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固中国淮山药病毒病调査、诊断和病原病毒分子生物学的研究邹承武．．Ｊ．．．．？－：廣；：Ａ學二〇一四年五月 分类号０９３９．４６密级ＵＤＣ博士学位论文中国淮山药病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究邹承武学科专业微生物学指导教师陈保善教授论文答辩日期２０－５－２９学位授予日期２０１４－６－２５１４答辩委员会主席樊晓晖教授论文评阅人双盲评审 广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大一学或其它单位的学位而使用过的材料。与我同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归，属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行、检索和传播，可以采用影印缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：□保密，在年解密后适用授权。□不保密。“”（请在以上相应方框内打Ｖ）法式论文作者签名：却日期：指导教师签名：日期：作者联系电话：电子邮箱： 中国淮山药病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究摘要＿淮山药病毒病是引起淮山药减产和品质下降的主要因素之。本研究通过调查中国的广西、江西、河南、山东和江苏共五省的主要淮山药产地的病毒病发生情况，发现不同地区不同品种的淮山药的病毒病发病率差异较大。＇南方的广西和江西主栽种为参薯（Ａｏｓｒｏｒｅａａ／ｆｌｔｏＬｉｎｎ．）和日本薯蔬７％？４０％之），病毒病的发病率在间；而北方的河南、山东和江苏等省份，主栽种为普通山药（ＤｚＶｗｃｏｒｅａｃ＾／ｔｏＴｈｕｎｂ．），ｉｐ／？５９病毒病的发病率在２％．３％之间。世界上已经报道的淮山药病毒分别属于马铃薯Ｙ病毒属（外批順）、杆状ＤＮＡ病毒属（５ａ办ａｖ／ｍｓ）、马铃薯Ｘ病毒属（Ｐｏｔｅｘｖ／ｍｓＯ和黄瓜花叶病毒属（Ｃｗｃｗｗｏｖ／ｍ？）的多种病毒。本研究使用小ＲＮＡ深度测序技术以及ＰＣＲ或ＲＴ－ＰＣＲ等技术对采自上述５个省区共３６５份的淮山药病毒病样本进行病原病毒鉴定，发现在中国侵染淮山药的病毒至少有２种ＤＮＡ病毒和７种ＲＮＡ病毒，其中有３种是本研究发现的新病毒，分别为马铃薯Ｘ病毒属（ＰｏｔｅｒＷｍｓＯ的淮山药Ｘ病毒（ＹＶＸ，暂命名）、香石竹潜隐病毒属（Ｃｆｌ／ａｒｖ／ｍｓＯ的淮山药潜隐病毒（ＹＬＶ，暂命名）和菜豆金色花叶病毒属（５ｅｇｏｍｏｖ／ｍｓ０的淮山药黄斑花叶病毒（ＹＹＳＭＶ，暂命名）。其它的６种病毒分别为：杆状ＤＮＡ病毒属的薯蓣杆状病毒（ＤＢＶ）、马铃薯Ｙ病毒属的淮山药温和花叶病毒（ＹＭＭＶ）和日本淮山药花叶病毒（ＪＹＭＶ）、枳檀花叶病毒属（Ｍａｃ／ｗｒａｖ／ｍｙ）的中国淮山药坏死花叶病毒（ＣＹＮＭＶ）和淮山药褪绿坏死花叶病毒－－（ＹＣＮＭＶ），以及蚕豆病毒属（Ｆａ—）的蚕豆萎蔫病毒２（ＢＢＷＶ２）。在参薯中检测出ＤＢＶ、ＹＶＸ、ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ、ＣＹＮＭＶ和ＹＣＮＭＶ在；Ｉ 日本薯蓣中检测出ＤＢＶ、ＹＹＳＭＶ、ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ；在普通山药中检测ＹＭＶ－出ＤＢＶ、ＹＹＳＭＶ、ＹＶＸ、ＹＭＭＶ、Ｊ、ＢＢＷＶ２、ＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ。、其中，在参薯中检出率较高的有ＤＢＶ（７１．１％）ＹＭＭＶ（４９．３％）和ＹＶＸ（１６．２％）（６６．７％）和ＪＹＭＶＣ１２．６％）；，在日本薯蓣中的检出率较高的有ＤＢＶ在普通山药中检出率较高的有ＪＹＭＶ（４３．４％）、ＹＬＶ（３１．６％）、ＤＢＶ（１９．９％）、－ＹＹＳＭＶ（ＹＭＭＶ（１７．６％）、ＢＢＷＶ２（１７．６％）和１２．５％）；其它病毒在上述三种淮山药中的检出率小于５％。病毒复合侵染现象普遍存在，在检测＿的３６５份样本中有１３８份样本为两种以上病毒复合侵染，其中在个水山药的病毒病样本中同时检出５种病毒。－Ｓｅ－ＰＣＲ技术应用ＲＮＡｑ深度测序技术结合ＲＡＣＥ和ＲＴ，成功克隆到－－－ＷＸ－侵染淮山药的ＹＭＭＶＮＣ１、ＪＹＭＶ１、ＹＶＸＷＸ１、ＣＹＮＭＶＦＸ１、ＢＢＷＶ－２－－ＹＹＳＭＶ－ＳＧ、ＹＬＶＳＧ１和ＦＸ１病毒分离物的基因组全长序列。ＹＶＸ－Ｐｏｔｅｘｖ其中ＷＸ１具有ｉｒｕｓ的基因组结构特征，与白三叶草花叶病毒ｒｖ一（膽／ｆｅｃ／ｏｖｅ／ｒｗｓ，ＷＣ１ＭＶ）日本分离物的核音酸序列致性最？—－ｒ高，５３．１％，／ＷｅｘＷｒｗｓ个新种ＳＧ１具有Ｃａ／ａｖ／ｍｓ但仅为是；ＹＬＶ的基因组结构特征？ｍｏｓａ／ｃｖ／ｎＨＭＶ）澳大利亚分离，与酒花花叶病毒（／／〇；ｐ一—．，６２９％，是Ｃａｒ／ａｖ／ｍｓ个新种物的核苷酸序列致性最高为；－ＦＸＹＹＳＭＶ１具有的基因组结构特征，与百香果严重畸叶病毒（Ｐａｓｓｉｏｎｆｒｕｉｔｓｅｖｅｒｅｌｅａｆｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｖｉｒｕｓ，ＰＳＬＤＶ）巴西分离物的核音酸序＿一。列致性最高，但仅为５４．２％，是个新种将本研究获得的２６个ＹＭＭＶ分离物与世界上其它淮山药种植区报道的１９个ＹＭＭＶ分离物的核苷酸序列进行系统进化分析，发现这４５个ＹＭＭＶ分离物共聚成５个组，呈现出与地理位置的密切相关性；来自中国南方和北方淮山药产区的２６个ＹＭＭＶ分离物分别聚在２个组，彼此进化关系较远，由此推测ＹＭＭＶ遗传变异可能是由于地理隔离导致ＹＭＭＶ不同群体的单独进化以及不同ＹＭＭＶ分离物对不同淮山药品种的宿主适应ＩＩ Ｃ－性差异所致。本研究发现ＹＭＭＶ分离物存在重组现象，其中ＰＩ、ＨＰｒｏ、Ｐ３、６Ｋ１和ＣＩ区域有重组热点。本研究通过表面抗原表位抗体库（ＳＥＡＬ）技术成功制备了ＪＹＭＶ的单克隆抗体，通过原核表达病毒外壳蛋白制备了ＹＭＭＶ、ＹＶＸ、ＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ的多克隆抗体。ＪＹＭＶ的单克隆抗体在检测某些淮山药样本时有微弱的非特异性反应，其它病毒的多克隆抗体的特异性较好，且效价均大于３１：２５６０００，这些抗体对稀释１０倍的病叶汁液仍表现出很强的免疫反应。基－－于所制备的病毒抗体，建立了相应的病毒ＥＬＩＳＡ检测方法和ＩＣＲＴＰＣＲ检Ｃ－ＲＴ－ＰＣＲ方法的ＥＬＩＳＡ方法的１０００倍以上。本测方法，其中Ｉ灵敏度是研究还建立了可同时检测ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ、ＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ的多重ＰＣＲ检测技术。综上所述，本研究查明了中国五个省区的主要淮山药产地的病毒病发生情况并鉴定了淮山药的病原病毒，建立了灵敏可靠的检测方法，为将来淮山药生产的病毒病防控提供了重要保障。关键词：淮山药病毒病；病原鉴定；病毒分子特征分析；深度测序；抗体制备ＩＩＩ ＤＩＳＥＡＳＥＳＵＲＶＥＹ，ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ，ＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮＯＦＶＩＲＵＳＥＳＩＮＦＥＣＴＩＮＧＹＡＭＩＮＣＨＩＮＡＡＢＳＴＲＡＣＴＶｉｒａｌｄｉｓｅａｓｅｓａｒｅｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｓｌｉｍｉｔｉｎｔｈｅｒｏｄｕｃｔｉｏｎｇｐｏｆａｍｉｎＣｈｉｎａｂｃａｕｓｉｎｈｅａｖｌｏｓｓｉｎｉｅｌｄａｎｄｄｅｃｌｉｎｅｉｎｕａｌｉｔ．Ａｙｙｇｙｙｑｙｅｅ－ｅａｒｓｕｒｖｅｃｏｎｄｕｃｅｄｔｈｒｔｉｎｔｈｅｍａｏｒａｍｒｏｗｉｎｒｏｖｉｎｃｅｓｏｆＧｕａｎｘｉｙｙｊｙｇｇｐｇ，ＪｉａｎｘｉＨｅｎａｎＳｈａｎｄｏｎｇａｎｄＪｉａｎｓｕｒｏｖｉｎｃｅｓｉｎＣｈｉｎａｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｖｉｒａｌｇ，，ｇｐｉｓｅａｓｅｓｗｅｒｅ－ｄｗｉｄｅｌｙｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄａｎｄａｎｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆ７％４０％ｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｏｎｄｖａｒｉｅｔｉｅｓｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏＤ．ａｌａｔａａｎｄＤ．ａｏｎｉｃａｉｎＧｕａｎｇｘｉａｎｄＪｉａｎｇｘｉｏｆｔｈｅｊｐｈｅＣｈ－ｓｏｕｔｒｎｉｎａａｎｄ２％５９．３％ｏｎｖａｒｉｅｔｉｅｓｂｅｌｏｎｉｎｔｏＤ．ｏｏｓｉｔａｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ，ｇｇｐｐｉｎＨｅｎａｎＳｈａｎｄｏｎａｎｄＪｉａｎｓｕｉｎｔｈｅＮｏｒｔｈｏｆＣｈｉｎａ．，ｇｇＶｉｒｕｓｅｓｏｆＰｏｔｙｖｉｒｕｓ，Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ，ＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓａｎｄＣｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓｇｅｎｅｒａｈａｖｅｂｅｅｎｆｅｃｌ－ｒｅｏｒｔｅｄｔｏｉｎｔａｍｗｏｒｄｗｉｄｅ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｔｈｅｃａｕｓａｔｉｖｅｖｉｒａｌｐｙｙ，－－ａｅｎｔｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｓｍａｌｌＲＮＡｄｅｅｐｓｅｕｅｎｃｉｎｇａｎｄＰＣＲ／ＲＴＰＣＲｏｆｇｙｑ３６５ｌｅａｆｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅ５ｒｏｖｉｎｃｅｓｍｅｎｔｉｏｎｅｄａｂｏｖｅ．ＤｉｏｓｃｏｒｅａｐｂａｃｉｌｌｉｆｒｏｍｖｉｒｕｓＤＢＶｏｆｅｎｕｓＢａｄｎａｖｉｒｕｓＹａｍｍｉｌｄｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＹＭＭＶ（）ｇ，（）ａｎｄＪａａｎｅｓｅａｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＪＹＭＶｏｆｅｎｕｓＰｏｔｖｉｒｕｓＹａｍｖｉｒｕｓＸＹＶＸｐｙ（）ｇｙ，（）ｏｆｅｎｕｓＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓＹａｍｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓＹＬＶｏｆｅｎｕｓＣａｌａｒｖｉｒｕｓＣｈｉｎｅｓｅａｍ，），ｇ（ｇｙｎｅｃｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＣＹＮＭＶａｎｄＹａｍｃｈｌｏｒｏｔｉｃｎｅｃｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（）ｏｆｅｎｕｓ－ＹＣＮＭＶＭａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓＢｒｏａｄｂｅａｎｗｉｌｔｖｉｒｕｓ２ＢＢＷＶ２ｏｆｅｎｕｓ（）ｇ，（）ｇＦａｂａｖｉｒｕｓ，ａｎｄＹａｍｅｌｌｏｗｓｏｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＹＹＳＭＶｏｆｅｎｕｓＢｅｏｍｏｖｉｒｕｓｙｐ（）ｇｇｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＤＢＶ，ＹＶＸ，ＹＭＭＶ，ＪＹＭＶ，ＣＹＮＭＶａｎｄＹＣＮＭＶｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎＤｌｔＹＹＳＭＶ．．ａａａＤＢＶＹＭＭＶａｎｄＪＹＭＶｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎＤ；，，－ａｏｎａｎｄＹＶＸＹＭＭＶ－ｉｃａＤＢＶＹＹＳＭＶＪＹＭＶＢＢＷＶ２ＣＹＮＭＶａｎｄｊｐ，，，，，，，ＩＶ 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目录ｍｓｉＡＢＳＴＲＡＣＴＩＶ一第章前言１１．１淮山药研究概述１１．１．１淮山药的主要品种和形态学特征１１１．．２淮山药的起源２１．１．３淮山药的生产和栽培２１．１４淮山药的用途３．１．２淮山药病毒性病害及其研究进展４１．２．１马铃薯Ｙ病毒科病毒４１．２．２花椰菜花叶病毒科杆状ＤＮＡ病毒属病毒１２１．２．３雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属病毒１３１．２．４未分类的淮山药病毒１４１．３病毒检测技术１７１３１．．生物学检测技术１７１．３．２电镜检测技术１７１．３．３免疫检测技术１８１．３．４基于核酸的检测技术１８１．３．５双链ＲＮＡ分析技术１９１．３．６深度测序技术２０１．４本研究目的及意义２１第二章中国淮山药病毒病调査及病原病毒鉴定２２２＿１引言２２２．２材料与方法２３２．２．１田间调查２３２．２．２病毒样本的采集２４２．２．３生化及分子生物学试剂２４ｖｎ ２．２．４病毒检测弓２４丨物２２６．２＿５淮山药总ＤＮＡ的提取２．２．６淮山药总ＲＮＡ的提取２６２．２．７ｃＤＮＡ的合成２７２８２７．２．常规ＰＣＲ反应体系与条件２．２．９ＰＣＲ产物电泳检测２７２．２．１０克隆和测序２８２．２．１１系统进化树分析２８２．２．１２小ＲＮＡ的深度测序２８２．２．１３ＧＡＩＩｘ上机３０２．２．１４深度测序的生物信息学分析３１２．２．１５淮山药病毒粒子的提取和形态观察３１２３２．２．１６淮山药的细胞病理观察２３３２．结果２．３．１淮山药病毒病田间症状３２２．３．２淮山药田间发病率３３２３６．３．３小ＲＮＡ深度测序鉴定淮山药病原病毒２－．３．４ＰＣＲ或ＲＴＰＣＲ检测淮山药病原病毒３７２３９．３．５ＹＹＳＭＶ的传播介体２．３．６ＹＹＳＭＶ的部分田间寄主４０－２４２．３．７侵染淮山药的ＹＬＶ和ＢＢＷＶ２病毒粒子的形态特征２．３．８受病毒侵染的铁棍山药叶片的细胞病理变化４３２．３．９受ＹＭＭＶ侵染的桂淮５号叶片的细胞病理变化４６２．３．１０受ＹＶＸ和ＹＭＭＶ复合侵染的紫山药叶片的细胞病理变化４７２４８＿４讨论第三章中国淮山药病原病毒的分子生物学特性分析５０３．１引言５０３２５１．材料与方法３．２．１毒源５１３．２．２生化及分子生物学试剂５６ｖｍ ３．２．３引物５６３．２．４核酸提取方法５９３－．２．５ＲＮＡＳｅｑ深度测序５９３．２．６逆转录反应６１３．２．７快速扩增ｃＤＮＡ末端６２３．２．８ＰＣＲ反应扩増基因组全长６４３．２＿９克隆及测序方法６４３ｆ．２．１０ＭｉＭｆ６４３．３结果６５３－ｅ．３．１ＲＮＡＳｑ深度测序６５３．３．２ＹＭＭＶ南昌分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析．．．．．．．６９３．３．３ＪＹＭＶ温县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析．．．．．．．．．７８３．３．４ＣＹＮＭＶ丰县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析．．．．．７９３ＢＢＷＶ－１．３．５２寿光分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析．．．．．８３．３ＶＸ温县分离物的基因组全．５Ｙ序列测定及其分子生物学特征分析８３３．３．６ＹＬＶ寿光分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析８９３．３．７侵染淮山药的ＤＢＶ的遗传多样性分析９３３．３．８ＹＹＳＭＶ丰县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析．．．．．９６３．４９９０第四章五种淮山药病毒抗体的制备及病毒检测方法的建立１１４．１引言１０１４．２材料与方法１０１４．２＿１毒源１０１４．２＿２常用试剂及试剂盒１０２４２３弓１０．．丨物２４．２．４病毒ＣＰ蛋白基因的扩增与测序１０４４．２．５原核表达载体的构建１０４４．２．６蛋白的诱导表达及表达条件优化１０４４．２．７表达产物的可溶性分析１０５４８．２．重组蛋白的纯化１０５ＩＸ ４．２．９多克隆抗体的制备１０５４２１０１０６．．单克隆抗体的制备４．２．１１抗体效价及特异性检测１０８－４．２．１２间接抗原包被免疫吸附测定（ＡＣＰＥＬＩＳＡ）方法检测病毒１０８４１．２．１３蛋白质免疫印记（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）方法检测病毒０９４．２．１４免疫捕获反转录聚合酶链式反应１０９４．３＾１１０４．３．１病毒蛋白基因的克隆１１０４．３．２重组蛋白的原核表达及纯化１１１４．３．３抗体效价测定１１３４－．３．４ＡＣＰＥＬＩＳＡ对淮山药病毒病样本的检出能力１１４－４－．３．５ＩＣＲＴＰＣＲ检狈！山药病毒１１５Ｉ淮４．３．６其它淮山药病毒抗体的制备１１６４．３．７Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证淮山药病毒抗体特异性１１８－－４３８ＰＣＲ或ＩＣＲＴ－ＰＣＲ检１２．．五种淮山药病毒的ＩＣ测方法的建立０４－．３．９多重ＲＴＰＣＲ检测淮山药病毒１２２４．４讨论１２３第五章总结与展望１２６５．１全文总结１２６丨５．２本研究的仓Ｊ新点１２８５．３工作展望１２９参考文献１３１Ｉｔ£１４７附录１本论文所用术语缩写及全称对应表１４７附录２本论文所用病毒缩写及全称对应表１４９附录３本论文所用物种拉丁名与中文学名对应表１５２附录５用于制备抗体的病毒外壳蛋白氨基酸序列１５５１致谢５７攻读学位期间发表的学术论文１５８Ｘ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查诊断和病康病毒分子生物学的研究、第一章前言淮山药ＣＤｆｏｓｃｏｒｅａｓｐｐ．），原名山药，又名薯蕷、山薯、大薯、延草、诸薯、薯药等，一。我国北方地区常称之为山药或怀山药，南方地区尤其是广西和广东等地般称之为淮山我国农业部和财政部批准设立的国家公益性行业（农业）科研淮山药专项中，将北方的山药和“”１［］南方的淮山等可食用及栽培利用的薯蓣属植物都统称为淮山药。病毒性病害是世界上一。所有淮山药种植区的主要限制因素之，在淮山药生产上造成重大损失因此，研究中国淮山药病毒病的发生流行情况，并对病原病毒鉴定，具有重要的理论意义和现实意义。１．１淮山药研究概述＇一淮山药为百合目（Ｌｉｌｉａｌｅｓ）曹蓣科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）薯蓣属（Ａａｓｃｏｍｉ）的年或多年生蔓性根茎类作物，在植物学分类上属于单子叶被子植物，但具有双子叶植物特性，以肉质根状块茎和零余子为主要利用产品。淮山药的块茎富含蛋白质、淀粉、多糖、矿物质及其它营养物质，依据种和品种的不同，可作药用或食用，具有良好市场前景和产业开发潜势。１．１．１淮山药的主要品种和形态学特征一淮山药种类众多，它们被认为是最原始的被子植物之。我国淮山药资源丰富，品种众ｌ［ｊ多，在分类学上主要有以下几个种：普通山药（Ｄ／ｃｗｃｏｒｅａｃ＾ｏ＾ｔｏＴｈｕｎｂ．）、日本薯葡Ｔｈｕｎｂ．）、参薯（ＺＷｔｗｃｏｒｅｆｌａ／ａｔｏＬｉｎｎ．）、甜薯（Ｚ＾ｏｓｃｏｒｅａＬｏｕｒ．）和褐袍薯截。淮山药块莲中主要包含淀粉，不同的一２淮山药种类的块茎大小差异很大．５ｍ．ｋ。，小的与土豆般大，大的长度超过，重达７５ｇ２［］不同种类的淮山药的块茎形状各异，有球状、圆柱状、椭圆和扁平等。不同种类淮山、、药块茎的肉质颜色也各不相同，有灰白黄色紫色和粉红，其块茎表皮颜色从灰白到暗褐色都有。某些种类的淮山药能产生零余子，例如黄独汾ｒａＬ．，ａｅｒｉａｌ一ｙａｍ）。大多数淮山药种类的块茎是年生，部分淮山药种类的块茎是逐年增大并木质３化形成地下茎［］。淮山药的藤状枝蔓通常围绕附近的植株或支架按照顺时针或逆时针方向攀爬，其缠一？绕方式因种类而异。叶为对生，心形、卵圆形至椭圆形，般长３６英寸，从叶基开始１ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病谓查、诊断和病康病毒分子生物学的研究￣？４ｎｕｎ有７９条叶脉。淮山药是雌雄异体，开花不显著，花朵的直径为２，花的颜色有白色、乳白色。雎雄花均为穗状花序，雌花较少，、浅绿色或褐色，通过虫媒或风媒传粉雄花较多。必须同时种植雄株和雌株才能获得淮山药种子，但是很难保证它们同时开花。￣ｃｍ。淮山药零余子为干胶囊状的，长１２１１２．．淮山药的起源淮山药被认为是在公元第二世纪，由居住在马达加斯加岛的马来西亚人携带其从亚。洲横跨大草原，带到非洲的西部接着，西非种植的淮山药又在十五世纪五十年代后期，经大西洋带入到加勒比海地区。有研究证据显示不同种类的淮山药起源于热带的三个独立的地区：亚洲、西非和热带美洲。参薯和甜薯起源于亚洲后被引入西非。白薯蓣（ＺＷｆｗｃｏｒｅａｒｏｍｎｒｆａｔｅＰｏｉｒ．）、几内亚薯蕷（Ｄｆｃｗｃｏｒｅａ肌Ｌａｍ．）和灌丛薯蓣（ＺＷｃｗｃｏｒｅａＰａｘ．）起源于西非，而在西非家庭栽培的三裂叶薯蕷（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ７＾１的起源于热带美洲。在已知的６００多种薯蓣属植物当中，只有１０多种作为食用４８，［】、、、薯被栽培。其中最普遍用于食用的是白薯费、参薯几内亚薯蓣灌丛薯蓣黄独和７［］此甜薯等，在热带地区种植的淮山药有９０％以上是这些品种。相比之下，白薯莨（Ｚ）ｃｏｍ！Ａ冲此Ｄｅｎｎｓｔ．）、薯蓣、日本薯蓣和三裂叶蓄蕷则较不常见。１１．３．淮山药的生产和栽培，其产量仅次于马铃薯（２０１２年．）、淮山药是世界上第四大重要的的块茎作物，３６亿吨９［］１２０１２年，２．６亿吨）和甘薯（２０１２年１），２０２年世界总产量达到５８７５万吨。木薯（，亿吨世界范围内有超过５００万公顷的土地用于淮山药生产，淮山药块莲是在非洲和亚洲的部分地区。、美洲的中部和南部以及大洋洲地区食用碳水化合物的主要来源我国淮山药已有２５００年以上的栽培历史，是普遍受欢迎的药食兼用作物，广泛分布于浙江、江苏、甘肃、山东、广西和河南等地。随着对淮山药的营养价值和药用价值的认识加深，以及科技进步和市场拉动，近年来，我国各地淮山药生产发展势头良好。历史上形一成的淮山药主产区种植面积稳定发展，些新的区域也在不断引进试种和扩大种植，目前南至海南省，北至黑龙江，西至新疆，都有淮山药种植，２０１３年淮山药种植面积近７００万亩１０００万吨。、、山东、江苏和广西，是我国淮山药主要产区。，年产量超过河南河北一１口基地［］。这五个省区常年种植面积都在２万公顷以上，目前已经形成定规模的出２ 广西大单博士学位论文中国淮山苗病毒病调查诊断和病康病毒分子生物举的研究、一：食用淮山药是年生作物，有两个生长周期在热带雨季，藤蔓延长营养生长和开花；在干燥的季节，茎上部分停止生长，营养素在淮山药进入休眠状态之前转移到块茎１（）［］－。。淮山药生长需要肥沃并且排水良好的土壤，土壤的ｐＨ值在６７之间最佳在茎上部７１，１］［５？６分生长阶段的个月内需要最低１０００毫米的降雨或等量的灌溉用水。准备种植淮山？３药的土地首先要清除植被。清理后，从１２月初到次年三月中旬准备土墩。土墩长０．６ｍ，￣１，宽０．９．３ｍ。这些操作必须在雨季来临之前完成。农民通常切取淮山药的块茎进行播种？切取的块茎通常至少包含２３个芽。块茎表面在播种前可以晾干，也可以用杀菌剂处理。一一播种时通常是在准备好的土墩上打一三分之到入切个大约为土墩高度半深的洞，放一。取的块茎，填满泥土即可种植的块茎经过段休眠时间才会发芽，长出光秃秃的藤蔓，°到雨季来临时才会长出叶片。收获后，淮山药块茎在平均环境温度为２５Ｃ的仓库中可以４－６个月贮存。１．１．４淮山药的用途？％？、蛋白、淮山药块茎的主要成分为：碳水化合物约７５．６８３．３质３７．４％纤维＇１２１４一［］？￣－０１．５．５％、灰分０．７２．０％和脂肪０．０５０．０２％。淮山药也富含些重要维生素，１４［］尤其是维生素Ｃ在块茎含量约－２４１３．７ｍｇ／１００ｇ。块茎还包含丰富的矿物质和膳食纤１４１５维［，］、维生素Ｂ６、钾、锰、低饱和脂肪、钠和胆固醇，有利于维持人体内的钠钾平衡１５［］和防止骨质疏松症及心脏疾病。另据报道，淮山药的碳水化合物被缓慢分解后，逐步释放葡萄糖进入血液，这也意味着淮山药可提供更持久的能量形式，并对于防治肥胖和１６［］糖尿病给予更好的保护。淮山药在许多国家是非常重要的食物，特别是西非、东南亚、太平洋和加勒比群岛１７［］和巴西的部分地区。块茎的皮是传统的动物饲料的来源。某些淮山药还可药用，如野生Ｄｆｏｓｃｏｒｅａｖ／／／ａｗ含有可的松的前体留体皂甙和苷元，可用于治疗更年期疾病、关节１８［］炎和月经紊乱。有些品种还可提取雌性激素的前体薯蓣皂甙元，以及用于制造避孕药４１９一一［’］ｉ和性激素。还有些品种，如长薯葡（■Ｄｆ＜ｗｃｏｍｉ６ａｔｏｔｏＤｅｅｎｅ．），作为种装饰植１８２（）［，］物具有很高的观赏价值。３ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究１．２淮山药病毒性病害及其研究进展病毒性病害可导致淮山药减产和种质退化，对淮山药的生产和种质交流造成重大威胁。病毒侵染淮山药可引起的症状包括叶片花叶、绿色脉带、褪绿斑驳、脉间褪绿、萎２１２２’［］缩和畸形等。以叶子受影响最大，导致光合作用的能力受破坏，最终影响块茎产量和质量一一，甚至造成植物死亡。在生产上，淮山药般采用营养繁殖方式进行种植，病毒旦感染淮山药便会通过种薯代代相传，造成淮山药产量和品质下降以及种质退化。特别是近年来随着淮山药种植面积的不断扩大，种质交流日益频繁，防控淮山药病毒病的重要性逐渐凸显。１９３６１９年，首次在塞拉利昂和波多黎各发现淮山药病毒病，１９５７年和６１年报道了淮、山药病毒的侵染过程，之后在尼日利亚科特迪瓦和多哥报道了白薯蓣出现中度到严重的花叶症状。至今，侵染淮山药各种品种的病毒在所有淮山药种植的热带地区都有报道。侵染淮山药的病毒主要是马铃薯Ｙ病毒属、杆状病毒属、马铃＿Ｘ病毒属（Ｐｏｔｅｘｖ－薯ｚｍｓ）和黄瓜花叶病毒属（ＣｗｃＭｗｏｖ／ｍｓ）（见表１１）。目前国际上鉴定并报道了１０多种淮山药病原病毒。１．２．１马铃薯Ｙ病毒科病毒马铃薯Ｙ病毒科包括马铃薯Ｙ病毒属、黑麦草花叶病毒属＿（办ｍｏｖｉｍｓ）、大麦黄花叶病毒属（办ｍｏＷｍｓ）、甘薯病毒属（夺ｏ／ｎｏｖ／ｍｓ）、枳澄病＇毒属（Ｍａｃ／ｗｒａＷｍｓ）和小麦花叶病毒属（７Ｗｆｔｗｏｖ／ｍｓ）该科的大多数病毒依靠厨虫以非持久性的方式进行传播－，某些病毒是通过真菌、螨虫或粉虱进行传播（表１２）。４ 钭Ｚ穿－ｓＡＡ．Ａ＇Ｉ＃ＡＭＪＡ弇ＩＡＡ糾ｆｌｒｇａＡａａａｍｊ＞＞ｖ＞碌ｖＨ教ａａｃ聢忘ｒａ４＞＊ＡＡＡＡ超＃ＪＡＭｓｉ—ｉａｓ胺候Ａａａｕａａｕ卷运－隹ｓ＂ｐＶＶＶＶＮ砌＾ＮＮＺｖ－￥－ＨｆｌＳＥｓｓｓＳＳ§ｆＳ１Ｓｅ？ｓ＋＋＋ｐ＋按彐（Ｄ．ｑ蝌｝画，０ｏｆ、０ｆｒ－０ｇＫ（ｎｌｉ１ＩｉｏｏｓＩ￣－￣＜０ｏ－ｏｘＥ＞０ｏｏＳ００ｓＥ６６ｓａＧ（ＶＮａ，ｓ「￡、ｐｓＧ）￥０．目ｓＶ０ＪＥｕｌ６ｓＮ—１ｕｉｓｉｓ０ｉ０ｉｏｃ英ａｉ￣８９ｅｉ雜９ｕ９ｌ您ｌ遯＾桐＾ｓ１ｓ＾ｓｗＫ＾（Ｖ＾Ｎｏ￥ｉｉｓｓ．ｉｓ－ｅＡ＋＾＾Ｍｕ．ｌ＾ｆｃ§ｌｉｓ＿＾ｐ．ａＶ？ＪｖＪＮＳＵｒＩｚＪＨＳ薦賓ａｓ－Ｓ／ｓｕ３！ｌＳｌｐｕ＃雜．２Ｉｔ＋ＪＢｌ）ＳＪ银．２ＪＥＭ＞ｓｉｖＶ５３ｍＡ０左ＮｚＪ＇ｑ＾Ｗｌ；？０§浮（Ｊ３ＪＳＳｙＯｔ：ｓ穹￡ｓ７ｃｏｆＪＳ＋ｐＭＣｒ■舾ｒｓｉＪＫｐ「ｏｉ－＾ｖｏ备ＵｎｓＳＪｚ拉ＯＥＤｉＪｌ＾ｓＥ孙ｐ＃審ｓｓ＋ｕ＾＋ｕ１ｔ＾ｏＩｓｆ社Ａｆ！Ｊｌ？ｃＩａ孙Ａ０（ｕｆ＇＾Ａ，—ＥＩａｖ？＿Ｏｌ－ｆ＾Ｕｑｔｅｑ＾３ｑ＾－＾ｏｖ，／ｌ漆＾ｓ雲ｌ－一ｊ 广西大学博士学位论文中国淮山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究１２１１Ｙ．．．马铃薯病毒属病毒■一ｖ■Ｐｏ＾／ｍｓ是植物病毒中最大的个属，共有９１个种和８８个暂定种。该属的大部分病一毒可以通过财虫以非持久的方式进行传播，也可通过机械摩擦接种传播，些病毒还可以通Ｐ’过种子传播。感染ｏＫｗｍｓ的植物细胞中通常出现风轮状的内含体，但是不同病毒的内含体ｔ＾？差异较大。作树ｍｙ的病毒粒子为线状，无包膜，长度在６８０９００ｎｍ之间，直径约２５２６’］［］［？１１－为１５ｎｍ。其基因组为正义的单链ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ），长约１０ｋｂ，５末端共价’一一－－结合个病毒基因组连接蛋白（ｖａｌｅｎｏｍｅｌｉｎｋｅｄｒｏｔｅｉｎ，ＶＰ）３ｉｒｇｐｇ，末端包含条２７１一［多聚腺苷酸尾（ｐｏｌｙ（Ａ））。基因组有个大的开放阅读框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）２８一［］，可先翻译成个大的多聚蛋白（ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ），然后再通过自身编码的蛋白酶将０—－－该多聚蛋白加工成１个病毒蛋０，从Ｎ端Ｃ端依次产生（见１１及表１２）图：第一－ＨＣ－蛋白（ｆｉｒｓｔｒｏｔｅｉｎ，Ｐ１），辅助蛋白酶（ｈｅｌｅｒｃｏｍｏｎｅｎｔｒｏｔｅｉｎａｓｅ，Ｐｒｏ），ｐｐｐｐｈ一ｔｉ３ＫＫ１ｉｌ第三蛋白（ｔｉｒｄｒｏｅｎ，Ｐ），第个６蛋白（６），圆柱状内含体蛋白（ｃｙｌｉｎｄｒｃａｐｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＩ），第二个６Ｋ蛋白（６Ｋ２），病毒基因组连接蛋白（ＶＰｇ），核内含体蛋‘’ａ（Ｎｕｃ－ＮＩａ－白蛋白酶ｌｅａｒＩｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄａｒｏｔｅｉｎｒｏｔｅｉｎａｓｅＰｒｏ），核内含体蛋白ｙｐｐ，ｂ‘’２８Ｎｕ［］（ｃｌｅａｒＩｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｂｐｒｏｔｅｉｎＮｉｂ）和外壳ｃｏａｔｒｏｔｅｉｎ，ＣＰ）。ｙ，蛋白（ｐＰ－ＩＰＯ６Ｋ１６Ｋ２ＮｌａＰｒｏ＿＿１．．．Ｉｒ，，，ＶＰＰ－５ｇ１ＨＣＰｒｏＰ３ＣｌＶＰｇＮｉｂＣＰＡｎ３Ｈ｜卜｜图－１１马铃薯Ｙ病毒属病毒的基因组结构Ｆｉｕｒｅ１－１ＯｒａｎｉｚａｔｉｏｎｆＰｏｔｖｉｒｕｓｅｎｏｍｅｇｇｏｙｇ具有中等的免疫原性，有报道，该属内得许多病毒之间存在着血清学关系一２４］［称种单克隆抗体能与绝大多数该属的蚜传病毒发生免疫反应。６ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病镧查、诊断和病屎病毒分子生物学的研究＊％表－７＞１１２／０如？编码的蛋白的主要功能ｂ－Ｔａｌｅ１２ＦｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｒｏｔｅｉｎｓｅｎｃｏｄｅｄｂＰｏｔｖｉｒｕｓｐｙｙ病毒蛋白病毒蛋白的氨基酸序列特征病毒蛋白的功能Ｐ－ｋ１（３２６２Ｄａ）有典型的丝氨酸蛋白酶特征，序列特异基因沉默的辅助因子蛋白酶；有，进行多聚蛋白加工与胰蛋白酶相似活性；影响病毒基因组复制和宿主症状ＨＣ－Ｐ－－ｒｏ（５６５８ｋＤａ）Ｃ末端自动裂解，与木瓜蛋白病毒基因组增殖；系统移动；自身互作；酶的半胱氨酸蛋白酶类似细胞间及长距离运输；抑制基因沉默；协生和症状表达；种传；姆虫传毒Ｐ３（３７ｋＤａ）与豇豆花叶病毒的３２Ｋ蛋白Ｒｓｖｌ介导的致死性系统过敏反应激发子；相似影响病毒基因组复制和多聚蛋白加工６Ｋ１（６ｋＤａ）氨基酸序列有疏水区域与膜结合，参与复制；在ＰＳｂＭＶ中决定无毒性ＣＩ（７０ｋＤａ核苷酸结合基序，与解旋酶复制ＲＭＡ解旋酶）有（）；细胞间运动；症状产相似生６Ｋ２（５．５ｋＤａ）氨基酸序列有疏水区域有膜结合功能，参与病毒基因组的复制；参与病毒的系统移动ＶＰｇ（ＮＩａ４９ｋＤａ）病毒基因组连接蛋白，可连接与真核翻译起始因子ｅＩＦｉｓｏ４Ｅ和ｅＩＦ４Ｅ（）’到病毒基因组的５端互作；影响病毒基因组扩增；参与细胞间移动和长距离移动：－ｒＮＩａＰｏ（２７．７ｋＤａ）有典型的丝氨酸蛋白酶的氨介导抗性的激发子；具有蛋白酶活，以顺式及反式方式起作用基酸和核定位信号性；结合ＲＮＡ；有ＤＮａｓｅ活性Ｎｉｂ（５８ｋＤａ）有ＲｄＲ基序和核定位信号有依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶活性，参与ｐ病毒基因组的复制ＣＰ－（２８４０ｋＤａ）有ＤＡＧ基序基因组扩增；ＲＮＡ衣壳化；蚜虫传播；细胞间及长距离运输７ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究２Ｗ１目前影响范围最广［］、研究最为深入的侵染淮山药的病毒是。主要包括淮山『％药花叶病毒气淮山药温和花叶病毒ＹＭＭＶ）、日本淮山药花３４［］ＹＭＶ）－ｖ，Ｄ／叶病毒／ｎ？Ｊ、薯蕷绿带花叶病毒（ｃｗｃｏｒｅａｇｒｅｅｎｆｔａｎＪ／ｎｇ．．．－ｍ（Ｍｆｌｚｃｖ／ｍｓ，ＤＧＢＭＶ）、尼曰利亚淮山药花叶病毒（Ａ＾ｅｒｆａ？ｗｎｍｏａ？ｃＷｍｙ，ＹＶＮ）、薯ｊ３５］［－Ｄ／ｃｗ截绿带病毒（■Ｄ／ｃｗｃｏｍｚｒｅｅ？Ｚ＞、三裂叶Ｓｒｇ＞ａｎ＜ｉｉ７ｇＷｍｙ，ＤＧＢＶ）薯葡病毒（ｃｏｒｅａ＾ａ＿ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ，ＤＴＶ）参署环斑病毒（Ｚ）ｚｃｗｃｏｒｅａａ／ａｔｏｒ／？ｇ／ｗｏｆｔ／ｅＷｍｓ，ＤＡＲＭＶ）和灌丛薯葡＇２９［］ｔｏ－病毒（■Ｄｚｃｗｃｏｒｅａｔ／ｗ／ｎｅｒｕｍ／ｗ＾ｖ／ｍｓ，ＤＤＶ）（表１３）。ＹＭＶ是研究最为清楚的侵染淮山药的病毒，自１９７９年在科特迪瓦被首次报道侵染黄独，３２３７３８３９’］［’］随后发现该病毒广泛侵染非洲的白薯蓣。ＹＭＶ也侵染其它淮山药种类。ＹＭＶ的接种一４０［］条件。，，、宿主范围和些病毒特性也已经研究得较为清楚该病毒核酸是ｓｓＲＮＡ长９６０８ｂｐ包含１个ＯＲＦ，编码１个包含３１０３个氨基酸（ａｍｉｎｏａｃＨａａ）的多聚蛋白，分子量为３５０９１５Ｄａ。ＹＭＶ的寄主范围比较窄，仅包括若干种薯葡和烟草中的本氏烟草（Ｍｃｏｒｔａｎａ６ｅ／ｉ決ａｍ／ａ／ｉａ）和３２’４１ｃｏｔｏｎａ］麦格隆息丰烟（Ｍｗｅｇａ／ａｓ７＞Ａｏ？）。该病毒可以通过机械摩擦、樹虫及无性繁殖传播。可观察到感染ＹＭＶ的淮山药表现明显症状。根据该病毒与单克隆抗体的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果３７显示［］ＹＭＶ的科特迪瓦，ＹＭＶ分离物被分为两个血清组和四个亚组。分离物的完整核苷酸序４２［］，尸卿Ｗｍｓ的序，ＹＭＶ存在Ｐｏ列己经公布和其它列相比？ｙＷｎ？的共有基序特征，即ＹＭＶ４２４３３９’’凡＿［］［／腳ＹＭＶ分离物之间的遗传变是。有报道将异性很高归因于重组事件和变异累积４４一］。ＹＭＶ分离物的遗传变异研究表明，个ＹＭＶ分离物的ＤＡＧ盒的突变导致其失去了传播能４５一［］力，有力地证明了这病毒分离物只含封慰１无性繁殖传播。ＹＭＭＶ可导致淮山药叶片出现轻度花叶和斑驳症状。该病毒最初被Ｏｄｕ等人命名为淮山药４６［］病毒１（少ａｍＷｍｙｌ，ＹＶ１），随后又被命名为参薯病毒￡＞ｈｃｏｍｚａｔｏｆｌｏｆ＞ｗ，ＤＡＶ）（ｐ（ｖｖ４７［］一４８］ＭｕｍＳｅａ■［。ｆｏｒｄ和ｌ首次提供分子生物学证据证明ＹＭＭＶ是Ｐ〇ｉ＾ｖ／ｍｓ的个新种，它的３３］ＣＰ蛋ｄ的核酸序列显不它与ＹＭＶ和ＪＹＭＶ存在显著差异ｃｒａｃｃ／ｖｏｒａ。该病毒通过丑姆（冲Ｍｓ４９２９４４８３３ｆ］［’［］Ｋｏ［］ｃｈ．）＇亚汧传播。在非洲丨和大洋洲都有报道ＹＭＭＶ侵染参薯，认为是继ＹＭＶ５［之后在淮山药上第二大流行的病毒ｌＢ〇ｕｓａｌｅｍ等在力＿比和南美洲也检测到ＹＭＭＶ的存在，分子特征分析显示来自于哥伦比亚、马提尼克和巴布亚新几内亚岛的不同分离物之间存在显著的分子多样性。＇１９７４年，ＪＹＭＹ首次在日本的日本薯葡（Ｚ）；ｃｗ（：ｏｒｅｆｌ７如續Ｔｈｕｎｂ．）上被分离，被报道为５１一’一］ＹＭＶ的［，９７５，Ａ１个分离株。该病毒含条ｓｓＲＮＡ７ｂｐ不包括３端的ｐｏｌｙ，包含个（），ａａ组成的多聚蛋白３５６７９３Ｄａ。ＯＲＦ编码１个３１３０，分子量为感染该病毒的植株出现花叶和ＭＶ侵染的症状ＹＭＶＹＭＶ的科特绿脉斑症状，类似于被Ｙ，但是Ｊ和迪瓦分离物序列比较结果３４４２一［，］，ＪＹＭ显示二者存在显著差异Ｖ是个新种。该病毒己经严重影响了日本淮山药８ 广西大学博士学位论文中国淮山巧病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究一个导致轻微症状或无症状的的种植。Ｆｕｊｉ等人发现ＪＹＭＶ的弱毒株并发布其完整的基因组核５２１１苷酸序列，研究还显示其可用于交叉保护植株免受强毒株的侵染，以期减轻该病毒对淮山药产业的危害。户吵咖狀的研究非常有限一一早期对侵染淮山药的，同是研究个病毒，麵究人员只是观一一察了症状，，些研究人员测试了不同的宿主范围些研究人员贝吩离并鉴定该病毒。但是这纷开的研究容易导致误解，无法进行正确的分类。例如，日本首先在１９７４年报道侵染日本薯５１１１蕷造成花叶和绿色镶脉症状的病毒属于凡奶，认为其与在尼曰利亚Ｎｉｅｒｉａ）的白薯蓣沙咖（ｇ３２［］上发现的ＹＭＶ非常相似。但是，通过比较它们的的核苷酸序列和基因组特征，将其确定为３４５３１［】］ＪＹＭＶ。ＤＡＲＭＶ和ＣＹＮＭＶ侵染淮山药后也表现出非常相似的症状，但它们分别属于Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ＾ｌＭａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓ〇１．２．１．２柘？＾毒属病毒Ｍａｃ■／ｗｒａＷｍｓ核酸为正义ｓｓＲＮＡ，约８ｋｂ，比Ｐｏ／ｙｖ／ｒｗｓ的基因组略小，其典型的基因组结－构与尸的基因组结构类似，但是无Ｐ１蛋０１２）。（图该属病毒由蚜虫以非持久方式５４［］传播，但是发现缺失参与蚜虫传播的保守的氨基酸基序的ＤＡＧ或ＤＴＧ。该属病毒只有柘橙花叶病毒和水仙潜隐病毒的研究较为清楚，其中柘橙花叶病毒的寄主范围很窄，目前发现其一只能侵染５个双子叶植物科中的１７种植物，茄科和藜科的些草本寄主容易感病，但是许多寄一［２４］主仅表现出轻度症状或隐症，而水仙潜隐病毒可以侵染茄科和苋科的些植物。柘橙花叶病毒具有中等程度的免疫原性，与其他线形病毒如麝香石竹潜隐病毒属和马铃薯Ｙ病毒属的病毒无明确的血清学关系。水仙潜隐病毒的病毒粒子形态及其他特性与麝香石竹潜隐病毒属的２４［］１４病毒较为类似，但与种该属病毒无明确的血清学关系。在细胞病理方面，有研究报道感染柘橙花叶病毒的寄主植物细胞在光镜下可见无定形的细胞质内含体。而在电镜下观察可见＾４］柱状的细胞质内含体，横切面上可见众多薄片组成的风轮状体。５５］［目前已报道的ＣＹＮＭＶ也是该属成员，但是由于病毒形态和蚜虫传播能力，ＣＹＮＭＶ长一直被认为是香石竹潜隐病毒属期以来（Ｃａｒ／ｏｖ／ｍＯ成员，直到ＣＹＮＭＶ基因组的测序结果一■４＾４７２％表明，其ＣＰ的氨基酸与Ｍａｃ／ｗｒａｖ／ｍｓ的氨基酸致性为１．３．，但与的氛基酸６一［２１’５］６－致性仅为．０２２．９％，才将ＣＹＮＭＶ归为成员。１ＰＩＰＯ７Ｋ９ＫＩ＿■，’，—丨人—ＶＰＧＨＣ－ＰＰＶＮ－ｌａＰｒｏｉＡｎ５ｒｏ３ＣｌＰｇＮｂＣＰ３－２图１柘橙病毒属病毒属病毒的基因组结构－ｉｕｒｅｉｉ（ｔＭｌＦｇ１２ＯｒｇａｎｚａｔｏｎｏｆｉＱａｃｕｒａｖｉｒｕｓｅｎｏｍｅｇ９ 班啬米＿Ｉ钭鹚閊Ｗ左穿避丑茚§，ｔ啉１｜秭韬遨１ｕｓ叙弇？奪８植，擊唞蓉氽？截貂ｎｃＩｆｉｉ蘇胡＆辑窗滅Ｈ３截＿ｗＳ翠避，截？鹚驿柃？Ｙｙ，？鞍８举＃迆，｜＾细邂ｐＩ截奪ＭＨ繫截箄靼箄蕻＊箄軍？ｒ苌把运截ｎＮｔ：钯奪运艇＾运靼运忘０暴运奪兵４Ｗ菊靼这蜇，彔铟锻联ｉ左彰ｔ，，匡，轮羞珈婼制靼，ｓ靼链５璇圮盏哳鸯嗞£扣，亡ｓ截職崁跦镟－酜，隊，联闵£茑盏ｓ§，盏嵌长按聆扣瓶夂赋＾轮璇篓彐宾璇，蜜锴撇左０银氐娲，－，，銻０，，团州古祖４￥＂蕺銻古０赋脏择运０＾截＾稃撇＾桴狯ｓ撇＾ｇ商鄱要屮，ｌｒ＿糊頰，擗稱叫，，囤铷吻＿＿唪掛頫，，＿，＾猓－要＿頫要吳左，齡￡１２耷迟挪Ｗ魏叫拽／瞾１，画ｉｓｔ、鄭稃，蘅，Ｅ酕，，缺要概Ｗ，，頫将途＿，ＩＥ瓣要要齡挪，峨茬擴志锊左川扣允頫州驴ｎ，，挪§ｇ，联，搣＿挪袒要頫ｔ钟ｌｇｆｒ罢瞾，ｔ盔迟Ｈ：瓣联翠＿？，ｔｎ蕻０－Ｉｎｓ幽锊ｔｎ１Ｓ０洚讲阇ｆｒ带趾雜１１ｍ挪择￥ｇ聒飧，ｓＪ￥，，＿＃餱＃２，蹈頫＾＃ｌ瓣挪＿挪，ｓ雜匀碎ｔ概，ｗ州，鲠振联＿頫總ｗ蟀頫，挪０ｆｒ左瓣＿ｉｏＩ黎瓣頫ｍ锊０Ｅ頫？錤ｔＭ０皿－ｍｍ＾翻ＭＪｌ＿雜挪＃ｍ３０ｆ＞（Ｉ＾ＡｏＡ０＃银＃＾Ａｖ０ｌ０ｆｆｓｍ＃）ａ０＾ｌ（ｍ０（遯（Ｃ（０Ａ概ｆＡ＃（ＡＣ￥Ａ￥—ｓＡ挪（ｌｓＫＡＭｍ２卻ｍＷａ－ａ０ｔＮｏｏ￥＿ＷＷＭＡＡｖＡ＆２＃§Ａｒ￥ａＡ０ａ０ａ錤ＱｗＯＩＳＡＷ）））））））））Ｊｍ００ＩＫ＾Ｈ偃００ＩＩ规 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广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病凰病毒分子生物学的研究１．．２２花椰菜花叶病毒科杆状ＤＮＡ病毒属病毒５—的病毒粒子是环状ｄｓＤＮＡ基因组被包裹在无碰的杆棚粒。核酸大小通常￣ｘ？为７．３８，毒粒大小通常为１３０。．０ｋｂ２９３０ｎｍ常见的为内部褐白斑杆状病毒（Ｉｎｔｅｒｎａｌｂｒｏｗｎｓｐｏｔｂａｄｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ，ＪＢＳＶ）和参辜杆毒（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａａｌａｔａｂａｃｉｌｈｆｏｒｍｖｉｒｕｓ，５７］ＤａＢＶ），咖ａＢＶ更为常见，最常侵染宿主是参嘗〇ＤａＢＶ可被相橘粉蚁（ｉ＾ｍｏｃｏ謂ｄ时５７５７［］Ｒ［］ＤＢＶｉｓｓｏ）传播或摩擦接种。ＤａＢＶ侵染参薯导致严重的叶子扭曲、皱缩和斑驳。ａ尼日利亚分离物（Ｎｉｇｅｒｉａｎ）和ＤａＢＶ贝宁分离物（Ｂｅｎｉｎ）的全基因组核苷酸序列已经进行分析５８５９’一［］二者的致性为，基因组大小分别为７．４ｋｂ和７．２６ｋｂ，核苷酸６１．９％。与已经猶的＿＿Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ＾ｔｂ＞这两个病毒均与口Ｊ口』肿枝病毒（Ｃｏｃｏａｓｗｏｌｌｅｎｓｈｏｏｔｖｉｒｕｓ，ＣＳＳＶ）的核苷８５９一＾，］酸致性最高。ＤａＢＶ和ＤｓＢＶ分别拥有３个和４个ＯＲＦｓ。这两个病毒的ＯＲＦ３预测的氨基５８，一［酸序列编码个假定的多聚蛋白，包含的若干保守基序特征＇淮山药的内部一褐白斑病被认为是由于ＳｆｌｄｗａＷｍｓ与种／混合感染导致，最初是在参薯发现并报道，５８５９’［］之后在黄独±也发现了相同情况。５—的核酸序列和血清学水平的变异性非常大，该属内在不同种之间的病毒基因组的核苷酸序列相似性非常低一，甚至同个种的不同病毒分ｎａｎ离物之间的基因组的核苷酸序列相似性也非常低，如ＧｅＢｋ中公布的香蕉杆状ＤＮＡ病毒属。病毒的６个不同分离物，不仅基因组长度相差近５００ｂｐ，它们的核苷酸序列变异也超过３０％洳―已在甘蔗、香蕉、芋头、柑桔、薯蓣和可可树等多种热带和亚热带的经济作物上、被发现，其弓丨起的症状包括花叶黄化、条状褪绿、褪绿斑驳、脉明、叶缘卷曲、肿瘤、脉坏死、叶斑和落叶等。肋办Ｍｍｓ主要通过带毒的寄主植物的无性繁殖材料进行传播，传播６０］方式包括嫁接和汁液接种，传毒的昆虫介体主要为粉阶，有触可通过姆虫进行传播（见表１４）。的基因组由３个ＯＲＦ（ＯＲＦ－。１、ＯＲＦ２和ＯＲＦ３）组成（见图１３）的ＯＲＦＩ和ＯＲＦＩＩ的编码产物的功能尚不清楚。目前己发现ＯＲＦＩ编码的蛋白与未成熟的病６１一］ＯＲＦｎ则与成。ＯＲＦｍ毒颗粒相关，而熟和未成熟的病毒颗粒均相关的编码产物包括－－＾ｃｓｅｉｎｅｒｉｃｈｚｉｎｃｆｉｎｅｒｌｉｋｂｉｎｄｉｎｄｏｍａｉｎ个富含半胱氨酸的铸指ｔ＾ＲＮＡ＾合结构域（ｙｔｇｅＲＮＡｇ，ＣＹＳ）、天冬氨酸蛋白酶（ａｓｐａｒｔｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ，ＰＲ）、病毒逆转录酶（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＲＴ）、核糖核酸酶（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）和ＲＮａｓｅＨ（ＲＨ），所有已鉴定的花椰菜花叶病毒科的成员麵６２６３［＞］。ＰＣＲ有这些结构域病毒的基因组变异很大，所以大多数检测引物是根据１２ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病厩病毒分子生物本的研究６４［］ＲＮＡＯＲＦｍ中的相对保守的区域设计的，这些区域主要是转运结合域（＿Ａｂｉｎｄｉｎｇ６５６６’［］ｄｏｍａ）ＲＨＲＴ－（１３）ｉｎ、和见图。０ＲＦ１Ｚ０ＲＦ２：：ｒｊ／＼ＣＹＳＲＢ图的基因组结构Ｍｅｔ：假定移动域；ＲＢ：ＲＮＡ结合基序；ＣＹＳ：半胱氨酸保守区；ＰＲ：天冬氨酸蛋白酶；ＲＴ：逆转录酶；ＲＨ：核糖核酸酶Ｈ－ｎＦｕｒｅ１ｒｉｚａｔｉｏｎｏＢａｄｎａｖｉｒｕｓｅｎｏｍｅｉｇ３ＯｇａｆｇＭＥＴ：ｐｕｔａｔｉｖｅｍｏｖｅｍｅｎｔｄｏｍａｉｎ）；ＲＢ：ＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｍｏｔｉｆ；ＣＹＳ：ｃｙｓｔｅｉｎｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎ；ＰＲ：ａｓｐａｒｔａｔｅｐｒｏｔｅａｓｅ；ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；ＲＨ：ＲＮａｓｅＨ１．２．３雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属病毒ＣＭＶ属于雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属，，等轴病毒粒子直径约３０ｎｍ是经济上最重６７一至少包括［］８３６５。ＣＭＶ要的植物病毒之，具有很宽的宿主范围，５个科个属的植物已经被６７］［报道广泛侵染全球范围内的植物种类，但是在淮山药病毒的研究中，只有报道称在瓜德罗普岛（Ｇｕａｄｅｌｏｕｐｅ）、科特迪瓦和尼日利亚种植的参薯上发现了ＣＭＶ的侵染，其它地方未见２９，３６，６８ＣＭＶ侵染淮山药的报道［］。该病毒通过多种蚜虫以非持久性的方式或通过机械摩擦在大＇ＭＬ．范围的寄主植物中高效传播，特别是在黄瓜（Ｃｗｃｗｍ／ｕａｆｔｖｗ）、粘毛烟草（ｃｏｒ／ａｒａＬ．）、本氏烟（Ａ＾和藜麦（０＾〇／７６＾／＿（７以職７Ｗｉｌｌｄ．）