癌症预后的LncRNA标志物肿瘤的发生、发展以及转移等生理状况与诸多LncRNA的异常表达相关，一些LncRNA逐渐被发现与肿瘤的预后密切相关，使它们成为潜在的预后生物标志物。Gupta等人在2010年最初发现乳腺癌转移组织比正常的乳腺上皮组织的HOTAIR会高度的过表达，而早期肿瘤细胞高表达HOTAIR提示会发展为转移和死亡。乳腺癌细胞强制表达的HOTAIR，诱导全基因组重新定位起始复合物2，导致H3K27甲基化和改变了基因表达模式，增加了侵袭性和转移性[23]。同时，肿瘤组织过表达的HOTAIR与肝切除术后复发的危险性增加有关，也与淋巴结转移成正相关[24]。敲除HOTAIR减少肝癌细胞系的生存能力和侵袭能力，也会增加阿霉素的敏感性[25]。病人过表达HOTAIR会有更差的预后和更大的肿瘤尺寸和更快的肿瘤细胞增值速度[24]。1.2.3LncRNA与心血管疾病越来越多的证据证明，LncRNA在心血管的形成和胚胎发育起着重要作用[26,27]。实际上，LncRNA调控着细胞转换和器官形成。在器官形成时，LncRNA使基因和miRNA5 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）在细胞周期被激活，进而确保细胞能够向正常的方向发展和转变[27]。LncRNA是胚胎干细胞基因调控的重要部分，因为基因表达的改变可以引起干细胞不同的分化[28]。LncRNA在哺乳动物的心脏形成中起着重要作用。使用小鼠作为实验对象发现，Bvht参与心血管细胞的分化。研究显示，Bvht是中胚层的发育必须的，它可以影响心脏增长和激活与心脏分化相关的基因网络。Bvht与心肌分化相关，并且调节新生儿心肌细胞的细胞周期[29]。采用高通量测序技术RNA测序和染色质图谱分析发现，在人体和动物模型中LncRNA是心脏疾病主要调控因子[30,31]。最近研究发现，在各种病理情况下，LncRNA发生异常变化，这使它们成为理想治疗靶位和生物标记物[32]。LncRNA，在心血管的形成和心脏疾病（如心肌梗死，原发性心肌病，心力衰竭和原发性心肌病）中扮演着重要的角色。例如敲除AK143260后发现，心肌细胞失去搏动能力,并使心脏关键转录因子（Nkx2-5、Hand2、Mef2c、Myocardin、Gata4等）失活。此发现有助于了解细胞增殖分化为心肌细胞的分子机制，为先天性心肌病的治疗提供思路[33]。LncRNA-ANRIL与动脉粥样硬化密切相关，其表达水平的升高与病情严重程度直接相关[34]。1.2.4LncRNA与自身免疫性疾病LncRNA代谢紊乱可能在自身免疫性疾病中起着重要作用，在发现LncRNA系统性红斑狼疮（SLE）[35]、类风湿性关节炎(RA)[36]、一型糖尿病(T1DM)[37]与多发性硬化症(MS)[38]等疾病中均有报道。全基因组研究已经确定位于染色体1q25的基因GAS5与系统性红斑狼疮有关[39]。此外,小鼠模型实验发现,GAS5对糖皮质激素有免疫抑制作用[39]。此外,GAS5的启动子失去Sp1结合位点导致GAS5的低表达,进而可能抑制细胞周期和细胞凋亡[40]。类风湿性关节炎是一种系统性自身免疫性疾病,其特征是慢性炎症和破坏滑膜关节[41]。炎性细胞因子,包括TNF-α，IL-1b,IL-6已经证实和RA的发病机制密切相关[36,42]。最近，有新的证据表明RA病人LncRNA表达发生改变[43]。通过微阵列分析对RA患者和正常人血液单核细胞（BMCs）和血清中exosome进行比较发现HOTAIR、LUST，anti-NOS2A，MEG9，SNHG4，TUG1和NEAT1等7种LncRNA的表达明显升高；mascRNA，PR反转录本，PRINS和HOXA3as明显降低[44]。过表达的HOTAIR可以吸引激活的吞噬细胞发生迁移。相反，抑制HOTAIR（在成骨细胞和风湿性滑膜中可以被检测到）的水平，可以激活MMP-2和MMP-13[44]。这个结果提示HOTAIR可以作为RA的潜在的生物标志物。6 济南大学硕士学位论文另一种RA相关的LncRNA是H19，被报道在RA滑膜组织比正常人关节创伤患者的滑膜组织有明显的过度表达，与骨性关节炎和反应性关节炎的滑膜组织比较差异更大[43]。通过使用微阵列研究发现，H19在RA患者血液单核细胞比在正常人血液单核细胞表达有明显等增加。然而，H19在RA患者血清exosome比正常人血清exosome差异不明显[44]。因此还需要进一步的研究来确定H19在RA中的作用。Ⅰ型糖尿病(T1DM)是一种自身免疫性疾病[45]。大约40%的Ⅰ型糖尿病，糖尿病性肾病会发展到终末期（ESRD）[45,46]。LncRNA-PVT1(浆细胞瘤异位改变1)编码一些选择性转录本，它可以在多种类型的肾细胞中过表达，当被放大或过表达时，会增加细胞增殖和抑制细胞凋亡[37]。如胰岛素样生长因子2(insulinlikegrowthfactor2，IGF2)反义转录本IGF2AS以及第10号染色体丢失的磷酸酶基因诱导激酶1(pateninducedputativekinase1，PINK1)的反义转录本naPINK1。糖尿病患者高血糖浓度刺激胰岛β中IGF2AS的过表达，提示IGF2AS的表达可能与血糖浓度正相关[47]。1.2.5LncRNA与骨相关疾病目前，对于骨相关疾病的LncRNA研究相对较少。青少年特发性脊柱侧凸是最常见的小儿脊柱畸形，被认为是一种复杂的基因遗传病。LncRNA联合mRNA芯片研究发现了青少年特发性脊柱侧凸和正常人中存在表达差异的139种LncRNA和546种mRNA，随后GO和PATH进行分析预测，这些mRNA主要参与涉及骨矿化、肌肉神经连接、骨骼系统的形成、核苷酸和核酸代谢和各种信号通路[48]。骨质疏松症是一种常见的疾病，症状是低骨密度(BMD)和低创伤性骨折，主要由破骨细胞骨吸收超过了成骨细胞的骨形成。血液单核细胞直接参与破骨细胞形成,并且很多LncRNA被认为参与到成骨分化中。研究发现，低骨密度病人外周血LncRNA-DANCR表达升高。进一步研究发现，外周血LncRNA-DANCR可以在mRNA水平和蛋白质水平促进IL-6和TNF-α的表达。用siRNA敲除DANCR，低骨密度绝经期妇女的IL-6和TNF-α的表达被抑制。外周血中DANCR诱导的IL-6和TNF-α具有促进溶骨的作用，因此DANCR可能被作为绝经期妇女骨质疏松症潜在的生物标志物[11]。7 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）1.3LncRNA与miRNA的相互作用随着对LncRNA研究的发现，miRNA在LncRNA调控生命活动中，起着重要作用。LncRNA与miRNA的交互作用关系主要有以下四个方面(图3[49])。1.3.1MicroRNA引起LncRNA降解MALAT1的靶基因是Ago2,其存在于人类原发性胶质母细胞瘤细胞系U87MG和人类霍奇金淋巴瘤细胞系L428中[50]。沉默Ago2或拮抗miR-9可以增加MALAT1稳定性，而miR-9过表达则降低MALAT1的稳定性[50]。HuR和miRNA-let-b都会对人宫颈癌细胞中lincRNA-P21的表达降低起作用。HuR消耗稳定状态的lincRNA-P21，而let-7b过表达会加速lincRNA-P21的消耗；同时，HuR的调控降低lincRNA-P21的半衰期，导致需要补充更多的let-7，这说明HuR和let-7b共同抑制lincRNA-P21的表达[51]。1.3.2LncRNA作为miRNA分子诱饵有些诱饵分子可以成为蛋白或miRNA的“分子海绵”，如lncRNA-H19是miRNALet-7的“分子海绵”，其序列中包含许多Let-7结合位点[52]。在人类胚胎干细胞中，lincRNA-ROR在分化状态下是抑制的[53]。