症状尤其显著（见）ＲＮＡ病毒，病毒基因组由ＲＮＡ１、ＲＮＡ２和ＲＮＡ三条ｓｓＲＮＡ构成表１４。该病毒是正义３１３ 广西大学博士举位论文中圔淮山苗病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物举的研究６９７）６９（［’］［］一３．４诎３１＊．２吐。，大小分别为、和２个亚基因组外壳蛋白信使１＾０＾４）被认７１７２［’］为会随着ＲＮＡ３的复制而产生。根据血清学关系、外壳蛋白的肽指纹图谱、核酸杂交和６７一ＣＭＶ分为两］，。这两个亚组在血清学上密切相关核苷酸致性，将个主要亚组即Ｉ和ｔｆ，与７３［］一多克隆抗体会发生交叉反应。些针对ＣＰ蛋白亚组Ｉ和ｎ的单克隆抗体才能够将这两个亚组７３７４一［’］。区分开来，暗示每个亚组存在独特的表位最近，ＣＭＶ分离物的系统进化分析进步将５７６［７，］［７７］亚群Ｉ细分为ＩＡ和ＩＢ。这些高度的变异存在可以解释为何其拥有广泛的寄主范围。而且，该病毒对植株造成的影响可以从无症状到死亡。１．２．４未分类的淮山药病毒来自淮山药的很多病毒至今没有分类是因为将它们作为单独株系的地位进行的研究尚未。ｕｒｓｅ结束，或者因为它们与先前在淮山药上发现的病毒相同如Ｃｏｙ首次在巴巴多斯的参薯上＂发现的一ＩＢＳＶ，这可能是ｈ新的成员，包括非包膜杆状的病毒粒子，长１３０ｎｍ，８’卩＿］。宽２９ｎｍ，导致感染的植物出现褐色斑点薯賴斑驳病毒ＣＤｚａｓｏｗｅａｗｏｆｔ／ｅｖ！ｎ？ＤＭｏＶ），２９一豆花叶病毒属［］一可能是个ＩＩ（ＣｂｗｏＷｍｓ）成员，ＤＤＶ可能是个Ｐｏｖ／ｍｓ成员。另外，＾ｙ还包括在波多黎各（ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ）首次报道的在墨西哥菊叶薯蓣和多花薯蓣上发现的薯蓣潜隐７９一［］＞ｔｅＷｍｓ￣病毒ＤＺａｓｃｏｍｚ／ａｔｅｎ？ｖｚｗ，ＤＬＶ，该病毒拥有尸ｏｃ（４）。ＤＬＶ（）的些特征见表１８（）［］基因组为ｓｓＲＮＡ，线状，无包膜，病毒粒子弯曲，长４４５ｎｍ，宽ｌｌｎｍ。Ｆｕｋｕｍｏｔｏ和ＴｏｃｈｉｈａｍＣ＿＾于１９７８年在曰本的长薯截上首次发现了中国淮山药坏死花叶病毒（／ＨＶｉｅｓｅｙａｍ？ｅｃｒｏｆｔｃ／ｎｏｓｃ８１［］一£￥＞＾￥－＞＜抑＞１？），该１３６６〇１１１１１。，在日本流行广泛线状病毒粒子大小约为１２另，个尚未分类的ＤＴＶ在瓜德罗普岛的三裂叶薯蓣上首次被发现并报道，该病毒感染导致宿主表现出花叶、褪绿斑驳、脉带和叶片变形等症状。该病毒可以通过棉蚜（却ｔｏ职卿种）以非持久性的方式传播，并且也可以通过机械摩擦接种进行传播１４ ￡－ｓ－试愁宇ｓ５＾＃吳０＃？截韜截糾－傘￡＾＾恶茧－－ｙＳ避１楚０繼蠢ｓ４欠－ｆ０螗ｌ＾＾００徵徵避＾９靼髮０ｓ０寒箄ｘ．妇ｆｌ一１－ｅ娄＾＾＾Ｓ＃＃画＊：瑠ｒｆ藤Ｉ，．其ｆ电锻ｓｆ竭彰隹＾镝舾５钼■￥＂＾￡＿？砌Ｓ職＿踩ｓｋ踩ＩＪＪ？時诔，堰州，，，３辑烂峰锃＾左钜舾ｍ恶霞礙抝＾洋闳■＿按「ｒ彐夂，０ｒ＾沢ｓ｜頃響１＾您古左ｍ盏狀洋耕Ｉｆ寐谳左，ｓ＆姊ＨＳ５，昼ｎｕ＃３ｉｇ３：°目ｇ°頫Ｍ１Ｓ＿７、，＃１＿ｔ琳＜＾？Ｍ００？迨，ＳｗＩＭＳ蚺，？Ｈ￥，肆８３葚ａ翠慑Ｕｔ，ｔＰ舾＿要闺ｉＵＢ，，迟铷浮ｎｇＷ州揠頫＜，煜？鯽跸，辄，縣猛蓝？化录浮ｒｊｉ昼雜势錄锄４Ｋ祕＾浮§遯Ｍ左，＃屮頫遯頫ｘ，＿？？頫左浮１ｔ：挪蕻说１ｌ０＋／ｃｒ一．，，：１Ｐ］，，Ｂ揠－，頫ｌｔ議慑Ｉ挪振？ｍｔ萬ｅ吳＾挪左ｓ翁州概缴－０＊ｍ＾责遯Ａ，靼，，，乖Ｖ頫Ｎ目锭獅》頫商挪Ｘ皿换Ｊ鹆涛＿５ＵＯｉＳ°ｆｅ－ＣＳ舷锭ｓＣ抝３遯罢Ｐ彐？Ｖｖ？§Ｎｚ裝ＩＪＵ＾＾ａａ（保（（￣＞ｉ＾＾Ａ＾｜－叮．．Ａ｝．＞ｍｌｓ＆ｆｃｍｆｃ＞Ｉ＂ｕ．ｍＢｍＪＳｒｓＱａａ１Ｉ＾鉀莒ＱＵｒａ））Ｗ锵§挪鹆弒）＾裏）ｌ 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广西大学博士学位论文中国淮山充病毒病调查、徐断和病康病毒分子生物学的研究１３．病毒检测技术快速准确检测淮山药病毒在病害管理和控制中极其重要，但是目前在淮山药病毒检测方一面还存在系列问题。由于环境因素改变引起的症状变异，不同的淮山药品种或变种的症状。多样性导致淮山药病毒的田间诊断不可靠养分缺乏弓，丨起的症状也容易与病毒病症状混淆８２８３’［］而且有些无症状的植株也可能存在病毒病。免疫学、生物技柳分子生物学已经在快速、灵敏和特异性检测植物病毒领域起ｔ极其重要的作用。１．３．１生物学检测技术传统的的植物病毒检测方法主要有鉴别寄主反应或指示植物法，还有交叉保护，通过８４［］透射电镜观察胞浆内包涵体和病毒粒子等检测方法。这些方法在许多及其株系的划分中起到了显著作用，淮山药花叶病毒（ＹＭＶ）分离株就是通过症状、免疫印迹３７［］一法和单克隆抗体进行鉴定的。自然宿主上的症状被认为与在系列指示植物经机械摩擦８５［］接种或介体传播接种后的症状相似〇虽然这些方法仍然有效，特别是在新病毒研究的初步阶段是非常有用的，但是采用这些方法的研究效報低，不适合用于病毒的常规鉴定和检测。１３２电．．镜检测技术一。遞电子显微镜常用于植物病毒颗粒的观察，并已开发出了系列的病毒粒子检测方法８６５７Ａ［］［］ｌｍｅｉｄａ和Ｈｏｗａｔｓｏｎ首先开发了叶浸技术，随后被广泛用于淮山药病毒的表征分析。该方法快速，以观察粗组织提取物为基础，特别适合于细长病毒颗粒的检测。不便之处是汁液成分可能千扰病毒粒子与铜网的结合。采用改良的叶浸法和纯化的病毒浓缩液（ｃｌａｒｉｆｉｅｄｖｉｒａｌ８７［］ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅＣＶＣ。，）用于电镜观察可以获得较好的效果８８ｍｍｕｎ［］免疫电镜（ＩｏＳｐｅｃｉａｌＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＩＳＥＭ）观察最早是由Ｄｅｒｒｉｃｋ提出，已广泛应用于植物病毒学研究。ＩＳＥＭ结合血清学检测和电子显微镜的可视化功能的特异性，４６一［］可以检测出低浓度的淮山药病毒。ＩＳＥＭ也可以使用混合抗血清进行检测，这对于在同个。样本中检测多个病毒是非常有用的在这种技术中，首先在铜网上涂覆特异性抗体，经过温一育和洗漆后，段时间使病毒与抗体结合，然后再次洗漆和染色，，将粗汁液加到铜网上孵育观察。１７ 广西大学博士学位论文中国浪山药病毒？病调查、诊断和病厫病毒分子生物学的研究１．３３免疫检测技术．免疫分析是检测和监控病毒病害的有用工具，特别是用于常规检测，利用动物产生的抗体来捕获感兴趣的病毒。在植物病毒检测中应用最为广泛的是酶联免疫吸附测定８９［］（Ｅｎｚ－ｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）技术，具有灵敏度高、操作简单、重现。性和通用性好的优点，可用于筛查大规模样本彳吏用ＥＬＩＳＡ法作为病毒血清学检测方法时，９（）［］采用多克隆抗体可以提高病毒检测的灵敏度。随着单克隆抗体的开发，使得病毒检测更为９１９２［，］特异和灵敏。ＥＬＩＳＡ的原理是将提取的汁液中的抗原（通常为病毒）包被到聚苯乙烯或聚乙烯板的孔的表面上，漂洗未结合的物质，留下感兴趣的特异性抗原，然后用酶職体检测抗原。ＥＬＩＳＡ９３［］主要是用来确认是否存在病毒蛋白和估计病毒蛋白在植物汁液中的浓度。目前已经开发出许多ＥＬＩＳＡ方法，主要分为两种类型。直接ＥＬＩＳＡ过程是利用酶标记的特异性抗体直接检测抗ＥＬ一ＩＳＡ先用原，而间接个特异性的抗体与抗原作用，然后用酶标记的抗免疫球蛋白抗体针对与抗原作用的特异性抗体进行免疫检测。虽然ＥＬＩＳＡ做为检测病毒的常规工具有许多优但也有一些局限性点，如高效、高通量、易操作等：首先，ＥＬＩＳＡ需要高质量的抗血；清才能实现高灵敏及高特异性，而抗血清的制备需要进行病毒ＣＰ蛋白或其它蛋白纯化等漫长的过程，与ＰＣＲ检测对比，成本也更高，尤其是单克隆抗体的制备成本更高。其次，由于ＣＰ蛋白在同一属中的病毒非常保守，ＥＬＩＳＡ不能鉴定病毒的种间差异。再次，ＥＬＩＳＡ、在检测病原病毒的过程中，不能同时检测细菌真菌或线虫等其它病原。ｏｍ－在此基础上还发展了斑点免疫结合测定法（Ｄｔｅｎｚｙｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，９４［］－ＥＬＤｏｔＩＳＡ）用于植物病毒检测。其技术特点是直接将组织印迹在膜上，既保持了ＥＬＩＳＡ的特异性和灵敏度，又简化了操作程序，能够简单快速高效地检测病毒，检测结果能直观地显示出病毒感染的部位，而且印迹在ＰＶＤＦ膜或硝酸纤维素膜上的样本可以保存较长时间，特别适用于大规模普查植物病毒。１．３．４基于核酸的检测技术随着分子生物学技术的进步，采用分子生物方法进行植物病毒检测更为普遍，该方法通过检测病毒核酸来证实病毒的存在，具有着极高的灵敏度和特异性，操作方便，检测速度快。与ＥＬＩＳＡ比较，基于核酸的检测技术更具有耗时短、可同时检测细菌、真菌或其它虫类病原以及成本低等优点。最常见的基于核酸的检测方法是聚合酶链式反应（ＰＣＲ）－ＰＣＲ）。该或反转录聚合酶链式反应（ＲＴ技术也可以结合血清学检测方法，例如免疫捕获１８ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的研究４８’９５【］－ＩＣＰＣＲ方法ＰＣＲ检测的高灵敏性和血清学的快速简便的，具有优点，使植物病毒的检测更为方便－。其技术原理是先用抗体来捕获病毒，然后再进行ＰＣＲ或ＲＴＰＣＲ检测。该方法不但节省了核酸提取的时间和成本，还能去除抑制物质而改善检测环境，保证高特异性和Ｉ－－，比常规的核酸检测方法更为简便、可靠Ｃ灵敏度，应用前景广大。目前已成功采用ＲＴＰＣＲ４８［］ＹＭＶ和ＹＭＭＶ－检测Ｊ等淮山药病毒。近些年来，环媒等温扩增技术（ＬｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）也被广泛应用于病毒检测领域ｐ。其工作原理是针对ＤＮＡ靶序列的６个区域设计４条特异性的检测引物（两条内引物和两条外引物），在链置换ＤＮＡ°ｍｅ￣聚合酶Ｂｓｔ酶（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｈｉｌｕｓＤＮＡｏｌｒａｓｅ）的作用下６５ｐｐｙ，于６０Ｃｆ亘温环境１．５ｈ）中可以短时间（内实现对目的ＤＮＡ片段的高效率扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测；或直接向ＬＡＭＰ扩增产物中加入双链ＤＮＡ染料（如ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ）可使有扩增反应的反应液呈翠绿色，而无扩增反应的反应液呈暗红色；也可以通过观察扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀的量来判断ＬＡＭＰ反应（使用肉眼观察或浊度仪检测）。由于植物病毒复合侵染现象比一较普遍，多重ＰＣＲ技术逐渐显露出其优势，应用该项技术可以在同个反应中检测出多种病９６［］毒。而采用荧光定量ＰＣＲ技术来检测病毒，不但灵敏度更高，而且可以对病毒进行定量％实时荧光定量ＰＣＲ技术（ｑＰＣＲ）通过引入荧光化学物质使ＰＣＲ扩增反应产物随循环数增加而信号强度等比例增加，可通过荧光信号强度变化监测产物量的变化，从而可以对起始模板进行定性和定量分析，通过溶解曲线可以分析扩增产物的特异性，不需要进行电泳检测，因此具有比常规ＰＣＲ技术更为灵敏、准确和快速的特点，而且可以实现定量分析，被广泛应用一于病毒检测和其他科学研究一。基于核酸的检测技术还有个优点就是扩增产物可以用于进步的分子水平研究－，如ＲＦＬＰ分析或测序。但是采用ＰＣＲ或ＲＴＰＣＲ技术需要掌握待检病毒的一序列，从而设计特异性的检测引物。在病毒检测方面面临的个重大挑战就是某些病毒变异４５９８非常快［，］，有丰富的遗传多样性，基于特异性引物进行植物病毒检测就有可能导致产生假阴性的结果。因此有必要加强对植物病毒的遗传多样性分析，不断更新病毒检测引物和抗血清，以保证病毒检测结果的可靠性。目前解决此类问题的主要技术手段是在进行病毒遗传多样性分析的基础上设计简并引物用于该种病毒的检测。１．．３５双链ＲＮＡ分析技术－在检测未知病毒方面可以采用双链ＲＮＡ（ＤｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）分析技术，其技术原理是ＲＮＡ病毒和类病毒等在植物体内会形成ｓｓＲＮＡ的特异复制中间型，即ｄｓＲＮＡ。而通常植物体内不存在ｄｓＲＮＡ，因此，可用该技术进行植物病毒的检测和１９ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调釜、诊断和病康病毒分子生物学的研究９９［］ＲＮＡ还可用诊断。提取到的ｄｓ于病毒的抗血清制备或分子克隆，通过序列测定可以分析新病毒的分子特征。该技术的缺陷是不能用于ＤＮＡ病毒和负链ＲＮＡ病毒的检测。１．３．６深度测序技术近几年发展起来的深度测序技术不但可以用于基因组和转录组测序，还可以用来检０４１（ＸＭ［］测病毒甚至发现新的病毒。目前利用该技术已经发现多种新的病毒。由于深度测上可以对样本中的病毒一序技术不依赖于已知病毒的信息，理论网打尽，弥补了ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ等技术只能检测已知病毒的局限性，在病毒检测方面特别适合用于高通量检测病毒种类和发现新的病毒。特别是小ＲＮＡ深度测序技术（ｓｍａｌｌＲＮＡｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）在新病毒的鉴定方面发挥着重要的作用。ＪａｎＦ．Ｋｒｅｕｚｅ等通过小ＲＮＡ深度测序的方法，在甘薯上不但能同时鉴定两个常见的侵染甘薯的甘薯羽状斑驳病毒（ＳＷｅｅ炉ｏｔｅｔｏ＜ＳＷｅ〇加〇ｃ／ｆ／ｍｏｆｔ／ｅＷｍｓ，ＳＰＦＭＶ）和甘薯褪绿矮化病毒（吨ｉ／ｏｒｏｃ，ＳＰＣＳＶ）玉米线条病毒属（Ｍｗｆｒｅｖ／ｍｓ）和杆状ＤＮＡ病毒，还鉴定到了两个分别属于＿属的新病毒。ＱｉｎｇｆａＷｕ等则通过小ＲＮＡ深度测序分别在果蝇、蚊子１００［］和线虫细胞中共发现了五种病毒。一ｕｅｎａｎｅｒ测ｘｎｅｒａｉｓｅｃｉｎ早期的Ｓｇ序成本高，直到下代测序技术（Ｎｅｔｅｔｏｎ，ＮＧＳ）ｇｑｇ－的出现，如Ｒｏｃｈｅ的ＧＳＦＬＸ基因组测序仪，使得大规模宏基因组研究变得现实且更有价值。通过宏基因组方法诊断植物病毒使克服传统方法预测病原的困难成为可能，可以一。ＲＮＡ检测来自于受感染植物的包括任何个存在的病原序列提取受感染植物，利用随机引物合成ｃＤＮＡ，通过测序获得包括潜在病原的所有序列。ＲＮＡ病毒、类病毒以及激活复制ＤＮＡ病毒的ＲＮＡ产物都能够被直接测序。该方法能获得样本中包括植物菌原体、细菌或真菌的ｍＲＮＡ和ｒＲＮＡ序列。序列处理通常需要如下步骤：首先，去除低质量序列和引物序列；将序列进行组装并与已知数据库进行比对，通常使用Ｂｌａｓｔｎ或Ｂｌａｓｔｘ方法；最后，在有效数据库中比对到相似序列的存在。理论上，序列相似性搜索类似于体外的核酸杂交实验，如基于微阵列分析的诊断，然而存在于公众数据库的序列要比微阵列多得多，因而比对的灵敏性更高。而且，相似序列的搜索力度要远远胜于体外杂交。，不需要像微阵列的搜索还需要建立强大的统计学工作基础Ｉａｎ等人通过ＧＳ－ＦＬＸ基因组测序仪成功鉴定了侵染番茄的ＰｅＭＶ病毒ｐ，通过测序获得的６５６９１ｒｅａｄｓ中，有１３１８３ｒｅａｄｓ为病毒片段，与已经公布的序列比对后，能够组装出〇一该病毒的基因组全长序列［除去ｐｌｙ（Ａ）为６３８２ｎｔ］。而另个来自于山麦冬的病毒，此前２０ 广西大学博士学位论文中圔灌山苗病毒病调查诊断和病尿病毒分子生物学的研究、７一１１４６ｒｅａｄｓ９５ｒｅａｄｓ并未鉴定过，在测序获得的中，发现有２９０与公布的病毒序列具有定的相似性，以此为基础进行组装，在完全未知该病毒序列的情况下，获得该病毒三组分的基因组全长。新鉴定的病毒与ＣＭＶ病毒抗体在ＥＬＩＳＡ检测中的反应非常弱。聚类分Ｗｍ一析发现该病毒与来自于雀麦花叶病毒科ａ／ｃｗｍｏｙ的ｌａ复制酶同源性聚为组，序列比ｖ一对发现与番煎不孕病毒（ｒｏｍａｔｏｏｓｐｅｒｍｙ／ｍｓ，ＴＡＶ）的核酸致性为５９．０４％。将该病一系列指示宿主植物毒纯化后摩擦接种于，其宿主范围与ＴＡＶ宿主范围最为相似，但是’Ｖ产生的局ｃＭ／ｍｍ在黄瓜产生的症状与ＴＡ部褪绿小斑不同，与Ｇ／ｍｓ的其它成员在黄瓜１（）１［］产生的症状差异更大，故将该病毒命名为蛇鞭菊科温和斑驳病毒，归为ＣＭＣＭｍｏＷｍｓ。１．４本研究目的及意义植物的病毒性病害是仅次于真菌病害的第二大病害，淮山药病毒病严重制约淮山药的生。产，造成重大经济损失而农民側感染病毒的薯块或引进未检疫的种质进行种植，导致淮２９３２，［］山药病毒的更广泛的流行。我国对淮山药病毒病的研究较少，特别是对于淮山药病毒病的发病率以及地理分布信息，在国内还是空白。因此，研究中国淮山药病毒病的发生流行情。况，并对病原病毒鉴定，具有重要的理论意义和现实意义本研究是农业部公益性行业研究专项一《中国淮山药高效栽培技术与示范》的个重要组成部分，重点研究淮山药的病毒性病。２０１０２０１２１害及其检测和控制方法本研究拟在年至年间，（）调查广西、江西、河南、山东和江苏等淮山药主产区的病毒病发生情况；（２）采集淮山药样本，选取部分病毒病症状明显的样本，采用高通量测序技术对病原病毒进行全面的鉴定及分子特征分析，并分析这些病毒分离物的遗传变异和寄主的品种及地理分布之间的相关性；（３）基于高通量测序结果，制备多种淮－八、１（－（１山药病毒的抗体，并用于數针对中国淮山药病毒的丑１＾：孑０１、１：１１１？０和０（＾１〇１一。，等检测方法本研究致力于调查中国淮山药病毒病的发生情况，鉴定其病原病毒建立整套针对这些病原病毒的检测方法和控制策略，为在生产中监控和防治淮山药病毒病提供技术支持。２１ 广西大学博士学位论文中国浪山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究第二章中国淮山药病毒病调查及病原病毒鉴定２．１引言世界上对淮山药病毒病的研究主要集中在非洲、日本、南太平洋地区、印度的部分地区和中美洲的加勒比海地区等，中国的淮山药病毒病的研究相对较少。不同病毒侵染、不同品种的淮山药引起的症状各异，包括花叶斑驳、黄化、畸形和坏死等，主要通过。降低叶片的光合作用效率影响块茎的产量和品质受病毒侵染的块茎活力降低，不容易发芽。淮山药生产上常用薯块进行种植，这种无性繁殖的方式容易导致淮山药病毒的积累。常年种植带毒品种可导致淮山药种质退化。国际上已报道的侵染淮山药的病毒主要ｅｘＷｍｓｗｃＭｍｏｖ－涉及／Ｗ和Ｃ／ｍｓ（见表１１）〇而在１０６ＹＣＮＭＶ１１中国报道的侵染淮山药的病毒只有，尚不清楚是否还有其它病毒侵染中国的淮山药，中国的淮山药病毒病发病情况也未见报道。因此，全面调查中国淮山药病毒病的发生情况并鉴定其病原病毒具有重要的意义。病毒检测和鉴定领祿规的技术手贼小ＲＮＡ深度测其原理是植物可一ｓ以利用小千扰ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）机制干扰植物体内ＲＮＡ病毒的复制，在这过程中植物体内产Ｄ￣生的ｉｃｅｒ酶或类Ｄｃｅｒ２５ｎｔ的ｉ酶可以将病毒复制中间体的双链ＲＮＡ切割产生大小为２１＿ｓｉＲＮＡ，通过测定这些ｓｉＲＮＡ的序列可以获得病毒的序列信息。该方法不依赖于已知病毒序列信息，可以賴物体内的所有病毒进行鉴定。因财论：小ＲＮＡ深度测雜术对受病毒侵染的淮山药的ＳｍａｌｌＲＮＡ进行深度测序，通过生物信息学方法决速、全面地鉴定受测的中国的淮山药样本中的与病毒相关的核酸序列信息，以期发现新的侵染淮山药的病原病毒。本章主要阐述中国淮山药种植面积较大的五个省份的主要淮山药产区的病毒病发生情况，以及通过深度测序和常规ＰＣＲ或ＲＴ－ＰＣＲ鉴定的淮山药病原病毒种类，为淮山药在生产上的病毒病监控和防治提供参考。２２ 广西大学博士学位论文中国淮山碎病毒病调查、诊断和病雁病毒分子生物羊的研究２．２材料与方法２．２．１田间调査２０？？本研究分别在１０年７月９月、２０１１年８１０月和２０１２年９月对广西、江西、河南、山东（采样地点如图２－）和江苏的淮山药主产地的淮山药的病毒病发生情况进行调查１所示，并采集疑似受病毒侵染的样本进行病原病毒鉴定。田块一田间发病率的调查方法：每个采样地点选取若干进行调查，每个田块代表个一一品种或种田块类型，。每个田块随机选取五个点每个点观察百株样本，分别记载各种症状类型的病株数。Ｋ！＾ｍ：Ｅ图２－１淮山药病毒病调查釆样地点分布图Ｉ：广西壮族自治区ＩＩ：江西ＩＩ：河ＩＶ：山Ｖ：江；省；Ｉ南省；东省；苏省Ｆ－－ｉｕｒｅ２１ＩｎｖｅｓｔｉａｔｏｎｍａｖｒｕｓｎｆｔａｍｉｎｔｈｒｅａｃｈｇｉｏｆｉｉｅｃｉｎｉｓｓｅｒｇｐｇｙＩｕａｎｘＰｒＩＩ：ｘＰｒｏｖｉｎＩＩＩＨｅｎａｎＰｒｉｅＩＶ：ｎＰｒｏｖｎｃｅ：ＧｇｉｏｖｉｎｃｅＪｉａｎｇｉｃｅｏｖｎｃＳｈａｎｄｏｉ；；；ｇ；Ｖｉ：ＪａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ２３ 广西大举博士学位论文中国淮山箱病毒病１Ｗ查、诊断和病康病毒分子生物举的研究２．２．２病毒样本的采集每个调査点采集若干疑似病毒病的症状明显的淮山药和无病毒病症状的淮山药叶片或植株、地点、淮山药品种和症状类型等信息，用保鲜袋封装后，分别标记采样时间￣放入冰盒。３５，，带回实验室进行病原病毒检测将采集的每种症状类型的病株各株在广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的温室进行种植，用以保存毒一。源，以作进步研究２．２Ｊ生化及分子生物学试剂复杂植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（ＳｕｒｅＰｌａｎｔＤＮＡＫｉｔ）、植物ＲＮＡ提取试剂盒ｎ—ｘ（ＲＮＡｐｕｒｅＰｌａｔＫｉｔ），ＳｕｐｅｒＲＴｃＤＮＡ＾ＥＳＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ（＾１４）？－Ｋ－购自康为世纪公司。坤ＡＳＴＴｌＣｌｏｎｉｎｇｉｔ和ＴｒａｎｓｌＴｌ感受态细胞购自全式金公司。柱？Ｇｌｒａｃｔｉｏｎｉｔ）。式ＤＮＡ胶回收试剂盒（Ｅ．Ｚ．Ｎ．ＡｅＥｘｔＫ购自ＯＭＥＧＡ公司质粒ＤＮＡ小提试剂盒？ＷＥＳＴ－Ｂ购于天根生化科技有限公司。琼脂糖ＢＩＯＲｅｇｕｌａｒＡｇａｒｏｓｅＧ１０购自ＩＯＷＥＳＴ公司。？？ＧｅｌＲｅｄ核酸凝胶染料购自ＢＩＯＴＩＵＭ公司。ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌＯＯｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＧｅｎｅｍｌｅｒ、？？ＧｅｎｅＲｕ丨ｅｒｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ和Ｇｅｎｅｍｌｅｒ１ｋｂｌｕｓＤＮＡｌａｄｄｅｒ和Ｔ４ＤＮＡｉ＾接酶购自ｐ－－ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司。ＳｍａｌｌＲＮＡＳａｍｌｅＰｒｅＫｉｔ（ＦＣ１０２１００９３）购自Ｕｌｕｍｉｎａ公司。ＭｉｎＥｌｕｔｅｐｐＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ、ＱＩＡｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔｆ口ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ购自ＱＩＡｅｎｑｇ公司。其它普通化学试剂及生化试剂为进口或国产分析纯。２．２．４病毒检测引物使用国际上已经报道的侵染淮山药的病毒的检测引物或根据已有的淮山药相关病毒的序列信息使用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ６软件设计引物用于淮山药病毒检测，同时根据淮山药的核酮糖－－－二／ｓＣＯｌａｒｅｓｕｂｕｎｉｔｒ６ｃＬＲＴＰＣＲ１５加氧酶大亚基基因（ＲｕＢｉ）设计引物用于，磷酸羧化酶ｇ，ｃ－验证ＤＮＡ的质量。引物信息见表２１。引物为生工生物工程有限公司或Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ公司合成。２４ 广西大学博士学位论文中国淮〇４苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究－表２１本研究用于病毒检测的引物信息Ｔ－ａｂｌｅ２１Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｖｉｒｕｓｅｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ＊’’引物名称引物序列（５—３）产物大小ｂ（ｐ）检测病毒参考文献Ｂａｄｎａ－ＦＰａｒａａＢｔｃｃｉｔｔｉｉｔｉａａｙｇｃｉｃｃ５７９ａｄｎａｖｉｒｕｓ１０７ｇｙｇｇ［］Ｂａｄｎａ－ＲＰｃｃａｙｔｔｒｃａｉａｃｉｓｃｉｃｃｃｃａｉｃｃＤＢＶ－Ｆｔｃｇｇｇｇｔｇａａａａａｃｇｃｇｃｃｔａｇ５４８ＤａＢＶ本研究ＤＢＶ－ＲｃｃａｃｃａａｔｇｇｔｔｃａｃａａｃｃａｔｃｔａｔｃｇＰＡｔａａｔａｔｔａｃｃｋｇｗｋｇｖｃｃｓｃ５００Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ［１０８］ＰＢａｔｇｇａｃｙｔｔｒｃａｗｂｃｃｔｔｃａｃｇｇＹＹＳＭＶ－ＦｃａＹＹｔｃａｔｇｃｇｇａａｇｇｃｇｔｇｔｇ４４６ＳＭＶ本研究ＹＹＳＭＶ－ＲｃａｔｔａｔｔｃｔｔｃａａａａｔａｇｇｇｇｇｇｇｇｇＣＩＦｏｒｇｇｉｗｉｇｔｉｇｇｉｗｓｉｇｇｉａａｒｔｃｉａｃ７００Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ［１０９］ＣＩＲｅｖａｃｉｃｃｒｔｔｙｔｃｄａｔｄａｔｒｔｔｉｇｔｉｇｃ－ＹＭＶＦａｔｃｃａｔｔａｃａａｔａ５８６ＹＭＶ４８ｇｇｇｇｇｇｇ［］－ＹＭＶＲｔｇｇｔｃｃｔｃｃｇｃｃａｃａｔｃａａａＹＭＭＶ－Ｆｇｇｃａｃａｃａｔｇｃａａａｔｇａａｒｇｃ２６２ＹＭＭＶ４８［］ＹＭＭＶ－Ｒｃａｃｃａｔｇｔａｇａｇｔｇａａｃａａｇ－２４ＪＹＭＶＦｔｔａｔａｔａａｔｔｃａａｔｃａａ１ＪＹＭＶ１１０ｇｇｇｇ［］ＪＹＭＶ－Ｒｇｔｃａｔａｔａｃｃｔｔｔｔｔｃｇｇｇ－ＦｔａｃａｃｃａＣＹＮＭＶａｔｇｇａｙｃｇｇｔｃｇｔｇｃ１０９８ＣＹＮＭＶ本研究ＣＹＮＭＶ－Ｒｃｃｔｃｔａｔｇｇａａｃａｇｇａｗａａｒｔｔｙｃｇｅ－ＹＣＮＭＶＦａａｔｔｔａｃａｃｃａｃｔ１７０ＹＣＮＭＶ本研究ｇｇｇｇｇｇｇｇＹＣＮＭＶ－ＲａｔｔｃｔａｃｔｃａｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇＹＶＸ－ＦｃｃａＹＶＸｇｇｔｃｃａｔｃａｇｔｃａｃｔｔｃｔ６９２本研究ＹＶＸ－ＲｃｔａａｔｃｔａｃｃａｇｃａｇｔｃａｃｔｔｃａｔａＹＬＶ－Ｆａｇｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇ１５８ＹＬＶ本研究－ＹＬＶＲｃｇｔｃｃｔｔｇｔａｃｃａａｃｃｇｃｃｇｔｇＢＢＷＷＳＳＰｇｔｂｔｃｄａｇｔｇｃｔｙｔｄｇａａｇｇ３２２ＢＢＷＶ１１１［］ＢＢＷＶＫＭＲＭｔｄｗｄｃｃａｔｃｖａｇｉｃｋｃａｔｔｔｔｇＢＢＷＶ－ＦａａａＢＢＷＶｔａｇｇａｔｇｔｔｔａｔｃｔｇｔｇｇｇｔｇｇ１７９５本研究ＢＢＷＶ－Ｒｔｃｃａｃｃｃｔｔｃｔｇｔｃｃａｃｇｇｇ－ＣＭＶＲｇｃｃｔａａｃｔａｔａｃａａ４８７ＣＭＶ１１２ｇｇｇｇｇｇ［］ＣＭＶ－ＦｔａｔａｔａａａａｃｔｔｔｔｔｃｃｇｇｇｇｇｇｒｂｃＬ－Ｆｇａｃａａｃｔｔｔａｃｔｇａｔ５１５内参基因本研究ｇｇｇｇｇｇｇ－ＲｒｂｃＬｔｃｃｃｔｔａｔｔｔｃｃｃｔｔｔｔｃｇｇｇｇ＊＝＝＝＝＝＝＝＝简并引物代码：ＲＡＧＹＣＴＫＧＴＳＧＣＭＡＣＷＡＴＢＧＣＴＶＡＧＣ，；，；，：，；，；，；，，；，，；＝ＡＧＴ＝Ａ＝＝ｎｅＤ；ＨＣＴ；ＮＡＧＣＴ；１ｉｎｏｓｉ，，，，，，，２５ 广西大学博士学位论文中国淮山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究２．２．５淮山药总ＤＮＡ的提取使用复杂植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取淮山药叶片总ＤＮＡ，操作步骤参考说明：书，略有改动剪取淮山药新鲜叶片约１００ｍｇ，加入液氮充分研磨；立即将研磨后的粉末收集到１．５ｍＬ离心管中，加入４００ｊｉＬＢｕｆｅｒＧＦｌ和４ｆｉＬＲｎａｓｅＡ（１００ｍｇ／ｍＬ），涡旋振荡ｌｍｉｎ使其充分裂°￣解６５（：１１１１１１１１＾＾孵育１〇，期间涡旋混３；３０６０？２，混勻，冰浴５１１細；于勻２次加入１吣０００？ｘ立即充分于１４ｉｍ（２００００）离心１〇ｍｉｎ；吸取上清，加入１．５倍籠的ＢｕｆｅｒＧＦ３，，ｐ，ｇｃｔｉｏｎｕｂｅｉｎｕｍｎ混勻；将混勻反应液全部加入到已装入收集管（ＣｏｌｌｅＴ）的吸附柱（ＳｐＣｏｌＤＭ）一ｍ？ｘｉ中，若次不能加完溶液，可多次转入，于１００００（１１５０Ｏ）离心ｌｍｉｎ，，ｐ，ｇ倒掉收集管中的废液，然后将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中加入５００叫ＢｕｆｅｒＧＷ，于１０，０００ｍ一ｉｍｉｎ，离心１倒掉收集管中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中０００ｐ；重复次；１２，ｍ？ｘｔ（１３４００）离心２ｍｉｎ，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；ｐ，ｇ一－１．５ｍＬ５０１００ｅｒ将吸附柱放到个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加ｎＬＢｕｆＧＥ￣或灭菌水，室＾＾置２５論，于１００００１１１１１１１，收＾＾脱液即为淮山药总０似溶液，啊离心。。－２０。保存置于。２．２．６淮山药总ＲＮＡ的提取使用植物ＲＮＡ提取试剂盒提取淮山药叶片总ＲＮＡ，操作步骤参考说明书，略有改动：剪取淮山药新鲜叶片约１００ｍｇ，在液氮中迅速研磨成粉末，立即加入６００ｊｉＬＢｕｆｅｒＲＬＣ，祸旋振荡使其充分裂解；将全部反应裂解液转移至已装入ＳｈｒｅｄｄｅｒＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ的２ｍＬ收集管ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ），于１３０００ｘ２ｍｉｎ，小心吸取收集管中的４００Ｌ上清液至（中ｇ离心ｐ新的ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ离心管中加入０．５倍体积的无水乙醇（２００吣）后立即混匀，然后转移６００心；混合液至已经装入收集管中的吸附柱（ＳｉｎＣｏｌｕｍｎｓＲＭ）上；于８００〇ｘ心３０ｓｅｃ，ｐ，ｇ离弃废液，５０ｉＬＢｕｆｅｒＲＷ１，于１３０００ｘ心将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中加入３ｊｇ离ｌｍｉｎｉ，弃废液，将吸附柱再重新放回收集管中；向吸附柱中直接加入新鲜配制的８０Ｌｊａｓｅ（－ｒｅｅａｅｒｘａｃＤＮＩ混合５２ｉＬＲＮａｓｅＦＷｔｉｏｎｆｅｒ液，８Ｌ１０ＲｅｔＢｕ和２０ＬＤＮａｓｅＩ（１（ｐｐ。入３５〇队８＞＜１１／））２５〇孵育１５１１１＾１１０＆１１＼＾１８〇〇〇眛，混勻，于；向吸附柱中加，于８离心１ｍｉｎ，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中加入５００ｊｉＬＢｕｆｅｒＲＷ２，于８０００ｘ３０一ｘ离心ｓｅｃ，，３０００心１ｇ弃废液；重复次；将吸附柱放回收集管中于１ｇ离２６ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究ｍ－心管ｉｎ１．５ｍＬＲＮａＦ，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；将吸附柱装入新的ｓｅｒｅｅ离３５ＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅＷａｒｘ中，向吸附膜的中间加入卟ｔｅ，室温放置１．５ｍｉｎ，于１３０００ｇ离心１°ｍ－７０Ｃ。ｉｎ，收集的洗脱液即为ＲＮＡ溶液，保存在防止降解２．２．７ｃＤＮＡ的合成一一使用ＳｕｐｅｒＲＴｃＤＮＡ第链合成试剂盒合成ｃＤＮＡ第＾，操作步骤参考说明书进行，略有改动：ｅｒＭＲＴ－Ｆｒｅｅ将ＲＮＡ、Ｐｒｉｍｉｘ、ｄＮＴＰＭｉｘ、Ｂｕｆｅｒ、ＳｕｐｅｒＲＴ和ＲｎａｓｅＷａｔｅｒ溶解并置于冰上备用；配制２０＾Ｌ反应体系：２．５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ４｜ｘＬ，ＰｒｉｍｅｒＭｉｘ２｜＿ｉＬ，ＲＮＡｔｅｍｐｌａｔｅＸ５ｘｕｆｅｒＡＲｎａｓｅ－ｊＬ２００Ｕ／ｉＬＳｕｅｒＲＴ１ＦｒｅｅＷａｔｅｒ至终为２０ＬｐＬ，ＲＴＢ４，，加；｜＾ｐ４ｐ°Ｃ－Ｘ涡旋震荡混匀，３０５０ｍｉｎ，８５：孵育，短暂离心使管壁上的溶液收集到管底；于４２孵育一５ｍｉｎ。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却，即为ｃＤＮＡ第＾物。产物可直接用于ＰＣＲ。ＰＣＲ反应－２０。长。破和荧光定量，或置于期保存２．２．８常规ＰＣＲ反应体系与条件使用２ｘＥＳＴａＭａｓｔｅｒＭｉｘ进行ＰＣＲ反应。ｑＰＣＲ反应体系：２ｘＥＳＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０ｐＬ，１０ｐＭＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ１ｉＬ，１０ｉＭ｜｜＜入Ｄｎａｓｅ－ｒｅｅＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ１ｐＬ，ＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅＸＬ（１），加／ＲｎａｓｅＦＷａｔｅｒ至终ｐｐｇ体积为２０成。°？？（：ＰＣＲ反应条件：９４Ｃ预变性２ｍｉｎ９４：３０ｓｅｃＸ：６０ｔ３０ｓｅｃ；变性，５５退火，°°７２Ｃ延伸？ｌｍｉｎ（按照２ｋｂ／ｍｉｎ，根据不同片段大小设置），３０３５个循环；７２Ｃ延伸２ｍｉｎ。２．２．９ＰＣＲ产物电泳检测ｘ取２仏ＰＣＲ产物．５ＴＢＥ缓冲系统中，于１％琼脂糖凝胶（含ＧｅｌＲｅｄ，在０核酸？？染料）进行电泳。使用ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ或ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ？或Ｇｅｎｅｒｕｌｅｒ１ｋｂｐｌｕｓＤＮＡｌａｄｄｅｒ作为分子量标准，在５Ｖ／ｃｍ电场强度下电泳，最后用凝胶成像系统分析电泳结果。２７ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究２．２．１０克隆和测序？ＰＣＲ的＾Ｕｙ－Ｔ根据结果，如果ＰＣＲ产物为目的条带，直接使用；ｌＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ进行连接反应。如果ＰＣＲ产物有其它条带，则切下含目的条带的凝胶，使用胶回收试剂－盒进行纯化后再进行连接反应。连接反应体系为：１ｉＬＰＣＲ产物，１ｐＬＥａｓｙＴｌＣｌｏｎｉｎｆｐｇｍ－ｅｃｔｏｒｄｄＨ０。ｉｎ。ｒａｎｓｖ，３２轻轻混合，室温反应５将连接产物加入５０队ＴｌＴｌ感°－立即冰浴２ｍ受态细胞中，轻弹混匀，冰浴２０３０ｍｉｎ后，４２Ｃ热激３０ｓｅｃ，ｉｎ。加入°２５０吣ＳＯＣ或ＬＢ培养基，于２００ｒｐｍ３７Ｃ震荡培养ｌｈ。取８５００ｍＭＩＰＴＧ和４０Ｌ吣ｐ２０－ＬＡ－ｍｇ／ｍＬＸｇａｌ混合后涂布平板，待ＩＰＴＧ及Ｘｇａｌ被吸收后，取１００叫菌液涂板，°Ｃ。于３７倒置培养过夜挑取白色克隆至ｌ〇ｎＬ无菌水中，涡旋混勻，取ｌｐＬ混合液用作ＰＣＲ反应的模板。２０成ＰＣＲ反应体系中，依次加入１０叫的２ｘＥＳＴａＭａｓｔｅｒＭｉｘ，ｑａｓｅ／－ｒｅｒ１ＨＬ模板，Ｍ１３Ｆ和Ｍ１３Ｒ各１ｎＬ，７ｎＬＤｎＲｎａｓｅＦｅＷａｔｅ，采用以下程序进行°°°°卩０１鉴定：９４（：预变性５１＾１１；９４（：变性３〇８６（：，５５（：退火３〇３６〇，７２（：延伸（根据片°段的大小确定延伸时间），２５个循环；７２Ｃ延伸５ｍｉｎ。电泳分析ＰＣＲ产物大小，从／而确认阳性克隆并扩大培养，用引物Ｍ１３ＦＭ１３Ｒ测序分析ＰＣＲ产物。将测序获得的序列信息利用Ｂｌａｓｔ、ＤＮＡｍａｎ和ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ１１．０系列软件进行生物信息学分析。２．２．１１系统进化树分析采用ＭＥＧＡ６进行系统进化树分析，将不同病毒分离物进行聚类分析。将测序获得的序列输入ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）进行ＢｌａｓｔＮ或ＢｌａｓｔＸ检索，获得多个物种相似的核苷酸序列或同源蛋白的氨基酸序列。使用ＭＥＧＡ６软件的邻接法（ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）、最大似然法（ＭａｘｉｍｕｍＬｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，ＭＬ）、最小进化法（ＭｉｎｉｍｕｍＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，ＭＥ）和最大简约法（ＭａｘｉｍｕｍＰａｒｓｉｍｏｎｙ，ＭＰ）分别构建进化树，建树过程选择ｂｏｏｔｓｔｒａｐ检验１０００次。比较后选择最优树用ＴＲＥＥＶＩＥＷ进行展示。２．２．１２小ＲＮＡ的深度测序采用ＳｍａｌｌＲＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅｐＫｉｔ按照说明书进行ＳｍａｌｌＲＮＡ测序文库的制备，操作步骤略有改动：分别在２００ＰＣＲ薄壁管（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｔｅｅ）ｐＬ中准备试剂盒要求的相应浓度的ｖｌ．５’°ｓＲＮＡ３ａｄｅｐｔｅｒ、ＳＲＡＲＴｐｒｉｍｅｒ、１００ｍＭＭｇＣｌ２和１．２５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ，置于２２Ｃ预－ｘｅａｓｅｆｉｅｅ）－：ｌ５总ＲＮＡ５ｐＬ热。在２０〇ｎＬ离心管（ｎｕｃｌ中加入连接反应体系ｎｇ，ｌ２８ 广西大学博士学位论文中国淮山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物掌的研究°’Ｃｖｌ５ｓＲＮＡ３ｔ１Ｌ，混匀后置于７０，．ａｄｅｐｅｒｐ赌育２ｍｉｎ迅速置于冰上冷却。继续加入如下试剂：１０ｘＴ４ＲＮＬ２ＴｒｕｎｃａｔｅｄＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ１ｘＬ，１００ｍＭＭＣｈ０．８〇Ｌ，Ｔ４ｊｇ｜°’ＲＮＡＬｉｇａｓｅ１．５ｐＬ，ＲｎａｓｅＯＵＴ０．５Ｌ，混勻后置于２２Ｃ孵育１ｈ以进行３端ａｄｅｐｔｅｒｐ°’连接反应。连接反应将近结束时，将５ａｄａｐｔｅｒ置于７０Ｃ孵育２ｍｉｎ，迅速置于冰上冷’。：１０ｍＭＡＴＰ１ＬＳＲＡ５Ａｄａｔｅｒ１Ｔ４ＲＮＡ却向连接反应混合液中加入如下试剂ｐ，ｐ叫，°Ｌ’’’ｉａｓｅ１２０Ｃ１ｈ５ａｄｅｔｅｒ３ｇ卟，混匀后在孵育以进行端ｐ连接反应。反应产物为５端°ＲＮＡ直接用于ＲＴ－ＰＣＲＣ，也可于４端已连接的，可保存过夜。’’一２００ＬＰＣＲ薄壁管ｌ－ｆｒｅ取个ｎ（ｎｕｃｅａｓｅｅ），加入如下试剂：５端３端已连接的ＲＮＡ°４ｐＬ，ＳＲＡＲＴｐｒｉｍｅｒ１ｐＬ，混匀后短暂离心，于７０Ｃ赌育２ｍｉｎ，置于冰上冷却。依ｘ：５ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＢｕｆｅｒ２ｘＬ１２．５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ０．５ｉＬ１００ｍＭ次加入如下试剂，，ｊｆ°Ｃ孵ＲＤＴＴ１ＬＲｎａｓｅＯＵＴ０．５Ｌ，混勾后于４８ｉｎ。ｅｒｓｃｒｉｔＩＩｅｖｅｒｓｅ卩，ｐ育３ｍ加入Ｓｕｐｐ°Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ１ｉＬ，总体积为１０ｐＬ，混勻后４４Ｃ反应１ｈ，进行反转录反应合成ｃＤＮＡｊ一第链。一Ｌ－取２００ＰＣＲ壁管（ｎｕｃｌｅａｓｅｆｉｅｅ），加入如下试剂：Ｕｌｔｒａｕｒｅｗａｔｅｒ２７Ｌ个ｐ薄ｐ卩，５ｘＰｈｕｓｉｏｎＨＦＢｕｆｆｅｒ１０ｉＬ，ＰｒｉｍｅｒＧＸ１１ｉＬ，ＰｒｉｍｅｒＧＸ２１Ｌ，２５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ０．５ｆ｜＾一混勻后按照下述程序进行｜ａＬ，ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．５（ｘＬ，ｃＤＮＡ第链１０ｐＬ，°°°°卩〇１（（（：：９８：３０９８：６（：，６０退火３０３６＜；，７２（：延伸１５８６（扩增预变性８６（：；变性１０３：，°°１２个循环；７２Ｃ延伸１０ｍｉｎ；于４Ｃ终止反应，ｃＤＮＡ双链合成。取制备好的ｃＤＮＡ双链在６％的ＰＡＧＥ胶（Ｉｎｖｉｔｒｉｇｅｎ公司）中进行电泳，电泳缓冲液为１ｘＴＢＥ。将１吣的２５ｂｐｌａｄｄｅｒ与１队的ＤＮＡ上样染液混合后加入第１个凝胶上样孔５０ｃＤＮＡ双链与１０Ｌ的ＤＮＡ上样染液混合后，分成２等份加入第，将以的ｐ２和３个凝胶上样孔。在２００Ｖ电压下电泳至溴酚蓝前沿完全移出凝胶。取出ＰＡＧＥ胶，￣〇６１１＾（１核酸染料（８１（＾１１１１１公司）染色２３１１１１１１２５５匕（１（＾，通过凝胶成像系统观察到卩２５一５在条带２５ｂｐ到４５０ｂｐ之间每隔ｂｐ有条带，其中１２ｂｐ最亮，据此用手术刀小心切下１００ｂｐ和９３ｂｐ大小的两条带。一ｍＬｎｕｃａｓ－ｅｅ用注射器针头，将个０．５离心管（ｌｅｅｆｒ）的底部刺穿后套入２ｍＬ离心管。将切下的胶块放入底部刺穿的〇．５ｍＬ离心管中，于１４０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ至所有ｘ凝胶落入下面的２ｍＬ离心管。加入１００Ｌ１ｅｌｅｌｕｔｉｏｎｂｕｆｅｒ，室温下轻柔的旋转离ｐｇ一Ｓ－心管２ｈ，或者放置过夜。将洗脱液和胶碎块转移到个ｐｉｎＸｆｉｌｔｅｒ的上部，于１４０００ｍｍ－ｉｐ离心２ｉｎ，弃收集液。继续加入１吣糖原，１０ｐＬ３Ｍ醋酸钠，３２５队的２（ＴＣ预２９ 广西大学博士学位论文中囯淮山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究１４０００ｒ２０ｍｉｎ。５００Ｌ７０％乙冷无水乙醇，立即室温下于ｐｍ离心去上清，加入ｐ醇洗漆沉淀。开盖室温瞭干后，加入１０ｉＬｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆｅｒ，即为测序用的ＳｍａｌｌＲＮＡ的ｆｃＤＮＡ文库。Ｉ－使用ｌｌｕｍｉｎａＧＡＩＩＸ测序仪进行单端测序（ＳｉｎｇｌｅＲｅａｄ），测序读长为３５ｎｔ，上机操作步骤见２．２．１３。２．２．１３ＧＡＩＩｘ上机开启ｃＢｏｔ，按照提示，检查废液瓶；开启ＧＡ主机和ＰＥＭｍｏｄｕｌｅ，检查ＧＡ控制ＳＢＳ２－．８。运行ＧＡ２ＰＥＭＰｒＷａｈｉ电脑磁盘空间，打开软件ｅｓｒｅｃｅ，量取液体体积是否＿ｐ在１８ｍＬ±１０％范围内。０＝ｘｎＭ浓：ｎＭｄＮａＯＨ将样本稀释到１度，换算公式为值（ｎｇ（ｓＤＮＡ）ｌ５１５）／ｂｐ；用Ｎ变性样本，将样本浓度稀释到１ｎＭ：１０ｎＭＤＮＡ２ｐＬ＋２ＮＮａＯＨ１ｎＬ＋ＥＢ或ＨｙｂＢｕｆｅｒ（）ｉ－１７Ｌ，室温变性５ｍｉｎ；用预冷的ＨｂＢｕｆｆｅｒ将ＤＮＡ稀释到终浓１８Ｍ：１ｉＬ？ｊｙ变性后度ｐｊＬ装－ｎＭＤＮＡ＋９９９１２０Ｌ到八连管中，从左到右为１８Ｆｌｏｗｃｅｌｌ的条形码边为ｎ；分ｎ，－第８条ｌａｎｅ。提前融化９６ｗｅｌｌｒｅａｇｅｎｔｌａｔｅ和ＨｂＢｕｆｆｅｒ；做完Ｃｌｕｓｔｅｒｅｎｅｒａｔｉｏｎ之前ｐｙｇ配好ＳＢＳ试剂，注意防止６号试剂（ｃｌｅａｖａｅｍｉｘ污染其它试剂ｇ）；ＬＦＮ加入ＩＭＸ之后过滤，然后加高保真ＤＮＡ聚合酶，充分混匀。－ｗ标记９６ｅｌｌｒｅａｇｅｎｔｐｌａｔｅ试剂高度；按提示装入ｆｌｏｗｃｅｌｌ，运行ｗａｓｈ程序，选择ｒｅｃｉｐｅ生成ｃｌｕｓｔｅｒ；运行结束之后检查试剂所剩余的量，如液面不齐或残液过多，暂停一下步操作。运行ＰｒｅＷａｓｈｒｅｃｉｐｅＶ８，量体积是否为１８ｍＬ±１０％，若体积异常，暂停后续操作，－７ｅ调整体积合适后再继续进行。放置１号试剂，运行ＰｒｉｍｒｅｃｉｐｅＶ８，量体积是否为６．４ｍＬ±１０％；在ｍａｎｕａｌｃｏｎｔｒｏｌ界面下选ｓｏｌｕｔｉｏｎ２８，ｖｏｌ０，６０／２０００，按回车键之后取下棱镜和旧的ｆｌｏｗｃｅｌｌ，取时尽量用左手操作，不可以碰到右侧激光头、调控杆等。用酒精和无尘纸擦洗棱镜，小心细致的擦尽残油，放回相应位置；小心的把做好ｃｌｕｓｔｅｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ的ｆｌｏｗｃｅｌｌ装好，在ｍａｎｕａｌｃｏｎｔｒｏｌ界面下选ｓｏｌｕｔｉｏｎ５，ｖｏｌ１００１００／２５００，按８００３ｌｌ回车键，量体积是否为ｐＬ±１０％，重复次，检查有无漏液；在ｍａｎｕａｃｏｎｔｒｏ界＝＝＝＝Ｇ面下选Ｌａｎｅ４ｃｏｌｌｔｉｌｅ３０按回车键，然后选ｚ０，，选ｒｅｅｎ／Ｎｏｎｅ／３检，，按回车键查＝＝＝＝ｘ０ｙ０和ｘ０ｙ３６０００状态下ｆｌｏｗｃｅｌｌ是否放直。小心的把１３０ｐＬ油从ｆｌｏｗｃｅｌｌ左后侧往前推加至ｆｌｏｗｃｅｌｌ底部全部被油浸润且棱镜边缘无油渗出；选Ｔｈｅｒｍｏｏｎ／ｏｆ三次，３０ 广西大学博士学位论文中国淮山筘病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物单的研究用手电筒检查Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｉｏｎ底部是否有油渍，如果有油溃，取无尘纸沾酒精小心擦拭后重复步骤４至步骤８。关好门，选择Ｖ８ｒｅｃｉｐｅ，机器开始运行。确认ｆｉｒｓｔｂａｓｅｒｅｐｏｒｔ和ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔ，ｏｏｄｎｅｓｓｏｆｆｉｔ爸０．９９００，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ兰３５０，符合标准后选择确认进ｇｙ。行测序，如不符合标准，联系应用工程师观察机器运行状态，运行期间及时补充试剂。运行完单端测序后如需要进行ｒｅａｄ２测序，按步骤１３至步骤１６进行，如果只是单端测－序，直接跳到步骤１７操作。提前融化ｐａｉｒｅｄｅｎｄｃｌｕｓｔｅｒｅｎｅｒａｔｉｏｎｋｉｔＶ４Ｒｅａｄ２，在试管ｇ壁上标注体积。根据ｒｅｃｉｐｅ提示进行ｐｒｉｍｅ，检查体积是否正常，按提示把试剂装在相应位置。运行ｒｅｃｉｐｅ，确认ＦｉｒｓｔＢａｓｅＲｅｐｏｒｔ。根据ｒｅｃｉｐｅ提示，取下试剂，检查用量，相应位置换回水。运行ＰｏｓｔＷａｓｈＶ８ｒｅｃｉｐｅ，运行期间将Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ文件夹上传到服务器上，新文件夹以ｆｌｏｗｃｅｌｌＩＤ、运行时期命名。完成ＰｏｓｔＷａｓｈ之后关闭ＰＥＭ和ＧＡ，文件传输完成之后关闭控制电脑。２２１４．．深度测序的生物信息学分析（Ｒｅａｄｓ）过ＣＬＣＧｅｎｏｍｉｃｓＷｏｒｋｂｅｎｃｈＶｅｒｓｉｏｎ６软件去除接测序所得的读段，通ａｄｓｅａｄｓ头、去除低质量Ｒｅ、去除污染等过程，从而获得符合分析条件的Ｒ，然后采用Ｔｒｉｎｉｔｙ算法对合格的Ｒｅａｄｓ进行办ｚｉｏｖｏ组装拼接获得Ｃｏｎｔｉｇｓ，再将这些Ｃｏｎｔｉｇｓ与ＮＣＢＩ的病毒数据库进行比对分析，从而发现病毒序列信息。２．２．１Ｓ淮山药病毒粒子的提取和形态观察°采集淮山药的新鲜叶片３于４Ｃ预冷后，置于液氮中１ｍｉｎ并研磨成粉末。加入ｇ０－ｍＭ３０ｍＬ预冷的０．０５ＭＴｒｉｓｃｉｒａｔｅＨ７．４０ｍＭＧ．０５Ｍ柠檬酸盐缓冲液［ｔ），１ＤＥＤＴ，５（ｐＥＤＴＡ０４％－ＶｉｔａｍｉｎＣ０＿５％ＴＧＡＮａ２％ＰＶＰＨ５．８４０００ｘｉ〇，．，，，勻浆后于（ｐ）］，ｇ离心ｍｉｎ。１／１００ａＣｌ１／２００．２Ｍ，经两层纱布过滤向上清液加入体积的１ＭＣ２和体积的－Ｎａ２ＨＰ〇４，２０ｍｉｎ。于６０００ｘ心１〇ｍｉｎ，取上清液并加入ＴｒｉｔｏｎＸ１００（５％搅拌，ｇ离Ｖ／Ｖ），搅拌均匀并于１３６，０００ｘｇ离心ｌｈ。用０．１Ｍ磷酸盐缓冲液０．１％ＴＧＡ－ＮａＨ［（ｐ°６．０］悬浮沉淀，加入崩溃酶（１％Ｗ／Ｖ；Ｓｉｇｍａ公司），混勻并在２８Ｃ搅拌孵育２ｈ。）于６０００ｘ离心１０ｍｉｎ之后取上清，小心加入用０．１Ｍ憐酸盐缓冲液配制的蔗糖２０％（，ｇｘ－Ｗ／Ｖ）之上，于９０，０００ｇ离心２ｈ，用０．０５Ｍ硼酸盐缓冲液［５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（ｐＨ８．０）］重悬沉淀，即为纯化的病毒粒子悬液。３１ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的研究一ｒｍｖａ取小滴纯化的病毒粒子悬液滴在腊片上，将覆有Ｆｏｒ膜的铜网扣在液滴上孵￣５ｍｉｎ２％２５ｍｉｎ铜网表面的液体，自然晾干，用育，然后经磷钨酸负染，用滤纸吸千－ｔａｃｈ－８０ＫＶ。日本Ｈｉｉ公司的Ｈ７６５０型透射电镜进行观察拍照，加速电压为６０２．２．１６淮山药的细胞病理观察ｘ取健康和感病显症的淮山药叶片切成１３ｍｍ的小叶块，分别放置于用０．１Ｍ的磷°Ｃ酸缓冲液（ｐＨ７．０）配制的２．５％戊二醛的固定液中，抽气至小叶块完全下沉，在４条件下固定３ｈ以上。吸去固定液后，用０．１Ｍ的磷酸缓冲液（ｐＨ７．０）漂洗３次，每次１５ｍｉｎ。然后吸去漂洗液，在通风橱中加入用相同的磷酸盐缓冲液配制的１％四氧化饿，固定ｌｈ。再吸出固定液，加入０．１Ｍ的磷酸缓冲液（ｐＨ７．０）漂洗３次，每次１５ｍｉｎ。吸去缓冲液，然后依次用５０％、７０％、８０％、９０％、９５％的乙醇进行梯度脱水，每次１５ｍｉｎ，＝然后用无水乙醇脱水２０ｍｉｎ，再１００％丙酮脱水２０ｍｉｎ。用包埋剂Ａ（丙酮：包埋剂１：１）＝ｌｈＢ（丙酮：包埋１：３３ｈ６ｈ浸泡，包埋剂剂）浸，纯包埋剂浸泡以上。最后将材料置于°ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管底部，在７０Ｃ条件下聚合过夜。Ｒｅ－ｉｃｈａｒｔＪｕｎＵＬＴＲＡＣＵＴＥ型超薄切片机上进行切样本经过定位和修块之后，在ｇ￣为６０８０ｎｍ，。然后将切片用醋酸铀和柠檬酸片，切片的厚度用２００目有膜载网收集？铅溶液进行双重染色，最后用ｄｄＨ２０清洗２０３０次，用滤纸吸去残余的水滴，自然晾－ｃｈ－８０ＫＶ。干后，用日本Ｈｉｔａｉ公司的Ｈ７６５０型透射电镜进行观察拍照，加速电压为６０２．３结果２．３．１淮山药病毒病田间症状一淮山药病毒病般在淮山药生长中后期才表现出明显症状。症状或因品种或因感病时间或因侵染病毒的种类和数量的不同差异较大。多数淮山药病毒病在初发病时出现明－２Ｂ）的花叶症状伴随叶面畸形显的褪绿斑，后发展形成典型的花叶症状（见图２；有－２－２（见图Ｃ）；有的出现黄化、花叶症状（见图２２Ｄ）；有的叶片发生变形扭曲，皱（见图２－２Ｅ）的叶片出现萎黄缩畸形并伴有褪绿斑；有、叶缘卷曲并伴随有坏死斑（见－图２２Ｆ），严重时整株萎蔫。有些淮山药病毒侵染植株会导致生长缓慢，整株矮化，地下块茎明显小于健壮植株的块茎。３２ 广西大举博士学位论文中国》山药■病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物举的研究１論图２－２中国淮山药病毒病主要症状类型Ａ：无症状Ｂ：花叶Ｃ：畸形、花叶Ｄ：；；；：黄化、花叶；Ｅ褪绿斑、皱缩畸形Ｆ：萎黄、坏死；Ｆｉｕｒｅ２－２ＳｍｔｏｍｓｏｆｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｉｏｆａｍｎｉｎｇｙｐｔｏｎｙｉＣｈａＡ：ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ；Ｂ：ｍｏｓａｉｃ；Ｃ：ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｍｏｓａｉｃ；Ｄ：ｙｅｌｌｏｗｉｎｇａｎｄｍｏｓａｉｃ；Ｅ：ｃｈｌｏｒｏｔｉｃｓｐｏｔｓ，ｃｒｉｎｋｌｅａｎｄｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎＦ：ｃｈｌｏｒｏｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓ；２．２．３淮山药田间发病率２０１０年７月至９月分别对广西的南宁市武鸣县、桂平市金田镇和鹿寨县寨沙镇等淮山药主产地以及南宁市广西大学农场的淮山药种植区的淮山药病毒病发生情况进行调査，并采集样本进行病原病毒鉴定。广西以种植桂淮系列等山药品种为主，其次为当地的淮山药品种，以及少量北方品种的淮山药，如铁棍山药（■Ｄ／ｏｓｃｏｒｅａｏｐｐｏｉ＾ａｃｖ．ＴＧ）等。？田间调查结果显示山药的发病率在７％４０％之间－（见２２Ａ），广西淮表，其中广西大学３３ 广ｗ大來博士举位论文中ｍａｆｅ■山苗病？病调查、诊断和病康病毒分子生物举的研究农场和广西农科院武鸣种植基地的淮山药发病率较低，桂平市金田镇和鹿寨县寨沙镇的淮山药发病率明显较高。２０１１年８月中旬扩大了淮山药病毒病调査采样范围，除了继续调査广西大学农场的淮山药种植区的病毒病发生情况，还对河南省温县和山东省寿光市淮山药病毒病发生情－况进行调査，田间调査结果显示（见表２２Ｂ），以种植铁棍山药为主的河南省温县淮’？％之间山药种植区，发病率在１６．６％１８．５。以种植日本大和长芋（１）１〇１５￡；０？＾０７７〇１？７〇（＾．／／ＤＨＣＹ）为主的山东省寿光市淮山药种植区，大量植株出现黄化和扭曲坏死的症状，平均发病率为５９．３％，部分田块的发病率髙达１００％。广西大学农场的淮山药发病率较前—年也有提高。２０１２年对江苏省徐州市、宿迁市、丰县等地的淮山药病毒病的发生情况进行了调查，一徐州市农科所和丰县大沙河镇种植的淮山药品种较为单，调査结果显示，徐州市农科所和丰县大沙河镇发病率分别为３．５％和２％，而种植品种较多的宿迁市的发病率为２９％（－２Ｃ。见表２）对不同品种的淮山药的病毒病发生情况进行统计，结果显示铁棍山药￣ｏ的发病率为１９％３７％，徐农紫药（￡＞／ｓｒｏｍｚａ／ａｔｏｃｖ．ＺＹ）和徐农白药（ＺＶｏｓｃｏｍａｔａ／ａｔｏ￣？ｃｖ－。．ＢＹ）的发病率为２％５％，其它品种的发病率在６％１５％之间（见表２３）３４ 广西大学博士学位论文中国推山苗病毒病调杳诊断和病康病毒分子生物学的研究、表２－２２０１卜２０１２年调查的淮山药病毒病发病率Ｔｂｌ－ａｅ２２Ｔｈｅａｅａｒｅｎｔｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆａｍｉｒｄｉｓｅａｓｅｓｉｎ２０１０ｔ２０１２ｐｐｖｕｓｅｓｏｙ畸形黄化褪绿斑萎黄调査地点花叶病株率花叶花叶皱缩畸形坏死（Ａ）２０１０年南宁武鸣县里建武帽农场２％３％２％００７％桂平市金田镇金田村１９％３％５％４％１％３２％桂平市金田镇彩村１７％５％１％３％０２６％桂平市金田镇茶林村１６％２％１％２％２％２３％柳州市鹿寨县寨沙镇寨沙村１３％１７％２％６％２％４０％广西大学农场２％４％３％２％０１１％（Ｂ）２０１１年．河南温县祥云镇下庄村１．２％２２％４．９％１０．２％０１８．５％０６％５％６２％３２％１．６％１６６％河南温县黄庄镇南韩村．．．．山东寿光市稻田镇３％７％０１０．．３％３９％５９３％广西大学农场１１％７％３％２％０２３％（Ｃ）２０１２年江苏徐州市农科所１％２．５％０００３．５％江苏宿迁市郊区７％９％３％６％４％２９％江苏丰县王沟镇２％１％０７％２．５％１２．５％江苏丰县大沙河镇２％００００２％广西大学农场５％３％２％２％３％１５％３５ 广西大学博士学位论文中国浪山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究－３表２２０１２年调查的淮山药各品种病毒病发病率ｂ－Ｔａｌｅ２３Ｔｈｅａｅａｒｅｎｔｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｍｓｅｃｉｅｓｖｉｒｕｓｅｓｄｉｓｅａｓｅｓｉｎ２０１２ｐｐｙｐ序号淮山药种类淮山药品种宿迁市徐州市丰县王沟镇丰县大沙河镇ＡＺ■－＞．ｏｐｐｏｓｉｔａ铁棍山药３７％１９％？－－ＢＤ，ｏｐｐｏｓｉｔａ大和长芋山药１２％ＣＤｏｏｓ－－－ｉｔａ麻山药１５％．ｐｐＤＤ－－－，ｏｐｐｏｓｉｔａ淮山药１１％ＥＤａｌａ－－２％ｔａ５％．徐农紫药ＦＤ■－－．ａｌａｔａ徐农白药２％ＧＤｏｏｓ－６％－ｉａ水山药８％．ｐｐｔ２．３．３小ＲＮＡ深度测序鉴定淮山药病原病毒为全面鉴定中国主要淮山药产区的淮山药病原病毒种类，我们从２０１１年采集的淮’山药样本中选择不同品种［广西的桂淮２号（Ｄ．ａｏｍｃａＣＶ．ＧＨ２）、桂淮５号（Ｄ．ａ／ｆｌ／ｆｌｙｐｃｖ．ＧＨ５）、桂淮６号（Ｄ．ａ／ａｔｅＣＶ．ＧＨ６）；河南的铁棍山药（Ｄ．ｃ＾ｏｊ如ｃｖ．ＴＧ）、太谷山药（Ｚ）．ｏｐｊｃｗ／ｔｅｃｖ．ＴＡＧ）和紫山药（Ｄ．ｆｌ／ａｔｏｃｖ．ＺＹ）；山东的大和长芋；江西的／、桂淮６号］和不同症状类型（无症状；花叶；畸形花叶；黄化、花叶；褪绿斑、皱缩畸形；萎黄、坏死）的淮山药样本提取ＲＮＡ，按照２．２．１２所述方法分别构建小ＲＮＡ的测序文库。取１ＭＬ构建好的ｃＤＮＡ文库克隆至ｐＣＲ２．１载体进行测序验证文库质量，随机挑取５个克隆进行测序，发现其中有３个克隆的测序结果显示为ｍｉｃｒｏＲＮＡ相关序列，说明构建的小ＲＮＡ测序文库质量较好。将这些测序文库混合后，采用基于ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡＩＩＸ平台的高通量测序技术进行深度测序，通过ＣＬＣＧｅｎｏｍｉｃｓＷｏｒｋｂｅｎｃｈＶｅｒｓｉｏｎ６ｂ８ｎ？。ｔ３０ｎｔ软件去接头和去低质量数据，最终获得了４００Ｍ的高质量数据筛选１的ｒｅａｄｓ，通过Ｖｅｌｅｔ软件组装，获得的Ｃｏｎｔｉｇｓ与ＮＣＢＩ的ｎｒ数据库进行ＢＬＡＳＴ比对分析。从ＷｎａｖＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ、ＢＢＷＶ－２和数据分析结果初步证实这些样本中存在／ｎ＾、ＣＹＮＭＶ一，另外还发现有个具有的典型特征的新病毒，暂命名为淮山药潜隐＇一ｍ病毒ＹＬＶ），有个具有Ｐｏｔｅｍｓ的典型特征的新病毒，暂命名一为淮山药Ｘ病毒（ｙａｗｖ／ｍｓＪｆ■ｅｏ／ｎｏＷｍｓ，ＹＶＸ），还有个具有Ｓｇ的典型特征的新病＇毒，暂命名为淮山药黄斑花叶病毒ｖｅｉＴｉｗｃｗｆｌ／ｃｖｚｍｓ，ＹＹＳＭＶ）。小ＲＮＡ深度测序并未鉴定到ＹＭＶ和ＣＭＶ。３６ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究２－．３４ＰＣＲ或ＲＴＰＣＲ检．测淮山药病原病毒２０１０年分别在广西大学农场、广西农科院经作所资源圃、广西南宁市武鸣县里建武帽农场、广西桂平市金田镇、广西柳州市鹿寨县寨沙镇共计５个地点３３个采样点采集淮山药样本１３８个。由于当年对侵染淮山药的病毒信息了解有限，只能根据文献报道的＿５油ａｖ－！ｍｓ、ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ、ＢＢＷＶ２、ＹＣＮＭＶ、ＣＭＶ和ＹＭＶ的简并引物或特异性弓丨物进行淮山药样本的病原病毒检测。检测结果显示共有１０６个样本可扩增出病毒条带，其中ＤＢＶ的阳性率最高，１０６个样本中有１００个样本携带ＤＢＶ，其次是ＹＭＭＶ（１０６个样本中有３８个样本携带ＹＭＭＶ），有３２个样本同时检测出上述两种病毒。在上述样本中未－－检测到ＪＹＭＶ、ＢＢＷＶ２、ＹＣＮＭＶ、ＣＭＶ和ＹＭＶ。病毒检测结果见表２４。２０１１年分别在广西大学农场、广西南宁市武鸣县里建武帽农场、广西柳州市融安县、江西省南昌县、河南省焦作市温县祥云镇下庄村、河南省焦作市温县黄庄镇南韩村、山东省潍坊市寿光市稻田镇共计７个地点１９个采样点采集淮山药样本１３８个。通过小ＲＮＡ深、ＪＹＭＶ、ＢＢＷＹ－２、ＣＹＮＭＶ度测序发现样本中存在及ＹＭＭＶ、ＹＶＸ、ＹＬＶ和ＹＹＳＭＶ，为扩大病毒检测种类，根据小ＲＮＡ深度测序获得的病毒序列信息，设计了ＹＹＳＭＶ－ＰＣＲ、ＹＬＶ、ＹＶＸ和ＣＹＮＭＶ的病毒检测引物。ＰＣＲ或ＲＴ检测结果显示，１０５个样本被病毒侵染，仍以ＤＢＶ的阳性率最高，１０５个样本中有５７个样本检测到ＤＢＶ，其次是ＹＭＭＶ（１０５个样本中有３８个样本检测到ＹＭＭＶ），再者是ＪＹＭＶ（１０５个样本中有３３个样本检测到ＪＹＭＶ）。在１０５个样本中检出１３个样本感染ＹＶＸ，１１个样本感染ＹＬＶ，。－１７个样本感染ＹＹＳＭＶ，有５９个样本为病毒复合侵染ＢＢＷＶ２只在铁棍山药和大和长＞芋山药上被检测到。上述样本均未检测到ＹＭＶ和ＣＭＶ。病毒检测结果详见表２４。２０１２年分别在江苏省徐州市、宿迁市和丰县３个地点１０个采样点采集淮山药样本８９一个。使用的病毒检测引物与２０１１年致。结果发现７８个样本被病毒侵染，其中ＹＬＶ的阳（７８３２ＹＬＶ）ＪＹＭＶ（７８３１性率最高个样本中有个样本检测到，其次是个样本中有个样ＪＹＭＶ）ＤＢＶ（７８个２９个ＤＢＶ）和ＹＭＭＶ（７８本检测到，再者是样本中有样本检测到个样本中有２９个样本检测到ＹＭＭＶ）。在７８个样本中检出１１个样本感染ＹＶＸ，３２个样ＹＬＶ－１２ＢＢＷＶ２。ＣＹＮＭＶ和ＹＹＳＭＹ７８本感染，个样本感染检出率较低的是，在个样本中的阳性样本分别只有２个和１个。有４７个样本为病毒复合侵染。在所有采集的淮山药样。病毒检测结果详见表２－４本中亦未检测到ＹＭＹ和ＣＭＶ。３７ 试ｔｆｅｓｐｓａｏ９＃ＪＵ＃ＩＳＩ鉗Ｕ！／ｉ９ｉｏ０Ｌ寸０Ｓ＞ｕｔｉ们ｊｚｓｖｏ寸ｅ６们１Ｐ１９ＺＺ９ＷＰ３．２９０ｚ￡Ａ９堪ｉｚｌＳ６，１＾ｏｏｏＺ０６ｎｌ１２８ｅＩ（Ｌ６Ｓ時艇ＡＳ巷Ｎ４？ＵＡｏｏｏ０〇０００１ｏ〇〇０００〇０００〇０－參，＞１ａａａＱａＱＱＱ６ｅ喇Ａｚｚｚｚｚｚｚｚ０ｏ〇〇０００Ｓ９０１〇ｉ￥驿堪＞２蛛Ｎ堰ＡａａａＱＱｎａＱｕｚｚｚｚｚｚｚｚ０ｏ〇〇００１０寸００〇Ｚ－ｒ按彐３－Ａ销Ｍ画ａｆｒＣＱｏｏ００ｏｏｏ００ｏｏＯ０００ＩｎＬ０寸０％ｎ＞ＩＡｌＡ９寸ｆ００００ｏ０ｌｏｉｔ０００３００Ｌ３ｏｏＺ（ＮＡＩＡＩｓＳ１／１ｅＣＮＡｉ６６＾９ｏｕ０ｎｏｅ〇０１（Ｎ００１６８Ｓ．Ｚ２ＥＸｕ＞ａａａＱａａａａ？ｆ寸ｓｔｏｏ０ｚｚｚｚｚｚｚｚ７〇０９Ｎ１９ｚ－ｎＡ（００ＳａｄＡｕ！．ｓｒａｓＳｓｕＡｏｏｏ０ｏｏｏ０〇ｏｏ〇００ｏ０００００００ｊｏｏｇＭｉＡａ３毅ＪｑＳＭ爷Ｉｕ运Ｕｏｏｏ０ｏｏｏ０〇ｏｏ〇００ｏ０００００００ｕｎ把鰹ｏｚｎＡｓ＾ｐ蓐ｌｏＳ鹏ｓ鋁ｊＳ＾ｄＡａａａＣＩａａａａ张ｓｚｚＮｚｚＨ－赋ＵＡｚｚｚ０ｏ〇Ｑ１００Ｚ０ｏ０ｌ２ｉｌ遯ｅ＝ｓＡＡｒｚ＾ＪｓＶＯｕＣＱＯｏ一－（ＮＮ「（ｉ＝ａｌｗ一ｎｚ０ｏｏ￡ｌ２摇Ｂ（Ｎ〔ｓ９（Ｎｅｇ６们６ｅ寸ｌｄ＿ｕ酬ｕｎｉＥ．￡ｉｓ１Ｓ一ｌｓ０６１ｅ６ｓ頦Ｓ惩ｉ一１Ｕ＜（ＮＮＩｉ６寸６ｓｌ１々９Ｚｆｊｚ＜ｅｅＺＳ１ｓ哦琛３ｏｓＪａ靼ｓ３ｓ３ｓｓａ３ｓ；．ｎ摩ｍ．、￣－－＇—ｉｓｑ＞ｓｓｓａｏｏｏ张ｌＭａｏｌｓｏａｏＳｓ３ｓｕ—ｓｖａｄａｄａｄ－ａｎ？ｌａｄ￣ｌｌＳ￣ａｄ＝ｌ￡ｉｌｖ＞ｖｏｖ—民—ｐｆｚＥ－ａ、ａｆａ／－ａｆ—、ａｆＰａｏａｏ．．．．．＇．．．．「．Ａｌｚ：Ｋ摇ａｃｄａＱｄ？ｓＱｄｉｉＪａａａＱＱａＱＱａｄＱｄｄｚＡＩＯ＝Ｉｐ－（ＵＨ輙装Ｏｚ二００９寸ＩｚｃｓｐＷ８９（Ｎ寸￡ｎ３Ｉ蛏Ｊ孙畝Ｐｕｑ３Ｊ二．迤３－：Ｅ＝ＪＳＩ１Ｊ揪＜？Ｔ州＾幾Ｉ３ｐｔ．３：－ｌｓ．＊－Ｅ霱适震－Ｅ５Ｉ寡ｐＨ蠢；ｉＱＴ＇ｌ－；」Ｈａ寸、Ｈ１Ｈ雲£ＩＥ玲■Ｓ＊■ｏＪ．．．：ｎ：？＇．轴——．？—ｚｎ萆ｆ－ＪＪＭ－Ｕ－＞．Ｖ＜ＮＪ．Ｕ＞｛＜来－ｔ３１“：（Ｎ「ｏｏｏ０Ｅｑ＝ｌＺｚｚ°．ｉｌＵ＝ＩｌＧ－Ｅｌ，ｏＸｏｓ０ｏＯｏｚ／＾ｓｚｚｉｚｉＺＮｓＳｚＺｓｚ ？病毒病调查广西大学体士学位论文中国淮山ＪＳ、诊断和病服病毒分子生物学的研究病毒检测结果显示，在采集的所有淮山药品种都受到ＤＢＶ的侵染，南方种植的山药品种中ＤＢＶ检出率较高（参薯中ＤＢＶ检出率为７１．１％，日本薯蓣中ＤＢＶ检出率为°６６．７／。）北方种植的普通山药中ＤＢＶ的检出率较低１９Ｖ．９％。ＹＹＳＭ，，仅为在北方种植的普通山药的检出率为１２．５％，在南方种植的参薯中未检测到该病毒，在日本薯蓣中的检出率只有１．１％。ＹＶＸ只在参薯中检测到．２％。ＹＭＭＶ在参薯中的检，检出率为１６出率较高（４９．３％）。ＪＹＭＶ主要侵染普通山药，检出率为４３．４％，在日本薯蓣中的检３ＷＶ－出率只有．４％。ＢＢ２和ＹＬＶ只在普通山药％和。中检测到，检出率分别为７．６３．１６％１ＣＹＮＭＶ的检出率比较低，在参薯的检出率为０．７％，在普通山药中的检出率为４．４％。ＹＣＮＭＶ，在参薯中检测到检出率为０．７％。在检测的淮山药样本中发现普遍存在两种４４．４％及两种以上病毒复合侵染的现象，其中参薯中检测出的病毒复合的比率为，在日４－１３８％，６．３％２３。本薯蓣中为．而在普通山药中为（见图）８０．０ｎ＿７７１１ＤＢＶ＾７００■－ＶＹＶＭＶ＾－｜６０．０■？ＶＶＸ■５〇—－．〇ＹＭＭＶ！■■．．Ｉ＾４０－＿ＪＹＭＶ．０■Ｉ■■■■Ｂ－３〇－ＢＢＷＶ２．ｏＩＩＩＩＩｈＩ２。。－ｉ■』ｌ■＾ｍｉ：■ＹＣＮＭＶ：．ｔａＤａ．ｏｏｓｔａＤ．ａｌａ．ｊｐｏｎｉｃａＤｐｐｉＹａｍｓｅｃｉｅｓｐ图２－３淮山药病毒检出率－ｍｕＦｉｕｒｅ２３ＰｏｓｔｖｅｄｅｔｅｃｔａｂｒａｔｅｏｆｖｒｕｎｄｔｎｔｏｎｓｎｎａｇｉｉｌｅｉｓｅｓａｌｉｐｌｅｉｆｅｃｉｉＣｈｉ２ＹＹＳＭＶ．３．５的传播介体一些铁棍山药植株上发现有粉蚧存在田间调查时，在，并且表现出比较明显的病毒病症状，经ＰＣＲ检测到这些植株被ＹＹＳＭＶ侵染。取病株上的粉蚧提取ＤＮＡ，用ＹＹＳＭＶ的特异性检测引物进行ＰＣＲ检测显示为阳性。从病株上取若干粉蚧放置在ＹＹＳＭＶ阴３９ ■广西大学ｔ謇士学位论文中国谁山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究（－）性的铁棍山药植株上迸行传毒，两个月后植株表现出明显的黄脉花叶症状见图２４Ａ，ＭＶ侵染－Ａ进行（见图取叶片提取ＤＮ检测，证实其被ＹＹＳ２４Ｃ）。Ｍ１２３ＡＡＢＣ图２－４ＹＹＳＭＶ的传播介体：传播ＹＹＳＭＶ的粉蚧Ａ：用粉蚧传毒后铁棍山药叶片表现出明显的黄斑花叶症状；Ｂ；Ｃ：ＰＣＲ检测经粉蚧传毒的植株和传毒粉蚧的带毒情况Ｍ－－：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｆｒ２：ｉｔｖ：ｌＯＯｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ；ｈＹＹＳＭＶｅｅ植株，ＹＹＳＭＶｐｏｓｉｅ植株，３传毒粉蚧－ｍＹＹＶＦｉｕｒｅ２４ＴｒａｎｓｉｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆＳＭｇＡ：ｅｌｌｏｗｓｏｔｍｏｓａｉｃｓｙｍｔｏｍａｐｐｅａｒｅｄｏｎｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆＤ．Ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＴＧ（ＹＹＳＭＶＰｏｓｉｔｉｖｅｗｈｉｃｈｙｐｐ）ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｂｙｍｅａｌｙｂｕｇｓ｛Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓｃｉｔｒｉ）＼Ｂ：ｍｅａｌｙｂｕｇ（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓｃｉｔｒｉ）；Ｃ：ｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄｌａｎｔｓａｎｄｍｅａｌｂｕＰｌａｎｏｃｏｃｃｕｓｃｉｔｒｉＭ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１ｋｂｌｕｓＤＮＡｌａｄｄｅｒ＼；ｐｙｇ（）ｐＶ－Ｖ－ｗ１：ＹＹＳＭｆｒｅｅｌａｎｔ２ＹＹＳＭｏｉｉｖｌｔ３：ｌｂｕＰｌａｎｏｃｏｃｃｕｓｃｉｒｉｉｔｈＹＹＳＭＶｐ：ｓｔｅａｎｍｅａｓｔ；ｐ；ｙｐｇ｛）２．３．６ＹＹＳＭＶ的部分田间寄主鉴于粉蚧可传播ＹＹＳＭＶ，为明确ＹＹＳＭＶ的田间寄主，采集若干常见的生长在淮ＹＹＳＭＶ７０％？山药周边的田间杂草，使用带毒率为９０％的粉蚧进行传毒试验，待接种－的淮山药叶片显症后，发现杂草并不表现出明显病毒病症状（见图２５）。提取待测植ＳＭＶＳＭＶ－Ｆ株的总ＤＮＡ并用ＹＹ的特异性检测引物ＹＹ／Ｒ进行ＰＣＲ检测是否感染ＹＹＳＭＶ，结果显示马唐、反枝苋、皱果苋和牛筋草中均存在ＹＹＳＭＶ（见图２４）。４０ 广西大掌博士学位论文中国淮山药病毒病调查、诊断和病服病毒分子生物学的研究＾ｉｒ１图２－５用于ＹＹＳＭＶ检测的植物—？Ａ：铁棍山药Ｓ：Ｓ（ＹＹＭＶ阴性）；Ｂ铁棍山药（ＹＹＭＶ阳性）；Ｃ：叶荻，Ｄ：马唐Ｅ：反枝苋Ｆ：：：红：；；皱果苋；Ｇ牛筋草；Ｈ花酢浆草；Ｉ小叶冷水花Ｆｒｅ－ｔｓｕｔｏｎｉｇｕ２５ＰｌａｎｓｅｄｆｏｒＹＹＳＭＶｄｅｔｅｃｉＡ．ｉａｖ．ｉ．ｏｓｉｖ．ＴＧｖｅ：ＤＯｏｓｔｃＴＧＹＹＳＭＶＮｅａｔｖｅＢ：ＤＯｔａｃＹＹＳＭＶＰｏｓｉｔｉｐｐ（ｇ）；ｐｐ（；）Ｃ：ＦｌｕｅａｓｕｒｕｔｉｃｏｓａＰａｌｌ．Ｂａｉｌ．Ｄ：ＤｉｉｔａｒｉａｓａｎｕｉｎａｌｉｓＬ．Ｓｃｏ．Ｅ：ＡｍａｒａｎｔｈｕｓｒｅｔｒｏｆｌｅｘｕｓＬ．ｆｌｇｇ；；；（）ｇｇ（）ｐＦ：ＡｍａｒａｎｔｈｕｓｖｉｒｉｄｉｓＬ．Ｇ：ＥｌｅｕｓｉｎｅｉｎｄｉｃａＬ．Ｇａｅｒｔｎ．；（）；Ｈｉ．ｉｉ．：ＯｘａｌｓｃｏｒｂｏｓａＤＣＩ：ＰｌｅａｍｃｒｏｈｌｌａＬＬｉｅｂｍｙｍ；ｙ（ｐ）４１ 国灌山药■病毒病调音广西大学彳荨士学位论文中、诊断和病康病毒分子生物学的研究５００—ｂｐ２－６ＭＶ的电泳分析图ＰＣＲ检测ＹＹＳＢＹＹＭＶ阳一Ａ：（ＹＹＭＶ阴性）：铁棍山药Ｓ）；Ｃ：；铁棍山药Ｓ；（性叶荻Ｄ：马唐；Ｅ：反枝苋；Ｆ：皱果苋；Ｇ：牛筋草；Ｈ：红花酢浆草；Ｉ：小叶冷水花－ＭＶｔｔＦｒｅ２６ＹＹＳｄｅｅｃｉｏｎＰＣＲｎｔｉｅｌｔｒｒｅｓｓｂｙｉｄｅｉｆｄｂｙｅｌｅｅｃｏｈｏｉｉｇｕｇｐＭ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１ｋｂＤＮＡｌａｄｄｅｒＡ：Ｄ．Ｏｏｓｉｔａｃｖ．ＴＧＹＹＳＭＶＮｅａｔｉｖｅ；；ｐｐ（ｇ）Ｂ：Ｄ．Ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＴＧ（ＹＹＳＭＶＰｏｓｉｔｉｖｅ）；Ｃ：Ｆｌｕｇｇｅａｓｕｊｆｒｕｔｉｃｏｓａ（Ｐａｌｌ．）Ｂａｉｌｌ．；Ｄ：Ｄｉｇｉｔａｒｉａｓａｎｇｕｉｎａｌｉｓ（Ｌ．）Ｓｃｏｐ．；Ｅ：ＡｍａｒａｎｔｈｕｓｒｅｔｒｏｆｌｅｘｕｓＬ．；Ｆ：ＡｍａｒａｎｔｈｕｓｖｉｒｉｄｉｓＬ．Ｇ：ＥｌｅｕｓｉｎｅｉｎｄｉｃａＬ．Ｇａｅｒｔｎ．；（）；ＨｘａｉｓｃｏｒｍｂｏｓａＤＣ．Ｉ：ＰｉｌｅａｍｉｃｒｏｈｌｌａＬ．Ｌｉｅｂｍ：Ｏｌｙ；ｐｙ（）２ＹＬＶ和ＢＢＷＶ－２病毒．３．７侵染淮山药的粒子的形态特征－Ｙ－ＤＴ－１）取经ＲＴＰＣＲ检测ＹＬＶ和ＢＢＷＶ－２为阳性的日本大和长芋山药ＣＤＨＣ的－２．２．４７Ａ）．２．３，然后按１新鲜叶片（见图２，按照２１所述方法提取病毒粒子并进行纯化照ＹＬＶ的病毒粒子为线形１５ｎｍ、所述方法观察病毒粒子形态，，直径约。观察结果显示－（－长约７００ｎｍ见图２７Ｂ，ａ）和直径约３０ｎｍ的球形病毒粒子（见图２７Ｂ，ｂ）存在，分别符合香石竹潜隐病毒属（Ｃａｒ／ａｖ／ｍｙ）和蚕豆病毒属的病毒粒子形态特征。４２ 山药■广西大学■博士学位论文中国淮病毒病调查、诊断和病厩病毒分子生物学的研究＼、？气，纖／議１＂Ｗｍ％邏２００ｎｍ｜ＡＢ２－７ＹＬＶ的病毒粒子图形态Ａ－２：被ＹＬＶ和ＢＢＷＶ侵染的大和长芋的症状；Ｂ：纯化的ＹＬＶ病毒粒子（箭头所示２％，２００ｎｍ）用磷钨酸负染右下角标尺长度为Ｆｒｅ－ＹＬＶ２７ｔｒｍｃｒｏｒｈｏｆｖｒｕｓｔｉｌｓｏｆｉｇｕＥｌｅｃｏｎｉｇａｐｓｉｐａｒｃｅＡ．ＳｔｏｍｓｏｆＤ．ｏｏｓｉｔａｃｖ．ＤＨＣＹｉｎｆｅｃｔｅｄｂＹＬＶａｎｄＢＢＷＶ２ｙｍｐｐｐｙ；Ｂ：ＰｕｒｉｆｄｖｉｒｕｒｔｉｌｅｓｏｆＹＶｎｏｗｗａｓｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈ２％ＰＴＡ．Ｔｈｅｂａｒｒｅｒｅｓｅｎｔｓ２００ｎｍｉｅｓｐａｃＬ（ａ）ｐ２．３．８受病毒侵染的铁棍山药叶片的细胞病理变化２－．３＿８＿１受ＢＢＷＶ２侵染的铁棍山药叶片的细胞病理变化取生长中期的受ＢＢＷＶ－２寿光分离物侵染的铁棍山药叶片进行细胞病理超微结构－２的观察铁棍山药叶片的细胞严重空泡化，叶绿体解体，片层，结果发现感染ＢＢＷＶ－结构紊乱（图２８Ｂ）部分细胞出现明显的膜增生，逐步形成特殊的膜增生区域（图；－－２８Ｃ），基质增多，产生周边小泡（图２８Ｄ）还有些细胞的叶绿体膨胀变圆；病变；一２－细胞中的叶绿体内多产生空泡结构（图８Ｅ）；还在些叶肉细胞中观察到大量病理－８Ｆ）性囊泡结构，周边存在大量病毒粒子（图２。４３ 广西大举博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究Ｆ犠雇：＿狐＿图２－８感染ＢＢＷＶ－２的铁棍山药细胞超微结构变化Ａ：正常的叶细胞；Ｂ：细胞严重空泡化，叶绿体解体，片层结构紊乱；Ｃ：细胞中的膜增生区域（箭头）Ｄ：叶绿体膨胀变圆，基质增多，产生周边小泡（箭头；）；Ｅ：病变细胞中的叶绿体内产生空泡结构（箭头）；Ｆ：细胞产生大量病理性囊泡结构，周边存在大量病毒粒子；ＣＨ：：：：：叶绿体；ＣＷ细胞壁；Ｍ线粒体；Ｎ细胞核；Ｓ淀粉粒；Ｖ：病毒粒子－ｗＶ－－Ｆｉｕｒｅ２８Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ．ｉｔ．ｇＤｏｐｐｓａｃｖＴＧｌｅａｆｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｉｔｈＢＢＷ２ＳＧ１ｉｓｏｌａｔｅｓＡ：ｎｏｒｍａｌｌｅａｆｃｅｌｌＢ：ｓｅｖｅｒｅｃｅｌｌｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎｃｈｌｏｒｏｌａｓｔｄｉｓｉｎｔｅｒａｔｉｏｎａｎｄｌａｍｅｌｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉｓｏｒｄｅｒ；，ｐｇ；Ｃ：ｃｅｌｌｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｍｅｍｂｒａｎｅａｒｅａａｒｒｏｗ）；Ｄ：ｃｈｌｏｒｏｌａｓｔｅｘａｎｓｉｏｎ，ｍａｔｒｉｘｉｎｃｒｅａｓｅ，ｓｍａｌｌｅｒｉｈｅｒａｌｐ（ｐｐｐｐｂｕｂｂｌｅｓ（ａｒｒｏｗ）；Ｅ：ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎｉｎａｂｎｏｒｍａｌｃｅｌｌｓａｒｒｏｗ；（）ｕ－Ｆ：ａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｖｉｒｕｓａｒｔｉｃｌｅｓｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎａｔｈｏｌｏｉｃａｌｖｅｓｉｃｌａｒｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｐｇｐｇ；ＣＨ：ｃｈｌｏｒｏｌａｓｔＣＷ：ｃｅｌｌｗａｌｌＭｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａＮ：ｎｃｌｅｕｓＳ：ｓｔａｈｒａｉＶ：ｉｓｔｉｃｌｅｐ；；：ｕｒｃｎｓｖｒｕａｒｓ；；ｇ；ｐ２．３．８．２受ＪＹＭＶ侵染的铁棍山药叶片的细胞病理变化取生长中期的受ＪＹＭＶ温县分离物侵染的铁棍山药叶片进行细胞病理超微结构观察，结果发现感染ＪＹＭＶ的铁棍山药叶片的细胞空泡化或细胞器解体，细胞结构紊乱（图４４ ？病毒病调音诊断和病康病毒分子生物牟的研究广西大学体士举位论文中国淮山药、２－９Ｂ）部分细胞产生膜增生区域－（图２９Ｃ）有的细胞的叶绿体肿大变圆，内部产；；－９－生空泡结构（图２Ｄ）；大部分病变细胞中的叶绿体膜结构松散，甚至消失（图２９Ｅ）；一还在些细胞中可观察到病毒粒子富集区－（图２９Ｆ）。：囔＿＿图２－９感染ＪＹＭＶ的铁棍山药细胞超微结构变化Ａ：：细胞空泡化，细胞结构散乱或解体：正常的叶细胞；Ｂ；Ｃ膜增生（箭头）；Ｄ：叶（绿体肿大变圆，内部产生空泡结构箭头）；Ｅ（：病变细胞中的叶绿体膜结构松散，甚至消失箭头）Ｆ：；；细胞内出现病毒粒子富集区ＣＨ：叶绿体；ＣＷ：细胞壁；Ｍ：线粒体；Ｖ：病毒粒子－Ｄ－Ｆｕｔｒｔｒｕ．ｓｖ．ＴｅｎｔｔＹＭＶＷＸ１ｉｇｒｅ２９ＵｌａｓｃｔｕｒｅｏｆｏｐｐｉｔａｃＧｌｅａｆｃｌｌｓｉｆｅｃｅｄｗｉｈＪｉｓｏｌａｔｅｓＡ：ｎｏｒｍａｌｌｅａｆｃｅｌｌＢ：ｃｅｌｌｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎｃｅｌｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｓｃａｔｔｅｒｅｄｏｒｄｉｓｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ；，ｇ；Ｃ：ｍｅｍｂｒａｎｅｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ（ａｒｒｏｗ）；Ｄ：ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｅｘｐａｎｓｉｏｎａｎｄｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎ（ａｒｒｏｗｓ）；Ｅ：ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｍｅｍｂｒａｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｌｏｏｓｅ，ｏｒｅｖｅｎｄｉｓａｐｐｅａｒ（ａｒｒｏｗ）；Ｆ：ｖｒｕｓｉｌｎｒｚｏｎｅｉｎｔｈｅｖａｌｉｚｉｐａｒｔｃｅｓｅｉｃｈｅｄｃｕｏｅｄｃｅｌｌ；ＣＨ：ｃｈｌｏｒｏｌａｓｔＣＷ：ｃｅｌｌｗａｌｌＭ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａＶ：ｖｉｒｕｓａｒｔｉｃｌｅｓｐ；；；ｐ４５ 广西大学？博士学位论文中国浪山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究２．３．９受ＹＭＭＶ侵染的桂淮５号叶片的细胞病理变化取生长中期的受ＹＭＭＶ南宁分离物侵染的桂淮５号叶片进行细胞病理超微结构观察，结果发现感染ＹＭＭＶ的桂淮５号叶片的细胞严重空泡化，叶绿体膨大，增生（图－２－（１０Ｃ１０Ｂ）；部分细胞的叶绿体周边产生大量病理性囊泡结构图２）；还有些叶绿－，１０Ｄ）也观察到叶绿体周边出现大体膨胀变圆，基质增多片层结构紊乱（图２；同时一－２－量病毒粒子（图１０Ｅ）；还在些细胞中的线粒体发生畸形，空泡化（图２１０Ｆ）。＿罾變隱國２－图１０感染ＹＭＭＶ的桂淮５号细胞超微结构变化：正常的叶细胞：，，Ａ；Ｂ细胞空泡化叶绿体膨大增生；Ｃ：叶绿体周边产生大量病理性囊泡结构（箭头）；Ｄ：叶绿体膨胀变圆，基质增多，片层结构紊乱；Ｅ：叶绿体周边出现大量病毒粒子（箭头）；Ｆ：线粒体畸形，空泡化；ＣＨＣＷＭＳＶ：叶绿体；：细胞壁；：线粒体；：淀粉粒：病毒粒子；－－Ｆｉｕｒｅ２１０ＵｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＤ．ａｌａｔａｃｖ．ＧＨ５ｌｅａｆｉｇｃｅｌｌｓｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＹＭＭＶＮＣ１ｉｓｏｌａｔｅｓＡｒｌｅｌｌＢ：ｌｌｖａｌｉｚａｔｉｈｌｏｒｏｌｈｒｌｉ：ｎｏｍａｌａｆｃｅｃｅｃｕｏｏｎｃａｓｔｅｘａｎｄ，ａｎｄｅａｓａ；，ｐｐｙｐｐ；Ｃ：ａｌａｒｅａｍｏｕｎｔｏｆａｔｈｏｌｏｉｃａｌｖｅｓｉｃｌｅｓｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｃｈｌｏｒｏｌａｓｔａｒｒｏｗｓ；ｇｐｇｇｐ（）Ｄ：ｃｈｌｏｒｏｌａｓｔｅｘａｎｓｉｏｎｍａｔｒｉｘｉｎｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｌａｍｅｌｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉｓｏｒｄｅｒｐｐ，，；４６ 广西大本博士举位论文中国淮山药病毒病调查、诊断和病厥病毒分子生物学的研究Ｅ：ａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅｓｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ（ａｒｒｏｗｓ）；Ｆ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｍａｌｆｏｒｔｉｏｎａｎｄｖａｃｕｏｔｍａｌｉｚａｉｏｎ；ＣＨ：ｃｈｌｏｒｏｌａｓｔＣＷ：ｃｅｌｌｗａｌｌＭ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａＳ：ｓｔａｒｃｈｒａｉｎｓＶ：ｖｉｒｕｓａｒｔｉｃｌｅｓｐ；；；ｇ；ｐ２．３．１０受ＹＶＸ和ＹＭＭＶ复合侵染的紫山药叶片的细胞病理变化取生长中期的受ＹＶＸ徐州分离物和ＹＭＭＶ徐州分离物复合侵染的紫山药叶片进行细胞病理超微结构观察，结果发现感染ＹＶＸ和ＹＭＭＶ的紫山药叶片的部分细胞畸－－还有些形和结构散乱（图２１１Ｂ）有的细胞严重增生，内含病毒粒子（图２１１Ｃ）；；一（－Ｄ还有图２１，Ｅ）细胞的叶绿体周边产生大量结构松散的泡状结构１；些细胞严重－畸形皱缩，细胞器解体（图２１１Ｆ）。調＿ｍｍ２－ＭＭＶ的图１１感染ＹＶＸ和Ｙ紫山药细胞超微结构变化Ａ：正Ｂ：Ｃ：细胞严重增生，内含病毒粒子常的叶细胞；细胞畸形、结构散乱；；Ｄ：叶绿体周边产生大量结构松散的泡状结构；Ｅ：叶绿体周边产生空泡结构（箭头）；，细胞器解体Ｆ：细胞严重畸形皱缩；ＣＨ：叶绿体ＣＷ：细Ｍ：；Ｎ：细胞核；Ｓ：；Ｖ：；胞壁；线粒体淀粉粒病毒粒子４７ 广Ｗ大黎博士举位论文中国淮山苗病毒病调査、诊断和病屎病毒分子生物举的研究－－ｔｔｌＹｌｆ－Ｆｉｕｒｅ２１１ＵｌｔｒａｓｒｕｃｕｒｅｏｆｃｅｌｌｓｉｃｔｅｄｗｉｔｈＸＺ１ｄＹＭＭＶＸＺ１ｉｓｌｔｇＤ．ａａｔａｃｖ．ＺｅａｎｆｅＹＶＸａｎｏａｅｓＡ：ｎｏｒｍａｌｌｅａｆｃｅｌｌ；Ｂ：ｃｅｌｌｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｓｃａｔｅｒｅｄ；ｆｅｒａｔ－ＣｉｔＤｌｌｆｌｉｋｔ：ｓｅｖｅｒｅｃｅｌｌｒｏｌｉｉｏｎｗｉｔｈｖｒｕｓａｒｉｃｌｅｓ：ａａｒｅａｍｏｕｎｔｏｆｏｏｓｅｏａｍｅｓｒｕｃｔｕｒｅｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎ；ｐｐｇｇｃｈｌｏｒｏｌａｓｔＥ：ｖａｃｕｏｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｃｈｌｏｒｏｌａｓｔａｒｒｏｗｓｐ；；ｇｐ（）Ｆ：ｓｅｖｅｒｅｃｅｌｌｓｈｒｉｎｋａｇｅａｎｄｏｒｇａｎｅｌｌｅｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ；ＣＨ：ｃｈｌｏｒｏｌａｓｔＣＷ：ｃｅｌｌｗａｌｌＭ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａＮ：ｎｕｃｌｅｕｓＳ：ｓｔａｒｃｈｒａｉｎｓＶ：ｖｉｒｕｓａｒｔｉｃｌｅｓｐ；；；；；ｇｐ２４．讨论１０ＹＭＶ、ＪＹＭＶ、ＹＭＭＶ、目前己经报道的侵染淮山药的病毒超过种，包括ＣＹＮＭＶ－、。、ＹＣＮＭＶ、ＢＢＷＶ２ＤＢＶ、ＤｂＢＶ、ＤＬＶ和ＣＭＶ等本研究采用深度测序技术对采自中国主要淮山药产区的具有典型病毒病症状的淮山药混合样本进行深度测序分析，从中检测出的病毒至少有９种，其中包括２种ＤＮＡ病毒（ＤＢＶ和ＹＹＳＭＶ）－２和７种ＲＮＡ病毒（ＹＭＭＶ、ＹＶＸ、ＪＹＭＶ、ＢＢＷＶ、ＣＹＮＭＶ、ＹＬＶ和ＹＣＮＭＶ）。ＹＹＳＭＶ、ＹＶＸ和ＹＬＶ为本研究首次发现的新病毒。在广西和江西只发现ＤＢＶ、ＹＭＭＶ和ＹＶＸ侵染桂淮２号、５号和６号等桂淮系列淮山药，在河南和山东发现ＪＹＭＶ、ＢＢＷＶ－２、ＣＹＮＭＶ、ＹＬＶ侵染铁棍山药、太古山药和日本大和长芋等北方山药品种（见表＿。２６）１１３一提的是［］值得，ＹＭＶ在非洲和美洲普遍存在，而且常造成严重减产，本研究并［ｍ］［８（）一未检测到ＹＭＶ侵染在中国种植的淮山药。而ＣＭＶ和ＤＬＶ￥前仅在南非些国家的淮山药有发现，本研究也未检测到ＣＭＶ侵染在中国种植的淮山药。据国外研究报道ＤＬＶ属于但是未见其核苷酸序列的报道，因此无法分析本研究发现的ＹＶＸ与ＤＬＶ的同源性。由于本研究采样范围集中在五个省区，分析样本量不大，是未检测一到ＹＭＶ和ＣＭＶ侵染淮山药的可能原因之，也有可能是中国与国外的淮山药种质资源交流比较少，这两种侵染淮山药的病毒还未传入国内，还有可能是中国当地的淮山药品种对这两种病毒有抗性。就我国而言，ＤＢＶ和ＹＭＭＶ在全国各地均有发现，而其它一病毒的分布具有定的区域性，如目前ＹＣＮＭＶ仅在云南和广西有发现。在河南和江苏。的淮山药上发现的病毒种类最多，均达到８种在调査中国的广西、江西、河南、山东和江苏等地的病毒病发生情况的过程中，发现不同地区不同品种的淮山药的病毒病发病率差异较大。其中广西和江西主要以种植参４８ 广西大单博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究、薯和日本薯蓣为主，感染的病毒主要为ＤＢＶＹＭＭＶ和ＹＶＸ，而且这三种病毒共侵染的现象很普遍，甚至在部分田块的病毒病发病率可高达４０％。河南、山东和江苏等北方省份主要种植铁棍山药、太谷山药、水山药、麻山药、日本大和长芋山药等普通山药品－２种，感染的病毒主要为ＤＢＶ、ＹＭＭＶ、ＣＹＮＭＶ、ＢＢＷＶ、ＪＹＭＶ、ＹＬＶ和ＹＶＸ。病毒共侵染的现象很普遍，其中紫山药易受ＹＭＭＶ和ＹＶＸ共侵染，铁棍山药易受－ＹＭＶＹＹＳＭＶ、ＢＢＷＶ２、ＪＹＭＶ和ＹＶＸ共同侵染，水山药易受Ｊ、ＹＬＶ、ＹＭＭＶ和ＢＢＷＶ－２共同侵染。中国各淮山药产区根据各自的地理位置和气候特点选择种植的品，因而各产区种植的淮山药品种差异较大种，病毒病发生情况差异也较大。例如，２０１２￣年的田间调査发现江苏省宿迁市、徐州市和丰县的铁棍山药的发病率在１９％３７％之间，？５％６％？而徐农紫药和白药的发病率较低，在２％之间，其他品种的发病率在１５％之间。有些淮山药老产区的病毒病发生情况严重，在山东寿光市稻田镇的部分田块的病毒病发病率高达１００％。在南北方由于气候不同，种植的淮山药品种存在差异，淮山药病毒的种类和序列相似性存在差异，但是随着南方和北方淮山药种质资源的交流日益频繁，可能导致淮山药病毒的复合侵染现象更加普遍，病毒病的发生情况更加严重，对淮山药的生产威胁更大，因此需要在淮山药病毒病的监测和种质检疫方面予以重视。本研究发现粉蚧可传播ＹＹＳＭＶ，而且存在多种田间寄主植物，应在生产上重视防控粉阶，同时注意清除田间杂草，特别是马唐、反枝觅、皱果苋和牛筋草等可传播ＹＹＳＭＶ。的杂草今后还需要对侵染中国淮山药的病毒的寄主范围和传播方式进行研究，为防控这些病毒提供指导。－２不同淮山药品种受不同病毒侵染引起的细胞病变较为相似。ＢＢＷＶ、ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ和ＹＶＸ侵染淮山药均可引起线粒体和叶绿体异常。线粒体异常可能与病毒侵染所需的能量有关，而叶绿体异常则是由于病毒侵染破坏了寄主的光和系统。在这几种病毒侵染的淮山药的叶细胞中均发现膜增生现象，通常认为膜增生结构是由内质网（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ＥＲ）衍生出来的。ＹＭＭＶ和ＹＶＸ混合侵染导致的淮山药叶细胞病变程度加重，这与植株的花叶症状表现加重是相关的。目前国际上对病毒侵染的淮－２山药细胞的病理学变化研究几乎是空白，本研究从细胞和亚细胞水平展示ＢＢＷＶ、ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ和ＹＶＸ侵染淮山药造成的病理学变化，为相应病毒的细胞学水平上的诊断提供参考，也为更深入地了解和控制这些病毒奠定了基础。４９ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调查诊断和病康病毒分子生物学的研究、第三章中国淮山药病原病毒的分子生物学特性分析３．１引言测定病毒的基因组全长序列和表征其分子生物学特性是进行分子病毒学和分子流４２［］行病学研究的基础。ＹＭＶ是最早进行全基因组测序的淮山药病毒，在非洲广泛流行。Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ等分析了６个ＹＭＶ分离物的ＰＩ、ＨＣ、Ｐ３、Ｎｉｂ和ＣＰ区域，发现ＹＭＶ存４４一［］。Ｍ在种内的遗传多样性．Ｂｏｕｓａｌｅｍ等进步分析了ＹＭＶ的２７个分离物的复制酶’’’ｂ－－（Ｎｉ）的３端、外壳蛋白（ＣＰ）和３非翻译区（３ＵＴＲ）的遗传多样性，并提出ＹＭＶ的起源和传播假说，认为ＹＭＶ起源于非洲的几内亚薯蓣和白薯蓣的混合种，在进化过程中逐渐变异，最终独立传播并适应新寄主４５参薯和三裂叶薯蓣［］Ｍｍ。．Ｂｏｕｓａｌｅ等还根据ＹＭＶ的遗传多样性数据建立了ＹＭＶ的３９［］检测和分型的方法，可用于该病毒的分子流行病学研究。分子生物学研究显示，６５６６，［］有很高的遗传变异性，同样在侵染淮山药时也表现了丰富的遗传多样性，其中有两个株系（ＤａＢＶ尼日利亚分离物和ＤｓＢＶ贝宁分离物）已经进行了全基因５８５９，一组序列测定［］，序列比对分析结果显示它们之间在核苷酸水平上的致性只有６１．９％。即使杆状ＤＮＡ病毒属病毒的逆转录酶（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＲＴ）和核糖核酸６３６５，１１５［，］１１（４１）〇１１１１（＾〇８６１１１１＾记１１酶，）区域是高度保守的，要保证该病毒检测的可靠性，还是需要深入研究其遗传多样性。ＲＮＡ病毒的重组在其进化和修复等方面至关重１１６一［］要，是病毒学研究的热点之。在马铃薯Ｙ病毒属中重组发生特别频繁。病毒通过重组引起植物病毒自然种群的变化，甚至可以获得新的基因，从而増加对寄主的适应性１１７［］终能增强病毒的致病性和克服寄主的抗性从而扩大寄主范围。，最－本章主要阐述在深度测序获得的病毒序列的基础上，通过ＲＡＣＥ和ＲＴＰＣＲ技术获取侵染中国淮山药的病毒的基因组全长序列一，进步通过序列分析了解中国淮山药病毒的分子生物学特征，并对部分病毒的遗传多样性进行研究，为深入研究这些淮山药病毒的侵染、变异、进化和建立相应的检测方法提供重要参考。５０ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病？病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究３．２材料与方法３．２．１毒源在广西大学亚热带生物资源保护与利用国家重点实验室的温室种植的采自全国各－－淮山药主产区的感病植株，经ＲＴＰＣＲ检测确认病毒类型后，挂牌标记（表３１）。取°症状明显的带毒植株的新鲜叶片样本置于－８０Ｃ保存备用。用于遗传多样性分析的毒源°－８０Ｃ为各淮山药病毒的阳性样本，保存于。表３－１用于病毒基因组全长克隆的毒源Ｔａｂｅ－ｒ－ｎｌ３１Ｖｉｒｕｓｅｓｕｓｅｄｆｏｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅｉｒｆｕｌｌｌｅｔｈｓｅｕｅｎｃｅｓｇｑ样本名称采集地点品种用于全长克隆的病毒Ｄ－－－－１１１１１７ＮＣＹＢ３１江西农业科学院桂淮６号ＹＭＭＶＮＣ１Ｄ－－－－ＭＶ－１１０８１２ＷＸＸＺＴＧ３河南温县夏庄村铁棍山药ＪＹＷＸ１Ｄ－－－ＭＶ－１２０９０４ＦＸＳＳＹ３江苏省丰县王沟镇水山药ＣＹＮＦＸ１－－ＮＨ－－－－Ｄ１１０８１２ＷＸＺＹ１河南温县祥云镇紫山药ＹＶＸＷＸ１、ＣＹＮＭＶＷＸ１Ｄ－－－－１２０９０３ＸＺＺＹ１江苏省徐州市徐农紫药ＹＶＸＸＺ１－－Ｄ－ＤＴ－ＤＨＣＹ－－－１１０８１４ＳＧ１山东寿光市稻田镇大和长芋ＢＢＷＶ２ＳＧ１、ＹＬＶＳＧ１Ｄ－－－－１２０９０４ＦＸＴＧ２２江苏省丰县王沟镇铁棍山药ＹＹＳＭＶＦＸ１表３－２用于遗传多样性分析的ＹＭＭＶ分离物－Ｔａｂｌｅ３２ＹＭＭＶｉｓｏｌａｔｅｓｕｓｅｄｆｏｒｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓａｎａｌｙｓｉｓｇ病毒分离物采样时间采样地点侵染的淮山药种类Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＡＩｓｏｌａｔｅｓｓｅｕｅｎｃｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄ（）ｑｙ８Ｌｕｚｈａｉ２０１０广西鹿寨Ｚ）．ｏ＾ｏｓｚＹａＪＦ３５７９６３／ＬＺ１２０１０广西鹿寨Ｄ．ａｌａｔａｃｖ．ＧＨ５ＫＪ７８９１１４？Ｎａｎｎｉｎ２０１０广西南宁Ｄ＿ｏｏｓｉａＷｉ５１９６２ｇｐｐｔ＿ａｏｎｉｃａｃｖＷＭ１２０１０广西武鸣Ｄｊｐ＿ＧｌＵＫＪ７８９１２１ＮＣＩ２０１１江西南昌Ｚ）．ｆｌ／ａｔｏｃｖ．ＹＢ３ＫＪ１２５４７６ＮＣ２２０１．／．４１江西南昌ＤａａｔｅｃｖＹＢ３ＫＪ１２５７７＞１ＮＣ３２０１１江西南昌￡．ａ／ａｔａｃｖ．ＧＨ６ＫＪ２５４７３＞ＮＮ．ａ／ａａ４１２０１１广西南宁￡／ｃｖ．ＧＨ５ＫＪ１２５７２５１ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究病毒分离物采样时间采样地点侵染的淮山药种类Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＮＮ２２０１１广西南宁ｃｖ．ＧＨ２ＫＪ７８９１１５ＮＮ３２０１１广西南宁Ｄ．ｆｌ／ａｔａｃｖ．ＧＹ３８ＫＪ７８９１１６ＮＮ４２０１１广西南宁Ｄ．ａｔｏａｃｖ．ＧＹ１０１ＫＪ７８９１１７ＮＮ５２０１１广西南宁Ｄａ／ａ．Ｊ７．ｔｅｃｖＧＹｌＯｌＫ８９１１８ＷＸ１２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＴＧＫＪ１２５４７５．ａ／ｆｌｔｏｃｖＷＸ２２０１１河南温县Ｄ．ＺＹＫＪ７８９１２２ＷＸ３２０１１河南温县Ｚ）．ａ／ａｔａｃｖ．