在这种条件下,lincRNA-RoR不存在足以隔离mir-145-5p的量。而Nanog，Oct4和Sox2激活linc-ROR转录，这样人类的胚胎干细胞可以通过自我调节循环来维持多能性[53]。1.3.3LncRNA和miRNA竞争与mRNA作用的位点LncRNA-BACE1-AS和竞争mir-485-5-p与mRNA-BACE1的作用位点[54]，ncNRFR和let-7竞争mRNA-let-7的结合位点。有趣的是,YAMC细胞过表达ncNRFR会产生更高水平的let-7的靶mRNA，注入裸鼠时具有高度侵袭性,进一步表明ncNRFR的致瘤的作用是通过抑制let-7来作用于内源性靶mRNA[55]。1.3.4LncRNA可以产生miRNAlinc-MD1产生的miR-206和miR-133b分别来自内含子和外显子，这说明linc-MD1对肌肉分化和肌肉营养具有调节作用[56]。在小鼠体内lncRAN-H19可以产生miR-675，这个过程会被HuR抑制，并且反过来抑制胰岛素生长因子受体[57]。H19被敲除后，成肌细胞成肌会增加，相反，miR-675增加会使成肌受到抑制，因此增加miR-675可以恢复肌肉细胞分化[58]。8 济南大学硕士学位论文图3LncRNA和miRNA在转录后直接交互作用的主要方式随着对lncRNA研究的不断深入，众多异常表达的lncRNA先后在多种肿瘤组织中被发现。Gibb[43]等通过对64个肿瘤样品进行高通量RNA-seq测序及其lncRNA表达谱的分析，共找出1065个LncRNA在各种肿瘤类型中存在差异表达。Khaitan等对黑色素瘤细胞系WM1552C和黑色素细胞中LncRNA表达谱的分析发现，77个LncRNA在WM1552C细胞系中明显表达异常，表明LncRNA与肿瘤的发生发展密切相关。由于LncRNA存在MRE序列，使得其具有与miRNA竞争性结合MRE的ceRNA调节功能;而LncRNA在肿瘤组织中的异常表达，同样会导致其所调控的miRNA及其靶基因的表达异常。因此，两者之间可通过互相调控共同影响靶基因的表达，从而参与肿瘤的发生发展。随着对ncRNA机制的研究，发现miRNA和lncRNA疾病的发生中起作用，并且能够发生相互作用共同调控疾病进展，使ncRNA调控网络不断丰富。利用相关miRNA和lncRNA组合作为检测手段将为疾病早期诊断提供新证据，而利用这种相互调控关系也将为疾病治疗提供新思路，并且对患者疾病的预后具有指示意义。9 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）1.4LncRNA常用数据库随着LncRNA研究的深入，LncRNA汇总、分类、功能等相关信息被研究者所重视。近年来，研究人员结合生物信息学技术已经建立多个LncRNA先关的数据库（表1）。这些数据库不仅提供多物种LncRNA的综合信息，还为研究LncRNA与mRNA、cirRNA、蛋白质等提供了重要的研究平台。表1LncRNA数据库及网址数据库名称网址LncRNAdbhttp://www.lncRNAdb.org/NONCODEhttp://www.noncode.orgLNCipediahttp://www.lncipedia.orgLncRNADiseasehttp://cmbi.bjmu.edu.cn/lncRNAdiseaseNREDhttp://jsm-research.imb.uq.edu.au/nred/ChIPBasehttp://deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/Starbase2.0http://starbase.sysu.edu.cn/fRNAdbhttp://www.ncrna.org/frnadb/1.5本课题的研究内容成骨不全作为遗传性结缔组织疾病，具有表型与基因型异质性，致病基因数量多且致病分子机制复杂多样。本研究拟分析14种长链非编码RNA在成骨不全患者骨组织中的差异表达，为研究骨相关长链非编码RNA及其功能奠定基础。10 济南大学硕士学位论文第二章骨组织总RNA提取2.1实验材料2.1.1实验样本成骨不全患者骨组织2.1.2实验试剂液氮、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)、氯仿(国药集团化学试剂有限公司)、RNase-freewater、DEPC、Trizol(Invitrogen公司)2.1.3实验耗材研钵、冻存盒、镊子、废液缸、10ul，200ul，1000ul移液枪、10ul，200ul，1000ul无菌枪头(去RNA酶)、1.5ml无菌离心管(去RNA酶)、0.2ml无菌八连排管（罗氏公司）、RandomPrimers（50pM）（TAKARA公司）、dNTPMixture(10mMeach)（TAKARA公司）、RNase-freewater（TAKARA公司）、5×PrimeScriptBuffer（TAKARA公司）PrimeScriptReverseTranscriptase(200U/μl)（TAKARA公司）、2*MIX(罗氏公司)、SYBRGreen实时荧光定量PCR试剂盒（罗氏公司）、RnaseInhibitor（40U/μl）（TAKARA公司）2.1.4实验仪器移液器Eppendorf公司涡旋振荡器Qilinbeier公司MDF-382E-80℃冰箱SANYOTDGC2J超净工作台苏州净化设备厂石英比色皿Eppendorf公司SZ-93纯水蒸馏机上海亚荣生化仪器厂Centrifuge5415D离心机Eppendorf公司AUTOCLAVEMLS-3780高压灭菌锅SYNYO公司DGG-9140B型电热烘干箱上海森信实验仪器有限公司BioPhotometer紫外分光光度计Eppendorf公司Allegra™64R冷冻离心机BECKMANCOULTER纯水仪Millipore公司11 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）FM50型雪花制冰机北京长流科学仪器公司NanoDrop2000/2000c分光光度计ThermoScientific公司BS110S分析天平SARTORIUS液氮罐LightCycler®Nano荧光实时定量PCR仪罗氏公司普通PCR仪BioRAD纯水仪Millipore公司2.2实验方法2.2.1样本的采集经山东省医学科学院伦理委员会通过，本实验在天津市武清区人民医院和山东省立医院共收集被确诊的成骨不全患者和先天性髋关节脱位患者术中废弃的骨组织样本各9例。其中，成骨不全患者平均年龄在7岁，5男4女。先天性骻脱位患者平均年龄6.8岁，5男4女。本实验所使用的样本均获得了患者及家属的知情同意。2.2.2骨组织RNA的提取流程1）称取组织的重量并记录。2）在研钵中剪碎组织，加入适量液氮，将组织块研磨成粉末。（加入2-3次液氮反复研磨，确保骨组织充分研磨）3）将研磨好的组织转移到用DEPC处理过的离心管中，再称重得出组织量。4）然后加入1mlTrizol,涡旋混匀（均质50-100mg的组织样本需要1ml的Trizol试剂）室温孵育20分钟，以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。再加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置3分钟。5）4°C，12,000g离心15分钟，取上清约700μl(<80%体积，禁止接触到中间白色蛋白层)至到1.5ml离心管中，同时保存中间层和有机相。加入500μl异丙醇，用手摇晃混匀（震荡15秒），室温放置10分钟。6）4°C，12,000g后离心10分钟，弃去上清，加入1ml75%乙醇颠倒混合，洗涤RNA沉淀。