ＺＹＫＪ１２５４７８ＷＸ４２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ｌｋＧＫＪ７８９１２３ＷＸ５２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＴＭｉＫＪ７８９１２４ＷＸ６２０１１河南温县Ｚ）．ｃｗｗｉＹａｃ．ＴＡＧＫＪ７８９１２５ｐ／ｖＷＸ７２０１１．ｏｏｓｉｔａｃｖＫ河南温县Ｄｐｐ．ＴＡＧＪ７８９１２６．ｏｏｓｉｔａｃｖＡＧＫＪ１２ＷＸ８２０１１河南温县Ｄｐｐ．Ｔ７８９７ＳＧＩ２０１１山东寿光Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ｍｉＣＹＫＪ７８９１１９ＳＧ２２０１１山东寿光Ｄ．ｏｏｓｉｔａｃｖＤＨＣＹＫｐｐ．Ｊ７８９１２０ＦＸ１２０１２江苏丰县Ｄ．ｏｏｓｉｔｃｖ２ｐｐａ．ＳＳＹＫＪ１５４７４ＦＸ２２０１２江苏丰县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＳＳＹＫＪ７８９１１３．ａｌａｔａｃｖＴＹＫＸＺ１２０１２江苏徐州Ｄ．Ｊ１２５４７８ＸＺ２２０１２江苏徐州Ｄ．ａ／ａｔｅｃｖ．ＢＹＫＪ７８９１２８（Ｂ）ＰｒｅｖｉｏｕｓｌｙｓｅｑｕｅｎｃｅｄｉｓｏｌａｔｅｓＢｒａｚｉｌ２００９ＢｒａｚｉｌＤ．ａｌａｔａＪＸ４７０９６５ＣＮ１２０１４ＣｈｉｎａＤ．ｏｐｐｏｓｉｔａＫＣ４０７６７４ＣＲ１１９９９Ｃｏｓｔａ．ｒｉＲｉｃａＤｔｆｉｄａＡＦ５４８４９９－ＤａＣＤＩ１９ＩｖｏｒｙｏａｓｔＤ．ａｌａｔａＡＪ３０５４７０Ｃｍｎ２－ＤａＣ４ＣａｍｅｒｏｎＤ．ａｌａｔａＡＪ３０５４６８－１ＧｕｉｎｅａＤ．ａｌａａＡＪ３０５４６７ＤａＧｕｉｔＤａＴｏｇ２ＴｏｇｏＤ．ａｌａｔａＡＪ３０５４６２－ＧｈａｎａＤＤａＵｇａ１．ａｌａｔａＡＪ３０５４６０－ａｎａＤＤａＵｇａ３Ｇｈ．ａｌａｔａＡＪ３０５４５９５２ 广西大学博士学位论文中圔３１？山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究．病毒分离物采样时间采样地点侵染的淮山药种类Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏｂ－－ＣａｍｅｒｏｎＤ．ｃａｒｏｔ４５６ＤｒＣｍｎ１１ｙ．ＡＪ３０５ｂ－－ＤｒＧｕｉＧｕｉｎＤ．ｃａ．ｒｏｔ．３０５４５５１ｅａｙＡＪ－ｎｄＧ１ＩｉａＤ．ａｌａｔａＫＪ４６３４１６Ｇｕａｄ４１９９８ＧｕａｄｅｌｏｕｐｅＤ．ｔｒｉｆｉｄａＡＦ５４８５０３Ｇｕａｄ５１９９８ＧｕａｄｅｌｏｕｅＤ．ｔｒｉｆｉｄａＡＦ５４８５０４ｐＧｕ１１９９８ＦｒｅｎｃｈＧｕａｎａＤ．ｔｒｉｄａＡＦ５４８５０６ｙｙｆｉ－ＤＩｎｄｉａ３Ｄａ２００８Ｉｎｄｉａ．ａｌａｔａＦＪ３９００２４－Ｉｎｄ．ｉａ４Ｄａ２００９ＩｎｄｉａＤａｌａｔａＨＱ２３１８９４Ｍａｒｔ２１９９８ＭａｒｔｉｎｉｕｅＤ．ａｌａｔａＡＦ５４８４９４ｑＴｏｇｏ２２００３ＴｏｇｏＤｉｏｓｃｏｒｅａｄｕｍｅｔｕｒｕｍＡＦ５４８５２７表３－３用于遗传多样性分析的ＤＢＶ分离物Ｔａｂ－ｌｅ３３ＤＢＶｉｓｏｌａｔｅｓｕｓｅｄｆｏｒｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓａｎａｌｙｓｉｓｇ病毒分离物采样时间采样地点侵染的淮山药种类Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ．ｎｏＡ）Ｉｓｏｌａｔｅｓｓｅｕｅｎｃｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄ（ｑｙＦＸ１２０１２江苏丰县￡＞．ｏ／７／ｗｗｆｔｅＫＪ８５４４１１ＧＰ１２０１０广西桂平Ｄ．ｊ叩ｏｎｉｃａＫＪ８５４４１２ＬＺ１２０１０广西鹿寨Ｄ．ａｌａｔａＫＪ８５４４１３ＮＣＩ２０１１江西南昌Ｄ．ａｌａｔａＫＪ８５４４１４ＮＣ２２０１１江西南昌Ｄ．ａｌａｔａＫＪ８５４４１５ＮＮ１２０１０广西南宁Ｄ．ｊａｐｏｎｉｃａＫＪ８５４４１６ＮＮ２２０１０广西南宁Ｄ．ｊａｐｏｎｉｃａＫＪ８５４４１７ＮＮ３２０１０广西南宁Ｄ．ａｌａｔａＫＪ８５４４１８ＳＧＩ２０１１山东寿光Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４１９ＳＱ１２０１２江苏宿迁Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４２０ＷＭ１２０１０广西武鸣Ｄ．ａｌａｔａＫＪ８５４４２１ＷＭ２２０１０广西武鸣Ｄ．ａｏｎｉｃａＫＪ８５４４２２ｊｐＷＸ１２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４２３５３ 广西大学博士学位论文中国灌山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究病毒分离物采样时间采样地点侵染的淮山药种类Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＷＸ２２０１１河南温县￡）．〇即〇９此ＫＪ８５４４２４ＷＸ３２０１１河南温县Ｄ．ｄａｔａＫＪ８５４４２５ＷＸ４２０１１河南温县Ｄ．ａｌａｔａＫＪ８５４４２６ＷＸ５２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４２７ＷＸ６２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４２８ＷＸ７２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４２９（Ｂ）ＰｒｅｖｉｏｕｓｌｙｓｅｑｕｅｎｃｅｄｉｓｏｌａｔｅｓＰＧ－ａ１０２ｄＤａＰｐｕａＮｅｗＧｕｉｎｅａＤ．ｄａｔａＡＭ０７２６７５－ＰＧ１１７ａＤｅＰａｕａＧｕｉｎｅａＤ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａＡＭ０７２６７９ｐＮｅｗＰＧ－Ｐａ１０２ａＤａｐｕａＮｅｗＧｕｉｎｅａＤ．ｄａｔａＡＭ０７２６７４Ｂ３９４Ｄｓ２ＢｅｎｉｎＲｅｕｂｌｉｃＤ．ｓａｎｓｉｂａｒｅｎｓｉｓＤＱ８２２０７３＿ｐ－ＦＦｊ６０ｂＤｒｉｉＤ．ｒｏｔｕｎｄａｔａＡＭ０７２６５９＿ｊ－ＰＧ１１７ｃＤｅｕａ．ｅｓｃｕｅｎａＰａｐＮｅｗＧｕｉｎｅａＤｌｔＡＭ０７２６８０ＰＧｌ－ｌＯｂＤｅＰａｐｕａＮｅｗＧｕｉｎｅａＤ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａＡＭ０７２６７７－ＰＨｌｌａＤａＰｈｉｌｉｉｎｅｓＤ．ａｌａｔａＡＭ０７２６９１＿ｐｐ－ｕａｄｅｕｉＤＢＶ８ＧｌｏｐｅＤ．ｔｒｆｉｄａＫＦ８２９９５２－ＦＪ６０ａＤｒＦｉｊｉＤ．ｒｏｔｕｎｄａｔａＡＭ０７２６５８＿－ＳｏｍｏｎＳＢ１５ｂＤｌｏＩｓｌａｎｄｓＤ．ｐｅｎｔａｈｙｌｌａＡＭ０７２６９５＿ｐｐ－ＰＧｌｌＯｃＤｅａｕａ．ＰｐＮｅｗＧｕｉｎｅａＤｅｓｃｕｌｅｎｔａＡＭ０７２６７８－ｏｎＳＢｌＯａＤｎＳｏｌｏｍＩｓｌａｎｄｓＤ．ｎｕｍｍｕｌａｒｉａＡＭ０７２６９２ＰＧ－Ｐａ１０２ｃＤａｐｕａＮｅｗＧｕｉｎｅａＤ．ａｌａｔａＡＭ４２１６９０表３４用于遗传多样性分析的ＹＹＳＭＶ分离物ｂ－Ｔａｌｅ３４ＹＹＳＭＶｉｓｏｌａｔｅｓｕｓｅｄｆｏｒｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｉｔｉｅｓａｎａｌｓｓｇｙ病毒分离物采样时间采样地点侵染的淮山药种类Ａｃｃｅｓｓ．ｉｏｎｎｏＷＸ１２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４３０ＷＸ２２０１１河南温县ＤｉｔＫＪ８５４４３１．ｏｐｐｏｓｅＷＸ３２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４３２５４ 广西大学博士学位论文中国乘山苗病毒病调查、诊断和病尿病毒分子生物学的研究病毒分离物采样时间采样地点侵染的淮山药种类Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＷＸ４２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４３３ＷＸ５２０１１河南温县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４３４ＳＧ１２０１１山东寿光Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４３５ＬＺ１２０１１广西鹿寨ＡｏｗｃｆｌＫＪ８５４４３６ｙ印ＦＸ１２０１２江苏丰县Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔｅＫＪ８５４４３７表３－５用于遗传多样性分析的ｂ－Ｔａｌｅ３５ｉｒｕｓｄｆｏｔｉｄｉｒｓｉｔｉｅｓａｎａｌｓｉｓＢｅｇｏｍｏｖｕｓｅｒｅｎｅｃｖｅｙｇ病毒／采样采样地点寄主植物Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．分离物时间ＣＹＶＭＶ２００５Ｇｒｅｎａｄａ：ＰａｒａｄｉｓｅＣｒｏｔｏｎｂｏｎｐｌａｎｄｉａｎｕｍＡＪ５０７７７７ＩｎｄｉａＭａＹＳＶ２０１１Ｃｈｉｎａ：ＦｕｉａｎＰｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓＫＣ００４１１５ｊＢＲ：Ｏａｆ７：ｌｌＦＰＳＬＤＶ２００１ＩｒａｎＰａｓｓｉｊｌｏｒａｅｄｕｌｉｓｆ．Ｊ９７２７６７ＢＲ：ＬＮＳ２：Ｐａｓ：０１ｆｌａｖｉｃａｒｐａＰＹＭＶ２００７Ｂｒａｚｉｌ：ＭｉｎａｓＧｅｒａｉｓＳｏｌａｒｉｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＦＲ８５１２９９Ｇｒｅｎａｄａ：Ｐａｒａｄｉｓｅ：２００７ＲａＭｏＶ２００６Ｂｒａｚｉｌ：ＰｅｒｎａｍｂｕｃｏＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＥＦ１２５１９０Ｆ３ＴＣＴＶ２００９ＧｒｅｎａｄａｒＰａｒａｄｉｓｅＢｒａｓｓｉｃａｒａｐａＧＵ４５６６８６ＩＲ：Ｈｏｍｌ：２ｋ：０９ＴＧＷ２００４Ｃｈｉｎａ：ＦｕｊｉａｎＳｏｌａｒｉｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＪＦ８０３２５９ＤＦＢＲ：Ａｒａ３０４３：０４［ｇ］ＴｏＩＣＶ２００４ＩｒａｎＳｏｌａｒｉｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＪＦ８０３２５２ＰＥＢＲ：Ｍｄｃ２６８１：０４［］５５ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究３．２．２生化及分子生物学试剂复杂植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（ＳｕｒｅＰｌａｎｔＤＮＡＫｉｔ）、植物ＲＮＡ提取试剂盒ｕｒｌａｎｔｘａＭａｓｔｅｒＭ（ＲＮＡｐｅＰＫｉｔ）和２ＥＳＴｑｉｘ（含染料）购自康为世纪公司。高保真ｃＤＮＡ’合成试剂盒（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ）和５７３ＲＡＣＥＫｉｔ（２ｎｄ？Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）购自Ｒｏｃｈｅ公司。ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ试剂盒购自？ＴＡＫＡＲＡ公司。Ｐｈｕｓｉｏｎ热启动ＤＮＡ聚合酶ＩＩ、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１００ｂｐＤＮＡ？？？ＬａｄｄｅｒＧｅｎｅｒｕｌｅｒ、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１ｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ和Ｇｅｎｅｒｕｌｅｒ１ｋｂｌｕｓＤＮＡｌａｄｄｅｒ和ｐ？３￡／１５Ｔ－ＢｌｕｎｔＫｉｔ－Ｔ４ＤＮＡ＾接酶购自ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司。＞Ｃｌｏｎｉｎ和ＴｒａｎｓｌＴ１感受态／ｇ？－细胞购自全式金公司。琼月Ｉ＾ＢＩＯＷＥＳｔＲｅｇｕｌａｒＡｇａｒｏｓｅＧ１０购自ＢＩＯＷＥＳＴ公司。ＧｅｌＲｅｄ？核酸凝胶染料购自ＢＩＯＴＩＵＭ公司。柱式ＤＮＡ胶回收试剂盒（Ｅ．Ｚ．Ｎ．ＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ）购自ＯＭＥＧＡ公司。质粒ＤＮＡ小提试剂盒购于天根生化科技有限公司。ＴｒｕＳｅｑＲＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅｐＫｉｔ（Ｖ２）购自Ｄｌｕｍｉｎａ公司。ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ、ＩＡｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ和ＱｑＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ购自ＱＩＡｇｅｎ公司。其它试剂为进口或国产分析纯。３．２．３引物根据深度测序获得的淮山药的病毒序列信息设计病毒基因组全长克隆用引物，引物３－６序列信息见表。在生工生物工程有限公司或Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。表３－６用于淮山药的病毒的基因组全长序列克隆的ＲＡＣＥ和ＰＣＲ引物Ｔａｂ－ｒｓｕｎｄＰＣＲｌｅ３６ＰｒｉｍｅｓｅｄｆｏｒＲＡＣＥａａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ’，ＰｒｉｍｅｒＳｅ－Ｐｑｕｅｎｃｅ５３ｒｏｄｕｃｔｓｓｉｚｅｓｂ（ｐ）ＹＭＭＶＵＰＭｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔ－－ＹＭＭＶ５１Ｒｃｇｃｃａｇａａａｇｔｇｔｃｃｇｃｔａｇｔａｇｔｇｇａｔｇｇｔｇｃｔａｔａａｃ９５０ＮＵＰａａｃａｔｔａｔｃａａｃｃａａｔｇｇｇｇｇｇｇ’ＹＭＭＶ－５－２Ｒｃａａａｃｔｃａｃａａａｃ？ｇｔｔｇｃｇｔｇｔｔｃｔｇｔｔ９００ＹＭＭＶ－２ＦｃｃａａｔｇｇｔａｔａｇｃａｃｃａａｔｃｃａＹＭＭＶ－２Ｒｃａｃｃａａｔｃｃａａｃｃｇｔｔｃｔｃｔｇ２３３４ＹＭＭＶ－３ＦｇｇａｔｇａｇｇａｃｔｇｇｔｇｔｔａｇｇａｔＹＭＭＶ－３Ｒｔｇａｃｔａｃｇｇａａｔｇｔｇｇｔａｔｔｇｃ１９４７ＹＭＭＶ－４Ｆｃｃａｇｇｇｇｇｔｔｃｔｔｇａｇｔｔ－４ＲｔＹＭＭＶｃｔｇｔｔｃｃａｇａｔｃｃａｔｇａｇｔａｇｔｔ２２１４５６ 广西大学博士学位论文中国淮山箱病毒病调奎、诊断和病尿病毒分子生物学的研究’９Ｐｒｉｕｅｎｃｅ５－３ＰｒｏｄｕｃｉｂｍｅｒＳｅｑｔｓｓｚｅｓ（ｐ）－ＹＭＭＶ５Ｆａａｇｃａｇｃａｃａｃｃａｔｃａｇａａｃ－５ＲＹＭＭＶｔｃｃｇａａｇａｇｃｇｔａｔｔｃａｇａｇａｔ１５１７ＹＭＭＶ－３ＦａａａａＭｇｇｇｇｇｃｇｇａｔｔｇｔｔｇｃＮ￣１ａｃｃａｃｃｔａｔｃａｔｔｃａｃ１３００ｇｇｇｇｇｇＪＹＭＶＵＰＭｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔＪＹＭＶ－５、１Ｒｃｃａｃｔｔｃｃｃｃａｔｔｃｃｔｃａａｃｔｃａａａｔｃｃ？１２５０ｇｇｇｇｇＮＵＰａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔ’ＪＹＭＶ－５－２Ｒｇｃｔｔｃｃｔｇｔａｔｔｔｃｔｇａａａｇｇｃｔｇｔａｔ２００ＪＹＭＶ－２ＦｃａｔｔｃａｃｇｔｇｃａｔａｔｇｇａａｇｃａｔａｔＪＹＭＶ－２Ｒａｃｃｃａａｇｔｃｔｇｔｃｃｃａｔｃｔｔｃｇａｔ２１２４ＪＹＭＶ－３ＦａｔｃｔａａａａｔｃｔｔａａａａｃａａｔｃｇｇｇｇｇｇＪＹＭＶ－３Ｒｃａａｔｃｃｔａｔｔｔｔｔｃａｔｃ３０８９ｇｇｇｇｇｇＪＹＭＶ－４ＦｃａａａａｃａｃａａｃａａｃｇｇｇｇｇｇｔｃＪＹＭＶ－４Ｒｃｃｔｔａｔａａｃａｔａａｃｃａａａｔｔｃ２４９８ｇｇｇｇｇＪＹＭＶ－５Ｆｃａａｔｔｇｃａａｃａｃｃａｇａｔｇｇａａｃａａｔ－ＪＹＭＶ５Ｒｇｔｃｔｃｔａｔｃｃｃｔｔａａｔｃａａａｔｇｔｇａ１７５６－ＪＹＭＶ３１ＦａｔｇｃｃａｃｇｃｔａｔｇｇａｃｔｔｃａｇａｇｇＮａｃ－１ｇａｃｃａｃｇｃｇｔａｔｃｇａｔｇｔｃｇ５００ＣＹＮＭＶＵＰＭｃｔａａｔａｃａｃｔｃａｃｔａｔａｃａａｃａｔｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔｇｇｇｇｇｇｇｇ５－－ＣＹＮＭＶ？５ｌＲｃａｔｇｔｃｃｔｃｇａａｔｔｇｔｔｔｃｔｔａｔｔｔ１４５０ｙｇｇｇｇｇｇＮＵＰａａｃａｔｔａｔｃａａｃｃａａｔｇｇｇｇｇｇｇ＊－ＣＹＮＭＶ－？５２Ｒｇｃａａｔｃａａａｃａａｔａｔ１１００ｇｇｇｇｇｇｇｇＣＹＮＭＶ－２ＦｃａｃａａｔａｔｔｃａｃｇｃａｔａｃａｔｇｇｇｇＣＹＮＭＶ－２Ｒｇｃａｃａｃｃａｃａａｇｃａｃｃａａｇａｔｇ７３６５ＣＹＮＭＶ－３１Ｆｃｃａａａａｃａａｔｔｃａｃａａｃａａｃａｔｃａｃｇｇ？Ｎ１ｇａｃｃａｃｇｃｇｔａｔｃｇａｔｇｔｃｇａｃ８５０ＢＢＷＶ－２ＵＰＭｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔ＊ＢＢＷＶ－－－？ＲＮＡ１５ｌＲａｇｔｔｇｇｔａａｇｃａｔａａｃｃｇａｃｔｔｃｔｃｃａｃａｇｃｃｔｇｇｔ１２００ＮＵＰａａｃａｔｔａｔｃａａｃｃａａｔｇｇｇｇｇｇｇ＊ＢＢＷＶ－ＲＮＡ－－－１５２Ｒｇｃｃａｔａｇｃａｇｔｃｇｔｔａａｇａａｃａａａｇｔ１１００ＢＢＷＶ－ＲＮＡ－１２Ｆｇｃｔｇｃｔｔｔｃｃａｇｔｇｇｔｔｇａｇａａｔａｔｃ－ＲＮＡ－ＢＢＷＶ１２Ｒｃａｔｇｃｔｔｇａｇｔｇａｇｔｇｃｃｔｔｇｔｇ４９３５＇ＢＢＷＶ－ＲＮＡ－－１３１Ｆｔｇａｔｇｃｔｇｃｔｔｇｔａｃｇａｇｔａｇｇｔａｔｇ５７ 广西大学博士学位论文中国逢山苗病毒病调查诊析和病尿病毒分子生物学的研究、’，ｕｅｎｃｅ－ＰｒｉｍｅｒＳｅｑ５３Ｐｒｏｄｕｃｔｓｓｉｚｅｓｂ（ｐ）Ｎ？１ａｃｃａｃｃｔａｔｃａｔｔｃａｃ１３００ｇｇｇｇｇｇＵＰＭｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａａｔｇｇ，ＢＢＷＶ－ＲＮＡ２－－－１１５ｌＲｃｃｔｇｔｇｃａｔｃｇｇａａａｇｔａａａｔｇａｃｇｔｇｔｇａｇｇｇａａｃｔ５０ＮＵＰａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔ，－－－－ＢＢＷＶＲＮＡ２５２Ｒｔｃａｇｃｃｔｔｇｇｃｔｃｇａａｔｔｃｔａｔｃａｇ１０００ＢＢＷＶ－－２ＦｃａａＲＮＡ２ｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔ－ＢＢＷＶ－ＲＮＡ２２Ｒｔｃａｇａｇｃｃａａａｔｔｃｃｃａｔａｃａａｃａ３３６４ｇ－－ＭＢＢＷＶＲＮＡ２３ＦｔｔｔｔｔｔｔｔａｇｃｃｃａｇａｇｇｔｇｇａａｃｃｃＮ？１ｇａｃｃａｃｇｃｇｔａｔｃｇａｔｇｔｃｇａｃ１２００ＹＶＸＵＰＭｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔ，ＹＶＸ－５■Ｒ－１ａａｔｇｇｔｔｇｇｃａｃｃｔａｇａｃｔｔｔｃａａｔｃａｔｔｔｇｇｃａｔｇｔｇａｔｇｔａｇ９００ＮＵＰａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔ’ＹＶＸ－－２Ｒ￣５ｇｇｇｔｇｔｔｇｇａｔｃｔｇａｇｇｇａｔｔｇｔ５００－ＹＶＸ２ＦａｃａｔａｃｃｃａｔｇｃｃｇｃｃｔｇｔａａａｇＹＶＸ－２Ｒｃａｃｃｃｃｃ１ｇｔｔｇｔｇｔｔｇａｇａｔｔｇａｔ３７９－ＹＶＸ３ＦｃｇｔｃｃｇｃｃｇｔｃｇａａｇｔｔｃａａＹＶＸ－３Ｒｃａｃｃｔｃａａｔｃｔｃｔｔａｃｔｃｔｃ２７７１ｇｇｇｇ’ＹＶＸ＿３－１ＦｔｇｃｔｃｇｔｃｇｔｔｃｔｃｔｇｇｃｔｇｃＮ－１ｇａｃｃａｃｇｃｇｔａｔｃｇａｔｇｔｃｇａｃ６００，ＹＶＸ－３－２Ｆｃｃｔｃｃｔｇｃｔａａｃｔｇｔｃｔｃｔｃｔｃｇｇａｃｃａｃｃ？Ｎ１ｇｇｇｔａｔｃｇａｔｇｔｃｇａｃ５００ＹＬＶＵＰＭｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔ５ＹＬＶ－５－？ｌＲｔｃａｃｃｔｔｃｃａｇｃｇａｃｃａｇｔｔｇａｇｃａｃａｔｃ１４５０ＮＵＰａａｃａｔｔａｔｃａａｃｃａａｔｇｇｇｇｇｇｇ＇ＹＬＶ－５－２Ｒｔｃｔ？ｇｇｇｇｇｔａｔｃｃｔｔｃａｃｔｃｃｔｔ８５０－ＹＬＶ２ＦｃｇｃｃｔｃｇｇａｃｇａａｔｔｇｔｔｃａａｇＹＬＶ－２Ｒｃｔ２８１２ｇｔｇｔａｃｃａｃｔｔｃｇｃａｔｃａｔｔｇｔＹＬＶ－３Ｆｃａａｃｇｇａｇｇｔｇｃｇａｃｇａｔｃａ－ＹＬＶ３Ｒｇａａｃｔｔｔｃｃａｃｇｇａｔｇａｃｃｃａａｔｃ２２０８ＹＬＶ－４ＦｇｃａｇｃｇａｃｃａｔｔｇａｇａａｔｃａｔａｇｔｇＹＬＶ－４Ｒｔｃｔｔａｃａｃａｃａａｔｔａｃａａｔｃｔ２７８７ｇｇｇｇｇ－５ＦｃａｃＹＬＶｇｇｃｇｇｔｔｇｇｔａｃａａｇｇａ－ＹＬＶ５Ｒｇｇａｇｔｇｇａｔｇｇｔａｔｃａｃｃｔｃａｇｔｔ１６４８ＹＬＶ－３１Ｆａｃｃｃａｃｃｃａａｇａｇｔｃａａａｇｔｃａｇ５８ 广西大学博士学位论文中国淮山箱病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究，’ＰｒｉｍｅｒＳｅｅｎｃｅ５－３Ｐｒｏｄｕｃｔｓｑｕｓｉｚｅｓｂ（ｐ）Ｎ－１ｇａｃｃａｃｇｃｇｔａｔｃｇａｔｇｔｃｇａｃ１３５０ＹＹＳＭＶＹＹＳＭＶ－Ｆｃｃ１ｔｃａａｔｃｔｔｔｃｃｔｃａｇｔｔｔａｔｇｇｇｇＹＹＳＭＶ－１Ｒａａｃｔｔｃａｃｃａａａｔａｔｃｃｔｔｃａｔ１１９６ｇｇｇｇ－ＹＹＳＭＶ２ＦｔｔｇａｇｇｃｇｔｔａｇｃａｔａｃａｃａｇｔｔｇＹＹＳＭＶ－２Ｒｃａｃａｔｔａｃａｔａｃａｃ４ｇｇｔｔｔｔｃｃ２０８ｇｇｇ３．２．４核酸提取方法淮山药的ＤＮＡ提取方法见２．２．５ＲＮＡ提取方法见２．２．６。，３２－Ｓｅ深度测序．．５ＲＮＡｑ采用ＴｒａＳｅＲＮＡＳａｍｌｅＰｒｅＫｉｔＶ２ｃＤＮＡ文库，操作步骤略ｑｐｐ参照操作说明书构建有改动：°预热ＰＣＲ仪至６５ＣＰＣＲ薄壁ｎｕｃ－，在２００管（ｌｅａｓｅｆｒｅｅ）中稀释总ＲＮＡ至５０Ｌ叫卩，°６５Ｃ温育５ｍ１－置于ｉｎ，然后迅速置于冰上冷却。分装５ｐＬ磁珠（ＳｅｒａＭａｇｏｌｉｏ（ｄＴ）ｇｂｅａｄｓｍｌｃ－）于１．５离心管（ｎｕｌｅａｓｅｆｒｅｅ）。用１００ｊＬＢｅａｄＢｉｎｄｉｎＢｕｆｅｒ洗ｂｅａｄｓ两次，｜ｇ小心移去上清。用５０ａＬＢｅａｄＢｉｎｄｉｎｕｆｅｒ重悬磁珠，加入前面步骤获得的５０Ｌ总｜ｇＢｎＲＮＡ样本。将装有样本的离心管置于垂直混合仪上，室温旋转孵育５ｍｉｎ。用２００ｐＬ－ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｅｒ洗两次并小心移去上清。加入５０ｐＬ１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ于磁珠中，置于８０孵育２ｍｉｎ，将ｍＲＮＡ从磁珠上溶解下来。立即将离心管置于磁力架上，转移上清（ｍＲＮＡ）至备有５０ｊｉＬＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｅｒ的新的离心管中。不要丢弃使用过的磁珠。将样本°一放在边，用２００吣ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｅｒ洗涤磁珠两次。将样本置于６５Ｃ水浴锅中温育５ｍｉｎ以打开二级结构一，然后迅速置于冰上。将上步获得的样本再次加入到洗过的磁珠中，在室温垂直混勾５ｍｉｎ，然后小心移去上清。用２００ｐＬＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ洗漆两次并小心°移去上清Ｌ－Ｃ。加入１７ｐ１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ于磁珠中，置于８０孵育２ｍｉｎ，将ｍＲＮＡ从磁珠上溶解下来。立即将离心管置于磁力架上，转移上清（ｍＲＮＡ）至新的２００ｘＬ薄壁ｊＰＣＲ管中。最终获得的ｍＲＮＡ的量大约为１６ｇＬ。°Ｃ预热ＰＣＲ仪至９４。在２００ｐＬ薄壁ＰＣＲ管中加入４ｐＬ５ＸＦｒａｍｅｎｔａｔｉｏｎＢｕｆｅｒｇ°Ｃ预热的和１６ｎＬ的前面步骤纯化的ｍＲＮＡ，体积为２０吣。在９４ＰＣＲ仪上孵育５ｍｉｎ。加入２ｐＬＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎ。将ＰＣＲ管置于冰上。将溶液转移至新的１．５ｍｌ５９ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究－心管中Ｒｎａｓｅｆｒｅｅ离。加入２Ｌ３ＭＮａＯＡＣ（Ｈ５．２）、２ＬＧｌｃｏｅｎ和６０ｊＬ１００％乙醇，ｎｐｐｙｇ（°°－－８０Ｃ沉淀至少３０ｍｉｎ。Ｃ。混勻并置于如在此步骤暂停，可将样本置于２０保存其余步°￣０＞骤不可暂停。在４，１４０００１！１２０２００＾２５１１１丨１１。小心移去乙醇，避条件下，印（，）离心免吸走沉淀（沉淀可能透明不可见）。加入３００ｎＬ７０％乙醇洗涤沉淀，１２，０００ｒｐｍ离心吸走７０％乙醇－心１ｍｉｎ。室温千燥１０ｍｉｎ。用１１．１ＬＲｎａｓｅｆｒｅｅｗａｔｅｒ重悬ＲＮＡ。，小ｐａｎｄｏｍｒｉｍｅｒｓ和ｍＲＮＡ在２００ｐＬ的薄壁ＰＣＲ管中加入１ＲＰ１１．１ｐＬ，总体积为°然后迅速置于冰上１２。６５Ｃ的ＰＣＲ仪上温育５ｍｉｎ。设置ＰＣＲ．１吣将样本置于预热的，°Ｃ一ｘ仪至２５。在另管中加入４ｐＬ５ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＢｕｆｅ、２ｐＬ１００ｍＭＤＴＴ、０．４ｐＬ２５ｍＭ１１（？＾？１＾；和０．５叫１１１＾６１１１１１１＾〇１：，总体积为６．９４。混勻后将样本置于？£１仪中，２５°°Ｃ孵育２ｍｉｎ。加入１ｐＬＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ于样本中，并按如下程序进行反应：２５Ｃ反应１０°°°ｍｉｎ，４２Ｃ反应５０ｍｉｎ，７０Ｃ反应１５ｍｉｎ，然后降温至４Ｃ后将样本置于冰上，获得ｃＤＮＡ一链文库第。°Ｃ一预热ＰＣＲ仪至１６。加入６２．８ｐＬｕｌｔｒａｕｒｅｗａｔｅｒ与第链ｃＤＮＡ合成ｍｉｘ。在ｐｍｉｘ中加入１０ｐＬＧＥＸＳｅｃｏｎｄＳｔｒａｎｄＢｕｆｅｒ和１．２ｐＬ２５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ，混匀并在冰上Ｌ°孵育５ｍｉｎ以上。再加入１ｎＲｎａｓｅＨ和５吣ＤＮＡＰｏｌＩ，混合均匀并在１６Ｃ孵育２．５ｈ。用ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ纯化样本并用５０的ＱＩＡＧＥＮＥＢｂｕｆｅｒ洗脱。此叫＂一ｓＤＮＡ－Ｃ或者继时，２０，样本已经是ｄ可以将样本保存于续进行下步。°Ｃ－ＭｉｘＬ将ＰＣＲ仪预热至２０。在１．５ｍＬＲｎａｓｅｆｒｅｅ管中准备下列试剂的：２７．４ｘ（Ｗａｔｅｒ、１０ｉＬ１０ＸＥｎｄＲｅａｉｒＢｕｆｆｅｒ、１．６｜ｘＬ２５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ、５ｐＬＴ４ＤＮＡＰｏｌｍｅｒａｓｅ、｜ｐｙ１ｐＬＫｌｅｎｏｗＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ和５ｎＬＴ４ＰＮＫ，分装至装有ＥｌｕｔｅｄＤＮＡ（５０吣）的ＰＣＲ°１ａＬ。２０Ｃ的ＰＣＲ３０ｍｉｎ。ＩＡｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｔｉ管中，终体积为００仪上孵用ｃａｏｎ（在育ＱｑＫｉｔ纯化样本，并用３２Ｌ的ＱＩＡＧＥＮＥＢｂｕｆｆｅｒ洗脱。ｐ－Ｌ－在１．５ｍｌＲｎａｓｅｆｒｅｅ备下列试剂的Ｍ：５ＡＴａｉｌｉｎＢｕｆｆｅｒ、１０１ｍＭ管中准ｉｘｎｇ’’ｄＡＴＰ和３ｆｉＬＫｌｅｎｏｗｅｘｏ（３ｔｏ５ｅｘｏｍｉｎｕｓ），分装至装有ＥｌｕｔｅｄＤＮＡ（３２ｐＬ）的ＰＣＲ管°中，终体积为５０＾Ｌ。在３７Ｃ的ＰＣＲ仪上孵育３０ｍｉｎ。用ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ纯化样本，并用２３ｉＬ的ＱＩＡＧＥＮＥＢｂｕｆｅｒ洗脱。ｊｍｌＲｎａｓｅ－ｆｒｅｅＭｉｘ：２５＾Ｌ２ｘＲａｉｄＴ４ＤＮＡＬｉａｓｅ在１．５管中准备下列试剂的ｇ｜ｐＢｕｆｅｒ、１ｉＬＰＥＡｄａｐｔｅｒＯｌｉｇｏＭｉｘ和１ｐＬＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ，分装至装有２３吣ＥｌｕｔｅｄＤＮＡｊ的ＰＣＲ管中，终体积为５０ｐＬ。室温孵育样本１５ｍｉｎ。用ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ纯化样本并用１０叫的ＩＡＧＥＮＥＢｂｕｆｆｅｒ。，Ｑ洗脱６０ 广西大学博士学位论文中国淮山充■病毒病谲査、诊断和病康病毒分子生物学的研究ｘ用ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ和１ＴＡＥ制备５０ｍＬ的２％琼脂糖凝胶。按照下列顺序加样：第一０Ｌｘ孔加入１ｐ１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ。第三孔加入１０ＬＤＮＡ和２Ｌ６ＤＮＡＬｏａｄｉｎｐｐｇＤｙｅ的混合液。第五孔加入１０ｐＬ１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ。以此类推。１２０Ｖ电泳６０ｍｉｎ。在２００ｂｐ（±２５ｂｐ）范围内切取胶块。用ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ纯化样本，并用３０卩Ｌ的ＱＩＡＧＥＮＥＢｂｕｆｆｅｒ洗脱，获得纯化的ｌｉｇａｔｉｏｎｍｉｘ由于回收的片段较小，需在Ｂｉｎｄｉｎ（ｇｂｕｆｅｒ中加入异丙醇）。在２００Ｌ薄壁ＰＣＲ管中准备下列反应液：１０ｉＬ５ｘＰｈｕｓｉｏｎＢｕｆｅｒ、１ＰＣＲｈｆｐＬＰｒｉｍｅｒＰＥ１．０、ｌｊｉＬＰＣＲＰｒｉｍｅｒＰＥ２．０、０．５ｐＬ２５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ、０．５ｐＬＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ和７ｐＬＷａｔｅｒ，终体积为２０ｐＬ。加入３０ｇＬ的纯化ｌｉｇａｔｉｏｎｍｉｘ于２００ｉ＾Ｌ°卩０１管。用下列？０１１程序进行扩增：９８〇反应３〇３６（；；９８１：１〇８６（：，６５１３〇３６〇，°°°７２Ｃ３０ｓｅｃ１５７２Ｃ反应５ｍｉｎ４Ｃ。用ＱＩＡｕｉｃｋ，个循环；最后在；反应结束后降温至ｑＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ纯化样本，并用３０吣的ＱＩＡＧＥＮＥＢｂｕｆｆｅｒ洗脱。即为测序用的ＳｍａｌｌＲＮＡ的ｃＤＮＡ。文库取ｌｐＬ的重悬样本于ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上，用ＤＮＡｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈ－ｉｐ（例如ＡｇｉｌｅｎｔＤＮＡ１０００）进行检测。电泳检测样本的片段大小、纯度以及浓度，最终的产物大小应该在２００ｂｐ（±２５ｂｐ）。或用Ｑｕｂｉｔ检测文库的ＤＮＡ浓度。－ｘ使用ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡＩＩＸ测序仪进行双端测序（ＰａｉｒＥｎｄ），测序读长为２８１，上机操作步骤见２．２．１３。３．２．６逆转录反应？２总ＲＮＡ为模板ｃＤＮＡｏｄＴ取１，使用高保真合成试剂盒及０１ｉ（）引物或病毒ｎｇｇ１８的特异性引物进行反转录合成ｃＤＮＡ。操作步骤参考该试剂盒说明书：一－ｓｅ－ｅｅ（取个１．５ｍＬ离心管（ｎｕｃｌｅａｆｒ）置于冰上，加入如下试剂：总ＲＮＡ２００４００ｎｇ／ＶＬ）５吣，０１ｉｇｏ（ｄＴ）１８引物（５０ｐｍｏｌ／ｎＬ）或病毒的特异性引物（１０ｐＭ）１吣，°立即置于冰上冷却？〇＾＾（＾＼＼＾６１５．４叫，混勻后短暂离心，于６５（：孵育１０１１１１１１，。ｘＨ依次加入：５ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｔａｓｅＲｅａｃｔｉｏｏｎＢｕｆｅｒ４ｉＬ，４０ｐｊＵ／ｉＬＰｒｏｔｅｃｔｏｒＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．５ｘＬ，１０ｍＭｄＮＴＰ２ｉＬ，ＤＴＴ１Ｌ，ＴｒａｎｓｃｒｉｔｏｒＨｉｈｊｊｆ＾ｐｇ°ＦｉｄｅｌｉｔｙＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｌ．ｌ＾Ｌ，混勻后短暂离心，于５０Ｃ解育３０ｍｉｎ，转置于８５°Ｃ－。孵育５ｍｉｎ，将反应产物置于冰中冷却终止反应，立即使用或保存于２（ＴＣ６１ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的研究３．２．７快速扩增ｃＤＮＡ末端，？ｃＤＮＡ：ＳＭＡＲＴＲＡＣＥＤＮＡＡｍｌｉｆｉｔｉ快速扩增５末端使用ｅｒｃｐｃａｏｎ试剂盒，按。说明书进行操作，略有改动一ｘ－ｒｓｔ－ｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ取个２００ｉＬＰＣＲ薄壁管（ｎｕｃｌｅａｓｅｆｒｅｅ）加入以下试剂：５ＦｉＳｔ２（ｊｉＬ，２０ｍＭＤＴＴ１叫，１０ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ１ｐＬ，混勻并短暂离心，放置在室温作为一＾－入以下试剂？ＢｕｆｅｒＭｉｘ待用。Ｈ〇０ＬＰＣＲ薄壁管（ｎｕｃｌｅａｓｅｆｒｅｅ）加：ＲＮＡ１２取ｐ．７５’Ｌ－ｘ（可加入１ＬｏｆＣｏｎｔｒｏｌＭｏｕｓｅＨｅａｒｔＴｏｔａｌＲＮＡ１ｉ／Ｌ作为阳性对照），５ＣＤＳｊｐ（ｆｇｐ）°ＰｒｉｍｅｒＡ１Ｌ入Ｕｌｔｒａｕｒｅｗａｔｅｒ至总体积为３．７５ｘＬ，７２Ｃ孵ｐ，加混勻并短暂离心；于ｐｊ－育３ｍｉｎ转至４２Ｃ孵育２ｍｉｎ。于１４０００ｘ１〇ｓｅｃ；ＳＭＡＲＴｅｒＩＩＡｏｌｉｏ，ｇ离心加入，ｇｌ｜ｉＬ；依次加入ＢｕｆｅｒＭｉｘ４ｐＬ，４０Ｕ／ｐＬＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．２５ｐＬ，１００ＵＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ°°ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｔａｓｅｌｘＬ，轻柔混匀并短暂离心于４２Ｃ解９０ｍｉｎ，于７０Ｃ０ｐ；育孵育１｜一－ｍ－ｉｎ停止反应１００ＴｒｉｃｉｎｅＥＤＴＡＢｕｆｆｅｒ稀释上述第链ｃＤＮＡ产物，保存于２０；用ｐＬ°Ｃ或直接进行以下ＰＣＲ反应。配制５〇ｎＬＰＣＲ反应体系：依次加入ｄｄＨ２Ｏ３０＾Ｌ，５ｘＰｈｕｓｉｏｎＨＦ缓冲液１０卟，１０ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ１Ｐｈｕｓｉｏｎ热启动ＤＮＡ聚合酶ＩＩ２Ｕ／Ｌ０．５Ｌ混勻叫，（＾）ｐ，轻微振荡，短暂“”混合物－离心，标记为。按照表３７加入如下试剂，ＰＣＲ反应程序如下设置。’表－－ＲＡＣＥ３７５反应＊Ｔ－－ＲＡＣＥｎａｂｌｅ３７５ｒｅａｃｔｉｏ组分反应体系，－ＲＡＣＥ样本Ｇ＋ＧＵＰＭ５ＳＰ１ＳＰ２ＰＣ）（ＮＣ）ＧＳＰ１（ＮＣ（）２．Ｌ２ｃＤＮＡ５＼Ｌ２．５．５２．５ｉＬ＼ｐ［ＵＰＭｘ－５Ｌ？１０５Ｌ＾（）ｍＧＳＰ－１（１０＿ｌ＾Ｌ１＾ｉＬ１ＧＳＰ２－－－１０１Ｌ（＿ｎ’５－１引物０－－－－狀〇￡丁？１（１＿ｄｄ０－ＬＨ２４ｉ１ｉＬ５ｉＬｊｆｉ混合物４１．５Ｌ４１．５Ｌ４１．５４１．５ｉＬｐｐ＾５０ｐＬ５０５０ｉＬ５０Ｌ总体积ｆｐ６２ 广西大学博士学位论文中国灌山？病毒病镧查、诊断和病康病毒分子生物学的研究’’快速扩增３ｃＤＮＡ末端ＲＡＣＥＫｉｔ（２ｎｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ），按说明书进行：使用５７３。操作，略有改动在２０卩ｉｄｄＨ〇ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ，４１５ｘＤＮＡｓｎｔｈｅｓｉ１的体系中加入７ｐ２（）卩的ｃｙｓ，，－ｂｕｆｅｒ１ＮＩＴ１０Ｍ５ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＶ－３５，（）（）），总…ｎ（１７０ＲＮＡ（约ｏｎｏｌｎｅｏ－ｉＤ１ｐｇ，可加入ＣｔｒＲＮＡ）和２ｐｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｉｘｔｕｒｅ，１ｐｉ°°ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，混勻，５５Ｃ反应６０ｍｉｎ，然后在８５Ｃ反应５ｍｉｎ使逆°一。用－ｆｆｅｒｃ－转录酶失活１００ＭＬＴｒｉｃｉｎｅＥＤＴＡＢｕ稀释上述第链ＤＮＡ产物，保存于２０Ｃ或直接进行以下ＰＣＲ反应。ｘ配制５０ＬＰＣＲ反应体系：依次加入ｄｄＨ２０３０ｉＬ，５ＰｈｕｓｉｏｎＨＦ缓冲液１０ｐＬ，ｐｊ１０ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ１ｎＬ，Ｐｈｕｓｉｏｎ热启动ＤＮＡ聚合酶ＩＩ（２Ｕ／ｊｘＬ）０．５ｎＬ，轻微振荡混勻，“”－短暂离心，标记为混合物。按照表３８加入如下试剂，ＰＣＲ反应程序如下设置。’表－－ＲＡＣＥ３８３反应’Ｔａｂ－－ＲＡＣＥｌｅ３８３ｒｅａｃｔｉｏｎ组分反应体系’３－ＰｏＲＡＣＥ样本ｓｉｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌＮｅａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌｇｃＤＮＡ２．５＾ｉＬ２．５＾ｉＬ２．５Ｎｌ（１０＿１ｌ＼ｉＬ１－ｎｅｏ３－／ｆｏｒ１－－ＧＳＰ１（１０ｉＭ１ｉＬ｜）＼’－－－■３ＲＡＣＥＴＦ１Ｉ＾＾０＾Ｍ（）ｄｄＨ０－？Ｌ２１ｉｉ混合物４５．５ｉＬ４５．５Ｌ４５．５ｉＬ＾ｐｊ总体积５０吣５０ｘＬ５０ｉＬｊｆ°？°ＰＣＲ反应条件：９８Ｃ预１ｍｉｎ９８（：ｅｃ６０Ｃ退１５（为变性；变性１０ｓ，火ｓｅｃ根据引物°一Ｃｍｎ￣Ｔｍ值调整退火温度），７２延伸１ｉ（根据片段长度调整，般１５３０ｓｅｃ／ｋｂ），３０°个循环；７２Ｃ延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物于１％（Ｗ／Ｖ）琼脂糖凝胶进行电泳分析。如果ＰＣＲ产物特异性差ｃｎｅ－ｅｒ，可以用ＴｒｉｉＥＤＴＡｂｕｆｆ将ＰＣＲ产物稀释５０倍作为模板，继续进行巢式ＰＣＲ。６３ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病尿病毒分子生物学的研究３．２＿８ＰＣＲ反应扩增基因组全长￣ｈｕ取Ｌ的ＤＮＡ（ＨＭＯＯｎ）或ｃＤＮＡ（ｌ５０ｎ）作模板，使用Ｐｓｉｏｎ热启动ＤＮＡ１Ｈｇｇ聚合酶ＩＩ进行ＰＣＲ扩增，５０ｐＬ反应体系为：模板１ｊｉＬ，１０上游引物２．５吣，ｘｌＯｐＭ下游引物２．５ｐＬ，５ＰｈｕｓｉｏｎＨＦ缓冲液ｌ〇ｎＬ，ｌＯｒａＭｄＮＴＰｓｌＨＬ，Ｐｈｕｓｉｏｎ热启动ＤＮＡ聚合酶ＩＩ（２Ｕ／Ｌ）０．５ｉＬ，ＰＣＲＧｒａｄｅＨ２０３２．５Ｌ。ｐｊｎ°°°ＰＣＲ反应条件为：９８Ｃ预变性１ｍｉｎ；９８Ｃ变性１０ｓｅｃ，５５Ｃ退火１５ｓｅｃ（根据引物°一￣Ｔｍ值调整退火温度），７２Ｃ延伸１ｍｉｎ（根据片段长度调整，般１５３０ｓｅｃ／ｋｂ），３０°个循环；７２Ｃ延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物采用浓度为１％的琼脂糖凝胶电泳检测。３．２．９克隆及测序方法－Ｂｒａｎ－通过凝胶回收目的ＰＣＲ产物后，与坪必ｒｌｕｎｔ载体连接，转化大肠杆菌ＴｓｌＴｌ感受态细胞，挑取转化子，通过菌落ＰＣＲ鉴定阳性转化子，提取阳性转化子的质粒并进行相应的限制性内切酶消化，凝胶电泳分析酶切产物大小是否正确，选择鉴定正确的重？组质经生工生物工程（上海）有限公司测序分析，获得的序列采用ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＡｄｖａｎｃｅ１１软件进行比对分析。３．２．１０重组分析首先用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件对病毒基因组序列进行比对，保存为．ｍｅｇ格式的序列比对文１１８ＲＤＰ［］件４（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＰｒｏｒａｍ，ＲＤＰ），，然后将该文件导入重组分析软件ｇ１１９１２）１２１（［］［］［］用该软件包中的７个重组分析算法（ＲＤＰ、ＧＥＮＥＣＯＮＶ、ＢＯＯＴＳＣＡＮ、１２２１２３１２４１２５ＭＡＸＣＨ［］［】［］［］Ｉ、ＣＨＩＭＡＥＲＡ、ＳＩＳＣＡＮ和３ＳＥＱ）分别进行重组事件分析。＿ｖａ分析过程使用系统默认参数，设定置信值（Ｐｌｕｅ）为０．０５。重组分析结果中有４个以６“ｘ上的重组分析算法支持的重组事件．〇Ｔ，并且Ｐ＜ｌｌ（时该病毒分离物才被认为存在明确”“”的的重组位点（ｃｌｅａｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｉｔｅｓ），否则为暂定的重组位点（ｔｅｎｔａｔｉｖｅ１２６１２７一［，］ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｉｔｅｓ）。非重组的病毒分离物如果有部分序列与重组的病毒分离“”物的序列相似，则该非重组病毒分离物为相应非重组病毒分离物的亲本分离物（ｐａｒｅｎｔａｌｉｓｏｌａｔｅｓ）〇６４ 广西大学博士学位论文中国液山苗病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的所究３３．结果－３．．３１ＲＮＡＳｅｑ深度测序我们在对淮山药样本进行病毒检测的过程中发现有９个淮山药品种的样本具有典型－发现的所有病毒种类（见表３－９。（３１））由于小病毒病症状见图，并包含本研究所ＲＮＡ测序读长较短，，组装获得的病毒序列信息有限不能完全覆盖病毒基因组，为了一获得这些病毒的更多的序列信息，用于进步克隆这些病毒的基因组全长序列，我们对ＲＮＡ－Ｓｅ测序这９个样本采用ｑ深度，测序获得的序列去除接头和去除低质量序列（Ｔｒｉｍｍｉｎｇ）后，用Ｔｒｉｎｉｔｙａｓｓｅｍｂｌｙ算法进行Ｚ）ｅ？ｏｖｏ组装获得Ｃｏｎｔｉｇｓ，将其与ＮＣＢＩ的病毒序列数据库进行ＢＬＳＡＴ分析－ＰＣＲ只能检测到桂淮２号样本中。结果发现用ＲＴ一存在ＪＹＭＶ－Ｓｅ，而通过ＲＮＡｑ测序分析，发现其中个Ｃｏｎｔｉｇ与ＹＶＸ在核苷酸水平一一８一的致性最高为２％，但是覆盖度只有１１％，推测其可能是个新病毒，需要进步验证。在桂淮６号样本中获得了ＹＭＭＶ的近全长序列，与最近报道的ＹＭＭＹ巴西分离一ｅｎＢａｎ６５１）＞ｋ．ｃｖ．Ｂ物（Ｇ：ＪＸ４７０９．在核苷酸水平上的致性为８３％。粤北３号（￡Ｙ３）样本中获得的ＹＭＭＶ的近全长序列与ＹＭＭＶ巴西分离物（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＸ４７０９６５．１）在一８３％核苷酸水平上的致性也为。另外还发现粤北３号样本中存在的ＹＶＸ与凤果花叶＇ａｎ病毒ＵＳ１分离物（■Ｐｅ／ｗＴＪＯＴＭｆｗａｆｃｖ／ｍｓ，ＰｅｐＭＶ，ＧｅｎＢｋ：ＦＪ９４０２２５．１）在核苷酸水平一＞６９％一〇如〇＾＞？１上的致性为，是个新的／５病毒。紫山药样本中获得的￥＼０（的部分序’列与黎花叶病毒Ｘ（ＣＡｅｍｊｐｃｘ／ｉＭｗ／ｗｏｊａｉｃｖ／ｍｙＸ，ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ６６０３３３．１）在核苷酸水一致性为一平上的８７％，但是覆盖度只有１３％，推测其可能也是种新病毒。在徐农紫药（Ｚ）．ａ／ａｔｏｃｖ．ＺＹ）上获得ＹＶＸ的近全长序列，与？ＰｏｔｅｃＷｎｗ白三叶花叶病毒日本分离ｔｅＹｅｃＷｍｅｎａｎｋ：物（？ＰｏｃＷｍｓｗ／ｎ／ｏｖｅｒｗｏｊａ／ｃｓ，ＷＣ１ＭＶ，ＧＢＸ０６７２８．１）在核昔酸水平一一致性最高为７７％２５％的序列能够匹配上，因此也有可能是。上的，但是只有个新病毒在水山药（Ｚ）．〇沙〇汾ａｃｖ．ＳＳＹ）和大和长芋上均获得ＹＬＶ的近全长序列，都是与酒花花叶病毒澳大利亚分离物（ｉｆｏｐ／ｎｏｗｎｃｖｉｍｓ，ＨｐＭＶ，ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ５２７９７９．１）在核苷一致性最高为７７％ＢＢＷＶ－２的全长基因组酸水平上的。而在铁棍山药上除了获得序列夕卜，还获得了ＹＹＳＭＶ的部分序列，其与百香果严重畸叶病毒ＢＲ：ＬＮＳ２：ＰａＳ：０１分离物＞－（／〇＾〇？１治５＾＾＾／６＜２沿对〇／？／〇；１仍＞１？）＾〇６１１８￡１１１］（：？１９７２７６７．１）的核昔酸水户／，？８１＾１＼，一一平上的致性最高为６９％盖度为５８％，是。，覆个新的菜豆金色花叶病毒属病毒６５ 广西大学博士学位论文中国灌山充■病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究表３－９用于ＲＮＡ－Ｓｅ度测序的淮山药样本ｑ深Ｔａｂ－ｕ－－ｌｅ３９ＹａｍｓａｍｐｌｅｓｓｅｄｆｏｒＲＮＡＳｅｑｄｅｅｓｅｕｅｎｃｉｎｐｑｇ样本名称采集地点品种ＲＴ－ＰＣＲ检出病毒种类ＧＨ２－ＷＭ－２广西武鸣县桂淮２号ＪＹＭＶＧＨ６－ＮＣ－１江西农业科学院桂淮６号ＹＭＭＶ－－ＹＢ３ＮＣ１江西省南昌市粤北３号ＹＭＭＶ、ＹＶＸ－ＺＹ－１河南温县样云镇紫山药ＹＶＸＷＸ、ＣＹＮＭＶ－－ＺＹＸＺ１江苏省徐州市徐农紫药ＹＭＭＶ、ＹＶＸＳＳＹ－ＦＸ－３江苏省－２丰县王沟镇水山药ＹＭＭＶ、ＹＬＶ、ＢＢＷＶ、ＣＹＮＭＶ、ＪＹＭＶＤＨＣＹ－ＳＧ－－ＬＶ１山东寿光市稻田镇大和长芋ＢＢＷＶ２、ＹＴＧ－ＷＸ－３河南温县祥云镇铁棍山药ＪＹＭＶＴＧ－ＦＸ－２２江苏省丰县王沟镇铁棍山药ＹＹＳＭＶＢＢＷＶ－２、６６ 广西大举傅士学位论文中国浪山葯病毒病调音、诊断和病康病毒分子生物学的研究，顯声ｓ顆］ＶｙＬＩ處３－ＲＮＡ－ｅ图１用于Ｓｑ深度测序的淮山药病毒病样本症状表现：２，、花叶：６，：３，Ａ桂淮号黄斑；Ｂ桂淮号轻花叶；Ｃ粤北号褪绿花叶；Ｄ：紫山药，：，，褪绿花叶；Ｅ：徐农紫药斑驳；Ｆ水山药褪绿花叶；Ｇ：大和长芋，皱缩畸形；Ｈ：铁棍山药，花叶；Ｉ：铁棍山药，黄斑、花叶Ｆ－ｍＲＮＡ－ｉｕｒｅ３１ＳｙｍｐｔｏｍｓｏｆａｍｖｉｒａｌｄｉｓｅａｓｅｓａｌｅｓｕｓｅｄｆｏｒｓｅｇｙｐｑＡＤ．ａｏｎｉｃａｖ．Ｈｗｔｍｏａｃ．ａａｔａｖ．Ｈｍｄｍｏｓａ：ｊｐｃＧ２ｅｌｌｏｓｏｓｉＢ：ＤｌｃＧ６ｉｌｉｃ，ｙｐ，；，；Ｃ：Ｄ．ａｌａｔａｖ．ＹＢ３ｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃＤ：Ｄ．ａｌａｔａｃｖ．ＺＹｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃＥ：Ｄ．Ａｌａｔａｃｖ．ＺＹＭｏｔｔｌｅｄｃ，，，；；；Ｆ：Ｄ．Ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＳＳＹ，ｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃ；Ｇ：Ｄ．Ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＤＨＣＹ，Ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｈ：Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＴＧ，ｍｏｓａｉｃ；Ｉ：Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＴＧ，ｙｅｌｌｏｗｓｐｏｔ，ｍｏｓａｉｃ６７ °ｚｃ鉍￡ｓ穿ｓ０ｌＩｌ■１ｌ一ｌ１ｌｌｌ１°１．．１ｌ．．．．．ｒＩｒＩ－ｒｓｕＴｏ．卜６９－Ｌ６９０－－￡ｖ０卜－ｌ１ｓｓ０ｅ８ｏｅ８寸５ｓ９９ｓｌ釙ｓＳｉｌ０６－＆ｏ６－Ｓ－－６６０Ｓ／ｚ０Ｓ０ｏＺｓ＾ｏ卜９９ｏｕ５０ｓ１ｓｌ９ｚ＾－－弇１Ｌ９／ａｆ０寸ＳｇｓＫＳｓｏＫｓ－ｑ５６ａｌ＾钳ｎ８＆Ｓｘｆｓｌ０ｘｕ＇ｘａａａ８ｎａａａＨｓＶ１ＨａｄＸＭＫｆｖｖｖａｖｖｖＥＶ「「＊ｖｒＶ中为－＂＃ｓｐｌ礙Ｏ。。。。。ｘ？ｒ／＼／％％％０％％％％／％％％％Ｏ／０％％。％。／０％０／１６８Ｌ１ｒ０＞ｓ卜ｔ１９８０６晓２寸８ｓｓ２９８Ｓ８ＬＩ６８ＵＳ８Ｓ６口８８６９８犋兵０－９￡８９ｃＳ１对右０＇Ｚ９＇１Ｔ０－００－０００００７０ｏ０Ｃ０００－．．．．．．．．．．．隹３３ｕ－。－＾０３００２Ｚｚ寸００００００ｃ０ｏ０００与３＇Ｊ砌ＩＭＯＯ＾ｘ３＼。Ｘ００００。％ｏ。％０。＾０ａ％％％＼％＼／０ｏ％°％＼％ｃｏｏ％００。峰ｎ°６６９￡０ｏ£６寸００二９鵂ｏ５６６１ｓｌｓｓ—ｌ＿卜一１Ｉ５ｌ－泛—搲ｒｒＵＭＭｕ＃２ｐ°ｉｕ＞ａＳ；ｎ９－－Ｓ°＂ｌＺｉ－ｂＬｒ．ｓＳｅＭ＾．．９６ｅ８ｅＳｓＬ－９３－９０ｅ．．．．ｒ．－ｓ２Ｓ９０ｓ９寸－Ｗ．．０ｓＸ－ｓＬ－Ｕ＝－？ｄ＞２６２／－９ｓ８ｚｇ０５８６ｉ０３Ｘ－１Ｕ６９ｓ６－Ｓ９０ｓｏ９２－ａ－＞－Ｖｅ寸Ｇ９￡ｅｓｓ￡ｓＳＮＷ３ｅｌＳ１ｅ２ａｐｘＳｑＰｓｕＳＪ｝－－ｐｚ１ＯＳ．ｕ６－８寸父１ｏｄｚ６９—－ＳＳｏ々Ｓ对Ｓ卜９ｓＫ＂ｓｇ０－０－Ｓ６５６ｅ＇－０＆ｉ姿ｅ０９１９Ｓ８８１６５ｏ１ＳＳ／＾９ｓ２ｅ９—）ｉ９００寸－－ｕｓ９８￡ｇｚ寸－ｓ３ｌ５ｓ＾１，Ｚ９寸Ｓｓ＾ｓ＇５ｆｑＡ－ｌＳＫＥＴＪＴＩＡａｕ＇－ｄｄｄ－－ａｄｄｄ－ｄｄｄｄａｄｄｄ－－－－－－ｕｓｑｑ－°ｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑＪａｔ°＾°ｌ８ｓｓ－Ｘ８－６－ｅ６寸６－ＪＵ－Ｊｌ寸９ａ－－寸－６ｅｓ６＂６ＫＪａ＾ｇｓＺ．－ｇ－ｐｓｓ６．／＾５０ｙ６９６＆９９６ｓｓｓ００６ｓ一ｂｅｇＧ寸ｌｐＥｑ＾ＯｌＪＪＫＩＴ°－＆ａ°－ｓ－ａｄｄｄ＆－ｄ－－－ｄｄｄｄｄｄ－－＾ａｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑｑｕｌ—ｌ９９６°９〇ｇ寸－ｌ〇寸－－－ｕｕ°ｎ°二Ｓｓ８６９〇ａｏ５－寸Ｚ．１２ｌＳ—Ｓ６－ｓ６寸Ｌｎｕ６６ｉ９寸１９ｓｓＳ２ｓｓ８６￥Ｉ８ｅ５ｂｏｓ＾ａＩ３ＩＥＶＶｖ＜ＺｚｏＮｕＳ＞ｉＩｙＡａ＞－－＞Ａ－－ｓＩＡＳ＞Ａ＞ＡＳＡＡＩＩ＾＞＞ＷＩｓＩｉＸＸＡＺｎｌＸＮｘＭＭＡｉＭｓＭＳＭｓｉ＾ｙｌ＞ｉ＞Ａ５＞ＭＨＨＨ１ＡＨ２ａＡＡＡＡＡ＞ＡＡＡ°＾８ｒＡＡＡ３？ＡＨ８ＡＡｒａｒｆＡ３ＥｄｊｏＭＪ１备ｕ＇－ａ１＇９ｓ－ｅｌＳｓ扫Ｅ—３３＇－ＸＸ－ＸＵ－ＭＭＮｚＨ部－ＡＡｘｄ－．－Ｍｘ－ＵＶｌｄ－９ｌ－－Ａ－－屮ｕ１ｙＢＳＡＡＳＨＤｃＺ５５ＡＺＮＳＵＸ痺ｘＱ釙Ｉ－ｖ－－ｓａｑｃＥｚ３ｕ卜Ｖ８ｕＧ丄０Ｈ１ 广西大掌博士学位论文中国淮山药病毒病供查、诊断和病風病毒分子生物学的研究３．３．２ＹＭＭＶ南昌分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析－ＮＣ６淮山药温和花叶病毒南昌分离物（ＹＭＭＶ１）来自在江西农科院采集的桂淮－号样本，症状表现为轻度花叶（图３１Ｂ）。经高通量测序组装获得该病毒的近全长基－ＰＣＲ和ＲＡＣＥ技术进行克隆验证高因组序列，根据获得的序列信息设计引物，采用ＲＴ３－２通量测序结果，克隆策略见图。ＣＥ和ＲＴ－ＰＣＲ对ＹＭＭＶ－ＮＣ８ｂ、经ＲＡ１进行分段扩增，依次获得大小分别为９２ｐ－３２３３４ｂ、１９４７ｂ、２２１４ｂ、１５１７ｂ和１２９０ｂ的片段，凝胶电泳分析结果见图３。ｐｐｐｐｐ－ＥＡＳＹ－Ｂ回收纯化ＹＭＭＶＮＣ１的６个片段，分别连接至ｐｌｕｎｔ载体并转化感受态细ＹＭＭＶ－胞３个。测序拼接结果显示，ＮＣ１不，随机挑取阳性克隆的质粒进行序列测定包含Ｐｏｌｙ（Ａ）的病毒基因组全长为９５３８ｎｔ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ１２５４７６），包含１个大的ＯＲＦ，一一编码３０８４ａａ的多聚蛋白３５１．２７ｋＤａ，以及１个小的ＯＲＦ，编码个，蛋白分子量为１２８［］提出的马铃薯Ｙ病毒科的多聚蛋白切割位点个６７ａａ的ＰＩＰＯ蛋白。参考人（１〇１１１３等预测标准和植物病毒简述网站上对马铃薯Ｙ病毒属病毒多聚蛋白切割位点的统计分析ＤｅｓｃｒｉｔｉｏｎｓｏｆＰｌａｎｔＶｉｒｕｓｅｓ，ｈｔ＾）：／／ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ／ｐｏｔｙｃｌｅａｖａｇｅ／），并结合ＮＣＢＩ蛋白质（ｐ－ＮＣ１的多聚蛋白酶切位点进行预测功能预测，结果发现该多聚蛋白，对获得的ＹＭＭＶ（－３２）：可被毒自身编码的蛋白酶切割成１０个病毒蛋白见图，从Ｎ端到Ｃ端依次为Ｐ－）Ｋ１（、Ｉ（６ａａ、６Ｋ２１（３２０ａａ）、ＨＣＰｒｏ（４５７ａａ）、Ｐ３（３４８ａａ、６５１ａａ）Ｃ４３）（５２ａａ）、ａ（１９、ＮｌａＰ２４０ａａ）、Ｎｉｂ（５１６ａａ）和ＣＰ（２６６ａａ）。ＮＩＶＰｇ１ａａ）ｒｏ（－ＨＣＰｒｏ中存在ＦＲＮＫ基序，这在，在Ｎｉｂ中存在ＧＤＤ基序，在ＣＰ中存在ＤＡＧ基序３－２些保守的基序都是特有的（见图）。将预测的蛋白酶切割位点与本实验室克隆的７个ＹＭＭＶ分离物和已报道的ＹＭＭＶ巴西分离物以及新近登录ＮＣＢＩ的ＹＭＭＶＣＮ１分离物进行比较，发现来自不同地方不同品种的ＹＭＭＶ分离物的蛋白酶切割位点－１１）的氨基酸序列存在多样性（见表３。，可能与病毒的变异和宿主适应性相关６９ 广西大举博士举位论文中国淮山苑病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物掌的研究ＦＲＮＫｍｏｔｉｆＧＤＤｍｏｔｉｆＤＡＧｍｏｔｉｆＰ．ＩＰ０６Ｋ１６Ｋ２ｖ，３’５ｉ＿＿＿＿Ｌｎ＿Ｊｒ一一ＶＰ－ｒｏＶＰ－Ｐ１ＨＣＰ３ＣｌｒｏＡｆｌｇＰｌｇＮａＰＮｉｂＣＰｔｕＵ—Ｈ１，Ｆｒａｇｍｅｎｔ１Ｆｒａｇｍｅｎｔ３Ｆｒａｇｍｅｎｔ５－－０．９ｋｂ２ｋｂ１卜，５ｋｂ）（）（）－－－？？？？－，ＵＰＭ５－－ＲＡＣＥＹＭＭＶ３ＦＹＭＭＶ３ＲＹＭＭＶ４ＦＹＭＭＶ４ＲｍｅｒｐｒｉｓＦｒａｍｅｎｔ２Ｆｒａｍｅｎｔ４Ｆｒａｍｅｎｔ６ｇｇｇ－－－．．．（２３ｋｂ２２ｋｂ１３ｋｂ）（）（）’ＹＭＭＶ－２ＦＹＭＭＶ－２ＲＹＭＭＶ－４ＦＹＭＭＶ－４Ｒ３ＲＡＣＥＮ１ＴＮｐｒｉｍｅｒｓ１３－２Ｖ－图ＹＭＭＮＣｌ的基因组结构和全长序列克隆策略－Ｆ－ｉｇｕｒｅ３２ＧｅｎｏｍｉｃｍａｐｏｆＹＭＭＶＮＣ１ａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｔｏａｍｌｉｆａｎｄｓｅｅｎｃｅｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｇｙｐｙｑｕｐｇＭ１６Ｍ２３４５－－－－－＇ｎｒｆｒ；ｒｒ２ｆ１．５ｋｂ—１．５ｋｂ０７ｋｂ—．０７ｋｂ．Ｉ■ＩＨｉ３－３－图ＹＭＭＶＮＣｌ的基因组序列分段ＰＣＲ扩增电泳图ｌｋｂＡＬＭ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｕｓＤＮａｄｄｅｒｐ；’’？？ＡＣＥ１６：ＹＭＭＶ基因组序列分段扩增的片段１片段６（１和６分别为ＹＭＭＶ的５和３Ｒ产物）－－Ｆｉｇｕｒｅ３３ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＹＭＭＶＮＣｌｅｎｏｍｅｇＭ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｌｕｓＤＮＡＬａｄｄｅｒｐ；’’？？１：ｎｔ１Ｖ５ＲＡｔＹＭＭＶ６ｆｒａｇｍｅｓ６ｏｆＹＭＭ（＆３ＣＥｐｒｏｄｕｃｓｏｆ）７０ －ｌｎｏ￡ｃＭｒ２￡－２Ａ盖ｌ義ｉｓｓ麵ｓｓ＿ｚｓＳＸｓｓｉｒＪｖｖｖｖｖｖｖ＜ｓｓｖｚ＾ＳＡ鉍／、／／／＾ｖ／／／Ｖｖｕ．／Ｏａｆ＇ｄａｃｙａａａｃｙＯａ｝穿ｃｕＨＨＨＨＨ６ＨＨＩＨＨＨｒ＞ｉ５／ｌＩｌｌＨｌ－ｍＡＳ§ｕ＼ｌＡｚ＾／／＞＞ａＡＡＡ＞ｒｎｚ？＼＞；．ｑ．－Ａｌｌ？ｘｌ？？？ＪＡｓ钋ｌ寸ｒｑ０ｚａａａａａａａａａ５ｌｌ３５「＃ｌ＆．０４ｔｌ＞１／－趔Ｓｒ０ｓｓｓＳｓＳｓｓｓｔ２ｓＳ目屮ｓｓＳｓｓｓｓｓｓ；＾ＱｑｌｇｇＳｓｓｏｒｌｓｓｓｆＪｐ５ｉ、／／、／／Ｉ、－ｓ、ｆ／－欠ＳｌＮｙ／ａ６ａａａ＞ａａ０ｃ＿：§ｌａ６＾－５（蛛ｍｇ３３３３３Ｈ３５ｗｙ＿ｔｓＪ２７ＣＱＡ＞＞＞，／°＞ａ＾２＿联ｒｔ＞？Ａ？＞＞？＞？＞＞＞７ｇｃａ．ｙｌＪＪｄｄａ．ｄｄｆｃＪ５ＩＤ．．ｄ？ｏ嗥：ｌｌＣ＞Ａ＞＞＞＞＞．ｓ＿３Ｎ）ＮＩＨＪ胺ｎｌｄＩｊＸ兵ｍｕ２Ｓ（ｕ－Ｊ－－－来Ｍ－－＂ｓｒｔｉ＾§＜右－Ｓ？ｓＩｅ－Ｅｇ＾Ｉ￣Ｉ（ｎ（ａＡＩｉ§ｉｓＥ隹ｆｉＯ：００ｏ／ＤＯＤ－）ｃ／）／／／／／ＣＱＳｓ／／３／３３３３ｍ３ａＳＪｕ３＾３３３ｌ寸－ｃＨｈＨＳ３Ｓ１ＪＨＨＨ＇．Ｈ．．．－Ｈ１ｏＪＮｍＩ１．ｌｌ．Ｅ（Ａｌ．．ＬＮ０Ａ．／／Ａ１ＸｏＡＶ）ｌ＞ＡＶ＞＞＞Ａｌｐ铒－ｉ－ｌｘＬＭ－ｌ０ｌ１１ｌ（＾２胺ＮｓｄＳｄＳｓＳｓｓｌＭｘ§＞＝＾ｄ＂３跦ａｃ－ｒＮＰｐｐ名ｒｔ＞ｓｓ３ｓｌＳｓｓｃｘｓ３－ｉ一－２－－－－ｉ＾塒謹ＢｍＩｒｓｕｃｕ０ｏｏｃｏＱＤａｃａｊｏＤＶ＿／／／－ｕ抝＞／／／／／／／Ａｓ：Ｈｌｙｒ－５ａａａ５ａｃｙｃｙＩｃｇｃｆｓｅ０－ｐＩ５ｓＡｌ１Ｈ＾－Ｈ３ｌＨＨＨＨ：ＨＩｓｃ＝，＇－－－Ａ－Ｍ＊＜．）＾＿餅°５１Ｘｌｆｆ（ｈＨ１４Ａ／＞＞＞Ａ＞Ａ（Ｎ＼ＡＡ＞Ａ「ｔ：＞ｕ＆Ｂ２＞（ｌｓＳａ１ｌＳｓＳ／ｓＳＳｕｚｅｐ３ｇＵ３Ｓｕ３，Ｍ３Ｈ３３Ｊ！９Ｇ—Ｂｆｒ力ＴｎＳｚ＾ｎＪｌｏ０＝ｏ＝ｓ５ｌ０ｑＢｏｄｓｓｇｓｓＩｃｉ年Ｎ－ｌＩ－ｉ－－－－ｌｉＳｓｉ．ＥｎｇＳｇ５ｇｓｓ（ｕ／／／＇、／＾＾、、—＾ｘｏａ６ａａａａｃｙａ６ｃｙ０卜．Ｉ：；ｘｏａ１卜－ＩＩ工１ＨＨ寸００Ｓｓ－５５５Ｊ－ｌ５３５＿ＡＡＨＯ２１ｓＪ９Ａ＞＞＞＞ＡＡ＞Ｓ５Ｊ－＾＾１／．￡Ｈ－Ｈ￥￥ＶＶＬＸｅｆＨｖｏＣＵＡｕＩＵＪ３＾ｕｇｇｇｍ３Ｉａ３Ｓ（ｓＵ２－ｘＩＺｉ？Ｕ－ｚ．＝２＞ｚ５５ｕＥｐＥｐｐｐｐ一Ｓ－ｓ－－－＝＝－－名－－－－－Ｅｚ§！產ｆＮＳｓＶ）ｃｓｌｌｙ３ｓ／ｓ５ｓｓｓｌＯ／、／／、／／／／－／／ＣＱｙａｌｃｙｂ５ａａｃｙｃｙＯ０ａ０／ｕ－１２＾ａｅＨ１ＨｇｓＩＨＨＨＨ＾１３：ＩＩＨＨＫ－Ａｕ＾ｕ＜ＡＭＡ＜＼ＡＡＡＳｏＨｓ＝＾／ｚＱｌ＞＞Ａ＞＞＞＞＞＞）ｎｌ＞＞ｌ０ＨＡＭ：＊ｓ＞ｄ１ｃｌｐ－ｄ０－ｄＪｄｉｏ．！ｓＪ９Ｍｖｕ§＞ｕＭ３３３ＵＪｓｕ．Ｖ－ｆＧ＞（＾ＯＣＱｓｕ６＾Ｚｚ－Ｚ．＾－５ｇｓ３ｕｓｓｓｓｘ寸ｇｓ－－ｓｓｓ－ｌ—ｒｎ－－ｓ－－＝＝－－ｔａ＞ｉ＝鬆－７ｓ－§－－＜＜ｖＳ）ｔＮａ＜＜＜ｖ＜＜ｖ＜／ｏｌｓ、／／、ｖ／欢＾ｄａ、／＾ａｏ－０ｅ．ＡＨ０ｃｙａａａａａａｓＡｌＩＨＩＨ＝ｕＨｘＱｙＳ５５５ｗ３３ＵＪＨＡ＞Ｈｓｓ３ｓ３＾ＭＣ；ｗ＇Ｓ９＾＞＞＞＞ＡＡ／＞＞＞＞＞＞＞ｌ０（ＰｅＪｄａ．ａｄ？－＞＞３ｙ（Ｎ§Ｅ．：〔－Ａ￡－／５ｓｓ＿ｌＪ－ｌ＿：ｉｌａｄｌＮ１ａｏ＾－＞ｙ（ｕ３ｏｓｓ３ａ＊ｌｒＪｏ（ＮｓｓｚＥ０ｆＰ泛ｌＯｇ卜卜ＰＪ＞）ｌ－ＪｏａＤＩｌｏｓ－／／ＵＩＪｌ／、Ｊ／２／ｚｙＯ￡９§ａｏＯＯ／９ｚＤｌｄ－／＞＞＾Ｅｌ＞＞ＡＡ＞ｘ＾＾ｏ－－ａｄｓＳａ；ｏｉＤｉＭｎａ２§Ａ＞＞－ＡＡＡＡｃ＞ｐ－Ａ１１ｆｐＨＩＨＨ＝ｃａｕ３：ｕｓｄ：：＇ｓＨＭ＾＾ＭＭ２２§￥ｌ３ａＨ２＾ｄ！ＵｏＡＣＱ）－－－６Ｃ－－－－－－§ｌｃＪＳＳ３＾５Ｐｐｐｐ！ｓＳＳＳｇｄＳＳｚｓ／／ｕ－ＳＳｓｓｓｓＳＳＡ．ｏｓ／／／／／／／１ｓｌｔｕＡＡ／）ＮＩｕ＾ＡＡＡＡＡＡＡ０－Ａ（ＫｕＨＨＨＨＨＨＨＨＨ．２°＝ｏ／ＦＨａｌ＞ｌＨｆ－－１１Ｈｆｌ１１ｌ卜溆ｄ１１ｔｌＡｌｌ１Ｕ－Ｉ＼ｘｓｆ寸Ｇｌｓｓ５Ａ担ｏＭＩＭ１Ａ－ｄＳＡＪ／＊＃ＢＵａ＇ｌ＇Ｏ．Ｕｅ＿ｎｒｑＩ＾＾书Ａｓ＜ｎｆ１１ｘ２ＩＩ３－：ｘＨｎ§ｕｕＸＺＸ／２３ｓＮ０社ＷＥ＾ｕ－ｙ．ＸＭｕ－９ｉｚｚＵＭｏＵ３＿．Ａｏ／／／／／／／／／ｓ２／ｆ＞＾＾Ｕ釙ｓｌｆ－ｌ＞＞Ａ．ＡＡＡ＞／／ｌＡＨ§／ｋ／￡ＶＳＳｉｓＳＳＳ２＼ｉ＞＾ｕ８Ｔ－＞１！Ｅｌｉ２Ｊ５ｅＳｓｉｓＳＳＳＳ＼ｓＭ１Ｅ§ｆｅｑＩ０ＪＸＡＡ．Ｊ－Ｂ－＾＞ＡＡＡａＡＡＡＡＡＡｒｒＡｅＳ９Ｊ０Ｊ）－Ｈ 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广西大学博士掌位论文中圔嫌■山苗病毒病调查、诊断和病尿病毒分子生物举的研究－码的外壳蛋白ｒｏｔｅｉＣＰ）ＪＹＭＶＹＭＭＶＮＣ１编（Ｃｏａｔｐｎ，与同是的ＹＭＶ和一％的ＣＰ蛋白氨基酸序列致性分别为５１％和５６．７，其多聚蛋白与野生番茄花叶病毒＇ｃ一（奶Ｗｔｏｗａｔｏｍｔｗａｉｖｉｒｕｓ，ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ００９７４４．１）＿的多聚蛋白氨基酸序列致性最一高，为５２％，与其它１４个马铃薯Ｙ病毒属病毒的多聚蛋白的氨基酸序列致性在一４－１．５５２％之间，而与ＹＭＶ和ＪＹＭＶ的多聚蛋白氨基酸序列致性则分别为４６．６％和－４５．７％（表３１２）。一目前ＧｅｎＢａｎｋ共收录１０个ＹＭＭＶ分离物的基因组全长序歹！Ｊ，其中个为巴西分离物，其余９个为中国分离物，其中有８个ＹＭＭＶ中国分离物（ＮＮ１、ＮＣＩ、ＮＣ３、ＦＸ１、ＮＣ２、ＸＺ１、ＷＸ１和ＷＸ３）的基因组全长序列来源于本研究的工作基础。分别’’用它们的基因组全长核苷酸序列和３端的部分核苷酸序列（部分ＣＰ和３ＵＴＲ区域）构建系统进化树，结果显示，两个系统进化树的树形比较接近，来自中国南方、中国北方３个分３－４和巴西的ＹＭＭＶ分离物分别聚成支（图），表明采用ＹＭＭＶ分离物的部分‘ＣＰ和’ＵＴＲ区域构建的系统进化树可以在一３定程度上反映其进化关系。对１０５个来源于广西、江西、河南、山东和江苏的主要淮山药产区的ＹＭＭＶ阳性’２６３－２）样本的部分ＣＰ和３ＵＴＲ进行克隆测序，发现存在个ＹＭＭＶ分离物（表。将—其与ＮＣＢ３－３）起构建最Ｉ收录的来自其它国家和地区的１９个ＹＭＭＶ分离物（见表－ｍ－ｅｎｅｃｒｅｅ大似然进化树（Ｍａｘｉｍｕｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｐｈｙｌｏｇｔｉｔ）（见图３５），结果显示，ＹＭＭＶ分离物在进化关系上可以分为５个Ｇｒｏｕｐ，ＧｒｏｕｐＩ的ＹＭＭＶ分离物来自中国南方的淮山药产区；ＧｒｏｕｐＩＩ的ＹＭＭＶ分离物来中国北方的淮山药产区；ＧｒｏｕｐＩＩＩ的ＹＭＭＶ分离物来自印度；ＧｒｏｕｐＩＶ的ＹＭＭＶ分离物来自美洲中部的加勒比地区和巴西等地；ＧｒｏｕｐＶ的ＹＭＭＶ分离物来自非洲西部的多哥、喀麦隆、法属圭亚那、瓜德罗普岛和马提尼克岛和几内亚等地。ＹＭＭＶ的系统进化树清晰显示，其进化上的多样性和遗传变异性与所处地理位置密切相关，推测ＹＭＭＶ可能由于地理隔离导致不同群体的单独进化。采用重组分析软件包ＲＤＰ４中的７个算法对已有基因组全长序列的１０个ＹＭＭＶ分“”离物进行全基因组核苷酸序列重组分析，共发现了９个重组事件，其中有４个明确的“”３－重组事件和５个暂定的的重组事件（表１３）。重组事件主要发生在病毒基因组的－－Ｐｒｏ３。ＰＩ、ＨＣ、Ｐ３、６Ｋ１和ＣＩ的部分区域（图６）７３ 广西大学博士黎位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究—Ａ１００ＮＮ１｜１００Ｉ—ＩＮＣ１１２２．ＮＣ３＿ＦＸ１ＮＣ２ＢｒａｚｉｌＬＩ－—ＸＺ１，ｗｘ１＾ｄ＿ｒ１ＷＷＸ３ｉ１０．０２Ｂ９８ＮＮ１，ＬＮＣ１？０｜＾ＮＣ３ＦＸ１ＮＣ２ＢｒａｚｉｌＬＩＸＺ１「＾ｉｉＷＸ３Ｉ１００２．’图３４ＹＭＭＶ分离物的基因组全序列（Ａ）和部分ＣＰ＋３ＵＴＲ序列（Ｂ）构建的系统进化树使用ＭＥＧＡ６软件对９个ＹＭＭＶ分离物的基因组全序列（Ａ）和部分ＣＰ＋３ＨＪＴＲ序列（Ｂ）分别构建最大似然树。建树过程设置ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为１０００次重复。３－Ｆｉｕｒｅ４ＰｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅＡ）ａｎｄａｒｔｉａｌＣＰ＋Ｓ＾ＴＲＢｏｆＹＭＭＶｉｓｏｌａｔｅｓｇｙｇｙｐｇ）（ｐ（－ｍｅＭａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｓｅｕｅｎｃｅａｎｄａｒｔｉａｌｃｏａｔｒｏｔｅｉｎｐｙｇｐｇｑｐｐＳ－ＭＶＣＰｌｕｓ３ＵＴＲｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆ９ＹＭｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂＭＥＧＡ６．Ｎｕｍｍｂｅｒａｔｔｈｅｎｏｄｅｓｏｆ（）ｐｑｙｔｈｅｂｒａｎｃｈｅｓｒｅｒｅｓｅｎｔｅｒｃｅｎｔａｅｂｏｏｔｓｔｒａｖａｌｕｅｓ１０００ｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐ，ｐｇｐ（ｐ）７４ ■广西大学博士学位论文中国淮山病毒？病调查３？、诊断和病康病毒分子生物举的研究８２，Ｌｕｚｈａｉ＼４４ＴＬＬＺ１ＮＣ１Ｉ［＿ｒ—￣—８？ＮＮ１ＩＷＭ１６９６５ＬＮＮ２２７ＮＣ２ｉＧｒｏｕｐＩＳｏｕｔｈＣｈｉｎｊ，ａＰＮＣ３５４Ｌ９７ＦＸ１．￣—２６ＬＦＸ２｜ＮＮ４８８８９ｌＩ＾－ＮＮ５ＩＮＮ３ＩＣＮ１６７「ＳＧ１＇ＳＧ２ＸＺＩＬｆ”ＸＺ２５２６６ＷＸ１ｊ｜ＷＸ３９９ｉＧｒｏｕＩＩＮｏｒｔｈＣｈｉｎａｐ，—ＷＸ８——ＷＸ７ＷＸ２８２－ＷＸ４—ＷＸ５Ｉ—ＷＸ６／－Ｉｎｄｉａ４ＤａＩ］ＩＧ１＞ＧｒｏｕＩＩＩＩｎｄｉａｐ，ｇ８＊－Ｉｎｄｉａ３Ｄａ９２ｊ９３４、ｉＧｕａｄ３〇ＪｉＧｕａｄ５２８ＩＢｒａｚｉｌ￣ＣＲ１＞ＧｒｏｕｐＩＶＣｅｎｔｒａｌＡｍｅｒｉｃａ，｜｜Ｌ５，Ｇｕ２＿１ｙ＿｜１ｐ＾Ｍａ３７ｒｔ２——ＩＧｕ１ｙｔ—５２ＤａＣｍｎ４２＼丨＾６６Ｄ２７ｒＣｍｎｌ１｜ＤａＵｇａｌ＊－９９ＤａＵｇａ３１２８ＧｒｏｕＴｏ２ｐＶＷｅｓｔＡｆｒｉｃａｇｏ，ＩＤａＴｏ２ｇ６８ＩＬ—ＤａＣＤＩ１９７９￣—，ＤａＧｕｉｌ—Ｄ／ｒＧｕｉｌＩ１０．０２’图３－５ＹＭＭＶ分离物的部分ＣＰ＋３ＵＴＲ构建的系统进化树７５ 广面大举博士黎位论文中ｍ浪山苗病毒病调查、诊断和病厫病毒分子生物掌的研究６２６（－２Ｖ使用ＭＥＧＡ软件对个来自中国的ＹＭＭＶ分离物表３）和１９个来自其他国家的ＹＭＭ分’３－３ＣＰ＋３ＵＴＲ序列构建最大似然树离物（表）的部分。这４５个ＹＭＭＶ分离物在进化关系上可以分为５个Ｇｒｏｕｐ。建树过程设置ｂｏｏｔｓｔｒａ值为１０００次重复。ｐ－Ｆｉｕｒｅ３５ＰｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｐａｒｔｉａｌＣＰｌｕｓｏｆＹＭＭＶｉｓｏｌａｔｅｓｇｙｇｙｐ９－－ＭａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｒｔｉａｌｃｏａｔｒｏｔｅｉｎＣＰａｎｄ３ＵＴＲｓｅｕｅｎｃｅｓ２５９ｐｙｇｐｐ（）ｑ（－ｔｏ２６２ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｏｆ２６ＹＭＭＶｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＣｈｉｎａＴａｂｌｅ３２ａｎｄ１９ｏｔｈｅｒＹＭＭＶｉｓｏｌａｔｅｓｓｅｕｅｎｃｅｄ）（）ｑ－ｒｅｖｉｏｕｓｌＴａｂｌｅ３３ａｖａｉｌａｂｌｅｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅｆｉｖｅｍａｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｏｕｓａｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄ．Ｃｌｕｓｔｅｒｓｐｙ，）（ｇｐｃｏｎｔａｉｎｉｎｉｓｏｌａｔｅｓｂｅｌｏｎｉｎｔｏＩｔｏＶｒｏｕａｒｅｓｈｏｗｎｈｇ．Ｎｕｍｍｂｅｒａｔｔｈｅｎｏｄｅｓｏｆｔｅｂｒａｎｃｈｅｓｒｅｒｅｓｅｎｔｇｇｇｐｐｅｒｃｅｎｔａｅｂｏｏｔｓｔｒａｖａｌｕｅｓ１０００ｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐｇｐ，（ｐ）表３－１３ＹＭＭＶ重组位点分析－Ｔａｂｅｌ３１３ＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｃｒｏｓｓｏｖｅｒｓｉｔｅｓｉｎＹＭＭＶｅｎｏｍｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂＰ４ｇｙＲＤＲｅｃｏｍｂ－ｉｎａｔｉｏｎＳｕｐｐｏｒｔｉｎｇＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭａｏｒＭｉｎｏｒＡｖ．ＰＶａｌＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｊｅｖｅｎｔｓｏｆｔｗａｒｅｐａｒｅｎｔｐａｒｅｎｔｓｉｔｅｓ－１４ｘ￣Ｎｏ．ｌＲＧＢＭＣＮＣＩＮＮ１ＮＣ２４．６６８ｌ０１４７＇ｕｘ－Ｎｏ．２ＲＢＭＣＳ３ＷＸ１ＷＸ３ＣＮ１ＮＮ１２．４０７１〇１９６７，，，ＸＺ１９３５７－９５３０＇９３３ＣＮＣ＾－Ｎｏ．ＲＢＭＣＳＷＸ１ＷＸ１Ｎ３９．８６６１０９７９１９４９，，，ＸＺ－１９７９２０６９＇１０ＮＮＣＮＮｘ－ｏＲＢＳ１７．４３２ＷＸ１４．１７〇ｌ〇２１３３３８５＇５Ｎｏｘ－．５ＲＧＭＷＸ１ＸＺ１Ｂｒａｚｉｌ１．９９４ｌ〇１７４６＂４Ｎｏ３４９０－．６ＲＧＢＭＣＳＮＣＩＮＣ３ＣＮ１ＮＣ２３６５８Ｘ１０３７２５，，．，ＮＮ－３８１３４３２３３＇３－ＣＮ１ＦＸ１＞＜Ｎｏ．７ＲＢＳＮＣ２４．９６３１０３４６１３９５２＇３Ｎｘ－ｏ．８ＲＢＮＣ３ＮＣＩＣＮ１５．３４３ｌ〇４６７５８６＇２ｘ－Ｎｏ．９ＲＷＸ１ＮＣ２ＮＣ３４２１０９ＷＸ３．５７９ｌ０２３７２，，ＸＺ１注：ＲＧＢＭＣＳ３分别为ＲＤＰ４软件包中的ＲＤＰ、ＧＥＮＥＣＯＮＶ、ＢＯＯＴＳＣＡＮ、ＭＡＸＣＨＩ、ＣＨＩＭＡＥＲＡ、ＳＩＳＣＡＮ和３ＳＥＱ软件。红色粗体的字母代表获得尸值最小的软件。７６ 山药■广西大学博士学？位论文中国浪病毒病调查、诊断和病服病毒分子生物学的研究Ｉ６Ｋ２Ｎ－ＰｌａＰｒｏＩＰＯ６Ｋ１士Ｉ＿ｉ—ｉ１）｜丨’，ＶＰ－Ａｎ－－５ＶＰＰ１ＨＣＰｒｏＰ３ＣｌｇＮｉｂＣＰ３ｇ＾ＩＩＢｒａｚｉｌ＾“山ＣＮ１｜ＦＸ１＿丨ｉｌ１ＶＩ■ＮＣ２ｔＣ２｜｜１ＮＣ２ｉｖ１ＨＮＮ１ｖｉｉｆｘｉＩＩＶＩＩＩＩＣＮ１ＶＩＨｉＮＣ２ＶＩ■ｒＪｃ２ＷＸ１Ｉｌ｜■ＩＵＩＩＮＮ１ＩＸ■ＮＣ３＿｜ＶＢｒａｚｉｌ，ｌＩＩＨＩ■■■ＮＣ３丨＂ＩＩｉｘ■ＮＣ３＊＾ＭｎＮ１Ｉ＾Ｉ１ｍｍｍｍｎｃｓＸ＂ＩＩＩ＾Ｍ１Ｉ—ＮＣ３＿＿ｎＮ｜■■ＩＮＣ３－－ｎ１Ｉ？１３９５２ｎｔＭ１？３９５３９３５６ｔ＜ｎｏｎ－ｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｒｅｇｉｏｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｒｅｇｉｏ图３－６基于ＹＭＭＶ分离物的基因组全长序列的重组分析使用ＲＤＰ４对１０个ＹＭＭＶ分离物的基因组全长序列进行重组分析，采用不同的颜色对各ＹＭＭＶ分离物进行标识９个独立的重组事件，分别用不同的颜色进行标识。。共发现Ｆ－Ｒｅｃ－ＹＭＭＶｎｏｍｅｓｅｕｉｎａｔｆｕｌｌｌｅｎｔｈｅｅｎｃｅｓｉｕｒｅ３６ｏｍｂｉｏｎｉｎｇｇｑｇｕ－ｔｈｅｔｈｕｅｎＬｏｃａｔｎｆｕｎｉｕｅｍｂｉｎａｔｉｏｎｅｖｅｎｔｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＲＤＰ４ｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｆｌｌｌｅｎｓｅｑｃｅｉｏｓｏｑｒｅｃｏ，ｇｕ－ｎｒｅｒａｎｄｔａｎｍｅｎｔｏｆＭＭＶｉｌａｔｅ．Ｅａｃｈｆｌｌｌｅｔｈｅｎｏｍｅｉｓｒｅｒｅｓｅｎｔｅｄｂａｌｏｎｃｏｌｏｄｂａｈｅｌｉｇ１０Ｙｓｏｓｇｇｐｙｇｉｒｅｃｏｍｉｔｉｏｎｃｏｒｒｅｓｎｎａｍｅｖｅｎｔｏｔｈｅｌｅｆｔｒ．Ｔｉｕｒｅｓｈｏｗｔｔｌｏｆ９ｕｎｕｅｂｎａｔｏｆｈｅｂａｈｅｆｓａｏａｐｏｎｄｉｉｓｏｌａｔｅｉｑｇ，ｇｇｃｉｎｒｅｎｔｓｈａｖｅｂｅｅｎｉｎｔｅｒａｔｅｄｉｎｔｏ．ｅｖｅｎｔｓｄｅｍａｒｃａｔｅｄｂｙｔｈｅｂａｒｓｂｅｌｏｗｔｈｅｎｏｍｅｓｔｈｅｒｅｏｍｂａｎｔｆａｇｍ，ｇｅｇ７７ 国淮山药■病毒病调查诊断和病康病毒分子生物学的研究广西大学博士学位论文中、３．３．３ＪＹＭＶ温县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析－ＷＸ日本淮山药花叶病毒温县分离物（ＪＹＭＶ１）来自在河南省温县夏庄村的铁棍山３－１Ｈ）。经药样本，症状表现为重度花叶（图高通量测序组装获得该病毒的基因组的ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＡＣＥ技术进行克隆验证高通近全长序列，根据获得的序列设计引物，采用－量测序结果３７。，克隆策略见图－７３、经ＲＡＣＥ和ＲＴ－ＰＣＲＹＭＶＷＸ１进行分段扩增大小分别为１１ｂ对Ｊ，依次获得ｐ７５６３－８１７。２１２４ｂｐ、３０８９ｂｐ、２４９８ｂｐ、１ｂｐ和５ｂｐ的片段，凝胶电泳分析结果见图ＦＲＮＫｔｆＧＤＤｍｏｔｉｆＤＡＧｍｏｔｉｆｍｏｉＰＩＰ０６Ｋ１６Ｋ２Ｉ＼／，５，３Ｂｉｉ！Ａｎ－ＶＰｇＰ１ＨＣ－ＰｒｏＰ３ＣｌＶＰｇＮｌａＰｒｏＮｉｂＣＰ￣１Ｉ１Ｆｒａｍｅｎｔ１Ｆｒａｇｍｅｎｔ３Ｆｒａｇｍｅｎｔ５ｇ－ｋｂ．８ｋｂ１．２３．１卜１＞ｋｂ卜）（）－＾－＞■？，－－Ｍ－ＪＹＭＶ－３ＲＪＹＭＶ５ＦＪＹＭＶ５ＲＵＰ５ＲＡＣＥＪＹＭＶ３ＦｒｉｍｅｒｓｐＦｒａｍｅｎｔ２Ｆｒａｇｍｅｎｔ４Ｆｒａｇｍｅｎｔ６ｇ－－－－２．５０５ｋｂ２ｋｂ（）．１ｋｂ（）（），－－ＪＹＭＶ－２ＦＪＹＭＶ２ＲＪＹＭＶ４ＦＪＹＭＶ４Ｒ３ＲＡＣＥＮ１ＴｐｒｉｍｅｒｓＮ１－ＹＭＶ－ＷＸ图３７Ｊｌ的基因组结构和全长序列克隆策略－－３７ＧｅｎｏｍｌｉｆａｎｄｕｔｈｌｔｅｅｎＦｉｃｍａｆＪＹＭＶＷＸ１ａｎｄｔｈｔｅｔｏａｍｓｅｅｎｃｅｅｃｏｍｅｏｍｅｉｕｒｅｐｏｅｓｔｒａｇｙｐｙｑｐｇｇＭ１２３４５６屬３－８－图ＪＹＭＶＷＸｌ的基因组序列分段ＰＣＲ扩增电泳图ｄ’Ｍ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｌｕｓＤＮＡＬａｄｅｒ１：片段１（５ＲＡＣＥ）；ｐ；产物’ＲＡＣＥ）２：：５６：６（３：片段２３：３；片段４；５片段；片段产物；片段４７８ 广ｇ大掌博士举位论文中圔來山苗病毒病供查、诊断和濟Ｊｇｌ病毒分子生物学的研变－－ＷＸＦｉｇｕｒｅ３８ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＪＹＭＶ１ｇｅｎｏｍｅ＊Ｍ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒＩｋｂｌｕｓＤＮＡＬａｄｄｅｒ１：５ＲＡＣＥｒｏｄｕｃｔ；；ｐｐ＊－２３４５：ｆｒａｍｅｎｔｓ２３４＆５ｏｆＪＹＭＶＷＸ１６：３ＲＡＣＥｒｏｄｕｃｔ，，；，ｇ，，ｐＪＹＭＶ－ＥＡＳＹ－ＢＷＸｌ的６ｌｕｎｔ回收纯化个扩增产物，克隆至ｐ载体并转化感受态细胞，随机挑取３个阳性质粒进行序列测定。对测定的病毒片段序列进行拼接获得－－ＪＹＭＶ：ＫＪ７８９１３８）。ＷＸ１的基因组全序列（ＧｅｎＢａｎｋ序列分析结果显示，ＪＹＭＶＷＸ１Ａ’’不包含Ｐｏｌｙ（）的病毒基因组全长为９７３３ｎｔ，其中５ＵＴＲ１６８ｎｔ，３ＵＴＲ２０８ｎｔ（不包括Ｐｏｌｙ（Ａ）），经结构域预测和同源序列比对分析，结果显示其编码１个大的ＯＲＦ，编８ａａ３５５一的多聚蛋白．５ｋＤａ１个包含５９ａａ码３１１，分子量为，以及个小的ＯＲＦ，编码的ＰＩＰ０蛋白－。该多聚蛋白可被病毒自身编码的蛋白酶剪切成１０个病毒蛋白（见图３７），－从：Ｐ１（３１３ａａ）、ＨＣＰｒｏ（４５８ａａ）、Ｐ３（３５５ａａ）、６Ｋ１Ｎ端到Ｃ端的顺序分别为（５２ａａ）、Ｃｌ（６４４ａａ）、６Ｋ２（５３ａａ）、ＮＩａＶＰｇ（１９２ａａ）、ＮＩａＰｒｏ（２４３ａａ）、Ｎｉｂ５－（１８ａａ）和ＣＰ（２９０ａａ）。在ＨＣＰｒｏ中存在ＦＲＮＫ基序，在Ｎｉｂ中存在ＧＤＤ基序，在ＣＰ中存在ＤＡＧ基序，这些保守的基序都是特有的。其基因组结构与ＹＭＭＶ一５６．５％极为相似，但是全基因组的核苷酸序列致性只有，而编码的多聚蛋白的氨基酸一４５。序列致性也只有．７％３．３．４ＣＹＮＭＶ丰县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析－ＦＸ中国淮山药坏死花叶病毒丰县分离物（ＣＹＮＭＶ１）来自在江苏省丰县的水山药３－样本１Ｆ）。经髙通量测序组装获得该病毒的近全长基因组序，症状表现为花叶（图列－ＰＣＲ和ＲＡＣＥ技术进行克隆验证高通量测，根据获得的序列信息设计引物，采用ＲＴ－。序结果，克隆策略见图３９＿ＣＹＮＭＶ的病毒基因组为ｓｓＲＮＡ－，如图３９所示，经ＲＡＣＥ和ＲＴＰＣＲ对ＣＹＮＭＶ－ＦＸ１进行分段扩增，依次获得大小分别为１０９８ｂｐ、７３６５ｂｐ和８５８ｂｐ的片段，３－凝胶电泳分析结果见图１０。７９ 广西大学彳專士举位论文中国浪山苗病毒病调查、诊断和病服病毒分子生物学的研究ｒｏｔｅａｓｅｍｏｔｆｈｅｌｉｃａｓｅｍｏｔｆＶＰｔｒｏｓｉｎｅｒｏｔｅａｓｅｍｏｔｆＲｍｏｔｉｆｐｉｉｇｉｄＲｐｙｐＰ５’’＼ｉ３Ｔ，ｖ，ｚ——－＾－—￣■１１ＨＸ＇ｒＨｈ—＿ＶＰＧＨＣ－ＰｒｏＰ３Ｃ－ｌＶＰｇＮｌａＰｒｏＮｉｂＣＰＡｎ￣￣—－Ｌ－￣￣￣＇ｕＬ＇＼ＨｉＨ１Ｆｒａｍｅｎｔ１Ｆｒａｇｍｅｎｔ３ｇ－－１．１ｋｂ０．８ｋｂ（）（）－？＜－＊＊ＵＰＭ５ＲＡＣＥ３ＲＡＣＥＮ１ＴｒｉｒｐｍｅｒｓｍｐｉｍｅｒｓＮ１ａｅｎｔＦｒｇ２－７．４ｋｂ（）－？？－ＣＹＮＭＶ－２ＦＣＹＮＭＶ－２Ｒ－ＹＮＭＶ－图３９ＣＦＸ１的基因组结构和全长序列克隆策略Ｆｕｒｅ－ＹＮＭＶ－ＦＸｍ１ａｎｄｔｔｔｎｄｕｅｎｃｅｔｈｅｔｅｎｏｍｅｉｇ３９ＧｅｎｏｍｉｃｍａｐｏｆＣｈｅｓｒａｅｔｏａｐｌｉｆａｓｅｃｏｍｌｅｅｇｇｙｙｑｐＭ２Ｍ１３１—１ｋｂ．０１．０ｋｂｆｌ■Ｈｉ－－图３１０ＣＹＮＭＶＦＸ１的基因组序列分段ＰＣＲ扩增电泳图Ｍ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ；’’１１（）２２３：３（３ＲＡＣＥ产物）：片段５ＲＡＣＥ产物；：片段；片段Ｆ－ｍ－ｉｇｕｒｅ３１０ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｒｏｄｕｃｔｓａｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＣＹＮＭＶＦＸ１ｅｎｏｍｅｐｐｐｇＭＧｅｎｅＲｕＤＮＡ：ｌｅｒｌｋｂＬａｄｄｅｒ；’’ｍｅｎ－１ｆｒａ１５ＲＡＣＥｒｏｃｔ：２：ａｅｎｔ２ｏｆＣＹＮＭＶＦＸ１：ｆｒａｍｅｎｔ３３ＲＡｒｏｄｃｔ：ｇｔ（ｐｄｕ）ｆｒｇｍ３ＣＥｕ；ｇ（ｐ）Ｖ－ＦＸ－回收纯化ＣＹＮＭｌ的３个片段，克隆至ｐＥＡＳＹＢｌｕｎｔ载体并转化感受态细胞，３－ＦＸ随机挑取个阳性质粒进行测序。对测定的病毒片段序列进行拼接获得ＣＹ＾ＭＶｌＢＫＪ７）ＹＮＭＶ－ｌＡ的基因组全序歹ｉＫＧｅｎａｎｋ：８９１３５，序列分析结果显示，ＣＦＸ不包含Ｐｏｌｙ（）’’的病毒基因组全长８２２８ｎｔ，其中５ＵＴＲ１３５ｎｔ，３ＵＴＲ２３０ｎｔ（不包括ｏｌＡ）经结ｐｙ（），８０ 广西大举博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物举的研究构域预测和同源序列比对分析，结果显示其编码１个包含２６２０ａａ的多聚蛋白，分子量－为２９７．６４ｋＤａ。该多聚蛋白可被病毒自身编码的蛋白酶剪切成９个蛋白质（见图３９），－Ｐｒｏ从Ｎ端到Ｃ端的分别为：ＨＣ（２６１ａａ）、Ｐ３（３０７ａａ）、７Ｋ（６４ａａ）、Ｃｌ（６５６ａａ）、９ＶＰ－５６７ａａＩＣ（８０ａａ）、ｇ（１８０ａａ）、ＮＩａＰｒｏ（２１７ａａ）、Ｎｉｂ（）和ＣＰ（２８８ａａ）。Ｐ３一被认为与病毒复制、宿主范围和症状表现相关。经序列分析发现Ｐ３区域内包含个假一－Ａ定的ＰＩＰ００ＲＦ（１３４４１５１７ｎｔ），包含个高度保守的Ｇ＿ｙ基序（ＧＧＡＡＡＡＡＡＡ）。ｉ２ＹＨＣ－ＰｒｏＹＮＭＶＨＣ－Ｐ与马铃薯病毒科中的其它病毒的更小的相比，Ｃ的ｒｏ缺少保守－－Ｇ－Ｎ和ＣＣ－的Ｉ／ＳＣ基序，这两个基序被认为分别与基因组扩增和系统运动相关。该病毒基因组全序列与已报道的ＣＹＮＭＶ日本分离物（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ７１０１４５）的在核苷一一酸水平上的致性为７７．９％，在氨基酸水平上的致性为８８．５％。３ＢＢＷＶ－．３．５２寿光分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析在山东寿光市稻田镇采集的一株症状表现为严重畸形和花叶的大和长芋山药上检－－２－测到ＢＢＷＶ（图３１Ｇ），通过ＲＮＡＳｅｑ深度测序，组装拼接获得了其基因组近全长－序列。根据获得的序列信息设计引物，采用ＲＴＰＣＲ和ＲＡＣＥ技术进行克隆验证高通量－，克隆策略见图３１１测序结果。ＢＢＷＶ－２－，ＲＮＡ３１１是香豆病毒属成员为双分体正链病毒，如图所ＲＡＣＥＴ－ＰＣＲＢＢＷＶ－－１１示，经和Ｒ对２ＳＧ进行分段扩增获得大小，扩增基因组ＲＮＡ分别为１１０７ｂｐ、４９３５ｂｐ和１２８３ｂｐ的片段，扩增基因组ＲＮＡ２获得大小分别为９５１ｂｐ、２－３３６４ｂｐ和１３８ｂｐ的片段，凝胶电泳分析结果见图３１２。ＢＢＷＶ－－－回收纯化２ＳＧ１的６个ＰＣＲ产物，克隆至ＥＡＳＹＢｌｕｎｔ载体并转化感受态ｐ细胞，随机挑取３个阳性质粒进行测序。对测定的病毒片段序列进行拼接获得ＢＢＷＶ－２－ＳＧ５９５３ｎ－的ＲＮＡ１全长ｔ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ７８９１３６），与ＢＢＷＶ２日本分离物一－ｅｎＢａｎ－的ＲＮＡ：ＡＢ０５１．１）２ＳＧ１１（Ｇｋ３８６的核苷酸序列致性为９〗％。ＢＢＷＶ的ＲＮＡ’’一，（Ａ，包含的１个大的ＯＲＦ的５ＵＴＲ２３０ｎｔ３ＵＴＲ１１０ｎｔ不包括Ｐｏｌｙ），编码个包（）含１８７０ａａ的多聚蛋白，分子量为２０９．９ｋＤａ。该多聚蛋白可被病毒自身编码的蛋白酶剪５－Ｐ４ａ切成个蛋白：蛋白酶辅因子（ｐｒｏｔｅａｓｅｃｏｆａｃｔｏｒ，Ｃｏｒｏ３５ａ，３９４ｋＤａ）、核苷；．３－ｒｏ酸三磷酸结合蛋白（ＮＴＰｂｉｎｄｉｎｔｅｉｎ，ＮＴＢＭ５８２ａａ，６５．２６ｋＤａ）、病毒基因组连ｇｐ；ｅｎｏ－ｎｋｅｄｏＶｔｅ．１７）ｔＰ接蛋白（ｖｉｒａｌｇｍｅｌｉｐｒｉｎ，ｐｇ；２６ａａ，３ｋＤａ、蛋白酶（ｐｒｏｅａｓｅ，ｒｏ；ＲＮＡ－ＲＮＡＮＡ－２０９ａａ２２．９８ｋＤａ）和（ＲｄｅｅｎｄｅｎｔＲＮＡｏｌｍｅｒａｓｅ，ＲｄＲ，依赖的聚合酶ｐｙｐｐ；８１ ■广西大学？博士学位论文中国淮山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物举的研究’ａａ７９．２６ｋＤａ）ＮＡ１的（ＡＡＡＣＡＧＣＵＵＵＣ），６９９，。在Ｒ５ＵＴＲ发现存在四个重复的基序－－？－？￣？Ａ１）２１１ｔｔ、ｔ９３１０３ｎｔ（１１ＲＮ。ＢＢＷＶ２ＳＧ分别位于３ｎ、３９４９ｎ５６６６ｎ和见图３－的ＲＮＡ２全长３５９９ｎｔ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ７８９１３７），与ＢＢＷＶ２日本分离物的ＲＮＡ２’一７－－ＵＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋＡＢ．１％』ＢＷＶ２ＳＧ的ＲＮＡ１的５２２７：７４６９３９）的核苷酸致性为８一’ＲＦｎ１ｔ（，编个包含１０６４ａａ的ｔ３ＵＴＲ７７ｎ不包括Ｐｏｌｙ（Ａ）），包含的１个大的Ｏ码，多聚蛋白，分子量为１１９ｋＤａ。该多聚蛋白可在Ｑ／Ｇ残基和Ｑ／Ａ残基处水解切割产生３个成熟的蛋白：运动蛋白（ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＰ；４６５ａａ，５２．３８ｋＤａ）、大外壳蛋白（ｌａｒｇｅｃｏａｔｒｏｔｅｉｎ，ＣＰＬ；４０２ａａ，４４．２４ｋＤａ）和小外壳蛋白（ｓｍａｌｌｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＰＳ；ｐ’ＵＴＲＵＣ１９７ａａ２２．４２Ｄａ。５（ＡＡＡＣＡＧＣＵＵ），，ｋ）在ＲＮＡ２的发现存在三个重复的基序－？？￣２１１ｔ、１５ｎ５９６９ｎｔ（见图１１ＲＮＡ２）。分别位于３ｎ４１ｔ和３ＲＮＡ１Ｑ／ＤＱ／ＳＱ／ＳＱ／Ｇ、ｖｐｇ（？）ｉＩＰｏｌｙ（Ａ）－？ＰＣｏＰｒｏＮＴＢＭＶｐｇｒｏＲｄＲ（）ｐＦｒａｇｍｅｎｔ１Ｆｒａｇｍｅｎｔ３－１３ｋｂ１．１ｋｂ（卜＞）＇’３ＵＲＡＣＥＮＩＴＰＭ５ＲＡＣＥｍｒｉｍｅｒｓＮ１ｐｒｉｍｅｒｓＦｒａｇｅｎｔ２ｐ－４．９ｋｂ（）－？令－ＢＢＶＷ－２ＦＢＢＷＶ２ＲＱ／ＡＲＮＡ２，？＂（７？Ｖ？Ｈ乂、ＰｏｌＡｐｇ（）＞＝！ＺＺ二ｙ（ＭＰＬＣＰＳＣＰＦｒａｍｅｎｔＦｒａｍｅｎｔ６ｇ４ｇ－－１０ｋｂ１．２ｋｂ．（）（）—－？？—？＇’３ＲＡＣＥＮＵＩＴＰＭ５ＲＡＣＥｒｍｅｒｓＦｒａｍｅｎｔ５ｐｒｉｍｅｒｓＮ１ｐｉｇ－３．４ｋｂ（）－－？？－ＢＢＷＶ－５ＦＢＢＷＶ５Ｒ３－ＢＷＶ－２－ＳＧ１图１１Ｂ的基因组结构和全长序列克隆策略－－－１ａｎｒｔｔｕｅｎｈｍＦｕ１１ｆｌＢＢＷＶ２ＳＧｄｔｈｅｓｔａｅｏａｍｌｉｆａｎｄｓｅｃｅｔｅｃｏｅｔｅｉｇｒｅ３Ｇｅｎｏｍｉｃｍａｐｏｇｙｐｙｑｐｅｎｏｍｅｇ８２ 国谁山药■病毒病调音诊断和病尿病毒分子生物学的研究广西大举博士学位论文中、Ｍ１２３Ｍ４５６，。孤應－１．．０ｋｂＢＡＢ－－ＷＶ－图１２ＢＢ２ＳＧ１ＰＣＲ扩增电泳图３的基因组序列分段Ｍ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｌｕｓＤＮＡＬａｄｄｅｒ；ｐＡＢＢＷＶ－２－ＳＲＮＡ１Ｒ，：Ｇ１的分段ＰＣ扩增电泳图’’ＲＡＣＥ）：：３（３ＲＡＣＥ）１：片段１（５；２片段２；３片段；Ｂ－－ＲＮＡＰＣＲ：ＢＢＷＶ２ＳＧ２的分段扩增电泳图，’，ＲＡＣＥＲＡＣＥ４：片段４（５）；５：片段５；６：片段６（３）－－３－ｄｕｌｉｆｅｄｆｒｏｍＢＢＷＶ２ＳＧ１ｅｎｏｍｅＦ１２ｌｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｓｉｓｏｆＰＣＲｒｏｃｔｓａｍｉｉｇｕｒｅＧｅｅｐｙｐｐｇＭ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｐｌｕｓＤＮＡＬａｄｄｅｒ；－－ＡＧｅｌｅｔｏｒｅｓａｓｏｆＢＢＷＶ２ＲＮＡ１ｌｅｃｒｈｏｉｓａｎｌｓｉＳＧ１，ｐｙ，＊＊ｄｕｍｄｕｃｃｔ２：ｆｒａｍｅｎｔ２３：ｆｒａｅｎｔ３３ＲＡＣＥｒｏｔ１：ｆｒａｇｍｅｎｔ１５ＲＡＣＥｒｏ）；ｇ；ｇ（ｐ）（ｐＢＷＶ－２－１ＲＮＡ２ＧｅｌｅｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｎｌｉｏｆＢＢＳＧｌｉｓａａｓｓ，，ｐｙ，’Ｒｒｏｔ５：ｍｅｎｔ５：ｆｒａｍｅｎｔ６３ＲＡＣＥｒｏｄｕｃｔ４：ｆｒａｅｎｔ４５ＡＣＥｐｄｕｃｆｒａ６ｍ；；（ｐ）ｇ（）ｇｇ３．３．６ＹＶＸ温县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析一ＹＶＸ的紫山药症状表３－１Ｄ）株感染现为轻花叶。在河南省温县祥云镇采集的（图－通过ＲＮＡＳｅｑ深度测序获得了该病毒的近全长基因组序列，该病毒分离物命名为－ＹＶＸ－ＷＸＰＣＲ和ＲＡＣＥ技术进行克隆验证１。根据获得的序列信息设计引物，采用ＲＴ－１高通量测序结果，克隆策略见图３３。－－－ＷＸＲＡＣＥ和ＲＴＰＣＲＹＶＸ１ＹＶＸ的病毒基因组为ｓｓＲＮＡ，如图３１３所示，经对？２７７１４的大小分别为５２１ｂ、３１７９ｂ、１ｂ进行分段扩增，依次获得的病毒基因组片段ｐｐｐ４３－４８９ｂ１。和ｐ，凝胶电泳分析结果见图８３ 广西大学１善士半位论文中国淮山药病毒病调音、诊断和病風病毒分子生物李的研究－回收纯化ＹＶＸＷＸ１的４个片段的ＰＣＲ产物ＥＡ－Ｂ，克隆至ｐＳＹｌｕｎｔ载体并转化感受态细胞，提取ＰＣＲ鉴定为阳性转化子的质粒，内切酶消化大小正确的质粒中，随机－挑取３个质粒进行测序。对测定的病毒片段序列进行拼接获得ＹＶＸＷＸ１的基因组全序显示－ＷＸ列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＭ００９１２０），序列分析结果，ＹＶＸ１不包含ＰｏｌｙＡ的病毒基（）＿＇因组全长６１３４１１１；，与白三叶草花叶病毒（财扣￡７〇＾讲〇仰（：咖１？，＼＾０１＾／［＼０日本分离Ｂ一物（Ａ６６９１８２．１）的核苷酸序列致性最高，但仅为５３．１％。其编码的ｒｅｐｌｉｃａｓｅ和丁ＧＢ３一也与ＷＣ１ＭＶ编码的相应蛋白的氨基酸序列致性最髙．。，分别为５１．８％和２９４％但是一其编码的ＴＧＢ１则与ＬＶＸ的ＴＧＢ１的氨基酸序列致性最高，仅为３４．５％。而ＴＧＢ２一７－则与ＳＶＸ编码的ＴＧＢ２的氨基酸序列致性最高，为４．４％（见表３１４）。ＴＧＢ３ＴＧＢ１ｒ猫廳■＿丨￣丨丨＿■严㈧丨＿＇＃＃ＲｄＲｐＣＰＴＧＢ２ｃ“Ｆｒａｇｍｅｎｔ１－０．５ｋｂ（）－ｒａｍｅｎ？Ｆｇｔ４ＵＰＭｓ５ＲＡＣＥ０．５ｋｂ卜｝￣ｒｓｐｉｍｅｒＦｒａｍｅｎ２ｇｔ二：－３．２ｋｂｙＲＡＣＥＮ１Ｔ（）＾ｐｒｉｍｅｒｓＮ１ＹＶＸ－２ＦＹＶＸ－２ＲＦｒａｍｅｎｔ３ｇ卜２．８ｋｂ＞－？＜－－ＹＶＸ－３ＦＹＶＸ３Ｒ－－ＷＸ图３１３ＹＶＸ１的基因组结构和全长克隆策略－－ＷＸ１Ｆｉｕｒｅ３ｍｉＶＸｍ１３ＧｅｎｏｃｍａｏｆＹａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｌｉｆｓｕｅｎｃｅｔｈｅｃｏｍｇｐｔｏａｍｙａｎｄｅｐｌｅｔｅｅｎｏｅｇｙｐｑｇ８４ 山药■病毒病调音广西大学博士学位论文中国淮、诊断和病尿病毒分子生物学的研究Ｍ１１４Ｍ２３２■１°吐１。ｋｂｋｂ—－－ＷＸ图３１４ＹＶＸ１的基因组序列分段扩增ＭＬａｄｄｅｒＭ２：ＧｅｎＲｌｅｒｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ：ｅｎｅＲｕｌｅｒ１００ｂＤＮＡ；ｅｕ；ｌＧｐ，，２２３３４：４（３ＲＡＣＥ）１１５ＲＡＣＥ），：：，片段：片段（片段；片段－ＷＸ－ＰＣＲｒｔｍｆｍＹＶＸ１Ｆｕｒｉｅｆｅｎｏｍｅ１ｔｒｏｉａｎａｌｓｉｓｏｆｏｄｕｃｓａｌｉｄｒｏｉｇｅ３４ＧｅｌｅｌｅｃｐｈｏｒｅｓｓｙｐｐｇＭｌ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ；Ｍ２：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｐｌｕｓＤＮＡＬａｄｄｅｒ；’，ｍｍｅｎｔｓＲＡｒｏｔ２：ｆｒａｔ２３：ｆｒａｅｎｔｓ３４：ｆｒａｅｎｔｓ４３ＲＡＣＥｒｏｄｕｃｔ１：ｆｒａ１（５ＣＥｄｕｃ；ｍｅｎｓ；ｇ，ｇｍ（ｐ）ｇｐ）ｇ－丨（ｒｅｃａｓｅｏｒｏｔｅｉｎ，ＷＸ：ｌＹＶＸｌ编码的５个蛋白分另Ｊ为复制酶多聚蛋白ｐｌｉｐｙｐＲｄＲ）、三ｔｒｅｅｎｅｂｏｃｋｒｏｔｅｉｎｌＴＧＢ１）、二２（ｔｒｉｌｅｐ重基因区蛋白ｌ（ｉｐｌｇｌｐ，重基因区蛋白ｐｒｏ３ｔｒｉｌｅｅｎｅｂｌｏｃｋｒｏｔｅｉｎ３，ＴＧＢ３）ｇｅｎｅｂｌｏｃｋｐｔｅｉｎ２，ＴＧＢ２）、三重基因区蛋白（ｐｇｐ■－（ＣＰ）Ｐｏ／ｅｘＷｍｓ３１３）。选取和外壳蛋白？该病毒的基因组结构符合属特征（见图ｉ－ｄＲＭＥＧＡ６ＹＶＸＷＸ尸ｏｔｅｃＷｒｗｓ的Ｒ和ＣＰ蛋白的氣基酸序歹ｊ，用１和已报道的ｐ蛋白软件的最大似然法构建系统进化树。两个进化树均显示，该病毒与Ｉ（ＮＶＸ）－－（ＩＣＴＶ）在进化上的关系最近（图３１５和图３１６）。根据国际病毒分类委员会第九次Ｐ或Ｒ一报告，划分为Ｐｏ＾ｘｖ／ｎ？的新病毒种的标准是编码ＣｄＲｐ蛋白的核苷酸致性小一ＶＸ－ＷＸ１的ＣＰ和ＲｄＲ于７２％或其氨基酸致性小于８０％，而Ｙｐ分别与序列相似性最一５－高的ＮＶＸ和ＷＣ１ＭＶ的氨基酸序列致性只有３７．１％和１．８％（见表３１４），因此分ｖ■析结果支持其为Ｐｏｆｃｘｆｒｔ＾ｓ新种。８５ ｓ试ｕｄｊ【【【【【【【【ｔ【【【【【Ｅｊｕ６０３５９Ｆｒ８６ｏＩｒｎｅ￡ｋ＾￡￡￡寸寸ａ寸寸５２２ｍ２２ｌ１２ｗＩ§Ｈ一１ｌＩＩ＾二】】】１】ｌ】】】】】】】】ｌ＿＿ｌ】ｌ１ｌ一ＩｆｓＩｒＩＩ「ｒ－－「＿．．．．￡ｒｓ．ＯＯ／８ａｏｏｏ．８Ｔ＜ＮｓｏｕｚＪ５Ｓ８ｐｎＨｏｏｏ＇ｌｔｉ００ｉｚ．ｏｏ００Ｚ－－１ｌ６（Ｎｏｌｏｏｚ＜Ｓｌ〇５５Ｊ６ｓ６０Ｓ￥９９２§９ｕ６９ｖｏｏｌｃ９９ｓ９８ｌｖｏｐＩｓ９９ｏ９６ｑＺ１Ｋ￡９９．ｔｓｆｓｍｅ￡ｉ硃８ｓｏ￡—°９ｇＳＡｕｃａｉＣＱＡｒａ§ＣＱｆｉＡＡｙＹｕＶＶｖｖ＜：ｓｖＶ＾ＶｖＶＶＶｚａｖ联￣兵ｓ８９ｓ￡１ｏｏｇ９６ＬｔｒＴ．ｒｒｒ＿＿．＿＿＾５￡ｏ￡９寸９ｏｏｏ？ｓ？ｎｌＬｅｚ１１＜ｗ？２ｌ＜ｌｉｉ彔（ｓｔｓｚｓＪＱｓ｛ＱｔｓｓｚｓｆＮ，￣砌（？％Ｔｕ￥）＾＾Ｊ寸ｏａ６＜ｓ一卜Ｔｍ「ｒ，＿‘ｒ￥ｒ＜ｏｏ２７ｉｚＬｖｏ？ｓｓｐ茺錄ｓｃｉｓｆｏｃｏ￡＾§＾ｉ？豸ｓｒｎ寸ｉｓｐ联！＿ｐｕ按ｕ５ｃｐ彐ｐＭＸＳ８－Ａｌ．ｕ－ｌｓＶ１￡ｒｓｏｆＮ６９Ａ，．＿．．．ｒｎｚ￡ｏｌｃｓｏＳ口卜ｃｓ沄＝寸＾ｕＩｓＫＳｓｉｉｓｉｓ§Ｉ！ｓ寸々５９Ｍｐｑｓｗ（Ｍ■ｕａｕ￡ｌｒｌａｓｌＩｒｌ８ｓ００５？ｕｓ‘」．＿ｕｚｏｖｐ５口ＣＫ９卜ｍｏ￡ｅＮｃｓ§ｆＮｓ＾忾Ｓｆｓｇｉｉ〔ｓｓｆｓ＾ｎｂ＊必ｕ０ｉｓ＃§ｐ＇５ｂ赖一２丨ｏｐ冢－ｕ１００９３００一ＶＯｓ一１ｌ此ｌ．．．，．ｓＢ６２６＜Ｓ「￡９避Ｚ＾５－１２＜Ｎ２００ｉ２ｓ２２日ｚ？２１ＰＳＵＣｌＭＳ＾ｎＰｍ）－Ｓ．ｏｏｘ趦ｇＨｌ：ｐＷ舡ｎ＠：ｕＳｎ１ｏｏ５Ｓ逛＾？，ｎ「．５ｉＪｚＣＮ６＜ＮｖＯＯ艺寸ｓ９ｔｓ穿Ｐ：＾ｉｉＩ９？Ｓ＾带ｇ－＜ｆｓ，９￣敏，－＇￣ｃ：锻（ｌｕｘ３ａ（／ｐ！ｏｕ？Ｍ自ｏ〇－ａ腰ｓ＆ｓ９（？ＮＪｕ￡ＩｎｏｏＶＯ°ｏｏｖｒＺｓｏｏｏｘ？ｒ．ｕｓｒｌ３ｐ％０ｒｎＯＯｏｖｓｏｏｏ）／ａ荛ｉ：ｚｒｓＮｔｓｓｓｓｉＪＺｓｒｏ＾ｏ￡ｓｌＣｆ§？＿Ｋｉ＾９、Ｊ＃ｄＰ？ｆｃ（ｕｄｒ）ｉＳ．£．ｉＰｑ＾ＪＪＪＰｕｏｐＳｐ？！ＪｕＩＩｏ运ＩＵｔｒｓ）９９ｌＩｉＪｄＸＢ｛§ｏ导ｄＵＶｏ「一，．）ＡｕＩＳｇ２０Ｉ００ｓｏＶｌ－ｏＹＯＳ１０Ｓ＾Ｉ豸ｉ穿５ｓ「＾寸ｓｉｆ＾ｓ＾Ｘｕ胜Ａ＾鵝ｐＡｌ＞ｅａ－Ａ＞Ａ函ｌＸＸＸＡＭｗｉｘＷｓＰｄｌＩＵＡＳ＞＾＞ＭＡ＞＜Ｘ＞＜ＷＭｘ运ｄｅ§ｕ＞Ｖ＞ＳＡ＞Ｂｄ１１＞ＡｑＡｑＩＳ＆ａ由Ｂ＞Ｖｓｄ０ｄｓ２ＭＸｆｃＶ００Ｚ０ＵＷｊｏ懈ｌ？