12 济南大学硕士学位论文7）4°C，12,000g后离心5分钟，弃去上清，室温干燥5-10分钟(不要太干)。8）加入适当体积(一般为30-50μl)RNase-freewater溶解RNA，测定RNA（A260/A280在1.8-2.0为宜）。9）将提取的RNA分装后，放入-80°C冰箱冻存。10)在电脑中安装与NanoDrop2000/2000c分光光度计匹配的NanoDrop2000软件，并将分光光度计与电脑连接后，再打开软件，待仪器稳定后再使用。经NanoDrop2000/2000c分光光度计测定，RNA的浓度均在400ng/μl，OD（A260/A280）值均介于1.8-2.0之间，符合实验要求（表1.1）表1.1RNA样本浓度及纯度样本名称样本浓度OD(A260/A280)样本名称样本浓度OD(A260/A280)DDH-168461ng/μl1.9TJOI-2592459ng/μl1.81DDH-327743ng/μl1.93TJOI-1011358ng/μl1.82DDH-199600ng/μl1.83TJOI-374696ng/μl1.83DDH-163759ng/μl1.82TJOI-2741237ng/μl1.85DDH-332701ng/μl1.83TJOI-086986ng/μl1.85DDH-318590ng/μl1.85TJOI-062480ng/μl1.81DDH-242475ng/μl1.82TJOI-3261064ng/μl1.92DDH-324718ng/μl1.82TJOI-090804ng/μl1.85DDH-191711ng/μl1.83TJOI-291832ng/μl1.832.3引物的合成本实验采用14种长链非编码RNA引物(ATB、EBIC、HEIH、hLACR1、HOTAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC、LSINCTS、Nbla10727、Nbla12061、PRNCR1与UC.388)以及内参引物β-actin的合成均由华大基因公司合成。内参及引物序列如表1.2所示，13 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）表1.2lncRNA引物序列lncRNAPrimerpairsHOTAIRForward5’-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3’Reverse5’-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3’PRNCR1Forward5’-CCAGGGGGAAACACACAG-3’Reverse5’-AAATGGCAGTTTCCTTCAATG-3’LOC285194Forward5’-AATAGTTTCCCAAGATTTCAGTGG-3’Reverse5’-TCCTCTTTCATCTTACACTTGTGG-3’Uc.338Forward5’-AGCGACAGTGCGAGCTTT-3’Reverse5’-GGAAGGATTGAGTGAGCCTT-3’Nbla10727Forward5’-CAGTCAGCCTCAGTTTCCAA-3’Reverse5’-AGGCAGGGCTGTGCTGAT-3’Nbla12061Forward5’-ATGTTAGCTCCCAGCGATGC-3’Reverse5’-CTAACTGCCAAAAGGTTTTCC-3’LSINCT5Forward5’-TTTTGATTACGACGGGTTCC-3’Reverse5’-TTCGGCAAGCTCCTTTTCTA-3’HEIHForward5’-CCTCTTGTGCCCCTTTCTT-3’Reverse5’-ATGGCTTCTCGCATCCTAT-3’ATBForward5’-TCTGGCTGAGGCTGGTTGAC-3’Reverse5’-ATCTCTGGGTGCTGGTGAAGG-3’SRHCForward5’-GGAGGACCAGCTGCTGTAAG-3’Reverse5’-CCAGAGAGGTGGTGGTGTTT-3’EBICForward5’-GACTGAATGGACAAGTGGATCTTC-3’Reverse5’-GGAGTTCTTCTTGACCCTCTTGTAG-3’hLALR1Forward5’-ACGGGTGCGGGTTTAGG-3’Reverse5’-TCCAGGGCCGACTCCAT-3’hPVT1Forward5’-AAAACGGCAGCAGGAAATGT-3’Reverse5’-ATTCCCATAGAAGGGGCAGG-3’LETForward5’-GTTGTTGTTGCATTGGGGT-3’Reverse5’-AAGATGGAGAGTGGAGCCT-3’β-actinForward5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′Reverse5’-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′2.4RNA逆转录反应为保证逆转录反应转录效率，逆转录模版RNA的初始浓度应为2μl，所以应对RNA样本进行稀释。本实验的RNA逆转录反应使用的是两步法，第一步：冰浴条件下在八连排管中，根据下表1.3依次加入试剂，混匀离心。表1.3第一步反应体系试剂用量RNA2μgRandomPrimers（50pM）1μldNTPMixture(10mMeach)1μlRNase-freewater4μl14 济南大学硕士学位论文65°C5min后，立即冰浴冷却2min以上。离心10s，使模板RNA和引物的变性溶液聚集于八联排管底部。第二步：在上述八联排管中按表1.4依次加入试剂，反应体系总体积为20μl。表1.4第二步反应体系试剂用量TemplateRNA/Primermixture10μl5×PrimeScriptBuffer4.0μlPrimeScriptⅡReverseTranscriptase(200U/μl)1.0μlRnaseInhibitor（40U/μl）0.5μlRNasefreewater4.5μl将配置好的反应液放入PCR仪中，按设定好的反应程序进行逆转录反应。详细反应程序为30°C10min，42°C60min，70°C15min后冰上冷却。得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增。2.5实时荧光定量PCR反应2.5.1反应体系的配置根据表1.5在冰浴环境下配置10μl体系的反应液，混匀。表1.5实时荧光定量PCR反应体系试剂用量cDNA1.0μl2×MIX5.0μl上游引物（10μM）0.4μl下游引物（10μM）0.4μlRNasefreewater4.2μl2.5.2实时荧光定量PCR反应条件将配置好的反应液的8联排按顺序置于实时荧光定量PCR仪中。翻译程序如表1.6所示，反应分为两个阶段，第一个阶段是在95°C条件下，进行预变性5分钟；第二阶段是95°C变性10秒，然后60°C退火10秒，再72°C延伸15秒，整个扩增程序需要进行45个循环。15 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）表1.6实时荧光定量PCR反应程序步骤反应温度时间阶段Ⅰ预变性95°C5分钟阶段Ⅱ变性95°C10秒（45个循环）退火60°C10秒延伸72°C15秒图1成骨不全骨组织14种LncRNA相对表达2.6实验结果图1为LncRNA的相对表达量，14种LncRNA表达散点图如图2所示，结果表明16 济南大学硕士学位论文ATB、EBIC、HOTAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC等7种LncRNA表达差异均小于2倍；HEIH、hLACR1、Nbla10727、Nbla12061、UC.388等5种LncRNA在成骨不全骨组织中表达上调，上调幅度在2.68-7.32倍之间，但无统计学差异；LSINCTS、PRNCR1等2种LncRNA表达下调，其中PRNCR1表达(P值<0.05)，具有统计学差异。图2成骨不全骨组织14种LncRNA相对表达分析散点图2.7讨论LncRNA较编码蛋白质的RNA研究开始较晚，随着LncRNA研究的深入，越来越多的LncRNA被发现。LncRNA的研究多在肿瘤中报道[61]，关于骨相关疾病报道较少。但是有与LncRNA关联基因突变而引起骨相关疾病的研究，例如，UC.388的相关基因TCF12[59],而TCF12基因发生突变会引起新生儿颅缝早闭[60]；LOC285194缺失会引起肿瘤抑制基因（编码的边缘系统相关膜蛋白）拷贝数的改变，从而引起骨肉瘤的发生，并且LOC285194可以通过调控凋亡和细胞转录等方面促进成骨细胞增殖[61]。本研究探讨了HOTAIR等14种LncRNA在成骨不全患者骨组织中的表达情况，发现PRNCR1低表达，但仍然需要后续的进一步扩大样本以及血样样本的验证。目前关于17 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）PRNCR1的研究多限于肿瘤研究，通过siRNA降低PRNCR1表达可抑制前列腺癌细胞生长,同时反式激活雄激素受体，表明PRNCR1可能通过调控雄激素受体活性来影响前列腺癌的发生、发展[62]。在结肠直肠癌中，PRNCR1下降会使处于GO/G1细胞比例减少，处于S期的细胞明显增加，从而促进癌细胞的增值[63]。PRNCR1的低表达在成骨不全中的作用尚有待于进一步研究。另外，该研究中所差异变化没有显著性意义的一些LncRNA有一些在肿瘤组织中有差异表达。例如，HOTAIR在乳腺癌细胞中高表达，诱导全基因组重新定位起始复合物2，导致H3K27甲基化和改变基因表达模式，增加了侵袭性和转移性[64]。被lncRNA-ATB的TGF-β可以增加肝癌的转移并且导致不良的预后。因为lncRNA可以上调ZEB1和ZEB2基因的上调，从而竞争性结合miR-200家族导致上皮间质细胞转化为癌细胞；此外，lncRNA-ATB通过黏附mRNAIL-11，分泌IL-11激活STAT3信号通路，从而促进肿瘤细胞转化向其他器官转移[65]。研究发现通过siRNA降低lncRNA-EBIC表达，可以抑制宫颈癌的发生和转移，因为lncRNA-EBIC和蛋白甲基化转移酶（EZH2）协同抑制钙粘蛋白（一种宫颈癌转移中的关键分子）的表达[66]。LncRNA-HEIH与乙型肝炎的复发有密切关系，是乙型肝炎病毒的预后的独立影响因子。在G0/G1细胞阻滞期中起重要作用，它作用于EZH2(组蛋白甲基转移酶)的增强子从而抑制EZH2基因的表达[67]。LnRNA-hLALR1通过激活Wnt/β-catein信号通路（抑制AXIN1蛋白的表达）促进细胞周期蛋白D1的表达，从而可以在肝细胞再生阶段加速肝细胞进程和细胞周期[68]。成骨不全作为遗传性结缔组织疾病，具有表型与基因型异质性，致病基因数量多且致病分子机制复杂多样。对成骨不全LncRNA的分析，能为该类疾病的分子标记物以及机制的研究奠定基础。18 济南大学硕士学位论文第二部分成骨不全患者流行病学分析第一章前言1.1成骨不全概述成骨不全(osteogenesisimperfecta,OI)是一类Ⅰ型胶原蛋白合成和代谢障碍引起的遗传性结缔组织病。多数为常染色体显性遗传（AD），少数为常染色体隐性遗传（AR）主要临床表现为多发性骨折、低骨密度，部分患者会伴有蓝巩膜，鸡胸，三角形脸，牙本质发育不全(DI)，听力下降，肌肉薄弱，皮肤弹性下降，长期骨折所致骨骼畸形等症状[70]。成骨不全患者的个体发病率为1/10000，为罕见性疾病，有发病时间长治愈困难等特点。但这个发病率的估计可能被低估，因为在诊断的过程中，很多温和型的成骨不全患者由于骨折次数少，骨折症状轻，而被忽视无法确诊。以往对成骨不全的认知不足，成骨不全症患者未能得到及时诊断及治疗。近年来随着药双膦酸盐药物的应用、手术矫形水平的提高、以及物理康复等措施，已经能够降低骨折发生率减少，骨畸形发生，缓解疼痛。1.2Ⅰ型胶原蛋白突变及成骨不全分型骨细胞外基质含量最丰富的蛋白质是Ⅰ型胶原蛋白，在骨骼和大多数结缔组织中广泛存在。Ⅰ型前胶原是由两条前胶原α1链和1条α2链组成的三股螺旋链式结构，分别由COL1A1和COL1A2基因所编码。Ⅰ型胶原蛋白的α链都包含338个不间断重复的Gly-X-Y结构，C-前肽与N-前肽形成非螺旋的NC结构域位于Gly-X-Y两侧[71]。前胶原在链的合成和螺旋形成的过程中，都会在内质网进行翻译后修饰。前胶原装配完成后，C-前肽和N-前肽被特异性蛋白酶水解，赖氨酸和羟赖氨酸之间会形成稳定的共价交联，之后胶原分子自发的形成胶原纤维[72]。成骨不全在表型和严重程度具有异质性，目前为止成骨不全共分为17个亚型[70]。成骨不全症分为Ⅰ-Ⅳ型是该病的主要致病人群，是Sillence等根据临床体征和组织病例学特征进行划分的，是由于Ⅰ型胶原蛋白的结构基因COL1A1或COL1A2突变所致。一个无效的COL1A1/COL1A2等位基因（如发生移码、插入或缺失突变），可造成Ⅰ型胶原合成数量减少，但通常不会发生结构改变，因而只引起症状较轻的Ⅰ型成骨不全。胶19 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）原数量不足源于突变导致翻译过早终止，随着无义mRNA被降解，只保留下正常结构的胶原[73]。研究发现，超过80%的突变会改变Ⅰ型胶原结构（主要引起Ⅱ-Ⅳ型成骨不全），其中以甘氨酸被其他氨基酸替换居多[74]。氨基酸残基被大量改变会引起螺旋折叠的推迟，随后一系列的脯氨酸和赖氨酸残基过度加工修饰。然后，异常胶原被分泌、加工并释放到细胞质基质中。这会影响到胶原的纤维结构，与非胶原蛋白的相互作用、细胞外基质的矿化、成骨细胞的发育，以及细胞和细胞、细胞与基质之间作用，最终导致骨骼畸形和骨质脆弱。IFITM5（编码干扰素介导的跨膜蛋白5）基因突变造成的Ⅴ型成骨不全，为常染色体显性遗传。Ⅴ型成骨不全的一个定点突变位点是5’非编码区c.-14上胸腺嘧啶(T)杂合替代胞嘧啶[75]。Ⅵ-ⅩⅤ、布鲁克综合症Ⅱ型型均为常染色体隐性遗传，致病基因分别为SERPINF1、CRTAP、LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10、SP7、BMP1、TMEM38B、WNT1、CREB3L1布鲁克综合症Ⅱ型和成骨不全有表型相似性，为疑似成骨不全[76]。1.3成骨不全的诊断与治疗1.3.1成骨不全的临床分型1979年，Sillence[70]等根据临床表型和影像学诊断将成骨不全分成四个临床表型。Ⅰ型成骨不全表型症状较轻，基本不发生骨骼畸形；Ⅱ型成骨不全多发生围产期死亡；Ⅲ型成骨不全多发生渐进性骨折；Ⅳ型成骨不全发生中等强度的骨折[70]。Ⅰ型成骨不全临床表型最为温和，主要症状是骨折，蓝巩膜和听力损失。Ⅰ型通常有接近正常人的身材，骨骼变形较小，骨折通常在青春期后减少[71]。Ⅱ型成骨不全表现最严重，通常发生围产期死亡，最具有代表性的是子宫内的多次骨折。婴儿通常会在产后第一年发生夭折，最常见的死因为心肺功能丧失。Ⅲ型成骨不全会发生渐进性骨折，是非致命型中骨折最严重的。患者巩膜颜色通常是灰色或蓝色，身材极其矮小，骨折频繁发生，并且还经常伴有牙本质发育不全。影像学观察，大约有半数成骨不全患者的股骨干骺端的生长板表现为爆米花样[77]。Ⅳ型成骨不全发生中等程度的骨折，表型具有广泛性，可能会有牙本质发育不全。最典型的表现是移动时仅仅引起长骨的骨折，最终身体的高度与青春期前的儿童相似[78]。