Ａ 广西大举博士举位论文中国推山充■病毒病调査诊断和病康病毒分子生物学的研究、Ｓｃｈ１〇〇ｌｕｍｂｅｒｇｅｒａｖｉｒｕｓＸ／ＡＡＲ１１５３７１〇〇Ｚｙｇｏｃａｃｔｕｓ！ｖｉｒｕｓＸ／ＡＡＲ１１５４ＯｐｕｎｔｉａｖｉｒｕｓＸ／ＡＡＲ１１５４７Ｆｏｘｔａ９９ｉｌｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＡＡＡ４３８２６Ｃｌｏｖｅｒｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＮＰ０７７０７９ｙ１〇〇Ｐｌａｎｔａｇｏａｓｉａｔｉｃａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＢＡＧ１２１３３ｇｇＩＴｕｌｉｐｖｉｒｕｓＸ／ＢＡＣ１６７８５１〇〇ｔｔＰｏａｏｖｉｒｕｓＸＩＢＡＪ１２０４６Ｎｅｒｉｎｅ９５ｖｉｒｕｓＸＩＢＡＥ６６６１５？ＹａｍｖｉｒｕｓＸＩＫＪ７８９１３１ｔＭｉｎｖｉｒｕｓＸ／ＡＡＷ６７７４６６５ＬｉｌｙｖｉｒｕｓＸ／ＣＡＧ２４００７＾＇ＰｈａｉｕｓｖｉｒｕｓＸ／ＢＡＧ０６１５４１〇〇ＷｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＩＢＡＫ７８８６５Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＡＡＢ７１８５３９６ＰｅｐｉｎｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＩＡＦＩ２５３１４１００—ＬｅｔｔｕｃｅｖｉｒｕｓＸＩＣＡＮ８８８０８ＱＱ—Ｍａｌｖａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＡＢＧ４８６６０９９Ａｓｐａｒａｕｓｇｖｉｒｕｓ３１ＢＡＧ１２１５８１〇〇—ＩＩＳｃａｌｌｉｏｎｗｒｉ／ｓＸ／ＣＡＣ８７０８６１〇〇ｉ１０．２３－－图１５ＹＶＸＷＸ１的ＲｄＲｐ蛋白与其它马铃薯Ｘ病毒属病毒的ＲｄＲｐ蛋白的进化树分析使用ＭＥＧＡ６软件对ＹＶＸ温县分离物的ＲｄＲ蛋白的気基酸序列和其它１９种马铃薯Ｘ病毒属病毒ｐ的ＲｄＲｐ蛋白的氨基酸序列构建最大似然树，建树过程设置ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为１０００次重复。Ｆ－－ｒｕｓｅｉｇｕｒｅ３１５ＰｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＲｄＲｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆＹＶＸＷＸｌａｎｄｏｉｌｉｅｒＰｏｔｅｘｖｉｓｐＭ－－ＷＸａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＲｄＲａｍｉｎｏａｃｉｄｓｓｅｅｎｃｅｏｆＹＶＸ１ａｎｄｏｔｈｅｒｐｙｇｐｑｕＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＭＥＧＡ６．Ｂｏｏｔｓｔｒａｐｖａｌｕｅｓａｒｅｆｏｒｏｆ１，０００ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．８７ 广西大举博士学位论文中ＢＨ淮山药病毒病谲查、诊断和病康病毒分子生物学的研究９８Ａｓｐａｒａｇｕｓｖｉｒｕｓ３／ＢＡＧ１２１６２「９１１＿ＳｌｌｉｏｎｖＩＣｃａｉｒｕｓＸＡＣ８７０９０—广ＩＩＩ＿Ｍａｌｖａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＡＢＧ４８６６４＿—ＬｅｔｔｕｃｅｙｎｒｕｓＸＩＣＡＮ８８８１２——Ｐｅｉｍｏｓａｉｃｉｐｎｏｖｒｕｓ／ＡＦＩ２５３１８Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｍｏｓａｉｃｗｍｓ／ＡＡＢ７１８５７５６Ｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＢＡＫ７８８６９ＮｅｒｉｎｅｗｒｕｓＸＩＢＡＥ６６６１９３〇？ＹａｍｖｒｕｓＸ／ＫＪ７８９１３１８？ｉＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸＩＢＡＪ１２０５０ＭｉｎｔｖｉｒｕｓＸＩＡＡＷ６７７５０—ＬｉｌｙｖｉｒｕｓＸＩＣＡＧ２４０１１ＩＰｈａ６５ｉｕｓｖｉｒｕｓＸ／ＢＡＧ０６１５８Ｐｌａｎｔａｇｏａｓｉａｔｉｃａ／ＢＡ９９ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＧ１２１３７１４０Ｉ—ＴｕｌｉｖｉｒｕｓｐＸＩＢＡＣ１６７８９１Ｆｏｘｔａｉｌｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＡＡＡ４３８３０Ｃｌｏｖｅｒｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＨＰ０７７０８３ｙ——ＯｐｕｎｔｉａｖｉｒｕｓＸＩＡＡＲ１１５５１ＳｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒａｖＸ／ＡＡＲ１１＾ｉｒｕｓ５４１１Ｚｙｇｏｃａｃｔｕｓｖ９８ｉｒｕｓＸ／ＡＡＲ１１５４６ｉ１０．２－３－１６图ＹＶＸＷＸ１的ＣＰ蛋白与其它马铃薯Ｘ病毒属病毒的ＣＰ蛋白的进化树分析使用ＭＥＧＡ６软件对ＹＶＸ温县分离物的ＣＰ蛋白的気基酸序列和其它１９种马铃薯Ｘ病毒属病毒的ＣＰ蛋白的氨基酸序列构建最大似然树，建树过程设置ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为１０００次重复。ｕｒｅ－－Ｆｉｇ３１６ＰｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＹＶＸＷＸ１ａｎｄｏｔｈｅｒＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓｅｓｐＭａｘ－－ｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＣＰａｍｉｎｏａｃｉｄｓｓｅｕｅｎｃｅｏｆＹＶＸＷＸ１ａｎｄｏｔｈｅｒｐｙｇｑＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＭＥＧＡ６．Ｂｏｏｔｓｔｒａｐｖａｌｕｅｓａｒｅｆｏｒｏｆ１，０００ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．８８ 广西大掌博士举位论文中圔淮山药病毒病调查、诊断和病凰病毒分子生物举的研究３．３．７ＹＬＶ寿光分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析在山东寿光市稻田镇采集的一株感染ＹＬＶ的大和长芋山药症状表现为严重畸形和－花叶（图３１Ｇ），通过深度测序获得了该病毒的基因组近全长序列，命名为ＹＬＶ寿光－ＳＧ－分离物（ＹＬＶ１）。根据获得的序列信息设计引物，采用ＲＴＰＣＲ和ＲＡＣＥ技术进－。行克隆验证高通量测序结果，克隆策略见图３１７ＹＬＶ的病毒基因组为－－－ｓｓＲＮＡ，如图３１７所示，经ＲＡＣＥ和ＲＴＰＣＲ对ＹＬＶＳＧ１？、２８１２ｂ、２２０８ｂ、进行分段扩增，依次获得的病毒基因组片段１６的大小分别为８３９ｂｐｐｐ２７８７－。ｂｐ、１６４８ｂｐ和１３６１ｂｐ，凝胶电泳分析结果见图３１８－ＳＧ６ＰＣＲＥＡＳＹ－Ｂ回收纯化ＹＬＶ１的个片段的产物，克隆至ｐｌｕｎｔ载体并转化感受态细胞，，随，提取ＰＣＲ鉴定为阳性转化子的质粒内切酶消化大小正确的质粒中机挑－取３个质粒进行测序。对测定的病毒片段序列进行拼接获得ＹＬＶＳＧ１的基因组全序列ｎＢａｎｋ８９３０ＹＬＶ－ＳＧＡ（Ｇｅ：ＫＪ７１），序列分析结果显示，１不包含Ｐｏｌｙ的病毒基因组（）■全长８５３１ｎｔ（／／〇＞ｍｏｓａｉｃＨａｎｋＭＶ）澳大利亚分离物（ＧｅｎＢ：，与酒花花叶病毒／ｐＥＵ一６２５２７９７９）的核苷酸致性为．９％。其编码的蛋白ＲｄＲｐ、ＴＧＢ１、ＴＧＢ２和ＣＰ也与一６ＨｐＭＶ编码的相应蛋白的氨基酸序列致性最高，分别为１．７％、６９％、６３．９％和６２．８％。但是其编码的ＴＧＢ３则与酒花潜隐病毒（丑〇；？／ａｔｏｉｆＷｎ？，ＨｐＭＶ，ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０３２４６９．１）一４８－３的．３％。而ＯＲＦ６ｔｔｉｖｌｅｉｃａｃｉｄｂｉｎｄｉｎ的ＴＧＢ氨基酸序列致性最高，仅为（ｐｕａｅｎｕｃｇｎＢａｎｋ一ｒｏｔｅｉｎ）（Ｇｅ：ＡＭ１５８４３９ＴＧＢ２的ｐ则与ＮＣＬＶ．１）编码的氨基酸序列致性最髙，－－／－为６４％（见表３１５）。ＹＬＶＳＧ１的基因组结构符合Ｃａｒａｖ！＞ｗ属特征（图３１７）。选－ＳＧＣａｒ取ＹＬＶ１和己报道的／ａＷｍｙ的ＲｄＲｐ蛋白和ＣＰ蛋白的氨基酸序列，用ＭＥＧＡ６软件的最大似然法构建系统进化树。ＲｄＲｐ蛋白的进化树分析结果显示，该病毒与ＨｐＭＶ３－１９）ＣＰＣＬＶ和ＰＶＭ在进化上的关系最近（图，而蛋白的进化树则显示该病毒与Ｎ－２０在进化上的关系最近）。ＩＣＴＶ），（图３根据国际病毒分类委员会（第九次报告划分的新病毒种的标准是ＣＰ或ＲｄＲ基因的核苷酸一致性小于７２％或氨基酸ｐ—０％－致性小于８，而ＹＬＶＳＧ１的ＣＰ和ＲｄＲｐ与序列相似性最髙的ＨｐＭＶ的ＣＰ和ＲｄＲｐ一２－氨基酸序列致性分别为６．８％和６１．７％（表３１５），因此分析结果支持其为新种。８９ ■病毒病调查广西大学博士学位论文中国淮山药、诊断和病康病毒分子生物学的研究ＴＧＢ３ｕａ－ｐｔｔｉｖｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄＴＧＢ１ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＣＴＴＩ门—Ｔ＿？１ＡＲｄＲｐ＾ＣＰＴＧＢ２Ｆｒａｇｍｅｎｔ１Ｆｒａｇｍｅｎｔ３Ｆｒａｇｍｅｎｔ５－－－０．９ｋｂ２．．２ｋｂ１６ｋｂ）（（）（）＾，－－ＵＰＭ５ＲＡＣＥＹＬＶ３ＦＹＬＶ－３ＲＹＬＶ５ＦＹＬＶ－５ＲｒｍｅｒｓｐｉＦｒａｇｍｅｎｔ２Ｆｒａｇｍｅｎｔ４Ｆｒａｇｍｅｎｔ６－－２．８ｋｂ２．８ｋｂ１．４ｋｂ卜＞（）（），ＹＬＶ－２ＦＹＬＶ－２ＲＹＬＶ－４ＦＹＬＶ４Ｒ３ＲＡＣＥＮ１ＴｒｉｍｅｒｓＮ１ｐ３－ＬＶ－图１７ＹＳＧ１的基因组结构和全长序列克隆策略Ｆ－ｎｏｍＹＬＶ－ｍｉｕｒｅ３１７ＧｅｉｃｍａｏｆＳＧ１ａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｔｏａｌｉｆｙａｎｄｓｅｕｅｎｃｅｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｇｐｐｑｐｇＭ１２３４５６■ｋｂ—－－图３１８ＹＬＶＳＧ１的基因组序列分段扩增ＤＮＡＬ’ＲＡＣＥＭ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｐｌｕｓａｄｄｅｒ；１：片段１（５产物）；’２：片段２；３：片段３；４：片段４；５：片段５；６：片段６（３ＲＡＣＥ产物）Ｆｕｒ－１ｅｔｒａｎａｓｓＲｒ－ｌｉｅｆｒＶｅｎｏｉｇｅ３８ＧｌｅｌｅｃｏｐｈｏｒｅｓｉｓｌｙｉｏｆＰＣｐｏｄｕｃｔｓａｍｉｆｄｏｍＹＬＳＧ１ｍｅｐｇＪＭＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｌｕｓＤＮＡＬａｄｄｅｒ１：ｆｒａｍｅｎｔｓ１５ＲＡＣＥｒｏｄｕｃｔ：ｐ；ｇ（ｐ）；’－ｍ２３４５：ｆｒａｇｍｅｎｔｓ２３４＆５ｏｆＪＹＭＶＷＸ１６：ｆｒａｅｎｔｓ６３ＲＡＣＥｒｏｄｕｃｔ，，，，，；ｇ（ｐ）９０ 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广Ｗ大举博士掌位论文中ＢＨ淮山箱病毒病调查、诊断和病風病毒分子生物学的研究ＹａｍｌａｔｅｎｔＫ９４ｉ？ｖｉｒｕｓｔＪ７８９１３０１〇〇ＩＨｉｏｐｍｏｓａｃｖｉｒｕｓＩＥＵ５２７９７９．１Ｉ１００ＨｏｐｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓＩＡＢ０３２４６９１．ＮａｒｃｉｓｓｕｓｌｔｖｉｒｃｏｍｍｏｎａｅｎｔｕｓＩＡＭ１５８４３９１ｇｇ．ＩＩＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＭＥＵ６０４６７２／．１ｉ〇〇Ｑ７１—ＩＣｏｗｐｅａｍｉｌｄｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ／ＨＱ１８４４７１．１７０ＩＰｏｔａｔｏｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ／ＥＵ４３３３９７．２Ａｍｅｒｉｃａｎｈｏｐｌｉｒｕ／ａｔｅｎｔｖｓＪＱ２４５６９６．１Ｉ￣ＣｈｒａｎｈｅｍｕｍｖｉｒｕｓＳ／ＡＢ２４５１４２＾ｙｓｔ．１Ｉ—ＩＤａｐｈｎｅｖｉｒｕｓＡＪ６２０３００Ｓ．１９５／ＰｏｆａｔｏＷ／ｘ／ｓＳ／ＦＪ８１３５１２．１！ＩｓｐｏＵｇｕｓｔｒｕｍｎｅｃｒｏｔｉｃｒｉｎｇｔｗｒｕｓ／ＥＵ０７４８５３．１Ｉ＇１００ＨｙｄｒａｎｇｅａｃｈｌｏｏｍｏｅｖｉｒｕｓｒｔｉｃｔｔｌＩＥＵ７５４７２０．２９９ＩＫａｌａｎｃｈｏｅｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ／ＦＪ５３１６３５１．＊｜￣ＬｉｌｍｐｔｏｍｌｅｓｓｖｉｒＩｕｓＡＪ５６４６３８１＾ｙｓｙ．Ｉ１Ｐａｓｓ８ｉＨｏｒａｌａｔｅｎｔｃａｒｌａｖｉｒｕｓ／ＤＱ４５５５８２．１１ｍｓ９３Ｈｅｌｌｅｂｏｒｕｓｎｅｔｎｅｃｍｓｉｓｖｉ／ＦＪ１９６８３５．１１Ｉｗｎ／ｓＰｏｐｌａｒｍｏｓａｉｃ／ＸＢ５１０２２．｜Ｃｏ／ｅｕｓ晰Ｖ１〇〇？ｎｅｃｒｏｓ／ｓｖｒ＞ｕｓ／ＥＦ５２７２６０．１ｉ１〇〇ＧａｒｌｉｃｏｍｍｏｎｌａｅｎＩｃｔｔｖｉｒｕｓＩＪＦ３２０８１０．１Ｒｅｄｃｌｏｖｅｒｖｅ／ｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＦＪ６８５６１８７２．１Ｉ—．Ｇａｒｌｉｃｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ／ＡＪ２９２２２６＾．１１—１００／ａｆｅｎｆｖｆｎｉｓ／ＪＦ３２０８１１．１ｉ１０．２－图３１９ＹＬＶ－ＳＧ１的ＲｄＲｐ蛋白与其它香石竹潜隐病毒属病毒的ＲｄＲｐ蛋白的进化树分析使用ＭＥＧＡ６软件对ＹＶＸ寿光分离物的ＲｄＲ蛋白的氨基酸序列和其它２２种香石竹潜隐病毒属病ｐ毒的ＲｄＲｐ蛋白的氨基酸序列构建最大似然树，建树过程设置ｂｏｏｔｓｔｒａ值为１０００次重复。ｐＦ－ＲＲＹＬＶ－ｔｒｖｉｒｕｓｅｓｉｇｕｒｅ３１９ＰｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆＳＧ１ａｎｄｏｈｅｒＣａｌａｐＭａｘ－－ｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＲｄＲａｍｉｎｏａｃｉｄｓｓｅｕｅｎｃｅｏｆＹＬＶＳＧ１ａｎｄｏｔｈｅｒｐｙｇｐｑＣａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＭＥＧＡ６．Ｂｏｏｔｓｔｒａｖａｌｕｅｓａｒｅｆｏｒｏｆ１，０００ｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐｐ９２ 广西大学博士学位论文中国淮山箱病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的砑究Ｗｎ／ｓ５３／ｆａ／ａｚｉｃ／ｊｏｅ．５３／ａｆｅ／？ｆ／ＦＪ１６３５１—１５８ｌｕｉｙｓｙｍｔｏｍｌｅｓｓｖｉｒｕｓ／ＡＪ５６４６３８．１ｐＩＰａｓｓｉｆｌｏｒａｌａｔｅｎｔｃａｒｔａｖｉｒｕｓＩＤＱ４５５５８２．１ＩＨｒａｎｅａｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅｙｉｒｕｓ／ＥＵ７５４ｙｄｇ７２０．２翌ＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＳＩＦＪ８１３５１２．１２２ＩＬｉｇｕｓｔｒｕｍｎｅｃｒｏｔｉｃｒｉｎｇｓｐｏｔｗｎ／ｓ／ＥＵ０７４８５３．１ｒｔＣｈｙｓａｎｈｅｍｕｍｙ＾ｒｕｓＢ／ＡＢ２４５１４２．１５８！Ｉ６２０３００ＤａｐｈｎｅｙｉｒｕｓＳＩ．〇ＡＪ１１〇Ｉ８０Ｐｏｔａｔｏｌａｔｅｎｔｗｎ／ｓ／ＥＵ４３３３９７．２Ｃｏｗｐｅａ７ｍｉｌｄｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ／ＨＱ１８４４１．１ＩｔｔＨｏｐｌａｅｎｖｉｍｓ．５３／ＡＢ０３２４６９１１６７ＩＨｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｐ／ＥＵ５２７９７９．１＇Ｙａｍ１？／ａｆｅｎｆｗｒｎｓ／ＫＪ７８９３０ｇｇ｜ＮａｒｃｉｓｓｕｓｃｏｍｍｏｎｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓＩＡＭ１５８４３９．１ｇ５｜＊７２６５ＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＭＩＥＵ６０４６．１ＩＡｍｅｒｉｃａｎｈｏｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ／ＪＱｐ２４５６９６．１Ｐｏｐｌａｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／Ｘ６５１０２．２ＩＲｅｄｃｌｏｖｅｒｗ／ｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ／ＦＪ６８５６１８１，Ｉ１００ＧａｒｌｉｃｌａｔｅｎｔｖｒｕｓＩ１００ｒｉＡＪ２９２２２６．１６６Ｌｓ／ｉａ／／ｏｆ／ａｆｅｎｆｖｔＶｕｓ／ＪＦ３２０８１１．１ｌｌｒｕｓｎｅｔＨｅｅｂｏｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓＩＦＪ１９６８３５．１２９｜Ｃｏｅｕｓｖｅｎｎｅｃｒｏｓｓｌ／ｉｙ＾ｒｕｓ／ＥＦ５２７２６０．１＾ＩＩｒｌｃ１〇〇Ｇａｉｃｏｍｍｏｎｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ／ＪＦ３２０８１０．１Ｉ１０２．图３－２０－ＹＬＶＳＧ１的ＣＰ蛋白与其它香石竹潜隐病毒属病毒的ＣＰ蛋白的进化树分析使用ＭＥＧＡ６软件对ＹＶＸ寿光分离物的ＣＰ蛋白的氨基酸序列和其它２２种香石竹潜隐病毒属病毒的ＣＰ蛋白的氨基酸序列构建最大似然树，建树过程设置ｂｏｏｔｓｔｒａ值为ｐ１０００次重复。Ｆ－ｎａｎ－ｉｇｕｒｅ３２０ＰｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｙｓｉｓｏｆＣＰｒｏｔｅｉｓｏｆＹＬＶＳＧ１ａｎｄｏｔｈｅｒＣａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓｐ－ｍｎｅｎ－ＭａｘｉｍｕｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｈｌｏｇｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｔｈｅＣＰａｍｉｎｏａｃｉｄｓｓｅｕｅｎｃｅｏｆＹＬＶＳＧ１ａｎｄｏｔｈｅｒｐｙｑＣａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＭＥＧＡ６．Ｂｏｏｔｓｔｒａｖａｌｕｅｓａｒｅｆｏｒｏｆ１，０００ｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐｐ侵染淮山药的ＤＢＶ的遗传多样性分析３在对采自广西、江西、河南、山东和江苏的淮山药样本的ＤＢＶ阳性样本进行ＰＣＲ产物克隆测序的过程中，发现进行酶切鉴定克隆时大部分阳性克隆的酶切图谱具有多态－２性（图３１），推测其分子遗传多样性较为丰富。９３ 广？病毒病调查西大学博士学位论文中国淮山药诊断和病康病毒分子生物学的研究、Ｍ１２３４５６７８３．０ｋｂ１—．０ｋｂ３－２－图１ｐＵＣＤＢＶ的双酶切鉴定电泳图－ｅｎｅＲｕｒ？ＭｌｋＤＮＡａｄｄｅｒ１：ＤＢＶ：Ｇｌｅｂｌ；８ｐＵＣ的酶切产物－Ｆ－ｗｉｔｈｉｕｒｅ３２１ＥｌｅｃｒｏｈｏｒｅｉｃｒｏｉｌｅｏｌａｓｍｏＤＢＶｄｉｅｓｔｅｄＥＫＩａｎＩｇｔｐｔｐｆｆｐｉｄｆｐＵＣｇｃｏｄＳａｌＭｅｎｅＲｕｅｒ１ｋｅｒ１￣ＵＣ－ＤＮＡｌａ：ＤＢＶｅＥＲＩＩ：Ｇｌｂｄｄ８ｄｉｇｅｓｔｄｗｉｔｈｃｏａｎｄＳａｌ；ｐ１通过克隆和序列测定，最终获得了９个侵染淮山药的ＤＢＶ的分离物的ＲｎａｓｅＨ区￣５２２域序列（ｂｐ）。将这１９个ＤＢＶ分离物与ＮＣＢＩ登录的代表１３个Ｇｒｏｕｐ的１４个１６９一ＤＢＶ［］侵染淮山药的分离物的相应区域序列起构建系统进化树，结果发现有８个来一自中国的的ＤＢＶ分离物与来自巴布亚新几内亚的ＤＢＶ分离物ＰＧ１０２ｃＤａ聚在同个Ｇｒｏｕｐ中。另外１１个来自中国的ＤＢＶ分离物与其它ＤＢＶ分离物的进化关系较远，可单独聚成５个Ｇｒｏｕｐ。其中来自山东的ＤＢＶ分离物（ＳＧ１）和江苏的ＤＢＶ分离物（ＳＱ１和ＦＸ１）与国外发现的侵染淮山药的ＤＢＶ的亲缘关系较近，而与国内其它地方发现的ＤＢＶ的亲缘关系较远。９４ 广西大学博士学位论文中国推山药？病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究￣９５ＰＧｆ〇２ｃｂａ＼＾｜ＮＮ１１９９｜－ＬＺ１７ｌ！ｌｆｒｉｉ—ｉｖｙＭｔＩ＾ＮＣｌＸＩＩＩＧＰ１７８ｎ＿＿—｜ＮＣ２Ｉ＾？—１００ｒＷＸ６－ＷＸＩ＾７９６—－—ＷＸ５ＸＩＶＷＭ２ＸＶ７６—，ＮＮ２１９７ＷＸ３ＸＶｔＩＰ１００—ＮＮ３ＪＬ—ＷＸ１３７）＾ＷＸ２ｘｖ＂＾ｉｒ＊－ＷＸ４Ｊ７７ＳＢＩＯａＤｎＸＩＩ７３－ＳＱ１ｊ）ｉ〇〇１ｆｘｉＸＶＩＩＩ｜＾—ｌ）ＳＧ１ＸＰＧＨＯｃＤｅＩ１００Ｖ５６ＰＧ１１７ｃＤｅＩ￣｜—ＰＧＨＯｂＤｅＶＩＩ４７６４ＰＧ１０２ｄＤａＩ—５２ＰＧ１１７ａＤｅ＾ＩＩ｜ＩＰＧ１０２ａＤａＩＩＩＬ９１Ｂ３９４Ｄｓ２Ｖ｜｜Ｉ１８ＦＪ６０ｂＤｒＶＳＢ１５ｂＤｐＸ１７ＬＦＪ６０ａＤｒＩＸ｜１６３ｙ丨丨丨卜１ＰＨ１１ａＤａ）ｇｇｉ１０．１图３－２２ＤＢＶＤＢＶ分离物的多聚蛋凸棊因的部分序列的进化关系分中ＰＩ分离物与来自其它国家的析使用ＭＥＧＡ６软件对３３个ＤＢＶ分离物的多聚蛋白基因的部分序列构建最大似然树，ｂｏｏｔｓｔｒａｐ俏为１０００次重复。用方框标识的Ｂ３９４Ｄｓ２已经有基因组全序列报道，ＤＢＶ８有近全长的苺冈组斤列报逍，？＜Ｒ令．Ａ丨。ＰＧ１０２ｃＤａ｜１ＤＮＡ。它分离物尚未获得基丨辦砰ＵＫ中为整合进坫記１纟屮的病如丨列Ｆ－ｉｕｒｅ３２２ＰｈｅｎｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｓｔｉａｌｏｌｒｏｔｅｉｎｅｎｅｏｆＤＢＶｒＣｈｉｎａａｎｔｈｅｒｃｏｕｎｔｒｇｇｙｉｏｆａｒｐｙｐｇｆｏｍｄｏｙｐＭ－ａｘｌｉｋｌｉｈｌｔｉｔｂｔｈｔｉｌｌｔｆ３３ＤＢＶｉｓｌｉｍｕｍｅｏｏｄｈｏｅｎｅｃｒｅｅａｓｅｄｏｎｅａｒａｏｒｏｅｉｎｅｎｅｓｅｕｅｎｃｅｏｏａｔｅｓｐｙｇｐｐｙｐｇｑｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＭＥＧＡ６．Ｂｏｏｔｓｔｒａｐｖａｌｕｅｓａｒｅｆｏｒｏｆ１，０００ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．９５ 广西大学博士学位论文中国淮山药病毒病调查诊断和病康病毒分子生物学的研究、３．３．９ＹＹＳＭＶ丰县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析通过对深度测序数据进行分析，发现在江苏丰县王沟镇采集的铁棍山药样本一－（Ｄ－－１２０９０４ＦＸＴＧ２２）中存在条长１５８６ｂｐ的ＤＮＡ病毒序列，其与大翼豆黄斑病毒ＭａＹＳＶ）分离物ＢＲ：０ａｆ３：ｌｌ的基因组（ＧｅｎＢａｎｋ：一．４％）。由于该病毒的基因组结构为单链环状ＫＣ００４１１７）的核苷酸序列致性最高（６１，．１ｋｂ左右的ＤＮＡ片段因此根据此ＤＮＡ序列设计引物扩增获得长为１，经序列测定后再设计反向引物一，通过反向ＰＣＲ技术获得该病毒的另长为２ｋｂ左右的ＤＮＡ片段，－２３经序列测定并通过序列组装拼接获得该病毒的基因组全长序列，克隆策略见图３，ＰＣＲ产物的凝胶电泳图－２４见３。该病毒在植株上的症状表现为黄斑花叶－（图２５Ａ），因此暂命名为淮山药黄斑花叶病毒（Ｆｆｌ／ｗｙｅ／／ｏｗｗｏｓａ／ｃＷｒｗｓ，ＹＹＳＭＶ）。克隆获得的ＹＹＳＭＶ丰县分离物（ＹＹ－ＦＸ５２ｔＳＭＶ１）的基因组全长２７ｎ（核苷酸序列信息见附录４，暂时未递交‘ＧｅｎＢａｎｋ），与百香果严重畸叶病毒ｓｅｖｅｒｅｖｚｍｓ，ＰＳＬＤＶ）ＢＲ一：ＬＮＳ２２７６７分离物：Ｐａｓ：０１（ＦＪ９７）的核苷酸致性最高（５４．２％）。选择双生病毒科７个病毒属的代表种的基因组ＤＮＡ序列与ＹＹＳＭＶ的基因组ＤＮＡＭＥＧＡ６软序列，用件的最大似然法构建系统进化树。结果显示，ＹＹＳＭＶ与菜豆金黄色花叶病毒ｇｏＷｉＧｆｅ？；ｖｅ／／ｏｗｗ＜ｗａ／ｃｖｆｍｓ，ＢＧＹＭＶ）在进化上的关系最近，应为菜豆金色花叶病毒属（５ｅｏｍｏＷｍｓ）成员－。ｇ（图３２５）根据国际病毒分类委员会（ＩＣＴＶ）第九次报告，划一致性小于一分的新病毒种的标准是基因组的核苷酸８９％或氨基酸致性小于９０％，而ＹＹＳＭＶ的基因组的核苷酸序列与序列相似性最高的ＰＳＬＤＶ的基因组的核一ＹＹ苷酸序列致性只有５４．２％，通过ＰＣＲ和克隆测序获得了８个ＳＭＶ中国分离物的ｅ〇一部分ＭＰ基因序列，将它们与５ｇ７ｎｏＷｍｓ的８种病毒起构建系统进化树，分析结果ｏ（－２６表明ＹＹＳＭＶ与５ｅｇ／ｗｏｖ／ｍｓ的８种病毒的进化关系均较远图３），因此分析结果支持其为■ＳｅｇｏｍｏＷｍｓ新种。９６ 广西大李博士学位论文中国浪山苗病毒病调查诊断牙〇病康病毒分子生物李的研究、ＩＲＹＹＳＭＶ－■Ｖ２１ＲＦｒａｍｅｎｔ２ｇ７ｙＶｃ４＾ｔＣ３＼ＹＹＳＭＶ＇２ＲＹＹ＞ＭＶ，ＦＡＢ图３－２３ＹＹＳＭＶ－ＦＸ１的基因组结构和全长序列克隆策略Ａ－ＭＶ－：ＹＹＳＭＶＦＸ１的基因组全长序列克隆策略：ＳＦＸ１；ＢＹＹ的基因组结构Ｆｒｅ－２３ＰｒｏｅｎｏｍｍａｏｆＹＹＶ－ＦＸａｎｄｔｔｒａｅｔａｎｄｅｕｔｈｅｉｇｕ３ｐｏｓｅｄｉｃＳＭ１ｈｅｓｔｇｙｏａｍｌｉｆｓｑｅｎｃｅｇｐｐｙｃｏｍｅｅｖａｌｅｎｏｍｅｓｅｃｅｐｌｔｉｒｇｕｅｎｑＡｕｅｎＭＶ－：ＴｈｅｓｔｒａｔｅｔｏａｍｌｉｆａｎｄｓｅｃｅｔｈｅｃｏｍｐｔｖｌｅｎｏｍｅＹＹＦＸ１ｇｙｙｑｌｅｅｉｒａｓｅｕｅｎｃｅｏｆＳｐｇｑ；ＢＭＶ－：ＰｒｏｏｓｅｄｅｎｏｍｉｃｍａｏｆＹＦＸｐｐＹＳ１ｇＭ１１Ｍ２２■■２〇ｋｂ－ｎ．＾■■图３－２４ＹＹＳＭＶ－ＦＸ１的基因组序列分段扩增Ｍｌ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｌｕｓＤＮＡＬａｄｄｅｒ；Ｍ２：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ；ｐＭＶ－ＹＹ－１：ＹＹＳＦＸ１的片段１，２：ＳＭＶＦＸ１的片段２－ｆｍ－ＦＰＶｉｇｕｒｅ３２４ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏＣＲｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏＹＹＳＭＦＸ１ｅｎｏｍｅｐｇＭｌ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｐｌｕｓＤＮＡＬａｄｄｅｒ；Ｍ２：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ；－－：ｔ１ｆＹ：ｆｒａｅｎｆＹＹＳＭＶＦＸ１ｆｒａｍｅｎｏＹＳＭＶＦＸｌ２ｔ２ｏｌｇ；ｇｍ９７ 广西大学博士学位论文中国推山苗病毒病谲？、诊断和病康病毒分子生物举的研究９８ＢｅｅｔｃｕｒｌｔｏＩｒａｎｖｉｒｕｓ／ＪＱ７０７９５１Ｂｅｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓｙｐ１５２丨ＢｅｅｌｉＡＦ３７９６３７Ｃｔｏｉｒｔｃｕｒｙｔｏｐｖｒｕｓ／ｕｒｖｕｓＩＴｕｒｎｔＴｕｒｎｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ８５ｉｐｃｕｒｌｏｖｉｒｕｓ／ＪＱ７４２０１９ｙｐ－ｔＴｏｍａｏｓｅｕｄｏｃｕｒｔｔｏｖｉｒｕｓ／ＮＣ００３８２５ＴｏｏｃｕｖｉｒｕｓｐｙｐｐＩＢｅａｎｏｆｄｅｎｙｅｍｏｓａｉｃｗｏ／ｓＭ１ｉｒｌｌｏｗ／００７０Ｂｅｇｏｍｏｖｕｓｇ９９Ｉ＊Ｙａｍｅｌｌｏｗｉ９９？ｓｏｔｍｏｓａｃｖｉｒｕｓｙｐｔｔｒｏｖＥｒａｒｏｓｉｓｃｕｒｖｕｌａｓｒｅａｋｖｉｍｓＥｒａｉｒｇ／ＮＣ０１２６６４ｇｕｓＩ＾ｔｒｅａｋｉＭａｉｚｅｓｖｒｕｓＩＸ０１６３３Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓｉ１０．２３－２５－图ＹＹＳＭＶＦＸｌ的与双生病毒科７个病毒属的代表种的进化关系６－ＦＸ使用ＭＥＧＡ软件对ＹＹＳＭＶ１的基因组序列与双生病毒科的７个代表种的基因组序列构建最大似然树，建树过程设置ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为１０００次重复。Ｆ３－ｈ－ｉｕｒｅ２５ＰｅｎｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｂｅｔｗｅｅｎＹＹＳＭＶＦＸｌａｎｄｔｈｅｒｅｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓｅｃｉｅｓｏｆｇｇｙｐｐｐＧｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅＭａｘ－－ｌｎｄｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆＹＹＳＭＶＦＸａｔｈｅ７ｐｙｇｇｑｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＭＥＧＡ６．Ｎｕｍｍｂｅｒａｔｔｈｅｎｏｄｅｓｏｆｔｈｅｂｒａｎｃｈｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｂｏｏｔｓｔｒａｐｖａｌｕｅｓ（１，０００ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）．２７ＹＶＳＭＶｉｓｏｌａｔｅＷＸ２／ＫＪ８５４４３１厂４２ＳＭＶｉｓｏ／ＫＪＪｌａｔｅＦＸ１８５４４３７ＹＹ７ＬＩＹＹＳＭＶｉｓｏｌａｔｅＷＸ１／ＫＪ８５４４３０＾３８ｌＹＹＳＭＶｉｓｏｌａｔｅＷＸ５／ＫＪ８５４４３４ｒＩＹＹＳＭＶｉｓｏｌａｔｅＷＸ３／ＫＪ８５４４３２１〇〇匕ＹＹＳＭＶｔ９５ｉｓｏｌａｅＷＸ４／ＫＪ８５４４３３ｒＹＹＳＭＶｉｓｏｌａｔｅＳＧ１／ＫＪ８５４４３５—了＃ＹＹＳＭＶｉｓｏｌａｔｅＬＺ１／ＫＪ８５４４３６ｓｏＣＹＶＭＶｌａｅｎｄａ／Ｊ５０７７７７７２ｉｔＩｉＡＩＲａＭｏＶｉｓｏｌａｔｅＦ３／ＥＦ１２５１９０ＨＴＣＴＶｉｓｏＲＨｏｍ／ＧＵ４５ｌａｔｅＩ：１：２ｋ：０９６６８６ＰＹＭＶｉｓｏｌａｔｅＧｒｅｎａｄａ：Ｐａｒａｄｉｓｅ：２００７／ＦＲ８５１２９９ＴＧＷｌｉｓｏａｔｅＤＦ／ＪＦ８０３２５９８７—ＰＳＬＤＶｌＢＲ：ＬＮ：：０１／ＦＪｉｓｏａｔｅＳ２Ｐａｓ９７２７６７７５ＭａＶＳＶｉｓｏｌａｔｅＢＲ：Ｏａｆ７：１１／ＫＣ００４１１５｜Ｔｏ６ＴｌＣＶｉｓｏｌａｔｅＰＥ／ＪＦ８０３２５２Ｉ１０．１图３＿２６ＹＹＳＭＶ的部分基因与其它的部分基因的系统进化分析９８ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物举的研究使用ＭＥＧＡ６软件对８个ＹＹＳＭＶ中国分离物的部分ＭＰ基因序列和与其它８种的部分Ｗ基因序列构建最大似然树，建树过程设置ｂｏｏｔｓｔｒａ值为０００ｐ１次重复。Ｆｒｅ－ｒｉｇｕ３２６ＰｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅａｒｔｉａｌＲＥＰｅｎｅｏｆＹＹＳＭＶａｎｄｏｔｈｅｐｇＢｅｏｍｏｖｉｒｕｓｇａｘ－ｄｈｉｍｕｍｌｌｉｔｂｔｈｌｔｈｉｒｕＭｉｋｅｌｉｈｏｏｏｅｎｅｔｃｒｅｅａｓｅｄｏｎｅａｒｔｉａＲＥＰｅｎｅｓｅｕｅｎｃｅａｎｄｏｅｒＢｅｏｍｏｖｓｐｙｇｇｐｇｑｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＭＥＧＡ６．Ｂｏｏｔｓｔｒａｖａｌｕｅｓａｒｅｆｏｒｏｆ１，０００ｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐｐ３．４讨论目前已经有６种淮山药病毒进行了全基因组序列测定及其分子生物学特＇性分析，分４２５９１７。１７１１１１１７２丨７３’［］［］［］［］［］［］－ＹＮＭＶＹＭＭＶ别是ＹＭＶ、ＤａＢＶ、ＪＹＭＶ、ＢＢＷＶ２、Ｃ和。而关１（Ｉ６１７４［］［］于侵染中国种植的淮山药病毒的报道较少，目前仅有ＹＣＮＭＶ和ＹＭＭＶ的部分病毒序列报道。病毒变异快，遗传多样性丰富，同种病毒往往存在多种分离物，它们的基因组序列一定差异－ＰＣＲ方法存在，有些还有重组事件发生。因此，采用常规的ＲＴ很难对不同病一些没有参考序列的新病毒毒分离物进行有效扩增和序列测定。特别是对于，要想获得其基因组全长序列则更加困难。在植物病毒研究中，有研究人员采用双链ＲＮＡ技术克隆正义ＲＮＡ病毒，但是这种方法不适用于负链ＲＮＡ病毒和ＤＮＡ病毒。也有研究通过纯化病毒粒子，提取核酸后建库测序获得新病毒的序列信息，但是不同病毒粒子的纯化方法各异，而且很难排除植物核酸的影响。近几年发展起来的高通量测序技术不但可以全面鉴定样本中的病毒，还可以发现新的病毒一。特别是小ＲＮＡ测序技术几乎可以对样本中的所有病毒网打尽。但是本研究发现采用小ＲＮＡ测序技术虽然可以鉴定淮山药病毒的种类，但是组装获得的病毒序列长度有限－Ｓｅ，很难覆盖完整的病毒基因组。而采用ＲＮＡｑ则可以获得ＲＮＡ病毒的近全长序列－ＰＣＲ技术可以非常容易克，在此基础上设计引物结合ＲＡＣＥ和ＲＴ隆目标病毒的－ＮＣ全基因组并进行测序ＹＭＭＶ１、。本研究通过该策略成功克隆侵染中国种植淮山药的－－－－－ＹＭＶＷＸ－、、Ｊ１、ＣＹＮＭＹＦＸ１ＢＢＷＶ２ＳＧＹＶＸＷＸ１和ＹＬＶＳＧ１的病毒的全长基因－组序列，并对这些病毒分离物的分子生物学特征进行了分析，发现ＹＶＸＷＸ１和ＹＬＶ－ＳＧ１分别具有马铃薯Ｘ病毒属和香石竹潜隐病毒属的基因组结构特征，但是与已一３－４和表３－知病毒的核苷酸和氨基酸序列致性都比较低（表１１５）。国际病毒分类委“”员会第九次报告对这两个病毒属病毒的划分种的标准均是编码ＣＰ或ＲｄＲｐ的核苷９９ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病尿病毒分子生物学的研究１７５一一７２％或氨基酸序列［］８０％酸序列致性小于致性小于，因此这两个病毒分离物应为这两个病毒属的新病毒种。这也是首次发现这两种病毒侵染淮山药。此外，马铃薯Ｘ病毒属和香石竹潜隐病毒属中某些病毒可能有两个亚基因组ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡｓ），在淮山药ｅｒｎ。上发现的这两个新病毒是否也具有ｓｇＲＮＡｓ，还有待通过Ｎｏｒｔｈｂｌｏｔ等方法进行鉴定将侵染中国淮山药的２３个ＹＭＭＶ分离物与世界上已经报道的５８个来自世界各淮山药产区的ＹＭＭＶ分离物进行系统进化分析，发现分成的９个亚组与地理位置相关，因此推测ＹＭＭＶ可能由于地理隔离导致不同群体的单独进化一组病毒分离物也。而同有部分病毒是来自不同种植区，这有可能是由于种质交流导致病毒传播到不同的地方。本研究还发现侵染中国淮山药的ＹＭＭＶ分离物可以分成两个组，分别来自南方和北方的淮山药产区，而且这两个组间的进化关系较远。ＹＭＭＶ的这些遗传多样性分析表明ＹＭＭＶ分离物可能起源于不同的地方并独立经过了长时间的进化，某些ＹＭＭＶ分离物可能在进化过程中突破了某些淮山药种类的宿主抗性。值得注意的是，获得基因组全长序列的９个ＹＭＭＶ分离物的基因组核苷酸序列构建的系统进化树与这９个ＹＭＭＶ分’ＣＰ和３ＵＴＲ区一离物的部分域构建的系统进化树的树形比较接近，这结果表明，采用’ＵＹＭＭＶ分离物的部分ＣＰ和３ＴＲ区域构建的系统进化树基本上能够反应其进化关系。Ｂ’’ｏｕｓａｌｅｍ等使用ＹＭＭＶ分离物的３端序列（ＮＩｂ＋ＣＰ＋３ＵＴＲ）进行重组分析，发９８［现若干个分离物存在组内ｒａ－ｒｏｕ）１而（Ｉｎｔｇｐ重组现象基于ＹＭＭＶ全基因组序列的重组分析发现，重组事件发生在病毒基因组的Ｐ〗、Ｐ３、６Ｋ１和ＣＩ区域，其中ＣＩ区域是重组热点。这表明采用病毒基因组全长序列进行重组分析能够获得更加可靠的病毒重－ＷＸ－组信息。ＹＭＭＶ南昌分离物的ＣＩ区域的重组序列与ＹＭＭＶ１、ＹＭＭＶＷＸ３和－－－ＹＭＭＶＸＺ１等北方分离物的亲缘关系较近（图３５Ｃ），而非重组区域则与ＹＭＭＶＦＸ１、ＹＭＭＶ－ＮＣ－－１和ＹＭＭＶＮＣ３等南方分离物的亲缘关系较近（图３５Ａ、Ｂ和Ｄ）。推测ＹＭＭＶ－ＮＣ２的重组可能是由于南北方的种质资源交流导致病毒发生重组，而重组病毒的出现可能突破不同淮山药品种的宿主抗性，因此需要在种质资源交流过程中加强病毒的检测，以防病毒病的大面积流行。－本研究采用ＲＮＡ－Ｓｅｑ结合ＲＡＣＥ和ＲＴＰＣＲ的方法对侵染中国淮山药的主要病毒进行了病毒基因组全长序列测定和分子特征分析，既简单快速又可以了解病毒的丰度，还可以获得不同淮山药品种的基因表达信息一，为在转录水平进步研究病毒与寄主的互作提供了有用数据。本研究获得的淮山药病毒的分子生物学特征也可以为研究其发生流行、传播方式、遗传变异和建立相应的检测方法等提供重要借鉴。１００ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究第四章五种淮山药病毒抗体的制备及病毒检测方法的建立４．１引言为了保证淮山药生产的正常进行，首先要保证种薯不携带病毒，其次是及时在大田生产中及时发现和鉴定病毒，以便制定有针对性的防治措施，包括控制传播介体来切断病毒病的传播。因此，要求有灵敏度高、特异性好的病毒检测技术来对淮山药的种薯和田间样本进行。检测，既要考虑检测技术的方便性和可靠性，也要考虑其检测成本用于植物病原病毒检测－ｍａｔｏ－的主要技术手段有症状学方法（ｓｍｌｏ）、ＥＬＩＳＡ、Ｄｏｔｂｌｏｔ、ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＩＣＰＣＲ、ｙｐｔｏｇｙ－－－ＩＣＲＴＰＣＲ、ｑＲＴＰＣＲ和ＬＡＭＰ等。快速准确检测淮山药病毒在病害管理和控制中极其重要，但是目前在淮山药病毒检测方一面还存在系列问题。由于环境因素改变引起的症状变异，不同的淮山药品种或变种的症状多样性导致淮山药病毒病的田间诊断不可靠。养分缺乏弓丨起的症状也容易与病毒病症状混淆网。，而且有些无症状的植株也可能存在病毒病因此，要求有灵敏度高、特异性好的病毒检测技术来对淮山药的种薯和田间样本进行检测。而国内对淮山药病毒病的研究较少，尚无相关的病毒抗体用于淮山药病毒的检测。因此亟需制备淮山药病毒抗体，发展可靠的淮山药病毒检测技术。本研究的主要目的是制备淮山药病毒抗体并建立相应的病毒的快速髙效的检测方法。４．２材料与方法４．２．１毒源感染ＹＭＭＶ的桂淮６号植株、感染ＪＹＭＶ的大和长芋山药植株、感染ＹＬＶ的铁棍山药植株、感染ＹＶＸ的紫山药植株－、感染ＣＹＮＭＶ的大和长芋山药植株、感染ＢＢＷＶ２的的大和长芋山－药植株，经ＲＴＰＣＲ检测确认后，挂牌标记，分别种植于广西大学亚热带生物资源保护与利用国家重点实验室的温室内。１０１ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究４２．２常．用试剂及试剂盒ＢＤＮＡ一＾合成试剂盒和２ｘ蛋白质提取试剂盒、ＴＭ底物显色试剂盒、ＳｕｐｅｒＲＴｃ第ＥＳＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ（含染料）购自康为世纪公司。胰蛋白胨、酵母提取物、尿素、ＢＳＡ、ＰＭＳＦ、ＴＥＭＥＤ？？和ＤＴＴ购自Ｓｉｇｍａ公司。ＩＰＴＧ、ｄＮＴＰ、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ、Ｇｅｎｅｒｕｌｅｒｌｋｂ？ＤＮＡｌａｄｄｅｒ＞Ｇｅｎｅｒｕｌｅｒ１ｋｂｌｕｓＤＮＡｌａｄｄｅｒ＾ＰａｅＲｕｌｅｒＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ＾ＰａｅＲｕｌｅｒｐｇｇ？ＵｎｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ和ＰｉｅｒｃｅＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇＳｕｂｓｔｒａｔｅ购自ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司。氨节青霉素（Ａｍｐ）、卡那霉素（Ｋａｎ）、ＲＮａｓｅＡ、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基甲烷（Ｔｒｉｓ）、十二焼基磺麵（ＳＤＳ）、甘氨酸、溶菌酶等购自生工生物工程（上海）有限公司。其它普通化学试剂及生化试剂为进口或国产分析纯。４．２．３引物根据已获得的淮山药病毒的外壳基因（ＣＰ）序列设计引物用于构建淮山药病毒的外－壳蛋白的原核表达载体（表４１）。根据已获得的淮山药病毒的序列信息设计多重ＰＣＲ－。弓丨物（表４２）。引物均为上海生工生物工程有限公司合成－表４１淮山药病毒ＣＰ蛋白编码基因扩增用引物Ｔｂ－ａｌｅ４１ＰｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｃｌｏｎｉｎｇｉｒａｌＣＰｖＪＶｉｒａｌＣＰｅｎｅＰｒｉｍｅｒｎａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅ５＞３Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅｇｑ（）－－ＹＭＭＶＮＩｂＣＰＹＭＭＶ－ＮＩｂＣＰＦＣＣＣＧＡＡＴＴＣａｔｇｔｃｇｃａｃａａａｇｃａｇｔｔａａｇ１１９１ｂｐ－Ｎ－－ＹＭＭＶＩｂＣＰＹＭＭＶＮＩｂＣＰＲＣＣＣＧＴＣＧＡＣｃｔａｇａｔａｔｔｇｃｇｃａｃｔｃｃａａｇ－－－ａａｃｃ７７ＹＶＸＣＰＹＶＸＣＰＦＣＣＣＧＡＡＴＴＣａｔｇｔｔｇａａａｇｔａｔｇｔｃｔａｃ１ｂｐＹＶＸ－－ＣＰ－ａａＣＰＹＶＸＲＴＴＴＧＩＣＧＡＣｔｔｇｇｔｔｃａｇｇｃａａｇｔｔｇａｇ注：下划线表示酶切位点序列，ＧＡＡＴＴＣ为五⑶ＲＩ，ＧＴＣＧＡＣ为紹。Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｄｉｇｅｓｔｉｎｇｓｉｔｅｓ．ＧＡＡＴＴＣｉｓｄｉｅｓｔｅｄｂＥｃｏＲＩ，ａｎｄＧＴＣＧＡＣｇｙｉｓｄｉｅｓｔｅｄｂＳａｌＩ．ｇｙ１０２ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调査诊断和病屎病毒分子生物学的研究、表４－２用于多重ＲＴ－ＰＣＲ检测病毒的引物－ｍｕ－Ｔａｂｌｅ４２ＰｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｌｔｉｐｌｅｘＲＴＰＣＲａｎａｌｓｉｓｏｆａｍｖｉｒｕｓｅｓｙｙ＊５ｒＰ—＞Ｖｉｕｓ／ＧｅｎｅｒｉｍｅｒｎａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅ５３Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅｑ（）Ｔ－ＦａｇａｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇａａｔａＴａ－Ｒｔａｃａｃｔｃａｃｔａｔａｇａｇｇｇｇｇ－Ｆｔａｃａｃｔａｔａａａｔａａｔｃｃａｃｔｔａｃｔｃｃｔｃｃｃ１９６ＹＬＶＹＬＶａｇｇｇｇｇｂｇｇｐ－ＹＬＶＲｇｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｔｃｃｔｔｇｔａｃｃａａｃｃｇｃｃｇｔ－ＦａａｃｃａＹＣＮＭＶＹＣＮＭＶｔａｃａｃｔａｔａａａｔａａａｔｔｔａｃｃ２０９ｂｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｐＹＣＮＭＶ－Ｒｇｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｃｇｔｃｇ－ＦａａａａｃａａｃａＹＭＶＹＭＶｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇｔａｔｔｃｇｃａｇｃａｃｃｔｃｔ２２４ｂｐＹＭＶ－Ｒｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇａｃｃａｔｃｃｔｃａａｃａｔａｃａｃｇｇｇｇｇ－ＣＹＮＭＶＣＹＮＭＶＦａｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇａａｔａｇｔａｔｔｃａｃａｇｃａｇｃａｃｃａａｔｃ２３２ｂｐＣＹＮＭＶ－Ｒａｇｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｃｔｔｃｃｔｃｔｃｃａｃｔｔｃｃｇｇ－ＦＹＶＸＹＶＸａｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇａａｔａｃｔｃｃｔｇａｔｇｃｃｔｃｔｔａｃｔｃｃｔｃ２６５ｂｐＹＶＸ－ａｃＲｇｔｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｔｇａａｇｔｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇａｔＪＹＭＶＪＹＭＶ－Ｆａｔａｃａｃｔａｔａｇａａｔａｃｃｔａｔａｃｔｔｃａａａａｃ２８６ｇｇｇｇｇｇｇｇｇｂｐＪＹＭＶ－Ｒｇｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｔｃａｃｇｃｃｇａｇａａｇｇｃｔｇｔ－ＦａＹＭＭＶＹＭＭＶｔａｃａｃｔａｔａａａｔａｃａｃａｃａｔｃａａａｔａａｒ３０５ｂｇｇｇｇｇｇｇｇｇｐＹＭＭＶ－Ｒｇｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａａｃｃｔｃａｇｔａｇａｇｃｇａａｃａｔａｇ－ＣＭＶＣＭＶＦａｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇａａｔａｃｃｔｇｃｃｔｃｃｔｃｇｇａｃｔｔａｔｃ３２３ｂｐＣＭＶ－ＲｇｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａａａｃａｃａａｔｃａａｃｔｇｇｇｇｇｇｇＢＢＷＶ－２ＢＢＷＶ－２－Ｆａｔｇａｃａｃｔａｔａｇａａｔａｇｔｔｔｃｇａｇｔｇｃｔｔｔｇｇａａｇｇ３６１ｂｇｇｐ－－ＢＢＷＶ２Ｒｇｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｔｇｇａｔｃｃｒｔｃａａｇｒｃｇｃａｔｔ－ＦａｔａｃａｃＹＹＳＭＶＹＹＳＭＶｔａｔａａａｔａｃａｔｃａｔｔｃａａｃｔｔ４８３ｂｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｐ－ＹＹＳＭＶＲｇｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｃｇａｔｇｇｔａｇｔｔｃｔｔｃａａｇａｇｇａｇｇｔａｒｂｃｒｂｃＬ－ＦａＬｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇａａｔａｃａｔｔｃｃｇａｇｔａａｃｔｃｃｔｃａａｃ１４９ｂｐｒｂｃ－ＬＲｇｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇｇｔａａｇｔｃｃａｔｃａｇｔｃｃａｃａｃ１０３ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查诊断和病屎病毒分子生物学的研究、４．