Ⅴ型成骨不全为中度或严重的骨折，主要的表现为增生性骨痂和骨间膜钙化，相邻生长板两端存在干骺端带（股骨远端，胫骨近端）。身材正常或者矮小，前臂内旋或外20 济南大学硕士学位论文旋受限，无蓝巩膜，牙齿正常。Ⅵ型成骨不全的类骨质含量较高，一般无宫内骨折，部分患者韧带松弛。会有儿童早发性骨折，骨板呈鱼鳞状，存在骨矿化缺陷。通常身材矮小，有或无蓝巩膜，部分患者灰巩膜，牙齿正常。Ⅶ型成骨不全中等到严重的骨骼脆性，眼球突出且蓝巩膜，骨折疏松，但无牙本质发育不全，会有脊柱侧弯，髋内翻，髋臼内陷，近端肢体短小，多发性肋骨骨折，出生时多次股骨骨折，在婴儿期会因继发性呼吸功能不全或肺炎而致死，部分患者与Ⅱ型较为相似。Ⅷ型成骨不全与Ⅱ、Ⅲ型相似，严重的身体畸形，严重的骨骼矿化曲线，干骺端呈爆米花样，骨基质排列紊乱，中枢神经系统发育迟缓，身材矮小，上下身比例失调，手相对前臂较长，指骨长，掌骨短，无蓝巩膜，眼球突出，无牙本质发育不全，桶状胸，严重骨质疏松，出生时多发性骨折，脊柱侧弯，后凸。Ⅸ型成骨不全，灰巩膜或正常，无牙本质发育不全，听力视力正常，运动迟缓，无肋骨骨折，长骨短且弯曲，但无近端肢体短小表型，头大，前囟大，脊柱后凸，手指和骻关节活动幅度大。Ⅹ型成骨不全出生时存在多次宫内骨折，周身性骨质疏松，脊柱侧弯，四肢相对短，长骨弯曲，膝外翻，周身性关节松弛，该型婴儿显示渐进性的病情加重，身材矮小，大头畸形，三角脸，蓝巩膜，牙本质发育不全，小额畸形，骨折频繁。Ⅺ型成骨不全，身高正常或矮小，巩膜正常或依稀蓝色，一般无牙本质发育不全，中度到重度骨脆性，脊柱侧弯，髋内翻，“鱼鳞状”板层骨；类骨质增加，类骨质增多症，干骺端球状，渐进性严重或中等程度畸形，伴有大疱性表皮松解，多发关节挛缩可伴发或是缺少。Ⅻ成骨不全身材矮小，面部不对称，听力正常，无蓝巩膜，小口畸形，小颌畸形，腭弓高萌芽晚，无牙本质发育不全，多发骨折、周身性骨质疏松症，轻度骨畸形，脊柱轻微侧弯，运动迟缓。ⅩⅢ型成骨不全身材矮小，三角脸，无听力障碍，淡蓝巩膜，牙本质发育不全，鸡胸，产前骨折，脊柱侧后凸畸形，SillenceⅢ或Ⅳ型，尺桡骨、肱骨成角畸形，膝关节活动受限，肘与腕关节以及指关节过伸，手指纤细，掌骨相对较短(蜘蛛状指/趾)，缺少骨塑形。ⅩⅣ型成骨不全轻度或中度身材矮小，牙齿、听力与巩膜正常，骨折与骨质疏松严重程度不等，肌张力下降。ⅩⅤ型成骨不全身材矮小，正常或淡蓝巩膜，牙本质发育不全，部分患者有自闭症、眼脸下垂、智力发育障碍等症状，颅骨异常，上肢或下肢过长，肌张力下降。OI-BruckⅡ型身材矮小，漏斗胸，马蹄足，翼状胬肉，成骨不全病并伴随大关节痉挛。未分型成骨不全，有的会宫内死亡，头颅骨软，方颅，串珠状肋骨，管状骨形状似手风琴，多发骨折。21 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）1.3.2成骨不全的诊断对于成骨不全的诊断，临床上主要根据患者临床症状以及影像学资料来判断。影像学表现为骨密度降低，通常患者四肢骨及脊柱会发生弯曲变形。临床上通常对双能量射线吸收法，对病人进行骨密度测定，通常结果会显示骨密度降低。通过骨密度的测定，可以帮助临床医生监测患者使用双膦酸盐药物治疗后，骨密度的恢复情况。此外，对于成骨不全的诊断还应配合对巩膜颜色的观察，牙齿的发育程度，关节韧带松弛状况以及皮肤的弹性程度等。1.3.3成骨不全的治疗成骨不全的治疗原则是最大程度提高患者运动能力及自理能力，减少骨折次数，缓解疼痛。对于成骨不全的治疗主要有：手术治疗、药物治疗、细胞治疗和基因治疗[79]。1.3.3.1成骨不全的手术治疗成骨不全患者骨脆性大，骨折频率高，对于成骨不全的治疗应区别一般骨折。首先，对于成骨不全患者最终要的是不能够过度限制固定，防治继发性的骨量减少而导致的肌肉萎缩。应该尽量避免使用钢板固定，因为使用钢板固定可能会有在新位点发生骨折的风险[78]。骨折次数较多的成骨不全患者会发生渐进性的长骨畸形和脊柱侧凸，需要接受外科手术进行矫正治疗。对于需要矫形的长骨，应选择在骨折前或骨折时，进行截骨术并置入髓内钉。对于髓内钉的选择包括不可延长髓内钉和两种可延长髓内钉（包括Fassier-Duval和Sheffield可延长髓内钉系统）[80]。可延长髓内钉的作用是减少矫正次数和对骨骼的持续性保护。脊柱侧凸的矫正方法是先行颅骨牵引术后进行脊柱固定，进而减少脊柱弯曲和增强脊柱稳定性，可以减少疼痛并且增强呼吸功能[81]。髋关节和膝关节置换术根据不同年龄和步行能力通常采用电脑设计植入物进行治疗[82]。为防止严重的脊柱侧凸导致后脑形成疝和脑脊液阻塞，可以采用颈枕融合术降低脑内压[83]。1.3.3.2成骨不全的药物治疗药物治疗治疗主要包括双膦酸盐药物、特立帕肽、生长激素等。目前，临床发现双膦酸盐药物对成骨不全的治疗最明显，可以有效的增加骨密度、减少骨转化率，减少骨折频率[84,85]。对于成骨不全患者的治疗，低年龄轻型患者多采用静脉周期性注射帕米膦酸盐治疗，其机制是静脉注射后经肠道吸收,迅速进入骨组织吸附于轻基磷灰石晶体表面,可抑制骨表面破骨细胞的形成和活化,从而抑制骨吸收[86]。其短期疗效及安全性已经被大量研究证实，已经应用到临床治疗中。虽然双膦酸盐已被证实对大部分患者有效，但22 济南大学硕士学位论文其治疗的最适剂量和时间以及最佳治疗年龄等问题尚无统一标准，仍有待进一步研究。到目前为止特立帕肽是FDA批准的唯一一种治疗骨质疏松的药物，它是甲状旁腺激素的一种重组形式。特立帕肽可以增加骨密度，减少脊柱弯曲和非脊柱骨折，其成骨作用大于破骨作用[87]。对成年成骨不全患者研究发现，温和型成骨不全患者在注射特立帕肽后骨密度增加，血清标记显示骨形成和骨吸收增强，而Ⅲ型和Ⅳ型成骨不全则不会产生影响[88]。使用重组生长激素(rGH)治疗OI是基于其对胶原合成和长骨生长刺激影响。多年的临床试验表明，重组生长激素作用于胶原蛋白数量不足的成骨不全患者(I型成骨不全)，可以加速骨代谢率，骨形成率,BMD和增强成骨细胞成骨作用，但对骨折风险的影响没有报道过[89]。对于Ⅲ型和Ⅳ型成骨不全，rGH治疗没有任何效果[90]。最佳，一种新的对抗骨吸收的药物狄诺塞麦被研制出来，它可促进破骨细胞的分化，对于骨质疏松和其他骨骼疾病具有治疗作用[91]。狄诺塞麦是唯一一种被批准的人源化的抗体，它是针对NF-kB配体的受体激活剂(RANKL)，随后绑定到未成熟的单核细胞表面，随后诱导他们分化为成熟的破骨细胞[92,93]。临床应用狄诺塞麦与四例Ⅵ型成骨不全患者，发现其减少骨吸收作用明显[94]。因为双膦酸盐药物对Ⅵ型成骨不全的骨质矿化结合和激活作用效果较差。TGF-β可以同时激活成骨细胞和破骨细胞，是骨重建过程中的关键调控因子。TGF-β由成骨细胞分泌，以不活跃的形式储存于骨机制中。随着骨吸收的发生TGF-β被激活，随后激活SMAD信号通路。在动物模型中，无论是TGF-β缺乏还是过表达都会导致低骨量[95]。成骨不全骨基质发生改变决定TGF-β的存储障碍,从而导致信号通路激活失控[96]。李等人证明TGF-β信号改变主要会引起骨量减少，并且此现象至少存在于两种成骨不全亚型中，而其药理抑制动物能够改善骨量连少的症状[96]。在Ⅰ期段临床试验使用的三种TGF-β抗体亚型，对原发性局灶节段性肾小球硬化症和特发性肺纤维化患者都有效果[97],使该药物治疗成骨不全成为可能性。由骨细胞分泌的骨硬化蛋白，是WNT信号转导通路的拮抗剂。骨硬化蛋白可以抑制骨形成中与WNT受体交互作用的低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5).因此，骨硬化蛋白抗体(Scl-Ab)治疗是通过经典WNT信号通路，来刺激成骨细胞合成代谢从而影响骨骼,该治疗方法的有优点是绕过骨吸收抑制药物的副作用[98]。在成骨不全的动物模型和女性骨密度人群中，使用Scl-Ab治疗可以刺激骨形成增加骨量。