２．４病毒ＣＰ蛋白基因的扩增与测序一提取ＲＮＡ方法同第二章描述方法（具体描述见２．２ＤＮＡ第．６）。ｃ链合成方法同第二章描述方法（具体描述见２．２．７）。取１ｐＬ稀释２０倍的反转录产物作为模板，加入１０ｎＭ的相应的淮山药病毒ＣＰ蛋白基？因克隆引物各２吣，５ｘＰＣＲｂｕｆｅｒｌ〇Ｌ，１０ｍＭｄＮＴＰ０．５Ｌ，ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ高保真ｎｐＬ？ＤＮＡ聚合酶０．２５（ｌｄＨＯ３６．２５ｌＬＰＣＲ扩。：９８Ｃ预变３ｍｉｎｎ，２，进行增反应条件为性；＾°°°９８Ｃ变性１０ｓｅｃ，５５Ｘ：退火１５ｓｅｃ，７２Ｃ延伸１ｍｉｎ，３４个循环；７２Ｃ反应５ｍｉｎ。ＰＣＲ／ｍｚ产物于浓度为１％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，切胶回收纯化目的ＤＮＡ片段后，与用ＳＩ切开ｐＵＣ１９平端载体进行连接反应，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞，挑取转化子用质粒ＤＮＡ提取试剂盒提取质粒ＤＮＡ，用五ｃｏＲＩＡＳＷＩＩ双酶切消化鉴定重组质粒，选择鉴定正确的重组质粒于生工生物工程（上海）有限公司测序，核苷酸序列和其编码的氨基酸？序列采用ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＡｄｖａｎｃｅ１０软件进行比对分析。４．２．５原核表达载体的构建将纯化的重组质粒经相应的限制性内切酶消化后，回收目的基因片段连接至原核表达载体ｐＥＴ３０ａ。取５ｈＬ连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞，挑取转化子，提取质粒ＤＮＡ，用相应的限制性内切酶消化鉴定筛选阳性重组质粒，获得鉴定正确的原核表达重组质粒。再将该原核表达重组质粒和对照载体ｐＥＴ３０ａ分别转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ感受态细胞，经卡那霉素抗性筛选，分别获得携带目标片段的原核表达重组质粒和空载体ｐＥＴ３０ａ的表达菌株。４．２．６蛋白的诱导表达及表达条件优化挑取新鲜培养的携带目标病毒外壳蛋白基因的重组质粒的ＢＬ２１ＤＥ３ＬｓＳ菌株，（）ｐｙＬ°含卡那霉素（５〇／Ｌ）的ＬＢ２００ｒｍ３７Ｃ振荡培养过夜接种于ｌｍｎｇ培养基中，于ｐ，同时以含空质粒ｐＥＴ３０ａ的ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ菌株作对照。按１：１００的比例扩大培养过夜培养°＝ｍＣ继－ｍＬ培物。于２００ｒｐ３７续振荡培养３ｈ左右至ＯＤ６〇ｑ０．４０．６。各取６份５养液，分别加入ＩＰＴＧ至诱导终浓度分别为ＯｍＭ、Ｏ．ｌｍＭ、０．４ｍＭ、０．８ｍＭ、１．２ｍＭ、２．０ｍＭ，°转至于２００ｒｐｍ２８Ｃ振荡培养。至６ｈ后将诱导培养液冰浴１０ｍｉｎ使菌体停止生长，于００００心４一１ｌｍｉｎ收集菌体，用ＰＢＳ（１１７．）漂洗菌体沉淀次后，加入２００叫？８３，ｇ离口（ｐＨ７．４）悬浮菌体沉淀，取３０Ｌ悬浮液加入１０Ｌ４ｘ蛋白上样缓冲液，沸水浴１〇ｍｉｎ，ｎｎ１０４ ■中圔滇〇广ａ大学博士举位论文１药病毒？调查徐断和病原病毒分子生物举的研究、■００－－于１２，（＾离心２１１１丨１１，取１０＃上清进行８０３？八０￡电泳分析。根据３０３？人０￡分析结果选择最适ＩＰＴＧ诱导浓度。４．２．７表达产物的可溶性分析００００心２ｍｉｎ收集菌体ＢＳ漂洗菌体取５ｍＬＩＰＴＧ诱导培养６ｈ的菌液，于１，用Ｐ，ｇ离一？沉淀次，再用２０〇ｎＬＰＢＳ悬浮菌体，使用ＳＯＮＩＣＳＵｉｂｒａＣｅｌｌ超声波对菌体细胞进行超声破碎，Ａｍｐ（与功率对应）参数设置为３８％，超声处理１０ｓｅｃ，间隔１０ｓｅｃ，直至°菌液变澄清。于１２，０００ｇ，４Ｃ离心３０ｍｉｎ，将上清液转移至新的离心管。向菌体沉淀加入２００叫的ＰＢＳ（８Ｍｕｒｅａ，ｐＨ７．４），待菌体沉淀完全澄清后，于１２，０００ｇ离心１０ｍｉｎ。－分别取１０Ｌ上清和沉淀进行ＳＤＳＰＡＧＥ检测。Ｈ４．２．８重组蛋白的纯化ＥＴ－ＴＭ－ｐ３０ａ载体含有Ｈｉｓｔａｇ，可以根据ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ手册采用ＮｉＮＴＡ柱亲合层析方法纯化３０ａ载体携带的待表达纯化蛋白：将００ｍＬ诱导培养菌液转至４００ｍＬｐＥＴ１°ｍｍ－Ｂｅｃｋｍａｎ离心管中，于１００００ｒｐ离心５ｉｎ收集菌体，置于２０Ｃ冷冻菌体３０ｍｉｎ。将冰冻菌体于冰上融化３０ｍｉｎ，此时菌体在自身表达的溶菌酶的作用下开始发生裂解。加入（．ＬｓｉｓＢｕｆｆｅｒ１００ｍＭＮａＨ２Ｐ〇４，ｌＯｍＭＴｒｉｓＣｌ，８ＭＵｒｅａ，Ｈ８．０）重悬菌体，加入ｙｐ蛋白酶抑制剂ＰＭＳＦ至终浓度为１ｍＭ，使用超声破碎细胞，超声处理直至菌液完全澄清。Ｔｒｉ－向裂解液加入ｔｏｎＸ１００至终浓度为１％，于室温混合３０ｍｉｎ以提高融合蛋白的可溶性。°４Ｃ的Ｎ－将存放于ｉＮＴＡ填料混匀，装柱。加入５倍柱体积的去离子水过柱漂洗乙醇，加－ｕｆｅｒ过－ＮＴＡ树脂入５倍体积的ＬｙｓｉｓＢ柱，平衡Ｎｉ。将加入ＴｒｉｔｏｎＸ１００的蛋白溶液于１２０００１１１１＾１１＞＾－１１１１１１卬离心２〇１，取上清液加到平衡好的］＾丁八树脂上，控制流速为１１１／＾＾右，加＿入ＷａｓｈＢｕｆｅｒ（１００ｍＭＮａＨ２Ｐ０４，１０ｍＭＴｒｉｓＣｌ，８ＭＵ＾ｅａ，ｐＨ６．３）漂洗杂蛋白，加Ｐ０＿入ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｅｒ（１００ｍＭＮａＨ１０ｍｓＣｌ８Ｍｒｅａ４２４，ＭＴｒｉ，Ｕ，ｐＨ？５）进行洗脱，洗一脱按每管１ｍＬ收集，每收集管即测Ａ２８Ｑ直至测不到蛋白。洗脱产物每份各取１０化进Ｓ－ＰＡＧＥ电泳行ＳＤ，检测洗脱产物大小及质量。４．２．９多克隆抗体的制备取纯化后的重组蛋白１ｍＬ（约１ｍｇ）采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔（免一疫前采集正常血清作为阴性对照），以后每２周加强免疫次，共免疫４次。首次免疫１０５ 广西大学彳謇士学位论文中国淮山苗病毒病调音、诊断和病雁病毒分子生物学的研究ｕｎｄ’ｍ加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂（Ｆｒｅｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｕｖａｎｔ，Ｓｉａ，ＵＳＡ），后３次ｊｇ’ＵＳＡ（Ｆｒｅｕｎｄｓｉｎｃｏｍｌｅｔｅａｄｕｖａｎｔ，Ｓｉｍａ）。加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂ｐｊｇ，末次加强免疫７ｄ后，进行心脏采血，并分离血清。抗血清经抗原亲和纯化获得相应病毒外壳蛋白的多克隆抗体。４．２．１０单克隆抗体的制备单克隆抗体采用表面抗原表位抗体库（ＳｕｒｆａｃｅＥｐｉｔｏｐｅＡｎｔｉｂｏｄｙＬｉｂｒａｒｙ，ＳＥＡＬ）技术制备，在艾比玛特生物医药（上海）有限公司完成。４．２．１０１．抗原设计及蛋白表达用Ａｂｍａｒｔ公司开发的抗原设计软件对ＪＹＭＶ的外壳蛋白序列（见附录５ＹＭＶ－）：ＪＣＰ－－进行抗原表位（ＳｕｒｆａｃｅＥｐｉｔｏｐｅ，ＳＥ）扫描，获得６个ＳＥ（图４１）。目标蛋白（ＪＹＭＶＣＰ）（Ｅｔｏ）Ｅｔ中各区域的表位指标ｐｉｐｅｖａｌｕｅ以及被选中的表位（ｐｉｏｐｅｓｅｌｅｃｔｅｄ）用蓝色粗横线标识，Ｙ轴。Ｘ轴是目标蛋白中各１０肽的起始位置是表位指标得分。得分越高，该１０肽成为成功表位的可能性越高。灰色曲线是每个１０肽的得分曲线，蓝色表示被选中的１０肽片段，Ｘ轴上短柱表示目标蛋白中亲水性的分布（绿色代表亲水，红色代表疏水），该区域在Ｘ轴下方将用粗横线标识（图。如果目标蛋白中存在信号肽和跨膜区４－１）。Ｓｅｕｅｎｃｅａｎａ－ｑｌｙｓｉｓｏｆＪＹＭＶＣＰ３５３．０３０７．７２６２．４Ｉ——＾八＇！！８１２３１２ＭＵ／－■ＨＡｎｄｒｏｏｂｉｃｙｐｈＷｈｉＩ３５．９／ＵＭ／￥一－５４：．７－１００．０５２８５１７４９７１２０４３１６６１８９２１２２３５１－图４１蛋白表位指标分析图Ｆｕｒｅ－ｒｅｅｎａｉｇ４１Ｓｕｆａｃｐｉｔｏｐｅａｌｙｓｉｓ１０６ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究－￣４－３ＭＶＯ－－－－列的６个ＳＥＯＹ、ＪＹＭＶ１、ＪＹＭＶ２、ＪＹＭＶ３、ＪＹＭＶ４和ＪＹＭＶ５）将表中所进行进行基因合成，然后连接到串联表达载体上，通过表达和纯化获得抗原蛋白用于免疫小鼠制备单克隆抗体。表４－３选择的用于抗体制备的目标蛋白区域Ｔ－ａｂｅｌ４３Ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｒｅｉｏｎｆｒｏｍｔａｒｅｔｒｏｔｅｉｎｉｎｆｌｉｉｓｒｏｅｃｔｇｇｐｐｊ编号名称起始位置终止位置多肽序列０ＪＹＭＶ－０２０６２１５ＤＧＮＶＳＴＭＥＥＮ－２１ＪＹＭＶ１１３２２２ＥＥＮＴＥＲＨＴＡＥ２ＪＹＭＶ－２２ＫＤＶＤＶＧ１１ＳＶＧＴ３ＪＹＭＶ－３４１５０ＬＬＹＮＰＥＱＶＤＬ４ＪＹＭＶ－４３０３９ＲＧＫＰＡＬＮＬＤＨ５ＪＹＭＶ－５１５２４ＰＲＬＫＧＬＡＴＫＭ４．２．１０．２动物免疫￣将上述串联抗原免疫８１２周的雌性ＢＡＬＢ／ｃ健康小鼠３只。４．２．１０．３单抗细胞株筛选将免疫反应好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于９６孔培养板中培养，待克隆生长到全孔的１／６时，标记单克隆并进行ＥＬＩＳＡ检测。将ＯＤ值最高的单克隆再有限稀释接入９６孔板中，按上述方法再次亚克１００％。隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，６？ｘ按细胞数１２１〇／管进行冻存。４．２．１０．４腹水制备？。１０１４收集阳性单克隆细胞，用于小鼠腹腔接种天收集腹水，用ＥＬＩＳＡ检测腹水是否含抗原特异性抗体。４．２．１０．５抗体纯化ｒｏｅｉｎ对验证为特异性抗体阳性的单克隆细胞株，采用ＰｔＧ柱纯化腹水。１０７ 广西大学博士学位论文中国灌山药病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的研究４．２．１１抗体效价及特异性检测用ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ方法对原核表达纯化的病毒外壳蛋白与对应的多克隆抗体或单个抗原表位多肽（抗原包被浓度为４／ｍＬ）与对应的单克隆抗体进行成对检测。将多克隆ｐｇ抗体和单克隆抗体分别与不同病毒外壳蛋白进行交叉反应，单克隆抗体还需与不同抗原表位多肽进行交叉反应。抗原包被浓度为４ｐｇ／ｍＬ，以起始稀释浓度为１：１０００（约为１Ｈｇ／ｍＬ）的纯化抗体进行２倍的倍比稀释（１：１０００，１：２０００，１：４０００，１：８０００，１：１６０００，一１：３２０００，１：６４０００，１：１２８０００，１：２５６０００，１：５１２０００）作为抗，采用辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的二抗进行ＥＬＩＳＡ检测。一ＥＬＩＳＡ效价判断标准：将抗体进行定的梯度稀释：，，大于ＮＣ（ＮＣ免疫抗原包板检测抗体为牛奶＋细胞培养基）两倍且大于０．２５的ＯＤ４５〇值对应的稀释度值即为该抗体的效价。一ＷＢ效价判断标准：将抗体进行定的梯度稀释，可见清晰目的条带的最大抗体稀释度值为该抗体的效价。４－．２．１２间接抗原包被免疫吸附测定（ＡＣＰＥＬＩＳＡ）方法检测病毒－ＡＣＰＥＬＩＳＡ在酶标板中进行，所有样本、阳性对照和阴性对照均设置三个重复。在孵育ｘ－过程中藤酶标板，以防ｉｈ７ｊＣ分蒸发。所有步骤之间，用繼配制的１ＰＢＳＴ（０．１３７ＭＮａＣｌ，１．７６ｍＭＫＨ２Ｐ０４，０．０２ＭＮａ２ＨＰ０４，２．６８ｍＭＫＣｌ，ｐＨ７．４，０．０５％（ＶＡ〇Ｔｗｅｅｎ２０）次，每次３ｍｉｎ，以洗掉过量的病毒、抗体、酶标抗体或底物。ＡＣＰ－ＥＬＩＭ（）ＩＳＡ方法的操作步骤：加入１ｍＬ包含２％（Ｗ／Ｖ）ＰＶ０的碳酸盐缓冲液Ｈ９．６ｐ５ｍｎ２０倍１１Ｉ．１０００ｉｍ离心ｉ，取上清液稀释，００＾７孔加ＡＥＬＳＡ研磨０成右＿叶片，开ｐ按照ＹＭＭＶ°ＹＭＭＶ阳性淮山药叶片为阳性对照，３７Ｃ孵育２板，以，阴性淮山药叶片为阴性对照°－ｈ，Ｃ过夜将抗原按适当浓度溶解于包被液中ＰＢＳＴ洗漆两次后入５％或４加入２０００，加；；脱脂奶封闭３０ｍ－ｉｎ入２００叫ＰＢＳＴ洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照；加°Ｃ－１：８０００ＹＭＭＶ多克，ｌＯＯＩＶ，３７３ｈ加Ａ２００ｉＬＰＢＳＴ稀释的隆抗体ｐ孔孵育ｌｈ或室温孵育；［洗涤两次后，每个孔中加入按说明书稀释３０００倍的辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗鼠ＩｇＧＡ２０〇ＡＰＢＳ－结合物（Ａｂｍａｒｔ公司），ｌＯＯＩＶ孔，室温孵育ｌｈｒ漂Ｉ次后，使用ＴＭＢｎ；加显色试剂盒（康为世纪）进行显色，立即用酶标仪读取〇Ｄ４５Ｑ的值，以与阴性对照ＯＤ值比值（Ｐ／Ｎ）大于２．１为阳性。１０８ 广西大学博士学位论文中国浪山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究４．２．１３蛋白质免疫印记（Ｗｅｓｔｅｒｎｂ丨ｏｔ）方法检测病毒使用ＴＣＡ／丙酮沉淀法或采用蛋白质提取试剂盒（康为世纪）按照说明书提供的方法提取淮山药总蛋白样本，用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法进行蛋白质定量，调整蛋白质浓度为２ｍｇ／ｍＬ左右。制备蛋－白电泳凝胶，取１０吣蛋白（约２０咫）进行ＳＤＳＰＡＧＥ。蛋白产物由凝胶采用半干式转移至ＰｏＤＦＤＳ－ＰＡＧＥ聚偏氟乙烯膜（ｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅＤｉｆｌｕｏｒｉｄｅｍｅｍｂｒａｎｅ，ＰＶ）：Ｓ结束后将蛋白胶裁至额大小，经转膜缓冲液平衡３次，每次５ｍｉｎ；将预先餅的与赚同样大小的滤纸和ＰＶＤＦ膜用甲醇浸泡１ｍｉｎ，浸入转膜缓冲液中平衡５ｍｉｎ；转膜装置从下至上依次按阳极碳板、３层３ｍｍ滤纸、ＰＶＤＦ膜、凝胶、３层３ｍｍ滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、碰、ＰＶＤＦ膜需要２一对齐，并且在每步的操作过程中注意排除气泡，盖好阴极碳板之后，接通电源，恒流１ｍＡ／ｃｍ１．５ｈ。。转移待转移结束后，先断开电源，再将膜小心取出免疫反应：用０．０１ＭＰＢＳ（３．２ｍＭＮａ２ＨＰ０４，０．５ｍＭＫＨ２Ｐ０４，１．３ｍＭＫＣ１，１３５ｍＭＮ°ａＣｌ，ｐＨ７．４）洗膜ｌｍｉｎ；加入封闭液（５％脱脂奶或３％ＢＳＡ），室温（２５Ｃ）封闭１．５ｈ；一－弃封闭液，用〇＿〇１Ｍ的ＰＢＳＴ洗膜３次，每次５ｍｉｎ；然后加入抗（根据抗体的效价按合适一一稀释比例用０．０１ＭＰＢＳ进行稀释，本研究所有抗均按照１：５０００进行稀释，抗稀释液须完°一全覆邏）２ｈＣ过夜１％的ＢＳＡ取代，室麵育或４；以抗作为阴性对照，其余步骤与实一°－验组相同。僻育完毕后弃抗或１／，丁分别洗膜４１１１１１１＜＾８人用０．０１＼１的？８３次，每次５；然后加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（根据说明书用０．０１ＭＰＢＳ稀释１０００倍），平稳摇动，室＇２二＾１？８８－１１．０１１５１１１１１１￡（：说进行。灘育；弃抗，用０分别？４次，每次；最后采用检测４．．２１４免疫捕获反转录聚合酶链式反应ｃａｒｅ－ｅｒｓｅｒａｍｅ免疫捕获反转录聚合反应（ＩｍｍｕｎｏｐｔｕＲｖｅＴｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＣ－－。：，ＩＲＴＰＣＲ）可用于检测ＲＮＡ病毒操作步骤如下（麵０．０５Ｍ碳酸盐缓冲液ｐＨ９．６）按照１：８０００稀释病毒蛋白的多克隆抗体，每个１．５ｍＬ°的离心管中加入１００Ｈｉ屌释好的抗体，３７Ｃ孵育２ｈ；将淮山药新鲜叶片与研磨缓冲液（０．０２ＭＰＢＳ，２％ＰＶＰ）以０．２％（Ｗ／Ｖ）的比例放入禱中，研磨成叶汁匀浆，将匀浆液转移至１．５ｍＬ＾９０００ｍ－ｉ１０ｍｉｎ１．５ｍＬＰＢＳ三次离心管中，于ｐ离心；将包被好抗体的离心管用ｍ，每次间隔°３ｍｉｎ，然后加入２００吣匀楽液，于３７Ｃ孵育２ｈ，此时暴露的病毒颗粒特异性地附着于离心管３－３内壁上（免疫捕获）；移去匀浆液，？８谦３次，每次间隔１１１］１１，最后用〇丑？０７欠洗１次，洗一毕作短暂离心去除管底余液；用ＳｕｐｅｒＲＴｃＤＮＡ第链合成试剂盒按照说明书进行ＲＴ反应；１０９ 广西大学博士学位论文中国谁山药病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究－＞＜ＭＭｉｘ进行ＰＣＲ反应１），２ＥＳＴａａｓｔｅｒ，相应病毒检测引物见第二章（表２ＰＣＲ结束后用ｑ；取２ｐＬＰＣＲ产物用１．０％（Ｗ／Ｖ）琼脂糖凝胶进行电泳检测。４．３结果４．３．１病毒蛋白基因的克隆以感染ＹＭＭＶ和ＹＶＸ的采自广西南宁的桂淮６号叶片的总ＲＮＡ为模板，分别进行－ＰＣＲＲＴＰＣＲ扩增ＹＭＭＶ的基因和ＹＶＸ的ＣＰ基因，得到符合预期大小特异性的产４－２ＰＣＲ（１１９１ｂ７７１ｂ）的片段）。ＵＣ１９连接，转化感受态细胞，物ｐ和ｐ（图回收产物与ｐ－Ｎ－ＣＰ通过蓝ｄ筛选和酶切鉴定获得携带ＹＭＭＶＩｂＣＰ和ＹＶＸ的重组质粒，分别选择三个，重组质粒进行测序分析，序列比对结果显示构建的三个重组质粒携带的外源序列与相一致应病毒蛋白基因的参考序列。ＭＡ１ＭＢ１—１—．５ｋｂ１．５ｋｂ—１０ｋｂ１．０．图４－２ＹＭＭＶ和ＹＶＸ的外壳蛋白基因的ＰＣＲ扩增电泳图ｌＤＮＡｅ－ＮＩＰＣＲＢ－Ｍｌ：ＹＶＸＰＣＲ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｋｂｌａｄｄｒＡｌ：ＹＭＭＶｂＣＰ产物；ＣＰ的产物；的－ＹＶＸＦｌｉｉＣＰＹＭＭＶａｎｉｇｕｒｅ４２ＰＣＲａｍｐｃａｔｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｏｆｄ－ｅＲｕｅｒ－Ｐ１ＰｔＹＹＸｌｋｂＤＮＡａｄｄｅｒＡｌ：ＰＣＲｒｏｃｉｏｎｏｆＹＭＭＶＮＩｂＣＢ：ＣＲｒｏｄｕｃｉｏｎｏｆＣＰＭ：Ｇｅｎｌｌｄｕｔ；；ｐｐ－－－ＥＲ－ＮＩｂＣＰ１９ＹＶＸ用ｃｏＩ和Ｉ进行对重组质粒ｐＵＣ１９ＹＭＭＶ和ｐＵＣＣＰ分别进ＥＴ３０ＩＩａ，然后分别连接至已用和＆酶切消化处理的行双酶切获得目的片段／ｐＰＣＲ（４－３）表达载体中及酶切鉴定携带重组质粒的阳性转化子图，再次测序验证。经－Ｔ－ＹＭＭＶＮＩｂＣＰ和了该基因以正确的读码框框架连接到表达载体上，从而得到ｐＥ３０ａＥＴ３０ａ－ＹＶＸ－ＣＰ原核表达重组质粒ｐ。１１０ 广西大学博士学位论文中国谁山贫病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究ＭＡ１Ａ２Ａ３ＭＢ１Ｂ２Ｂ３６０—ｋｂ６．０．＾ｋｂ—ｋｂ６３ＢＨＵ４－ＥＴ３０ａ－ＹＭＭＶ－Ｎ－－Ｐ图３ｐＩｂＣＰ和ｐＥＴ３０ａＹＶＸＣ的双酶切鉴定电泳图－－－ｗＭｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂＤＮＡｌａｒＡ１Ａ：ＥＴ３０ａＹＭＭＶＮＩＣＰｉｅｓｅｄｉＥｃｏＲＩａｎＩ：Ｇｄｄｅ；３ｐｂｄｇｔｔｈｄＳａｌ；Ｂ１？－－Ｂ３ＥＴ３０ａＹＶＸｉｅｓｅｄｗｉｔｈＥｃｏＲＩａｎａＩ：ｐＣＰｄｇｔｄＳｌ－－－－ＹＶＸ－ＦｉｆｌｌｉｄＥＴ０ａＹＭＭＶＮｒＣＰＥＴ３０ＣＰｄｉｇｕｒｅ４３Ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｃｒｏｉｅｏｆａｓｍｓ３ｂａｎｄａｉｅｓｔｅｄｐｐｐｐｇｗＥｃｏＲＩａｎＩｉｔｈｄＳａｌ－－－ｗＭＲｌｌｋＤＮＡｌＡ１ＡＥＴ３０ａＹＭＭＹＮＩｉｅｓｅｄｉｔｈＥＲＩａｎＩ：Ｇｅｎｅｕｅｒｂａｄｄｅｒ３：ｂＣＰｄｇｔｃｏｄＳａｌ；；ｐＢ１－Ｂ３－－：ｐＥＴ３０ａＹＶＸＣＰｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＥｃｏＲＩａｎｄＳａｌＩ４．３．２重组蛋白的原核表达及纯化ｓＴａ，由于重组蛋白Ｎ端带有Ｈｉｇ标签所以重组蛋Ｇ分子量较相应病毒蛋白分子量增５－－．７ｋＤａＹＭＭＶＮＩｂＣＰＹＶＸ５０．２５ｋＤａ３２．７２力口，和ＣＰ的分子量分别为和ｋＤａ。重组蛋〇－－－－序列见附录１丨。将构建好的ｐＥＴ３０ａＹＭＭＶＮＩｂＣＰ和ｐＥＴ３０ａＹＶＸＣＰ原核表达重组质粒°？ｆｏｃ／）ＢＬ２１（ＬｓＳ），８Ｃ分别转化大肠杆菌（ｉｅｎｃ／ｉ／ａｃｏ／ｉｐｙ加入终浓度ＩｍＭＩＰＴＧ在２４ＤＳ－ＰＡＧＥ诱导培养ｈ后，超声波破碎菌体，分别取上清和沉淀进行Ｓ分析。结果表明，－－－ＮＩｂＣＰ主要以包涵体的形式存在（图４４Ａ１重组蛋ｄＹＭＭＶ），而ＹＶＸＣＰ主要以可溶－４Ｂ－－１）。因此重组蛋白ＹＭＭＶＮＩｂＣＰ用ＮＮＴＡ柱（ＩＡｅｎ性蛋白形式存在（图４ｉＱｇ公司）－－在变性条件下进行亲和层析纯化，而ＹＶＸＣＰ则采用非变性方式经ＮｉＮＴＡ柱进行纯化。４－５纯化的重组蛋白电泳结果见图。１１１ 广西大学博士学位论文中囯淮山药病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究Ｍ１Ａ１Ａ２Ｍ２Ｂ１Ｂ２６６ｋＤ３——４５—ｋｋＤａ４０Ｄａ—３０ｋＤａｋＡＷ＾图４－４原核表达的ＹＭＭＶ－ＮＩｂＣＰ和ＹＶＸ－ＣＰ重组蛋白的可溶性分析ｅｄＰｒｏｉＷｅｈＭ２ＲｕｅｒｉＬａｒＭｌ：ＵｎｓｔａｉｎｔｅｎＭｏｌｅｃｕｌａｒｉｇｔａｒｋｅｒ；Ｍ：ＰａｇｅｌＵｎｓｔａｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎｄｄｅ；－－－Ａ２－－－Ａｌ：ＥＴ３０ａＹＭＭＶＮＩｂＣＰ超声裂解后的沉淀：ＥＴ３０ａＹＭＭＶＮＩｂＣＰ超声裂解后的上清ｐ；ｐ；－－－－ＢｌＥＴ３０ａＹＶＸ－Ｂ２ＥＴＹＶＸ－Ｐ：ＣＰ超声裂解后的沉淀：３０ａＣｐ；ｐ超声裂解后的上清－－－Ｆｉｕｒｅ４４ＤｉｓｓｏｌｉｌｉｅｘｒｅｌｉＹＭＭＶＹＶＸＣＰｇｕｂｔｙｓｓｉｏｎａｎａｓｉｓｏｆｆｕｓｏｎｒｏｔｅｉｎｏｆＮＩｂＣＰａｎｄｐｙｐＭｌ：ＵｎｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｈＭａｒｋｅｒＭ２：ＰａｅＲｕｌｅｒｎｓａｎｅｄＰｒｏｅｉｎＬａｄｄｅｒｇｔＵｔｉｔ；ｇ；Ａ１ｏｆｓｉｏｆＴ－－ＹＭＭＶ－ＮＩｂＣＰＡ２ｎ：Ｄｅｉｔｉｅｒｓｏｎｉｃｌｓｉ：ＳｕｅｒｎａｔａｔｕｅｒｓｏｎｃｌｓｉｓｐＥ３０ａｏｓｏｎｏｆｓｕｓｏｆｐｐｙ；ｙｐｐＥＴ－３０ａ－ＹＭＭＶ－ＮＩｂＣＰＢ－－－ｐ１：ＳｕｅｒｎａｔａｎｔｏｆｓｕｅｒｓｏｎｉｃｌｓｉｓｏｆＥＴ３０ａＹＶＸＣＰＢ２：Ｄｅｏｓｉｔｉｏｎｏｆ；ｐｐｙｐ；ｐｓｕｅｒｓｏｎｉｃＥＴ－３－－０ａＹＶＸＰｐｌｙｓｉｓｏｆｐＣＭ１Ａ１Ｍ２Ｂ１６６ｋＤａ＿ｔｒ：…—４５ｋＤａ—＿４０ｋＤａ３０—ｋＤａ‘＇广ｖ：图４－５纯化的ＹＭＭＶ－ＮＩｂＣＰ和ＹＶＸ－ＣＰ重组蛋白ＭｌｎｓａｎｅｄＰＭｃｒＷｅＭａｋｅ２ＰａＲｕｅｒｉＰｎＬａｄｄｅｒ：ＵｔｉｒｏｔｅｉｎｏｌｅｕｌａｉｇｈｔｒｒＭ：ｌＵｎｓｔａｎｅｄｒｏｔｅｉ；ｇｅ；＿，Ａ－ＮＩｂＣＰ重组蛋白－ｌ：纯化的ＨｉｓＹＭＭＶＢｌ：纯化的ＨｉｓＹＶＸＰ；Ｃ重组蛋白Ｆｕｒｅ４－ＰｕｒＹＭＭＶ－－ｉｅｒｅｃｏｍｉｎａｎｏＮＩａｎＹＶＸＰｉｇ５ｉｆｄｂｔｒｏｔｅｉｎｆｂＣＰｄＣｐＭｉｌｌｉｌ：ＵｎｓｔａｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＭｏｅｃｕａｒＷｅｉｈｔＭａｒｋｅｒＭ２：ＰａｅＲｕｌｅｒＵｎｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｅｎＬａｄｄｅｒｇｔ；ｇ；－ＡｌＰｕＨｓＹＭＭＶ－ｅｎＢ１ＰｕｒｉｅＨｉｓＹＶＸ－Ｐｒｏｅｎ：ｒｉｆｉｅｄｉＮＩｂＣＰｒｏｔｉ：ｉｆｄＣｐｔｉｐ；１１２ 广西大本博士本位论文中国浪山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物羊的研究４．３．３抗体效价测定将纯化的重组蛋白用０．０２ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）调整浓度至ｌｍｇ／ｍＬ，分别取ｌｍＬ纯化，，的蛋白样本免疫新西兰大白兔两个月后采血分离血清，用剩下的纯化蛋白样本进行－Ｎ抗原亲和纯化。获得１８．４ｍＬ浓度为０．５７５ｍｇ／ｍＬ的ＹＭＭＶＩｂＣＰ抗体和１９．８ｍＬ浓度为ｍ－－０．８９８／ｍＬ的ＹＶＸＣＰ抗体。抗体效价检测结果显示ＮＩｂＣＰｇ，ＹＭＭＶ纯化抗体稀释５１２０００倍时检测因子（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆａｃｔｅｒ，Ｓａｍｐｌｅ／Ｂｌａｎｋ）依然大于２．１，其中抗体在稀释－－１６０００倍时的检测因子最大（图４６），而ＹＶＸＣＰ纯化抗体稀释２５６０００倍时检测因子依－然大于２．１，其中抗体在稀释８０００倍时的检测因子最大（图４７）。——－———？－ｕｎｅｒｕ？ＰｕｄａｎＡＰｒｅｉｂｉｍｍｓｅｍｒｉｆｉｅｔｏｄｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＩ３．５００４５．０００２￣４００００，？—－３ｔ１Ｅ．０００＾Ｉ§＇３５０００１．２■５００＾Ｉ＊■３０ｔ／ｓＮＪ．０００｜．２＇．０００２５｜ＮＸ．０００＞＇２０？．０００１Ｉ１．５００■１５０００，〇〇〇？＾！１■０ａ１０．００１０５００？■５＾．０００！￣＃４￣Ｉ１＃１＃１＃ａ＿￣Ｊｆ１００．０００．０００＾＃＃＃声ｙ＃３Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｔｉｏｎｓ４－６Ｖ－图ＹＭＭＮＩｂＣＰ多克隆抗体效价测定Ｆｉｇｕｒｅ４－６ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＹＭＭＶ－ＮＩｂＣＰｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒ１１３ 广西大学博士学位论文中国淮山贫病毒病调音、诊断和病尿病毒分子生物学的研究—Ｐ－ｒｅｉｍｍｕｎｅｓｅｒｕｍＰｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉｂｏｄｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＥＱ）３．５００３０．０００ｌ１■３＿＇—２５．０００！＃＿Ｉ２？５００■Ｉ２０．０００Ｉ■１５０００：：ＩＩＺ？１００００：？Ｉ＾■５．００００－．５００｜４＾＾Ｉｔ？：ｆＩ＊■？Ｉｉｉ＿－０？■？ｔｉ－．０００〇．〇〇〇Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｔｉｏｎｓ４－７ＶＸ－Ｐ图ＹＣ多克隆抗体效价测定Ｆｒｅ－７Ｄｅ－ｔｅｒｍｔｎＶＸｉｔｔｉｇｕ４ｉｎａｉｏｏｆｔｈｅＹＣＰｓｐｅｃｉｆｃａｎｔｉｂｏｄｙｉｅｒ４４Ａ－ＥＬＩＳＡ．３．ＣＰ对淮山药病毒病样本的检出能力４－Ｉ．３．４．１ＡＣＰＥＬＳＡ对ＹＭＭＶ阳性样本的检出會ｇ力取ＹＭＭＶ阳性的桂淮６号新鲜叶片约０．３ｇ，用包含２％ＰＶＰＰ的抗原包被缓冲液（ｐＨ９．６）研磨充分，９０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ后取上清液，用抗原包被缓冲液进行１０倍的梯度稀释，然后用稀释８０００倍的ＹＭＭＶ抗体进行ＥＬＩＳＡ检测其检出病毒的能力。结果发－现病叶汁液稀释１０００倍仍有明显阳性反应（图４８）。２．５００：２．０００Ｉ〇１．５００＼占Ｎｅｇａｔｉｖｅ〇１．０００Ｐｏｓｔｖｅｉｉ０．５００＊ｖ．￣＊￣．—．－＿—ｌ一：Ｔ？０丨；．０００ｔ２３４５６１１０１０１０１０１０１０Ｂｌａｎｋ抗蜓稀籽倍数图４－８ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ对淮山药ＹＭＭＶ病毒病样本的检出能力－８－Ｆｉｇｕｒｅ４ＡＣＰＥＬＩＳＡａｎａｌｙｓｉｓｏｆＹＭＭＶ４１１ 广西大学ｔ尊士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究４－．３．４．２ＡＣＰＥＬＩＳＡ对ＹＶＸ阳性样本的检出能力同样的，取ＹＶＸ阳性的紫山药新鲜叶片约０．３ｇ，用包含２％ＰＶＰＰ的抗原包被缓冲液９．６）研磨充分９０００ｒｍ离心１０ｍｉｎ后取上清１０（ｐＨ，ｐ液进行倍的梯度稀释，然后用稀释８０００倍的ＹＶＸ抗体进行ＥＬＩＳＡ检测其检出病毒的能力。结果发现病叶汁液稀０（４－９释１００倍仍有明显阳性反应图）。２．５００２．０００５００１Ｓ＼ｑＮｅａｔｉｖｅｇ°１０００－ｍ－Ｐ．ｏｓｉｔｉｖｅｊ＼＼０．５００ｊ—ｆｒ—ｙ■Ｊ——ｒ－０．０００４？ｉｉｉｉ２３４５６１１０１０１０１０１０１０Ｂｌａｎｋ抗Ｋｉ稀释估数４－９－图ＡＣＰＥＬＩＳＡ对淮山药ＹＶＸ病毒病样本的检出能力Ｆｕｒｅ４－－ＥＬＩＡｎａＡＣＰｌｉｓｏＹＶＸｉｇ９Ｓａｙｓｆ－４５ＩＲＴ－ＰＣＲ检．３．Ｃ测淮山药病毒用稀释８０００倍的ＹＭＭＶ抗体包被１．５ｍＬ离心管，然后取４．３．４．１中研磨的ＹＭＭＶ６号新鲜叶片汁液，用抗原包被缓冲液进行０，阳性的桂淮１倍梯度稀释分别加入包被－－ＭＭＶ－好抗体的离心管进行ＩＣＲＴＰＣＲ检测该抗体检出病毒的能力Ｆ。病毒检测引物为Ｙ６－Ｒ和ＹＭＭＶ，预期ＰＣＲ产物大小为３０５ｂ。实验结果显示ｐ，病叶汁液稀释１０倍仍能特异性检测出ＹＭＭＶ４－１。（图０）ＭＮＣ１２３４５６７８—ｋｂ－图４１０ＩＣ－ＲＴ－ＰＣＲ对淮山药ＹＭＭＶ病毒病样本的检出能力８Ｍ？：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｐＤＮＡｌａｄｅｒＮＣ：阴性对照１８：０ｌｕｓｄ；；抗原稀释ＫＭ倍－－－Ｆｉｇｕｒｅ４１０ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＩＣＲＴＰＣＲｕｓｅｄｆｏｒＹＭＭＶｄｅｔｅｃｔｉｏｎ８？？ｎｅＲｕｌＤＮＡＮＣ１Ｍ：Ｇｅｌｅｒ１ｋｂｕｓｌａｄｄｅｒ：ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ１８：Ａｎｔｉｅｎｄｉｌｕｔｅｄｕｔｏ０１０ｔｉｍｅｓｐ；ｇ；ｇｐ１１５ 国浪山苗病毒病调查、诊断和病尿病毒分子生物学的研究广西大学博士学位论文中ＶＸ抗体包被１．５ｍＬ离心４．３Ａ２用稀释８０００倍的Ｙ管，然后取中研磨的ＹＶＸ阳１〇倍梯度稀释，分别加入包被好抗性的紫山药新鲜叶片汁液，用抗原包被缓冲液进行－－－ＹＶＸＦ和体的离心管进行ＩＣＲＴＰＣＲ检测该抗体检出病毒的能力。病毒检测引物为５－ｂ。ＲＰＣＲ产物大小为６９２实验结果显示，病叶汁液稀释１〇倍仍能特异性ＹＶＸ，预期ｐＹＭＭＶ－检测出（图４１１）。ＭＮＣ１２３４５６７８—ｋｂ４－－－图１１ＩＣＲＴＰＣＲ对淮山药ＹＶＸ病毒病样本的检出能力８￣￣ｎｅＲｕｒ：０１０ＭｌｌＤＮＡｌｅｒＮＣ：阴性对照；１８抗原稀释１倍：Ｇｅｌｅｋｂｐｕｓａｄｄ；－－－１１ｕｓｅｄｆｏｒＹＶＸｔｅｔｏｎ．ＦｉｔｖｉｔＩＣＲＴＰＣＲｄｅｃｉｉｕｒｅ４Ｓｅｎｓｉｙｏｆｇ８－ｏ－ＭｅＲｕｒｌｕＤＮＡｎｅｔｖｅｃｏｎｔｒｏｌ１８：Ａｎｔｉｅｎｄｉｌｕｔｅｄｕｐｔ１０１０ｔｉｍｅｓｌａｄｄｅｒＮＣ：ａｉ：Ｇｅｎｌｅｋｂｐｌｓ；；ｇｇ４．６．３其它淮山药病毒抗体的制备ＪＹＭＶ－ＣＰ的单克隆抗体委托艾比玛特（Ａｂｍａｒｔ）公司通过ＳＥＡＬ技术成功制备，１ｅｒｎＢｔ体进行特异性检测，发现编号为２０７０２通过Ｗｅｓｔｌｏ对获得的６个细胞株产生的抗－１５１２０００）（４１），的细胞株产生的抗体的特异性最好，效价最高（：图２该抗体对应的ＹＭＶ的外壳蛋白的Ｎ端？５０ＬＹＮＰＥＱＶＤＬＪ（第４１个氨基酸）；抗原表位为Ｌ，位于另外，通过原核表达纯化ＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ的外壳蛋白并免疫新西兰大白兔制备相应的－１２５６０００（图４１３多克隆抗体：和图，经效价测定显示所有制备的抗体的效价均大于４－１４）。１１６ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调音、诊断和病康病毒分子生物学的研究１２０６２３１２０６２２１２０７０２１２０６２５１２０７０７１２０７０９ＭＨＶＩ／ＩＶＨＮ／ＭＨ＼／ＭＨＶＭＨ＞／ＭＨ＼ｕｉｉｉＬＬＹＮＰＥＱＶＤＬＬＬＹＮＰＥＱＶＤＬＬＬＹＮＰＥＱＶＤＬＥＥＮＴＥＲＨＴＡＥＥＥＮＴＥＲＨＴＡＥＫＤＶＤＶＧＳＶＧＴ图４－１２ＪＹＭＶ－ＣＰ的不同表位的单克隆抗体的特异性检测Ｍ：ＰａｇｅＲｕｌｅｒＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ；Ｈ：健康淮山药；Ｖ：感染ＪＹＭＶ的淮山药－ｍＷｅＦｉ４１２ＤｅｔｅｒｉｎａｔｉｏｎｏｆｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｓｉｆｃｉｔｂｍＢｌｏｔａｎａｌｓｉｓｕｒｅｍｏｎｙｅｃｉｒｔｅｇｐｙｙｙＭＰＲＰＬａｅａｔＶ－：ＪＹＭＶｎｆ：ａｅｕｌｅｒＰｒｅｓｔａｉｎｅｄｒｏｔｅｉｎｄｄｅｒＨ：Ｈｌｈａｍｉｅｃｔｅｄａｍ；ｇ；ｙｙｙ—ａ—？－＊ＰｏｎｆａｃＰｒｅｉｒｕｕｒｉｆｉｂＤｔｒＥｍｍｕｎｅｓｅｍｉｅｄａｎｔｏｄｙｅｔｅｃｉｔｏ〇４．．０００３００００ｇ３５００￡■２５ｘ．０００画、３邏．卜ｓｉ＇２００００－〇〇■＾Ｊ■Ｘ■Ｓ２．０００．１５．０００｜１．５００■｜１０．０００Ｉ■１．０００Ｙ１Ｉ５＊５００００■．５００Ｉ？—－？Ｊｔ—■＃ｒ＊０１ｔＩｔ？ｔ？＃．０００〇．〇〇〇３＜＃次ｆ＃Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｔｉｏｎｓ４－－图１３ＪＹＭＶＣＰ单克隆抗体效价测定Ｆ－ＤＪ－ｓｉｔｔｉｕｒｅ４１３ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＹＭＶＣＰｅｃｉｆｃａｎｔｉｂｏｄｙｉｅｒｇｐ１１７ ？博士学位论文中国淮山苗病毒病调查广西大学、诊断和病康病毒分子生物学的研究—－－Ｐｒ－ＰＡｅｉｎｅｓｅｒｕｍｕｒｉｆｎｉｂＤｅｉｆａｃｒｍｍｕｉｅｄａｔｏｄｙｔｅｃｔｏｎｔｏＥ２０）？３．５００３０．０００１３■０００＇２５．０００｜＾琴２．．５００ｉ．２０．０００ｉ■１５０００■Ｉ，５００＾Ｉ＇１００００，〇〇〇？Ｉ｜／差■５０？．０００．５００｜ｉｆＩ？Ｊ－０１？ｔｔ？？＃４．００００．０００＾＃Ａ＃声，＃＜Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｔｉｏｎｓ－４ＹＮＭＶ－图４１ＣＣＰ多克隆抗体效价测定－ＦＶ－ｎｉｇｕｒｅ４１４ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＹＮＭＣＰｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒ——ｒ－ｍｍｕｎｅｒｒｆＰｅｉｅｃｒＥｉｓｅｕｍＰｕｉｄａｎｔｉｂｏｄｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎｆａｔｏ２ａ＞？３．５００３０．０００「１＊３０００■２５．０００｜琴２，５００Ｉ■０２．０００Ｉ１■５２．０００ＴＶ＞■＇Ｓ＼１５．０００Ｔ§？ｒａ１．５００＾Ｉｋ｜＊１００００？１ｉ．ｏｏｏＩ＾＇■５００００．５００１＾１？＇００■１’１ｆ１？１？１？１？００００．００．ｚ＃＃＃，＃＜ｚｚＡｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｔｉｏｎｓ４－－图１５ＹＬＶＣＰ多克隆抗体效价测定Ｆ－－ｉｕｒｅ４１５ＤｅｔｅｒｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＹＬＶＣＰｓｅｃｉｃａｎｔｉｔｔｅｒｇｍｐｉｆｂｏｄｙｉ４．３．７Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证淮山药病毒抗体特异性－ＹＮＭＶ使用植物蛋白提取试剂盒分别提取经ＲＴＰＣＲ检测为感染Ｃ、ＪＹＭＶ、ＹＭＭＶ、ＹＬＶ和ＹＶＸ的淮山药叶片总蛋白Ｖ、ＭＶ、ＹＭＭＶ、，以制备的ＣＹＮＭＪＹ１１８ 广西大学ｔ尊士芈位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病厫病毒分子生物掌的研究ＹＬＶ和ＹＶＸ的病毒抗体稀释５０００倍分别进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验验证这些病毒抗体的特异性。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验结果显示，用ＪＹＭＶ抗体进行杂交有少量非常微弱的非特异性条带产生，用ＹＭＭＶ抗体检测ＪＹＭＶ阳性植株时发现有微弱的交叉反应。其余抗体均能特异性检测出相应的病毒，而与其它淮山药病毒没有明显的交叉反应，说明这些病毒４－抗体的特异性非常好（图１６）。Ｍ１２３４５６７８９Ａ—Ｂ撼ＣＹＮＭＶ２５—ｋＤａ麵獅＾２５ｋＤａ－ＤＹＭＭＶ３５ｋＤａ—２５—ｋＤａＥＹＬＶ３５—ｋＤａ２５—ｋＤａＹＶＸ３５ｋＤａ２５—ｋＤａ■響＾１１９ 广西大学博士学位论文中圔浪山苗病毒病调查、诊断和病凰病毒分子生物掌的研究－图４１６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证淮山药的病毒抗体特异性Ａ山药总蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析ＢＣＹＮＭＶ抗体特异性验证ＣＪＹＭＶ抗体特异性验证：淮；：；：；Ｄ：ＹＭＭＶ抗体特异性验证Ｅ：ＹＬＶ抗体特异性验证Ｆ：ＹＶＸ抗体特异性验证：；Ｍ：ＰａｅＲｕｌｅｒＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ；１：大和长芋山药（ＣＹＮＭＶ阳性）２：ｇ；大和长芋山药（ＹＬＶ？Ｖ阳阳性）；３：桂淮２号（ＤＢＶ阳性）；４？铁棍山药（ＹＬ性）；５：铁棍山药（ＹＹＳＭＶ阳性）；６：铁棍山药（ＣＹＮＭＶ阳性）；７：铁棍山药（ＹＭＭＶ和ＪＹＭＶ阳性）；８：水山药（ＹＭＭＶ和ＪＹＭＶ阳性）；９：紫山药（ＹＭＭＶ和ＹＶＸ阳性）Ｆ－ｉｇｕｒｅ４１６ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｍｖｉｒｕｓｅｓａｎｔｉｂｏｄｓｅｃｉｆｉｃｉｔｙｙｐｙＳＳ＿ＰＡＧＥＡ：ＤａｎａｌｓｉｓｏｆａｍｔｏｔａｌｒｏｔｅｉｎＢ：ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｓｉｓｏｆＣＹＮＭＶａｎｔｉｂｏｄｓｅｃｉｆｉｃｉｔｙｙｐ；ｙｙｐｙ；ＣｂｌｌｉＪＹＭＶｔｉｂｏｄｉｆｉｉｔＤＷｔｂｌｌｉｓｆｄ：Ｗｅｓｔｅｒｎｏｔａｎａｓｓｏｆａｎｓｅｃｃｙ：ｅｓｅｒｎｏｔａｎａｓｏＹＭＭＶａｎｔｉｂｏｙｙ；ｐｙｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ；Ｅ：ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆＹＬＶａｎｔｉｂｏｄｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ；Ｆ：ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆＹＶＸａｎｔｉｂｏｄｙｓｅｃｉｆｉｃｉｔ；ｐｙＭ：ＰａｇｅＲｕｌｅｒＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ；１：Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＤＨＣＹ（ＣＹＮＭＶ）；２）ＯｉＨＣＹＹＬＶ３ＤａｉＧ２ＤＢＶ４ＯｉＧ：Ｚ．ｏｓｔａｃｖ．Ｄ（）：．Ｊｏｎｃａｃｖ．Ｈ：Ｄ．ｏｓｔａｃｖ．ＴＹＬＶｐｐ；ｐ（）＼ｐｐ（）；５：Ｄ．Ｏｏｓｉｔａｃｖ．ＴＧＹＹＳＭＶ６：Ｚ）．Ｏｏｓｉｔａｃｖ．ＴＧＣＹＮＭＶｐｐ；；（）ｐｐ（）７：Ｄ．Ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＴＧＹＭＭＶａｎｄＪＹＭＶ８：Ｚ）．Ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＳＳＹＹＭＭＶ（）；（）；９：Ｄ．Ａｌａｔａｃｖ．ＺＹＹＭＭＶａｎｄＹＶＸ（）４－－－．３．８五种淮山药病毒的ＩＣＰＣＲ或ＩＣＲＴＰＣＲ检测方法的建立参考国内外已经报道的淮山药病毒检测引物，并根据已获得侵染中国淮山药的病毒序列设计病毒特异性引物－Ｓｅ获得的淮山药的ｒ＆Ｌ基因，还根据淮山药ＲＮＡｑ深度测序二－序列设计内参引物（见第章的表２１），结合本研究制备的针对ＣＹＮＭＶ、ＪＹＭＶ、ＹＭＭＶ－－、ＹＬＶ和ＹＶＸ的病毒抗体，建立了相应病毒的ＩＣＲＴＰＣＲ检测方法（实验操４２－－．１４。ＣＰＣＲ、作步骤见．）利用ＩＲＴ检测方法可以髙效灵敏、快速、特异性地检出ＣＹＮＭＶ－、ＪＹＭＶ、ＹＭＭＶ、ＹＬＶ和ＹＶＸ４１２，病毒检测结果如图所示，所有的病毒检测引物均可以在相应的阳性样本中扩增出特异性的ＰＣＲ产物。１２０ 国推山药■病毒病调查研究广西大学博士学位论文中、诊断和病尿病毒分子生物学的ＣＹＮＭＶｊｙｍｖ上’＂，ｄＣ二）ｆ＇ｒ＾ＹＭＭＶ：＾＾ＹＶＸ－－－图４１７淮山药病毒ＩＣＲＴＰＣＲ检测电泳分析Ｍ：ＧｅｎｅＲｕｅｒｌｌｕＤＮＡｌａｄｄｅｒＮＴＣ：；ＰＣ：阳性对照；ＮＣ：阴性对照；ｌｋｂｓ；无模板对照ｐ－Ｖ）－ＷＭ－２ＹＭＶＹＶＸ）ＤＨＣＹ－（ＹＬＧＨ２ＳＧ：２（Ｊ和；１：大和长芋山药；桂淮号－－－ＮＣ－（ＹＭＭＶ）３山药（ＪＹＭＶＹＶＸ）ＧＨ６ＷＸ；１：桂淮６号；ＴＧ：铁棍和－－ＦＸ－３ＢＢＷＶ２ＹＮＭＶ、ＹＭＭＶ和ＹＬＶ）ＳＳＹ：水山药（、Ｃ；ＴＧ－－－ＷＸ－ＭＶ、ＹＭＭＶＹＶＸ）ＦＸ２２：ＺＹ１：；铁棍山药；紫山药（ＣＹＮ和－－ＭＭＶ－－１ＹＭＭＶＹＶＸ）ＺＹＸＺ１ＹＶＸ）ＹＢ３ＮＣ：和：粤北３号（和：徐农紫药（Ｙ－－ＰＣＲＦ－１７ＤｉｎｏｉｏａｍｖｉｒｕｅｓｂＩＣＲＴｉｇｕｒｅ４ａｇｓｓｆｓｙｙＰＣｌＲｉｖｅｃｏｎＮＣ：ｎｅｉｖｏｎｔｒＭｌｋＤＮＡｌｅｒＮＴＣ：ｎｏｔｅｍｌｔｔｒｏｌ：ｏｓｔｉｔｒｏｌｔｅｃｏ：Ｇｅｎｅｕｌｅｒｂｌｕｓａｄｄａｅｃｏｎ；ｇ；ｐ；ｐ；ｐ－－－－２ＷＭ２．ＹＭＶＹＶＸＤＨＣＹＳＧ１．ＤＨ：Ｄ．ＪａｏｎｉｃｖＧＨ２Ｊａｎｄ：Ｄ．ｏｏｓｉｔｅｃｖＣＹＹＬＶＧＨｃａ）；ｐｐ；ｐ（（）－－－－ＷＸＮＣ１：．ｏｓｉｔａｖ．ＹＭＶａｎＹＶＸＧＨ６：Ｄ．Ａｌａｔａｃｖ．ＧＨ６（ＹＭＭＶＴＧ３ＤＯｐｐｃＴＧＪｄ）；）；（－Ｙ－ＦＸ－ａｎＶＳＳ３：Ｄ．Ｏｏｓｉｔａｃｖ．ＳＳＹＢＢＷＶ２＞ＣＹＮＭＶＹＭＭＶｄＹＬｐｐ，；（）－－ｎｄＹＶＸ－－ＷＸＴＧ２２．ＺＹ１：Ｄ．Ａａａｖ．ＺＹａＦＸ：Ｄ．ＯｏｓｉｔａｃｖＴＧｌｔｃＣＹＮＭＶ，ＹＭＭＶ；ｐｐ；（）－－－－ａｖ．ｄＹＢ３ＮＣ１．ｄＹＶＸＺＹＸＺ１：Ｄ．ＡｌｔａｃＺＹＹＭＭＶａｎＹＶＸ）：Ｄ．ＡｌａｔａｃｖＹＢ３（ＹＭＭＶａｎ）；（１２１ ？病毒病调杳广西大举博士学位论文中国淮山药、诊断和病康病毒分子生物本的研究－４．３．９多重ＲＴＰＣＲ检测淮山药病毒根据已获得侵染中国淮山药的病毒序列设计特异性引物（ＧｅｎｅＳｅｃｉｆｉｃＰｒｉｍｅｒ，ｐ’ＧＳＰ），在正向引物的５端加上通用接头引物序列（ＵｎｉｖｅｒｓｅＴａｇＳｅｑｕｅｎｃｅ，ＵＴＳ）的’Ｔａ－ＵＴＳ的Ｔａ－Ｒ的序列ｇＦ序列，在反向引物的５端加上ｇ。在对样本进行反转录的过程－２所列引物的反向引物混合液中，在２０吣反应体系中加入表４（ＲＴＰｒｉｍｅｒＭｉｘ，ＲＰＭ），使每条反向引物的终浓度为５００ｎＭ。反转录结束后，取８ｉＬ反转录产物，加入１０｜ｉＬ２｜ｘＥＳＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ、２ｉＬ正向引物和接头引物按１：４５比例的混合液（ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ｜Ｍｉｘ，ＦＰＭ），每条正向引物的终浓度为２００ｎＭ，轻微混匀后直接进行多重ＰＣＲ反应－（图４１８。Ｐ５ＰＣＲ产物进行电泳检测（图４－１。）ＣＲ结束之后直接取队的９）电泳结果显示只有此前检测为ＹＭＭＶ阳性的粤北３号样本没有扩增出预期大小的ＰＣＲ产物，其余病毒病样本均扩增出预期大小的目的片段。本工作建立的ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ、ＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ的多重一ＰＣＲ检测方法，可以在个反应中同时检测上述病毒。，，５３ＲＮＡＡ’５，ＲＮＡＢ３１ＩＧＳＰ１ＵＴＳ３’ｃＤＮＡＡ＾，５，ｃＤ３ＮＡＢ，，５３ＤＮＡＣ—￣一ｍ＾Ｉ麵＾４５Ｊ＇’３５ＤＮＡＡ，’５３ＤＮＡＢ’３，５ＤＮＡＣ４－图１８多重ＰＣＲ扩增策略－ｍａＦｕｒｅ４ｔｃａｒａｍｍｕｌｔｉｘＰｉｇ１８ＳｃｈｅｉｄｉｇｏｆｐｌｅＣＲ１２２ ■广西大学病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学？的研究彳尊士学位论文中国淮山药Ｍ１２３４５６ＶｉｒｕｓＰｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅＢＢＷＶ３６１ｂｐ．