Scl-Ab治疗Ⅳ型成骨23 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）不全老鼠，骨质量改善,长骨骨折减少，骨硬度增加[99,100]。但Scl-Ab治疗在COL1A1缺陷成年小鼠模型和严重型成骨不全模型中的作用是相反的。在成年小鼠模型中，较高的松质骨量和皮质厚度未被检测到。骨形成和骨吸收的血清标志物在Scl-Ab治疗前后的差别不具有统计学意义[101]。因此，Scl-Ab治疗对于成骨不全严重程度治疗效果不同，一种潜在的治疗儿童成骨不全合成代谢疗法，但Scl-Ab治疗效果还需要进一步的研究证实。随着骨生物学知识的发展，骨骼疾病的治疗进入了一个新时代。生长激素和磷酸盐治疗不在是成骨不全治疗的唯一选则。目前，将RANKL作为靶点刺激破骨细胞分化表现出前景。这种方法可以克服骨吸收药物抑制的问题。骨硬化蛋白是一种新型的刺激WNT通路的分子，被认为是另一种可以绕开骨吸收药物抑制，而治疗成骨不全的方法。然后，后一种方法在参与骨重建时会有严重的副作用，特别是儿童时期。最近，一个临床研究发现证明，TGF-β对由于内质网脯氨酸3-羟化复合体活性降低的经典型成骨不全和隐性成骨不全都有效[102]。但是考虑到TGF-β广泛的作用范围，其使用剂量和副作用还需要大量的实验数据来证明。1.3.3.3成骨不全的细胞治疗间充质干细胞是一类具有多向分化能力的组织干细胞，可在特定的诱导条件下分化为成熟点的成骨细胞并产生正常骨基质。干细胞移植、药物治疗和手术治疗的方法仅能够缓解患者症状，但对骨脆性和胶原缺陷无法治疗。研究发现儿童成骨不全患者植入同种异体间充质干细胞，能增加骨含量，提高生长速度，减少骨折发生，但移植成功率较低（〈2%）[103]。尽管各种干细胞治疗仍处于动物和临床研究阶段，但是其治疗的潜在结果较好，治疗方案和治疗年龄等一些重要的问题仍然需要解决。干细胞治疗最需要解决的是改善骨移植效率，克服缺乏特定的骨骼转化系统和清除移植的远期的副作用。我们还需要有一个很好的评估系统，来判断在无体外操作的条件下供者的骨细胞和成骨细胞在受者体内是否移植成功和干细胞在体内的成骨分化能力。1.3.3.4成骨不全的基因治疗基因治疗的发方法是对于突变的COL1A1和COL1A2等位基因进行沉默，然后替换掉突变基因，这是对于常见的成骨不全的唯一治愈方法。特异性抑制突变基因，能够改变严重型成骨不全的胶原结构缺陷和温和型成骨不全的胶原数量缺陷。迄今为止，治疗的技术手段有反义寡核苷酸、核酸酶、siRNA和shRNA等方法[104]。24 济南大学硕士学位论文1.4本实验课题的研究内容成骨不全为罕见病，对于成骨不全症的研究大多数都处在基础医学领域，而临床病例多为案例报道，对于成骨不全症很难有整体的认识。目前，急需一个可以供科研工作者和临床医生提供参考的一个平台，为系统性的治疗成骨不全提供一个辅助的参考平台。本课题旨在通过对大量的成骨不全患者进行流行病学调查，继而对成骨不全患者的基本信息以及疾病状况和遗传史进行一个汇总，为以后成骨不全登记建立提供数据支持，推动成骨不全在基础医学领域和临床医学领域的研究发展。25 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）第二章成骨不全患者流行病学调查及结果分析2.1材料于2010年12月至2015年11月，在天津市武清区人民医院和山东省立医院小儿骨科就诊的成骨不全患者，患者来源分布于国内29个省、市、自治区。2.2方法2.2.1病例收集于2010年12月至2015年11月，在山东省立医院小儿骨科和天津市武清区人民医院骨三科就诊的300例成骨不全患者患者。2.2.2纳入标准1)诊断为成骨不全的患者。2）性别及年龄不限。3）患者或父母对本身骨折史、发育史能够清晰描述，以及父母对妊娠期间身体状况记忆清晰描述清楚，并且能够如实回答。4）自愿参加临床调查研究并且签署知情同意书。2.2.3排除标准1）患有精神或神经疾患者导致无法或不愿合作者。2）研究者认为患者有不宜入选的理由。2.2.4成骨不全患者临床信息采集表临床病例分别有山东省立医院和天津市武清区人民医院两位专家确诊，并排除其他可被误诊为成骨不全症的疾病，如骨肉瘤、佝偻病、骨纤维异常增生及先天性假关节等疾病。临床信息采集表登记员均为本实验室研究人员，对成骨不全疾病发病机制了解并且在登记前，对所有登记员进行严格培训。成骨不全患者信息调查表(见附录)包括患者及其父母的基本信息及患者的临床信息。患者及父母的基本信息包括姓名、性别、出生年月、发病年龄、民族、居住地、联系电话、职业、工作环境，发病因素、诱发因素及家族史。患者的临床信息包括患26 济南大学硕士学位论文者出生时健康状况、运动能力、出生时及现在身高体重、骨折史、并发症及药物治疗和手术治疗史。2.2.5医学伦理本研究经过山东省医学科学院伦理委员会批准通过，且参加临床调查研究的患者并且签署了知情同意书。2.3结果2.3.1成骨不全的患病情况2.3.1.1患者基本信息1.年龄比较：患者年龄范围为1-46岁，平均年龄为13±7.48岁。年龄分布高峰出现在6-18岁年龄组，占患者总数的66.7%。表2.1成骨不全患者年龄及性别分布年龄1-6岁6-18岁18岁以上总计女23（17.4%）86（65.2%）23（17.4%）132性别男29（17.3%）114（67.9%）25（14.9%）168总计52(17.3%)66.7%48（16%）3002.性别比较：男性168例，女性132例，性别比例为1.27：1，男女发病率大致相同。3.学历：本病患者学历普遍较低，原因是该研究中的患者大部分为18岁下，另外该病发病较早，频繁骨折，影响患者的运动能力，造成生活与学习不便。4.民族分布：汉族282例，傣族1例，回族7例，满族2例，蒙古族4例，苗族2例，瑶族1例，壮族1例。5.省份分布成骨不全病例呈现散发分布，发病省份人数及所占百分比如图1中所示。安徽12例，北京6例，福建8例，甘肃3例，广东13例，广西5例，贵州8例，河北21例，河南35例，黑龙江6例，湖北21例，湖南14例，吉林5例，江苏16例，江西11例，辽宁14例，内蒙古7例，宁夏3例，青海2例，山东34例，山西9例，陕西7例，上海1例，四川11例，天津1例新疆2例，云南3例，浙江11例，重庆11例。成骨不全患者省份分布与该省人口数目大致呈正比，在本研究中所在调差的两家医院中地区差别不明显。27 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）图1成骨不全患者省份分布6.家族史具有成骨不全家族史的家庭有24个，其中父亲患有成骨不全的有10例，母亲患有成骨不全的14例，共占总体样本的8%。在临床调查中还发现，父母患有该疾病的下一代患者的临床症状较父母更为严重。8人父母为近亲结婚，占总体样本2.7%。7.妊娠史及喂养情况第一次怀孕的为187例，多次怀孕为113次。有过流产史的母亲为62例，无流产史的236例。怀孕时难产有6例，占总体样本的2%。B超检测有异常有113例，占总体样本的37.7%。出生时母乳喂养153例，混合喂养111例，人工喂养36例。8.出生时所伴随的症状前囟门闭合晚于正常儿童109例，四肢短小并且蜷缩的患者40例，胸腔短小患者17例，头骨软的患者60例，头偏大的患者53例，下肢成蛙式位患者44例，呼吸困难患者11例，吞咽困难患者20例。各种症状占总体的比例如图2所示，前囟门闭合晚，头骨软和头偏大三种头部骨折异常时成骨不全出生时所伴随的最多的临床症状，说明头部骨骼发育异常为成骨不全患者出生时所伴随的主要症状。28 济南大学硕士学位论文图2成骨不全患者出生时伴随症状9.身高体重，出生时身高男50.1±7.1cm，正常新生儿为50.6cm；女49.5±6.8cm，正常新生儿为50cm。出生体重男3.15±0.54kg，正常新生儿为3.27kg，女2.97±0.47kg，正常新生儿为3.17kg。患者的体重、身高的离散程度如下图3所示。成骨不全患者男性新生儿体重较正常新生儿低，而女性新生儿无差别；成骨不全新生身高男性、女性与正常新生儿对比均为差别。29 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）图3成骨不全患者新生儿体重及身高10.运动能力成骨不全患者在1岁半前可以独立行走的只占66%，骨折是影响成骨不全独立行走的额主要原因（如图4所示）。患者无法独立行走期间一直卧床的有48人，依靠爬行或小板凳挪动的11人，通过轮椅或助行器运动的有80人，依靠拐杖行走13人。研究发现，骨折后直接卧床，不进行运动的患者预后较差；而进行简答的恢复性运30 济南大学硕士学位论文动的患者预后较好。1岁半是正常儿童初次独立行走的最晚时间，而成骨不全患者只有88人。并且有13人，占到总人数5%的成骨不全患者在一直无法独立行走。图4初次行走年龄2.3.1.2患者临床信息1.骨折情况患者骨折史统计的如图5所示，OI患者骨折发生的部位多集中在长骨，并且以四肢骨最为明显，有62%的患者股骨发生过骨折。患者发生骨折1-10次的有92（30.7%）人，10-20次的人144人(48%)，20次以上的64人（21.3%）。首次骨折时间在出生后0-30天的患者有114人（38%），首次骨折年龄在出生后在30天-1岁的患者有95人（31.7%），首次骨折年龄在1岁-4岁有61人（20.3%），首次骨折年龄在4岁以上的有10人（3.3%）。此外，出生前骨折20人（6.67%），出生时骨折30人（10%），出生后易骨折的患者有59人（19.7%）。骨折情况与季节关系，3人春季高发，9人冬季高发，10人秋季高发，2人夏季高发，其余患者骨折高发期与季节无关。31 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）图5成骨不全患者骨折史统计2.临床表现成骨不全患者临床症状如图6所示，有263人具有蓝巩膜的症状，占总体样本的87.8%，调查中还发现部分患者会出现灰色和白色巩膜；术后瘢痕明显者202人，占总体样本的67.3%，术后瘢痕明显与胶原代谢异常相关；187人牙齿发育较差，占总体样本的62.3%，患者牙本质发育不全的症状有锯齿状，稀松，透明；患者有124人有生长障碍，占总体样本的41.3%，患者通常上身的长度超过下身长度；105人肘关节屈曲受限，占总体样本的35%，不会患者会发生桡尺骨融合，出现前臂的外旋和内旋受限；身材矮小有87人，占总体样本的26%；85人有鸡胸，占总体样本的28.3%；脊柱侧弯的患者77人，占总体样本的25.7%；头围偏大者61人，占总体样本的20.3%；脊柱后突的患者42人，占总体样本的14%；膝盖外翻的患者36人，占总体32 济南大学硕士学位论文样本的12%；有35位患者伴有三角脸的症状，占总体样本的11.7%；平足患者31人，占总体样本的10.3%；关节活动异常的患者24人，占总体样本的8%；关节松弛的患者20人，占总体样本的6.7%；肩脱位的患者16人，占总体样本的5.3%；15人皮肤弹性较差，占总体样本的5%；关节疼痛的患者14人，占总体样本的4.7%；手指纤细并且偏软的患者有13人，占总体样本的4.3%。成骨不全的临床表现与胶原合成代谢异常与缺乏存在着明显的相关性。图6成骨不全的临床症状3.并发症（图7）患者中14人(4.7%)出现听力下降；56人（18.7%）出现近视，19人（6.3%）发生过关节脱位；关节韧带松弛的患者29人（9.7%）；心血管疾病7人（2.3%）；疝气2人（0.67%）；经常性呕吐10人（3.3%）；肝肿大2人（0.67%）；颅底塌陷6人（2%）；便秘32人(10.7%)；痢疾2人(0.67%)。患者中出现最多是便秘症状，据临床医生反映，患者骨折后运动量减少，影响消化与吸收而造成便秘等症状。33 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）图7成骨不全患者并发症分布4.药物治疗史患者服用钙盐、维生素D及生长激素等药物后，骨折次数没有减少。成骨不全患者中123人采用过双膦酸盐药物治疗，其中有5人反应治疗效果不理想。2.4讨论我们严格按照起初设定的纳入排除执行研究工作，在临床医生确诊成骨不全后，专人询问情况并填写成骨不全患者临床信息调查表，可以较好的反应出在天津市武清区人民医院和山东省立医院就诊的患者的流行病学分布特点。由于成骨不全为罕见病，发病率极低，国内外还没有关于成骨不全的流行病学分析。从调查中我们得到了以下结论，成骨不全分布不存在地区差异，发病年龄主要集中在4-19岁之间，出生时男性体重低于正常儿童，女性无差异；身高男女均无差异。出生时所伴随的症状主要集中于头部骨骼，受骨折影响，初次独立行走年龄在1岁半之前的患者只占29%。成骨不全患者骨折部位主要集中在长骨，尤其是四肢骨；绝大多数患者4岁前发生首次骨折；骨折次数在10-20次之间的患者最多。成骨不全排在前三位的临床症状是蓝巩膜、术后瘢痕明显和牙本质发育不全，成骨不全最主要的并发症是便秘，主要原因是成骨不全患者由于骨折，运动量减少，消化吸收能力受到影响。大部分成骨不全患者是编码Ⅰ型胶原蛋白的基因COL1A1/COL1A2发生突变而引起常染色体显性遗传病，或是由调节Ⅰ型胶原转录或翻译的基因（SERPINF1、CRTAP、LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10等）发生突变而引起常染色体隐性遗传疾病[104]。34 济南大学硕士学位论文这些病变不仅限于骨骼系统，往往会累及其他结缔组织如眼睛、牙齿、耳朵、皮肤、关节、韧带等，其特点是蓝巩膜、牙本质发育不全、听力下降、皮肤异常和关节、韧带松弛等[70]。同时，越来越多的数据证明，双磷酸盐药物对携带常染色体隐性遗传基因的成骨不全患者，其治疗效果相比Ⅰ型胶原蛋白基因突变的患者要差，骨密度增加不明显。故对致病基因相关致病机制的研究，对于指导成骨不全患者临床用药以及潜在的药物开发都意义重大。部分非经典的常染色体隐性遗传致病基因突变并未引起前胶原α链的翻译后修饰、前胶原蛋白的分泌、加工等前胶原蛋白的合成代谢异常，越来越多样本的常染色体隐性遗传成骨不全患者的发现及非胶原致病基因突变的识别，与后续基因功能的研究，对于成骨不全的致病机制研究极为重要。随着对成骨不全的深入研究，越来越多成骨不全的基因型被发现。成骨不全的个体治疗随之被提出，对于不同患者，其发病机制会有所不同，可能是单基因突变或是细胞信号转导通路受阻，SNP也可能导致个体表型的异质性。随着第二代高通量测序的发展，对于成骨不全的基因检测变得更加方便和简单。对成骨不全患者孕妇进行产前筛查和出生后的婴儿基因检测，对于成骨不全的预防和早期治疗显得尤为重要[105]从短期治疗效果看，手术治疗见效快，对患者生存治疗明显，但仅能对长骨或脊柱骨折起到纠正，对听力、视力下降作用很小。目前，双磷酸盐药物被证明的治疗成骨不全药物，能够导致骨折率,减少患者疼痛和残疾儿童产生。通过多学科方法和二磷酸盐治疗的适当使用，成骨不全患儿及其家庭的生活质量得到明显改善。尽管磷酸盐的广泛使用在临床效果方面，但仍然存在着许多悬而未决的问题。关键领域需要进一步证明包括:治疗的长期影响，最优治疗方案效益最大化和最小化潜在的长期副作用，使用更新的二磷酸盐的准备，结果后停止治疗。这些问题只能通过持续系统评估的患者接受二磷酸盐治疗和能力获得这些人长期随访数据[105]。从长期疗效看，药物治疗对个体治疗效果明显，但不能治愈成骨不全。细胞治疗和基因治疗是治愈成骨不全的最理想的方案，但是由于技术、伦理方面限制，目前该方法还处于实验室研究阶段。本研究对成骨不全患者信息、临床症状及发症等做了系统性的调查，为成骨不全的基础医学研究和临床医学的治疗和诊断提供了数据参考。35 长链非编码RNA在成骨不全中的差异表达分析（Ⅰ）成骨不全患者流行病学分析（Ⅱ）参考文献[1]PontingCP,OliverPL,ReikW.EvolutionandfunctionsoflongnoncodingRNAs[J].Cell2009;136:629-641.[2]BrosnanCA,VoinnetO.ThelongandtheshortofnoncodingRNAs[J].CurrentOpinioninCellBiology2009;21:416-25.[3]BirneyE,StamatoyannopoulosJA,DuttaA,GuigóR,GingerasTR,MarguliesEH,WengZ,SnyderM,DermitzakisET,ThurmanRE.Identificationandanalysisoffunctionalelementsin1%ofthehumangenomebytheENCODEpilotproject[J].Nature2007;447:799-816.[4]NinaH,DamjanG.LongNon-CodingRNAinCancer[J].InternationalJournalofMolecularSciences2013;14:4655-4669.[5]LouroR,SmirnovaAS,Verjovski-AlmeidaS.LongintronicnoncodingRNAtranscription:expressionnoiseorexpressionchoice[J]?Genomics2009;93:291–298.[6]ClarkMB,JohnstonRL,InostrozapontaM,FoxAH,FortiniE,MoscatoP,DingerME,MattickJS.Genome-wideanalysisoflongnoncodingRNAstability[J].GenomeResearch2012;22:885-898.[7]CarninciP,KasukawaT,KatayamaS,GoughJ,FrithMC,MaedaN,OyamaR,RavasiT,LenhardB,WellsC.Thetranscriptionallandscapeofthemammaliangenome[J].Science2005;309:1559-1563.[8]ChodroffRA,GoodstadtL,SireyTM,OliverPL,DaviesKE,GreenED,MolnárZ,PontingCP.LongnoncodingRNAgenes:conservationofsequenceandbrainexpressionamongdiverseamniotes[J].GenomeBiology2010;11::R72.[9]ElM,HofPR,HenriT.DendriticBC200RNAinagingandinAlzheimer'sdisease[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2007;104:10679-10684.[10]IlievDI,KannenbergK,WeberK,BinderG.IGF-IsensitivityinSilver-RussellsyndromewithIGF2/H19hypomethylation[J].GrowthHormone&IgfResearchOfficialJournaloftheGrowthHormoneResearchSociety&theInternationalIgfResearchSociety2014;24:187-191.[11]TongX,GuPC,XuSZ,LinXJ.Longnon-codingRNA-DANCRinhumancirculatingmonocytes:apotentialbiomarkerassociatedwithpostmenopausalosteoporosis[J].BioscienceBiotechnology&Biochemistry2015;79:1-6.[12]WevrickR,FranckeU.AnimprintedmousetranscripthomologoustothehumanimprintedinPrader-Willisyndrome(IPW)gene[J].HumanMolecularGenetics1997;6:325-32.[13]YanS,ZhongminZ,KaigeP,ZhaojunD.TheParkinson'sdisease-relatedgenesactinmitochondrialhomeostasis[J].Neuroscience&BiobehavioralReviews2012;36:2034-2043.[14]MoraisVA,VerstrekenP,RoethigA,SmetJ,AnS,VanbrabantM,HaddadD,FrezzaC,MemakersW,Vogt-WeisenhornD.Parkinson'sdiseasemutationsinPINK1resultindecreasedComplexIactivityanddeficientsynapticfunction[J].EmboMolecularMedicine2009;1:99–111.[15]DerrienT,JohnsonR,BussottiG,TanzerA,DjebaliS,TilgnerH,GuernecG,MartinD,MerkelA,KnowlesDG.TheGENCODEv7catalogofhumanlongnoncodingRNAs:analysisoftheirgenestructure,evolution,andexpression[J].GenomeResearch2012;22:1775-1789.36 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济南大学硕士学位论文致谢转眼间，三年的研究生生活就要结束了，而刚入学的情景任历历在目。回忆起这三年时光，感慨不已。三年里我获益匪浅，遇到了很多良师益友，他们给我很多帮助和支持，使我能够顺利完成学业，在此向向他们表示最诚挚的谢意！首先，我要感谢我的导师鲁艳芹教授。学术上，她严谨科研态度、缜密的思维以及忘我的敬业精神深深的影响了我，给我树立了一个终身的榜样。生活中，不拘小节、关心学生，言传身教，使我学到了书本上没有东西，这同样是我获得的最宝贵的财富。本课题能够顺利完成，依赖于天津市武清区人民医院骨三科任秀智主任及山东省立医院小儿骨科王延宙主任为本研究提供了大量样本。两位医生医术高超、品德高尚、敬业奉献，他们对病人、学生的关心无微不至，对自己的工作严格要求，我被他们人格魅力深深的折服，在此特别感谢对两位医生对本课题给予的支持。衷心感谢韩金祥研究员在课题方面给予的指导和支持，韩老师学识渊博科研上永远富有远见卓识与创新精神，为人谦和，对学生认真负责，永远值得我们敬重，是我今后工作中的楷模。感谢山东省医药生物技术研究中心张士娥主任、朱有名主任、师彬主任、潘继红主任的全力支持和帮助！感谢催亚洲、王世立、张更林、周小艳、栾静、庞靖祥、王林、围屏、窦建华、马海燕、钟彩霞等各位老师给予的知道和帮助。感谢刘保岩、莫新凯、李虎、石贤龙、韩峰等师兄、师姐在课题方面的指导；感谢我的同窗韩振忠、张宇昂、李承芝、李海英、聂小燕、刘晓、李颖、赵瑜的热情帮助，三年里，情同兄弟姐妹，愿友谊长存；感谢左清利，张瑶，马翔，代运章，尹小丽等师弟、师妹的帮助。感谢为我提供生活、学习、实验条件的山东省医药生物技术研究中心的各位领导、老师，感谢你们的支持！衷心感谢百忙之中抽出时间参加我的毕业论文答辩并提出宝贵意见的各位专家！2016年5月45