ＣＭＶ３２３ｂｐＹＭＭＶ３０５ｂｐ５００ｂｐＪＹＭＶ２８６ｂｐ＼ＹＶＸ２６５ｂｐ層ＣＹＮＭＶ２３２ｂｐ丫ＭＶ２２４ｂｐ＼＼ＹＣＮＭＶ２０９ｂｐ＇ＹＬＶ１９６ｂｐ；，ＤＲｂｃＬ１４９ｂｐ４－－图１９多重ＲＴＰＣＲ检测淮山药病毒ＤＴ－ＭＲｅｒＤＮＡｄｅｒ１：３（ＹＭＭＶ、ＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ阳性）；２：：ＧｅｎｅｕｌｌＯＯｂｐＩａｄ；大和长芋山药－ＹＬＶ阳性）ＤＴ４ＪＹＭＶ：（ＪＹＭＶ５：（阳性）：４阳性）；大和长芋山药；３水山药（；铁棍山药粤北３号（ＹＭＭＶ阳性）；６：水山药（ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ、ＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ阳性）ｌ－－ｖｉＲＴＰＣＲＦ４１Ｄｎｏｏｆｉｒｕｂｍｕｔｌｅｘｉｇｕｒｅ９ｉａｇｓｉｓｙａｍｓｅｓｙｐＭ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌｋｂｐｌｕｓＤＮＡｌａｄｄｅｒ１：Ｄ．ｏｏｓｉｔａｃｖ．ＤＨＣＹ（ＹＭＭＶ，ＣＹＮＭＶａｎｄＹＬＶ）；２：Ｄ．；ｐｐ．ＹＹＬＶ４：Ｄ．ｏｏｓｉｔａｖ．ＴＪＹ：Ｄ．ｏｏｓｉｔａｃｖ．ＤＨＣＹＤＴ４ＪＹＭＶ３：Ｄ．ｏｏｓｉｔａｃｖＳＳ（ｃＧＭＶ５；ｐｐ（；ｐｐ；ｐｐ））（）ａｌａｔａｃｖ．ＹＢ３（ＹＭＭＶ）；６：Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａｃｖ．ＳＳＹ（ＹＭＭＶ，ＪＹＭＶ，ＣＹＮＭＶａｎｄＹＬＶ）４．４讨论在病毒检疫方面最重要的是检测技术的可靠性和灵敏度。多种侵染淮山药的病毒已经被报道，但是关于其检测技术的研究并不多。国内对淮山药病毒的研究比较少，目前尚未见淮山药病毒抗体及相关检测方法的报道。２９＿［’３６，５７’１７６１７８］淮山药病毒的混合侵染现象普遍存在，不同淮山药叶片样本中的病毒种类和含量各异，，病毒含量极，有些样本不表现症状但是含有病毒而有些样本可能刚被病毒侵染少，有必要比较各种病毒检测方法的，因此单靠传统的病毒学检测方法很难做出正确的判断。可靠性和灵敏度，以保证淮山药病毒检测的可靠性１２３ 广西大学博士学位论文中固推山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究１［＇不需要提取核酸器设血清学检测方法的优点是可以使用样本粗提液进行检测，对仪。备的要求较低，检测成本相对核酸检测技术低，操作简便，可以大批量检测样本但是需要有特异性的病毒抗体。其主要缺点是耗时，检测灵敏度相对较低，可能会出现假阴性的结果，而有些抗体特异性不够好则可能出现假阳性的结果。血清学检测方法的特异性和灵敏度主要一取决于抗体的质量。完整的植物病毒作为核蛋白大分子，般具有良好的抗原特性，但一是纯化病毒粒子相对比较困难，采用原核表达病毒蛋白制备的抗体般不会与宿主蛋白发生反应，而采用纯化病毒粒子制备抗体则有可能由于为完全去除宿主蛋白或有未知的病毒蛋白，导致制备的病毒抗体用于检测时出现非特异性反应。而根据病毒的某些表位串联表达制备的单克隆抗体或高特异性的多克隆抗体用于病毒检测时，很可能由于其高特异性，只能识１８（）［１别同种病毒的某些株系，在病毒检测过程中可能出现假阴性。本研究选择原核表达纯化病毒外壳蛋白免疫新西兰大白兔进行病毒抗体制备，纯化的ＹＭＭＶ、ＹＶＸ、ＹＬＶ和１５６ＣＹＮＭＶ的多克隆抗体的效价均大于：２０００，且抗体特异性较好。另外，采用串联表达病ＹＭＶ１４０，ＹＭＶ的毒蛋白免疫小鼠制备的Ｊ单克隆抗体的效价也高达：６００但是只能识别Ｊ某些株系。淮山药样本粗提液的稀释比例对病毒检测结果的影响也比较大，因为不同病毒在样本中關，有研究报道进行ＣＭＶ检测时，淮山药样本粗提液可以稀释１６０而进的含量差异较大倍，８３及［］行检测时，淮山药样本粗提液只能稀释２０倍。本研究制备的淮山药病毒抗体在淮山药粗提液稀释５００倍时仍能进行有效检测。核酸检测技术相对于ＥＬＩＳＡ和ＳＥＭ有更高的检测灵敏度，不但省时省力，而且可以随后对病毒进行序列测定，，进行病毒序列的遗传多样性研究。该技术需要提取核酸不能有抑制ＰＣＲ反应的物质存在，ＰＣＲ的条件也可能影响病毒的检测效率，有报道称ＭｇＣｌ２和ｄＮＴＰｓ的浓１８１［］度可能影响ＰＣＲ反应。因为低浓度的ｄＮＴＰｓ避免引物与模板的非特异性结合，从而也会降，而ＭＣ、低简并引物用于检测病毒的扩增效率ｇｌ＾浓度贝ｙ影响引物的退火酶的活性和产物的一特异性，ＲＮＡ的质量和反转录的效率对检测ＲＮＡ病毒有。特别是对于些含量比较低的病毒重要的影响。采用试剂盒提取ＲＮＡ和进行反转录反应，既可以保证样本的纯度，又可以保证检测的稳定性和平行性，但是使用试剂盒会导致检测成本的增加。而且病毒的遗传多样性丰１８２］ＰＣＲ［，富，有时候引物的特异性太强也不利于病毒的检测有可能导致假阴性。所以针对遗传变异性较大的病毒，需要在病毒序列的保守区域设计简并引物用于病毒的分子生物学检测１８３６５［［］］。而引物的高度简并性则有可能降低检测的灵敏度，并且ＰＣＲ的检测效率很大程度上取决于核酸的提取方法、病毒ＲＮＡ的反转录效率以及ＰＣＲ反应的条件。特别是采用ＰＣＲ方法检２４１ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查诊断和病屎病？分子生物学的研究、测侵染淮山药的价办ｏｖ／ｍｓ的时候，某些只是该病毒的部分序列整合到淮山药基因组上的样本也可能被检出为阳性，但其可能并不含有游离的病毒核酸。因此，需要更深入研究淮山药病毒的遗传多样性，不断优化病毒的检测引物，保证其检测的可靠性和灵敏度。－ＲＴ－ＰＣＲ技术将血清学技术和核酸检测技术结合起来的ＩＣ，既有免疫学检测不需要提取４８ＰＣＲ１３核酸的优点，又有灵敏度高的优点，其检测灵敏度是ＥＬＩＳＡ的ＨＸＭ０００倍，而且检测成本相对较低。本研究制备的ＹＭＭＶ抗体用于检测ＪＹＭＶ侵染的淮山药样本时发现有微弱的交叉反应，这可能是由于这两种病毒都是马铃薯Ｙ病毒属病毒，二者具有相同或相似的抗原一决定簇－ＲＴ－ＰＣＲ检测方法则能够很好解。而采用ＩＣ决这问题。一般采用种薯进行种植淮山药在生产上，这种无性繁殖方式容易导致病毒的积累，本研究制备了多种淮山药病毒抗体，建立的相应淮山药病毒检测方法不但适用于淮山药叶片的检测，还适用于种薯的检测，为淮山药种质资源的病毒检测以及生产上的病毒监测和防控奠定了基础，具有良好的应用前景。１２５ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病讲查诊断和病尿病？分子生物学的研究、第五章总结与展望５．１全文总结一病毒病是淮山药生产上的重要病害之，在世界各国的淮山药种植区均有发生，病毒侵染淮山药可引起叶片花叶、畸形、黄化、褪绿和坏死等症状，降低叶片的光合作用效率，对淮山药的产量和品质造成重大影响。－目前世界上鍵的侵染淮山药的病毒种类超过１０种（表１３和表１４），本研究通过调查中国的淮山药种植面积较大的广西、江西、河南、山东和江苏等主要淮山药产区的病毒病发生情况，采集多个品种共计３６５份淮山药样本，运用ＳｍａｌｌＲＮＡ深度测雜术对部分淮山药病毒病样本混合后进行较为全面的病原病毒鉴定，发现侵染中国淮山药的病截步及７个病毒属中的９种病５－ＰＣＲ－毒（表１），并在此基础上＿＾ＲＴＰＣＲ检测技术对采集的淮山药的单样本进行病原病毒检测，发现不同地区不同品种的淮山药的病毒检出率差异较大，病原病毒种类也存在￣较大差异。其中广西和江西主栽参薯和日本薯蓣，田间发病率在７％４０％之间，病原病毒主要为ＤＢＶ、ＹＭＭＶ和ＹＶＸ南、山东和江苏等北方省份主要种植普通山药，田；河？２％５９ＤＢＶ、ＹＭＭＶ、ＣＹＮＭＶ、ＢＢＷＶ－２、ＪＹＭＶ、间发病率在．３％之间，病原病毒主要有ＹＬＶ和ＹＶＸ－。其中紫山药易受ＹＭＭＶ和ＹＶＸ侵染，铁棍山药易受ＹＹＳＭＶ、ＢＢＷＶ２、ＪＹＭＶＬＶ－２和ＹＶＸ侵染，水山药易受ＪＹＭＶ、Ｙ、ＹＭＭＶ和ＢＢＷＶ侵染。病毒复合侵染现象普遍存在，在检测的３６５份样本中有１３８份样本为两种以上病毒复合侵染，其中在某ＭＭＶ－些水山药样本中可同时检测出５种病毒（Ｙ、ＹＬＶ、ＢＢＷＶ２、ＣＹＮＭＶ、ＪＹＭＶ）。随着南北方淮山药种质资源的交流日益频繁，可能导致淮山药病毒的复合侵染现象更加普遍，病毒病的发生情况更加严重，对淮山药生产的威胁更大，因此需要在淮山药病毒病的监测和种质检疫方面予以重视。世界范围内的淮山药种类众多，种植区域横跨热带、亚热带和温带，侵染淮山药的病原病毒种类差异较大，如ＹＭＶ在非洲的淮山药种植区普遍存在，侵染淮山药后造成淮山药的严重减产，但在我国尚未检测到该病毒的存在。此外，ＣＭＶ和ＤＬＶ仅在非洲南部的一ＣＭＶ和ＤＬＶ侵染淮山药的报道些国家的淮山药上被发现。由于ＤＬＶ，我国也未见未见核苷酸序列报道，因此本研究发现的同属于ＰｏｔｅｃＷｍｖ的ＹＶＸ是否与ＤＬＶ为同种病１２６ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的研究一毒，还有待进步的确认。在我国最普遍存在的侵染淮山药的病毒是ＤＢＶ和ＹＭＭＶ，在所调查的淮山药种植面积最大的五省区均有发现一。而其它病毒的分布有定的区域性，－如ＹＣＮＭＶ仅在云南和广西有发现，ＢＢＷＶ２和ＹＬＶ也主要侵染河南、江苏和山东等地的北方淮山药品种（表５－１）。表５＿１侵染中国的淮山药的病毒种类Ｔａｂ－ｍｍａｌｅ５１ＳｕｒｙｏｆｖｉｒｕｓｓｅｃｉｅｓｉｎｆｅｃｔｉｎａｍｓｉｎＣｈｉｎａｐｇｙＶｉｒｕｓＧｒｏｕｐＶｉｒｕｓＹａｍｓｐｅｃｉｅｓＧｅｏｇｒａｐｈｉｃｓｐｒｅａｄｉｎｇＮｅｗｖｉｒｕｓＡｎｔｉｓｅｒｕｍａｆｅｃｔｅｄＰｏｔｙｖｉｒｕｓＹＭＭＶＤ．ａｌａｔａＧｕａｎｇｘｉ，Ｊｉａｎｇｘｉ，ＶＤ．ａｏｎｉｃａＨｅｎａｎＪｉａｎｓｕｊｐ，ｇ，Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａＳｈａｎｄｏｎｇＪＹＭＶＤ．ａｏｎｉｃａＧｕａｎｘｉＪｉａｎｓｕＶｊｐｇ，ｇ，．ｏｏｓｉｔａｎａｎＤｐｐＨｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＭａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓＣＹＮＭＶＤ．ｏｐｐｏｓｉｔａＪｉａｎｇｓｕ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，ＶＤ．ａｌａｔａＨｅｎａｎＹＣＮＭＶＤ．ｚｉｎｇｂｉｅｒｅｎｓｉｓＹｕｎｎａｎ，Ｄ．ａｌａｔａＧｕａｎｇｘｉＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓＹＶＸＤ．ａｌａｔａＧｕａｎｇｘｉ，Ｊｉａｎｇｘｉ，ＹＥＳＶＤ．ｏｐｐｏｓｉｔａＨｅｎａｎ，Ｊｉａｎｇｓｕ－ＦａｂａｖｉｒｕｓＢＢＷＶ２Ｄ．ｏｏｓｉｔａｎａｎＪｐｐＨｅｉａｎｓｕＳｈａｎｄｏｎ，ｇ，ｇＣａｒｌａｖｉｒｕｓＹＬＶＤ．ｏｐｐｏｓｉｔａＨｅｎａｎ，Ｊｉａｎｇｓｕ，ＳｈａｎｄｏｎｇＹＥＳＶＢａｄｎａｖｉｒｕｓＤＢＶＤ．ａｌａｔａＧｕａｎｇｘｉ，Ｊｉａｎｇｘｉ，Ｄ．ｊａｐｏｎｉｃａＨｅｎａｎ，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｄ．ｏｐｐｏｓｉｔａＳｈａｎｄｏｎｇＧｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓＹＹＳＭＶＤ．ａｐｏｎｉｃａＧｕａｎｘｉ，Ｈｅｎａｎ，ＹＥＳｊｇ．ｏｏｓｉｔａＪＤｉａｎｓｕＳｈａｎｄｏｎｐｐｇ，ｇ－－Ｓｅ测序技术并结合ＲＡＣＥ和ＲＴＰＣＲ技术成功克隆到ＹＭＭＶ－ＮＣ应用ＲＮＡｑ深度１、－－－－－ＷＸ－－ＪＹＭＶＷＸ１、ＣＹＮＭＶＦＸ１、ＢＢＷＶ２ＳＧ１、ＹＶＸ１、ＹＬＶＳＧ１和ＹＹＳＭＹＦＸ１－－ＷＸ－等淮山药病毒分离物的基因组全长序列，其中ＹＶＸ１、ＹＬＶＳＧ１和ＹＹＶＭＶＦＸ１是新发现的淮山药病原病毒，分别具有Ｐｏｔｅｊｃｖ／ｒｕｓ、Ｃａｒ／ａｖ／ｍｓ和５ｅｇｏｍｏｖ／ｍｓ的基因组一致性都比较低结构特征，但是与已知的这三个属的病毒的核苷酸和氨基酸序列，均是这三个病毒属的新病毒种。对本研究获得的２６个ＹＭＭＶ分离物与世界上其它淮山药种１２７ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查诊断和病康病毒分子生物李的研究、植区鉴定到的１９个ＹＭＭＶ分离物进行遗传多样性和进化关系分析，发现分成的５个组ＭＭＶ不同群。与地理位置密切相关，可能与地理隔离导致Ｙ体的单独进化有关侵染中国淮山药的ＹＭＭＶ分离物在系统进化关系上分成的两个组分别来自南方和北方淮山药产区，而且这两个组间的进化关系较远，表明地理隔离和淮山药品种差异对ＹＭＭＶ的进化均有影响。同时本研究还发现ＹＭＭＶ分离物存在重组现象，Ｐ１到ＣＩ区域包含重组热点。重组事件的发生可能是由于南北方的种质资源交流所致，而重组病毒的出现可。能突破不同淮山药品种的宿主抗性，因此需要在种质资源交流过程中加强病毒的检测在较全面了解中国淮山药病原病毒种类的基础上，通过ＳＥＡＬ技术成功制备了ＪＹＭＶ的单克隆抗体，通过原核表达并纯化病毒外壳蛋白制备了ＹＭＭＶ、ＹＶＸ、ＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ的多克隆ＪＹＭＶ抗体，发现除了的单克隆抗体在检测某些淮山药样本时有微弱的非特异性反应，其它淮山药病毒多克隆抗体的特异性均较好。制备的所有抗体的效价均－ＲＴ－大于１：２５６０００。基于以上病毒抗体ＰＣＲ，建立了相应病毒的ＥＬＩＳＡ检测方法和ＩＣ３检测方法，其中发现病叶汁液稀释１〇倍时用ＥＬＩＳＡ方法检测ＹＭＭＶ和ＹＶＸ还有阳５－ＲＴ－ＰＣＲ检性反应，而病叶汁液稀释１０倍时使用ＩＣ测方法仍能特异性检测出ＹＭＭＶ和ＹＶＸ。本工作还建立了ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ、ＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ的多重ＰＣＲ检测方法，可以在一个反应中同时检测上述病毒。由于淮山药病原病毒种类多，使用该方法进行病原病毒检测具有通量高、操作方便、相对成本低等特点，具有良好的应用前景。５．２本研究的创新点１．首次较为全面地调查了中国淮山药种植面积最大的五个省区的的淮山药产地的病毒病发生情况，并通过深度测序技术进行全面的病原病毒鉴定，发现６种国际上已经报道的侵染淮山药的病毒和３种侵染淮山药的新病毒。２．首次发现粉蚧可以传播ＹＹＳＭＶ，ＹＹＳＭＶ可侵染铁棍山药、大和长芋山药、马唐。、反枝苋、皱果苋和牛筋草３－．首次从细胞和亚细胞水平展示ＢＢＷＶ２、ＹＭＭＶ、ＪＹＭＶ和ＹＶＸ侵染淮山药造成的病理学变化，，发现这些病毒侵染淮山药可引起线粒体和叶绿体异常以及膜增生等病变现象为相应病毒的细胞学水平上的诊断提供参考。、ＪＹＭＶ、ＣＹＮＭＶ－、４．首次对侵染中国淮山药的ＹＭＭＶ、ＢＢＷＶ２ＹＶＸ、ＹＬＶ和ＹＹＳＭＶ进行了基因组全序列测定和分子特征分析。同时对侵染淮山药的ＹＭＭＶ、１２８ ■病毒病调查广西大学博士学位论文中国淮山充、诊断和病康病毒分子生物学的研究ＤＢＶ和ＹＹＳＭＶ进行了遗传多样性分析，发现这３种病毒在进化过程中存在显著的分子变异。，其中ＹＭＭＶ还存在显著的重组现象５．制备了ＹＭＭＶ、ＣＹＮＭＶ、ＹＶＸ和ＹＬＶ的多克隆抗体和ＪＹＭＶ的单克隆抗体，ＥＬＩＳＡＩ－ＲＴ－基于这些抗体，建立了针对中国淮山药病毒的和ＣＰＣＲ检测方法。－６、、ＰＣＲ．首次建立了可同时检测ＹＭＭＶＪＹＭＶＣＹＮＭＶ和ＹＬＶ的多重ＲＴ检测方法。５．３工作展望本研究选择淮山药种植面积较大的广西、江西、河南、山东和江苏等省区的比较有代表性的地点进行淮山药病毒病发生情况调查和病原病毒鉴定，可以初步了解中国淮山药病毒病的发生情况和病原病毒种类。但是中国淮山药种植区遍布大江南北，在广东、福建、浙江、河北、云南、贵州、甘肃和新疆等省也有广泛种植，由于气候和土壤诗点不同，各地种植的淮山药品一一步调查和鉴定种差异较大，淮山药病毒病的发生情况和病原病毒种类还有待进。下步工作将通过对更多淮山药产地的不同淮山药品种的病毒病样本进行采集并通过小ＲＮＡ深度测序更一全面普查侵染中国淮山药的病原病毒种类，进步完善淮山药病原病毒检测目录，为我国的淮山药生产和种质资源交流过程中检测淮山药病毒提供依据。病毒抗体在植物病毒检测中发挥着重要的作用，本研究制备了ＪＹＭＶ的单克隆抗体和ＹＭＭＶ－２多、ＹＬＶ、ＹＶＸ和ＣＹＮＭＶ的多克隆抗体，ＢＢＷＶ克隆抗体正在制备当中，其特一一异性和效价还有待进步验证。下步还要考虑制备ＤＢＶ和ＹＹＳＭＶ的多克隆抗体并建立相－ＰＣＲ应的ＩＣ检测方法。此外，虽然核酸检测技术相对于血清学检测技术的灵敏度高，但是由一，根于病毒的变异较快，因此需要对病毒遗传多样性分析进行进步分析据病毒基因组的保守区设计检测引物并优化反应体系，以确保检测结果的可靠性。通过淮山药病毒的遗传多样。ＹＹＳＭＶ性分析，，还可以更好地了解其进化过程和宿主适应性本研究还发现粉蚧可以传播并且可以在马唐、反枝苋、皱果苋和牛筋草等杂草中传播该病毒，因此需要在淮山药生产上重视清除田间杂草，防止田间杂草作为中间寄主进行病毒传播。其它淮山药病毒的寄一主范围步研究。、传播介体和传播方式还有待进本研究制备的淮山药病毒抗体可用于免疫共沉淀研究病毒蛋白与寄主蛋白的相互作用。此外，本研究所在课题组已经对桂淮２号淮山药进行了全基因组测序，再加上ＲＮＡ－ＳｅＥＳＴ的分子ｑ获得的不同淮山药品种的转录组数据，可以开发出基于标记用于１２９ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究一入淮山药种质资源鉴定，或进步研究不同病毒侵染淮山药后的差异基因表达谱，为深－研究淮山药病毒的侵染机制和病毒寄主互作提供重要信息。淮山药通过无性繁殖方式进行种植，导致病毒的积累日益严重，田间发病率居高不下。因此，亟需探索淮山药的脱毒技术，获得不同淮山药病毒的脱毒方法，生产淮山药脱毒苗，应用于大田生产和种质资源交流。本实验室对感染ＹＭＭＶ的淮山药组培苗（粤北３号）删利巴韦林、盐酸吗啉狐和阿昔齡等ｉ＿毒药剂处理，获得了较好的脱毒縣，今后可参考该脱毒技术对其它淮山药品种进行脱毒试验，获得无毒的淮山药组培苗应用于生产。１３０ 广西大学傅士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究参考文献［１］韦本辉．中国淮山药栽培．北京２０１３中国农业出版社．，，［２］ＴｏｙｏｈａｒａＨ，ＩｒｉｅＫ５ＤｉｎｇＷ，ＩｗａｔａＨ，ＦｕｊｉｍａｋｉＨ５ＫｉｋｕｃｈｉＦ，ｅｔａＬＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｕｂｅｒｓｈａｐｅｏｆａｍ（ＤｉｏｓｃｏｒｅａａｌａｔａＬ．）ｃｕｌｔｉｖａｒｓｂｉｍａｅａｎａｌｓｉｓａｎｄｅｌｌｉｔｉｃＦｏｕｒｉｅｒｄｅｓｃｒｉｔｏｒｓ．ｙｙｇｙｐｐ－ＳＡＢＲＡＯＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ２０００３２：３１７．，，［３］ＢｓｍＬ．ＤｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇＤｉｏｓｃｏｒｅａｓｐｅｃｉｅｓｉｎｔｈｅＳｏｕｔｈＰａｃｉｆｉｃ：ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｏｆＧｒｅｅｎｗｉｃｈ２００２ｙ．，４ＣｏｕｒｓｅＧ．Ｙａｍｓ．Ａｎａｃｃｏｕｎｔｏｆｔｈｅｎａｔｕｒｅｏｒｉｉｎｓｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ［］ｙＤ，ｇ，ｕｓｅｆｕｌｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅＤｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ．１９６７．５ＡｅｎｓｕＥＳＣｏｕｒｓｅＤＧ．Ｇｕｉｎｅａａｍｓｔｈｅｂｏｔａｎ，ｅｔｈｎｏｂｏｔａｎｕｓｅａｎｄｏｓｓｉｂｌｅｆｕｔｕｒｅ［］ｙ，ｙｙｙｙ，ｐ－ｏｆｙａｍｓｉｎＷｅｓｔＡｆｒｉｃａ．ＥｃｏｎｏｍｉｃＢｏｔａｎｙ１９７２２６：３０１１８．，，［６ＡｌｅｘａｎｄｅｒＪＣｏｕｒｓｅｙＤＵＣＫＯＰ，ＤｉｍｂｌｅｂＧ．Ｔｈｅｏｒｉｉｎｓｏｆｙａｍｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ］，，ｙｇｄｏｍｅｓａｎｄａｎｍａ－ｔｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎｏｆｌａｎｔｓｉｌｓ１９６９：４０５２５．，ｐ［７ＨａｈｎＳ，ＯｓｉｒｕＤ，ＡｋｏｒｏｄａＭ，ＯｔｏｏＪ．ＹａｍｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｆＵｔｕｒｅｒｏｓｅｃｔｓ．Ｏｕｔｌｏｏｋ］ｐｐｐｏｎｒｃｕｒｅＡｇｉｌｔｕ１９８７．，－Ｐ－８ＭａｌａｕｒｉｅＢＴｒｏｕｓｌｏｔＭＦＢｅｒｔｈａｕｄＪＢｏｕａｌｅｍＭｉｎｅｌＡＤｕｂｅｍＪ．Ｍｅｄｉｕｍｔｅｒｍａｎｄ［］，ｓ，，，，－ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎｖｉｔｒｏｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｓａｆｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅｘｃｈａｎｇｅｏｆｙａｍ｛Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｓｐｐ．）－ｅｒｍｌａｓｍ．ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ１９９８１：２６７．ｇｐｙ，，［９］ＦＡＯ．ＦｏｏｄａｎｄＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＯｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＮａｔｉｏｎｓ．ＦＡＯＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１２，ＦＡＯ：ｈｔｔ：／／ｆａｏｓｔａｔ．ｆａｏ．ｏｒ／．ｐｇ［１０］ＯｎｗｕｅｍｅＩＣ，ＣｈａｒｌｅｓＷＢ．Ｔｒｏｐｉｃａｌｒｏｏｔａｎｄｔｕｂｅｒｃｒｏｐｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｒｏｓｅｃｔｓ：Ｆｏｏｄ＆ＡｒｉｃｕｌｔｕｒｅＯｒ．１９９４．ｐｐｇｇ，［１１］ＯｓａｉｅＡＵ．Ｔｈｅａｍｔｕｂｅｒｉｎｓｔｏｒａｅ１９９２．ｇｙｇ，＇１２ＯｅｎｕａＶＡ．Ｎｉｅｒｉａｓｆｏｏｄｓａｎｄｆｅｅｄｉｎｓｔｕｆｆｓ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｒｅｓｓ１９６８．［］ｙｇｇｇｙＰ，［１３］ＦｒａｎｃｉｓＢ，ＨａｌｌｉｄａｙＤ，ＲｏｂｉｎｓｏｎＪ．Ｙａｍｓａｓａｓｏｕｒｃｅｏｆｅｄｉｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎ．ＴｒｏｐｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１９７５１７．，１４ＷａｎａｓｕｎｄｅｒａＪＲａｖｉｎｄｒａｎＧ．ＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆａｍＤｉｏｓｃｏｒｅａａｌａｔａｔｕｂｅｒｓ．［］，ｙ｛）ａｎｄ－ＰｌｔＦｏｏｓｆｏｒＨｕｍａｎＮｕｔｒｉｔｉｏｎ１９９４４６：３３９．，，１３１ 广西大学博士学位论文中国豫山药病毒病调查诊断和病尿病毒分子生物学的研究、［１５］ＷａｌｓｈＳ．Ｐｌａｎｔｂａｓｅｄｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄｈｅａｌｔｈ：ＶｅｇａｎＳｏｃｉｅｔｙ，２００３．－ｒａｎｄ－ｒｒｒａｎ１６ＢＭｉｌｌｅＪＭｉｌｌｅＪＢＢｘｉｉＪＦｏｓｔｅｒＰｏｗｅｌｌＫ．Ｔｈｅｎｅｗｌｕｃｏｓｅｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｃｋｅｔ［］，，，ｇｐｕｉｄｅｔｏｔｈｅｔｏ１００ｌｏｗＧＩｆｏｏｄｓ：Ｍａｒｌｏｗｅ＆Ｃｏｍａｎ２００３．ｇｐｐｙ，１７ＤｅｒａｓＬ．Ｔｈｅａｍ：ａｔｒｏｉｃａｌｒｏｏｔｃｒｏ：Ｍａｃｍｉｌｌａｎ１９９３．［］ｇ，ｙｐｐ［１８］ＫｏｍｅｓａｒｏｆＦＰ，ＢｌａｃｋＣ，ＣａｂｌｅＶ，ＳｕｄｈｉｒＫ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｗｉｌｄｙａｍｅｘｔｒａｃｔｏｎｍｅｎｏｐａｕｓａｌｓｙｍｐｔｏｍｓ，ｌｉｐｉｄｓａｎｄｓｅｘｈｏｒｍｏｎｅｓｉｎｈｅａｌｔｈｙｍｅｎｏｐａｕｓａｌｗｏｍｅｎ．Ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ，２００１，４－１４４５０．：１９ＵｌｂｒｉｃｈｔＣＢａｓｃｈＥＳｏｌｌａｒｓＤＨａｍｍｅｍｅｓｓＰＨａｓｈｍｉＳ．ＷｉｌｄａｍＤｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ．［］，，，，ｙ（）Ｊｏｕｒｎａ－ｌｏｆｈｅｒｂａｌｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａ２００３３：７７９１．ｐｐｙ，，－－２０ＣｓｕＬｅｅ－ｓｃｏｒｅａｂａｔａ［］ＨｏｕＷＦＭＨ．Ｙａｍ（Ｄｉｏｔａｓｕｂｅｒｍｕｃｉｌａｅｅｘｈｉｂｉｔｅｄ，Ｈ，Ｌ）ｔｇａｎ－ｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｐｌａｎｔａｍｅｄｉｃａ２００２６８：１０７２６．，，［２１］ＫｏｎｄｏＴ，ＫａｓａｉＫ，ＹａｍａｓｈｉｔａＫ，ＩｓｈｉｔａｎｉＭ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｎａｔ－ｔｔｅｎｕａｔｅｄｓｔｒａｉｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅａｍｎｅｃｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｆｏｒｃｒｏｓｓｒｏｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｙｐｔｈｏ２００７－ＧｅｎｅｒａｌＰｌａｎｔＰａｌｏ７３：１５２５．ｇｙ，，［２２］ＡｍｕｓａＮ，ＡｄｉｇｂｉｔｅＡ，ＭｕｈａｍｍｅｄＳ，ＢａｉｙｅｗｕＲ．Ｙａｍｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｉｔｓｍａｎａｇｅｍｅｎｔｉｎ－ｅｒｉａ：Ｎｉｇ．ＡｆｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００４，２４９７５０２．，－ｍａｎａ２３ＡＭＱＫＭＪＡＥＢＣＥＪＬ．ＩＣＴＶＩｎｔｅｔｉｏｌｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎｔａｘｏｎｏｍｏｆｖｉｒｕｓｅｓｎｉｎｔｈ［］，，，ｙｒｅｏｒｔｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎｔａｘｏｎｏｍｏｆｖｉｒｕｓｅｓ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ２０１１ｐｙ，，Ｌｏｎｄｏｎ．２４：洪键李德德周雪平．植物病毒分类图谱．北京科学出版社２００１．［］，，，［２５］ＨｏｌｌｉｎｇｓＭ，ＢｒｕｎｔＡ．Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８１．［２６］ＤｏｕｇｈｅｒｔｙＷＧ，ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎＪＣ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐｏｔｙｖｉｒａｌｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓ．－ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈｙｔｏａｔｈｏｌｏ１９８８２６：１２３４３．ｐｇｙ，，２７ＨａｒｉＶ．ＴｈｅＲＮＡｏｆｔｏｂａｃｃｏｅｔｃｈｖｉｒｕｓ：ｆｉｉｒｔｈｅｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｏｔｅｉｎ［］ｐ－ｌｉｎｋｅｄｔｏＲＮＡ．Ｖｉｒｏｌｏ１９８１１１２：３９１９．ｇｙ，，－２－ＩｎｃＨａｅｎｎｉＬＢＦ８ｈｉｍａＳＡｅｍａｒｄｉ．ＰｏｔｖｉｒｕｓｒｏｔｅｉｎｓＵｒｃｕｕｉ：ａｗｅａｌｔｈｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．［］ｑ，，ｙｐＶｒｒｃｈ－ｉｕｓＲｅｓｅａ２００１７４：１５７７５．，，［２９］ＨｕｇｈｅｓＪｄＡ，ＤｏｎｇｏＬ，ＡｔｉｒｉＧ．Ｖｉｒｕｓｅｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｙａｍｓ（ＺＪｚｏｓｒｏｒｅｆｌａ／ａｆａａｎｄＤ．ｒｏｔｕｎｄａｔａｉｎＮｉｅｒｉａ．Ｐｈｔｏａｔｈｏｌｏ１９９７８７：５４５．）ｇｙｐｇｙ，，１３２ 广西大学博士学位论文中国液山苗病毒病调査诊断和病康病毒分子生物学的研究、［３０］ＢｒｕｎｔＡＡ？ＣｒａｂｔｒｅｅＫ，ＤａｌｌｗｉｔｚＭ，ＧｉｂｂｓＡ，ＷａｔｓｏｎＬ．Ｖｉｒｕｓｅｓｏｆｐｌａｎｔｓ．ＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓａｎｄｌｉｓｔｓｆｒｏｍｔｈｅＶＩＤＥｄａｔａｂａｓｅ：ＣＡＢＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ１９９６．，３１ＫｅｎｏｎＬ，ＳｈｏｉｎｋａＳ，ＨｕｈｅｓＪ，ＯｄｕＢ．ＡｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｆｅｃｔｉｎＤｉｏｓｃｏｒｅａ［］ｙｙｇｇａｍｓ－－－ｉｎｓｕｂＳａｈａｒａｎＡｆｒｉｃａ．ＰｌａｎｔＶｉｒｏｌｏｉｎＳｕｂＳａｈａｒａｎＡｆｒｉｃａ２００１：４３２９．ｙｇｙ，３２ｅｎｅ－［］ＴｈｏｕｖｌＪＣＦａｕｕｅｔＣ．ＹａｍｍｏｓａｉｃａｎｅｗｏｔｙｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｎＤｉｏｓｃｏｒｅａｃａｅｎｅｎｓｉｓ，ｑｙ，ｐｇＩ－ｉｎｔｈｅｖｏｒＣｏａｓｔ．ＡｎｎａｌｓｏｆＡｌｉｅｄＢｉｏｌｏ１９７９９３：２７９８３．ｙｐｐｇｙ，，３３ＦｕｉＳＭｉｔｏｂｅＩＮａｋａｍａｅＨＮａｔｓｕａｋｉＫ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｃｏａｔｒｏｔｅｉｎｅｎｅｏｆ［］ｊ，，，ｑｐｇａｍｍｉｌｄｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＰａｕａＮｅｗＧｕｉｎｅａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇ１９９９ｙ，ｐｙ，，－１４４：１４１５９．３４ＦｕｉＳＮａｋａｍａｅＨ．ＣｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｅｎｏｍｉｃＲＮＡｏｆａＪａａｎｅｙｅ［］ｊ，ｐｑｇｐＡｒｃｈ－ｙａｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓａｎｅｗｏｔｖｉｒｕｓｉｎＪａａｎ．ｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ１９９９１４４：２３１４０．，ｐｙ，，ｐｇｙｅ＿ｍ３５ＷａｔｒｗｏｒｔｈＨ．ＴｗｏＦｌｅｘｕｏｕｓＲｏｄＶｉｒｕｓｅｓｉｎＤｉｏｓｃｏｒｅａｏｒｉｂｕｎｄａ：Ｓｔｏｍｓ［］ｆｌｙｐ，ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＵｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９７８．，［３６］ＭｉｇｌｉｏｒｉＡ，ＣａｄｉｌｈａｃＢ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｔｏｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆａｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅｏｆｙａｍ：ＤｉｏｓｃｏｒｅａｔｒｉｄａｉｎＧｕａｄｅｌｏｕｅ．ＡｎｎａｌｅｓｄｅＰｈｔｏａｔｈｏｌｏｉｅ１９７６．ｆｉｐｙｐｇ，－Ｋｏｎａ［３７］ＧｏｕｄｏｕＵｒｂｉｎｏＣＧｉｖｏｒｄＬｕｉｏｔＪＢｏｅｌｉｎＭｔｅＧＤｕｂｅｍＪ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，，Ｑ，ｇ，，ｏｆｙａｍｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｕｓｉｎｇｓｙｍｐｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙ，ａｎｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊｏｒｎａ－ｕｌｏｆＰｈｔｏｐａｔｈｏｌｏ１９９６１４４：２３５４０．ｙｇｙ，，ｏｕ－ｒｂ３８ＧｏｕｄＵｉｎｏＣＫｏｎａｔｅＧｕｉｏｔＪＤｕｂｅｍＪ．Ａｅｔｉｏｌｏａｎｄｅｃｏｌｏｏｆａａｍｍｏｓａｉｃ［］，，Ｑ，ｇｙｇｙｙｄａｓｅｎｒａｓｏｒｃａｃｃｅ－ｉｓｅｉＢｕｋｉｎａＦ．ＴｏｐｉｌＳｉｅｎ１９９６３６：３４４０．，，３９ＢｏｕｓａｌｅｍＭＤａｌｌｏｔＳＧｕａｄｅｒＳ．Ｔｈｅｕｓｅｏｆｈｌｏｅｎｅｔｉｃｄａｔａｔｏｄｅｖｅｌｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ［］，，ｙｐｙｇｐｔｏｏｌｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｎｏｔｉｎｏｆＹａｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌａｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｙｐｇｐｐｒｎ－ｅｉｄｅｍｉｏｌｏ．Ｊｏｕａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ２０００９０：２５３６．ｐｇｙｇ，，４０ＴｈｏｕｖｅｎｅｌＪＣＦａｕｕｅｔＣ．ＹａｍｍｏｓａｉｃａｎｅｗｏｔｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｎＤｉｏｓｃｏｒｅａｃａｅｎｅｎｓｉｓ［］，ｑ，ｐｙｇｙ－ｉｎｔｈｅＩｖｏｒＣｏａｓｔＡｎｎａｌｓｏｆＡｌｉｅｄＢｉｏｌｏ１９７９９３：２７９８３．ｙｐｐｇｙ，，［４１］ＯｄｕＢ，ＨｕｇｈｅｓＪｄＡ，ＡｓｉｅｄｕＲ，ＮｇＮ，ＳｈｏｙｉｎｋａＳ，ＯｌａｄｉｒａｎＯ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｗｈｉｔｅｙａｍ｛Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｒｏｔｕｎｄａｔａ）ｃｕｌｔｉｖａｒｓｔｏｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｒｅｅｖｉｒｕｓｅｓ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２００４，５３－：１４１７．１３３ 广西大学博士学位论文中国滚山筠病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究ｅｍａｎ－ａｒｃｏｒｕｉｄｏｕｅａｃｈｕ４２ＡｌＭＥＭｓＪＢＣＢｙＲＦａｕｅｔＣ．Ｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ［］，，ｇ，，ｑｐｓｅｕｅｎｃｅｏｆｙａｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＩｖｏｒＣｏａｓｔｉｓｏｌａｔｅｅｎｏｍｉｃＲＮＡ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｑ（ｙ）ｇｇｙ，－１９９６１４１：１２５９７８．，４３ＤｕｔｅｒｍｅＯ，ＣｏｌｉｎｅｔＤＫｕｍｍｅｒｔＪＬｅｏｉｖｒｅＰ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔａｘｏｎｏｍｉｃｏｓｉｔｉｏｎ［］，，ｐｐ－ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｙａｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｂａｓｅｄｏｎｓｅｕｅｎｃｅｄａｔａｏｆｔｈｅ５ｔｅｒｍｉｎａｌｑａｒｏｆ－ｔｔｈｅｃｏａｔｒｏｔｅｉｎｃｉｓｔｒｏｎｒｈｉｖｖｉｒｏｌｏ：ｐ．Ａｃｅｓｏｆ１９９６１４１１０６７７５．ｐｇｙ，，４４Ａ－ｒｒ－Ｇｏｕｄｏｕ－ｔｌｅｍａｎＶｅｄａｕｅＭＥＵｒｂｉｎｏＣＤｕｂｅｍＪＢｅａｃｈＲＮＦａｕｕｅＣ．Ａｎａｌｓｉｓ［］ｇ，，，ｙ，ｑｙｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅＰＩＨＣＰ３ＮｉｂａｎｄＣＰｅｎｏｍｉｃｒｅｉｏｎｓｏｆｓｅｖｅｒａｌａｍ，，，ｇｇｙｍｏｓａｉｃｏｔｙｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓ：ｉｍｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｉｎｔｒａｓｅｃｉｅｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉｖｅｒｓｉｔｏｆｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ．ｐｐｐｙｐｕｒｎａ－ＪｏｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ１９９７７８：１２５３６４．ｇｙ，，［４５］ＢｏｕｓａｌｅｍＭ，ＤｏｕｚｅｒｙＥ，ＦａｒｇｅｔｔｅＤ．Ｈｉｇｈｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｄｉｓｔａｎｔｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｎｄｉｎｔｒａｓｐｅｃｉｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｅｖｅｎｔｓａｍｏｎｇｎａｔｕｒａｌｏｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＹａｍｍｏｓａｉｃｐｐａｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，８－１：２４３５５．４６ＨｕｈｅｓＪｄＡ．ＶｉｒｕｓｅｓｏｆｔｈｅＡｒａｃｅａｅａｎｄＤｉｏｓｃｏｒｅａｓｅｃｉｅｓ：Ｔｈｅｉｒｉｓｏｌａｔｉｏｎ［］ｇｐ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＲｅａｄｉｎ１９８６．ｇ，［４７］ＯｄｕＢ，ＨｕｇｈｅｓＪｄＡ，ＳｈｏｊｄｎｋａＳ，ＤｏｎｇｏＬ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｏｔｙｖｉｒｕｓｆｒｏｍＤｉｏｓｃｏｒｅａａｌａｔａＬ．ｗａｔｅｒａｍｉｎＮｉｅｒｉａ．ＡｎｎａｌｓｏｆＡｌｉｅｄＢｉｏｌｏｐ（ｙ）ｇｐｐｇｙ，－１９９９１３４：６５７１．，－４８Ｓｅａｓｎｅｅｍｍｕｎｏｃａ－ＭｕｍｆｏｒｄＲｌＳ．ＲａｉｄｉｌｔｕｂｉｔｕｒｅＲＴＰＣＲｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｗｏ［］，ｐｇｐｔ－ａｍｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｉｃａｌｍｅｈｏｄｓ１９９７６９：７３９．ｙ，，ｐｇ４９ＯｄｕＢＯＨｕｈｅｓＪｄＡＳｈｏｉｎｋａＳＡＤｏｎｏＬＮ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎａｎｄ［］，ｇ，ｙ，ｇ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｏｔｖｉｒｕｓｆｒｏｍＤｉｏｓｃｏｒｅａａｌａｔａＬ．ｗａｔｅｒａｍｉｎＮｉｅｒｉａ．Ａｎｎａｌｓｏｆｐｙ（ｙ）ｇＡｌｉｅｄＢ－ｐｐｉｏｌｏｇｙ１９９９１３４：６５７１．，，５０Ｌｏｅｂｅｎｓｔ－ｅｉｎＧＴｈｏｔａｉｌｌＧ．Ｖｉｒｕｓａｎｄｖｉｒｕｓｌｉｋｅｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｍａｏｒｃｒｏｓｉｎ［］，ｐｐｙｊｐｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：Ｓｒｉｎｅｒ２００４．ｐｇ，５１ＯｋｕａｍａＳＳａｋａＨ．ＹａｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＳｃｉｅｎｃｅＲｅｏｒｔｓｏｆｔｈｅＦａｃｕｌｔｏｆＡｒｉｃｕｌｔｕｒｅ［］．ｙ５ｐｙｇｒｓ－ＩｂａｒａｋｉＵｎｉｖｅｉｔｙ１９７８２６：２９３４．，，５２ＦｕｉＳＮａｋａｍａｅＨ．ＣｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｅｏｎｏｍｉｃＲＮＡｏｆａｍｉｌｄｓｔｒａｉｎ［］ｊ，ｇｏｉ－４０Ｊａｐａｎｅｓｅａｍｍｏｓａｉｃｏｔｙｖｉｒｕｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２０００１４５：６３５．ｙｐｇｙ，，１３４ 广西大学博士擎位论文中国浪山箱銜毒病调查、诊断和病靡病毒分子生物学的研究５３ＳｈｉｒａｋｏＹＥｈａｒａＹ．ＲａｉｄｄｉａｎｏｓｉｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅａｍｎｅｃｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂ［］，ｐｇｙｙｅｅｃｏ－ｓａｎｎａｓｏａｃａｏｃｅｏｆｌｔｒｂｌｏｔｉｍｍｕｎｏａｓｙ．ＡｌｆｔｈｅＰｈｔｏｐｔｈｏｌｏｇｉｌＳｉｔｙＪａａｎ１９８６．ｙｐ，［５４］ＡｔｒｅｙａＣ，ＲａｃｃａｈＢ，ＰｉｒｏｎｅＴ．Ａｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｃｏａｔｒｏｔｅｉｎａｂｏｌｉｓｈｅｓａｈｉｄｐｐｐ－ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｏｆａ，ｏｔｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏ１９９０１７８：１６１５．ｙｐｙｇｙ，＇Ｕｓｈａ－ａｓｅ［５５］ＪａｃｏｂＴＲ．ＳＴｅｒｍｉｎｌｕｅｎｃｅａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅＲＮＡｅｎｏｍｅｏｆｔｈｅＩｎｄｉａｎｉｓｏｌａｔｅ，ｑｙｇｏｆＣａｒｄａｍｏｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ：ａｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆｅｎｕｓＭａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓｏｆＰｏｔｖｒｉｄａｅ．ＶｉｒｕｓｇｙｉＧｅｎｅｓ－２００１２３：８１８．，，５６ＫｏｎｄｏＴＦｕｉｔａＴ．Ｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｃｌｏｎｅ［］，ｊｐｑｏｆＣｈｉｎｅｓｅｙａｍｎｅｃｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｍａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓｅｓｈａｖｅｔｈｅｓｍａｌｌｅｓｔｇｅｎｏｍｅａｍｒｓｏｆ－ｅｍｂｅｔｈｅｆａｍｉｌＰｏｔｙｖｉｒｉｄａｅｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１２：．ｍｏｎ．Ａ１５７２２９９３０７ｇｙｇｙ，，［５７］ＰｈｉｌｌｉｐｓＳＢｒｉｄｄｏｎＲＢｒｕｎｔＡ，ＨｕｌｌＲ．Ｔｈｅａｒｔｉａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｂａｄｎａｖｉｒｕｓ，，ｐｉｎｆｅｃｔｉｎｔｈｅｒｅａｔｅｒａｓｉａｔｉｃｏｒｗａｔｅｒａｍＤｉｏｓｃｏｒｅａａｌａｔａ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｔｏａｔｈｏｌｏ１９９９ｇｇｙ（）ｙｐｇｙ，，－１４７：２６５９．［５８］ＢｒｉｄｄｏｎＲＷ，ＰｈｉｌｌｉｐｓＳ，ＢｒｕｎｔＡ，ＨｕｌｌＲ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＤｉｏｓｃｏｒｅａａ／ａ鉍ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓｃｏｍａｒｉｓｏｎｔｏｏｔｈｅｒｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｂａｄｎａｖｉｒｕｓｒｏｕ．ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ１９９９，ｐｇｐ，，８－１：２７７８３．ｅｒｏｅｃｕａｒｕ－５９ＳｅａｌＳＭｕｌｌＥ．Ｍｌｌａｎａｌｓｉｓｏｆａｆｌｌｌｅｎｔｈｓｅｕｅｎｃｅｏｆａｎｅｗａｍｂａｄｎａｖｉｒｕｓ［］，ｙｇｑｙｆｒｏｍｉ－Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｓａｎｓｉｂａｒｅｎｓｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００７１５２：８１９２５．ｇｙ，，［６０］陈秀，阮小蕾，赵芹，李华平．富贵竹中杆状ＤＮＡ病毒湖北分离物的分子鉴定．４２－中国农业科学２００９：２００２９．，，６１Ｃｈｅｎ－ｃｋｈａｒＢＯＣＰＬｏｔｌｓｚｅｗｓｋｉＮＥＴｈｅＯＩａｎｄＩＩＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆｌｉｌｌｏｗ［］．ＲＦＣｏｍｍｅｎａＹｅｇ，，Ｍｏｔ－－ｔｌｅＶｉｒｕｓＡｒｅＶｉｒｉｏｎＡｓｓｏｃｉａｔｅｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９９６２２３：２６３７１．，，［６２］ＬａｃｏＧＳ，ＢｅａｃｈｙＲＮ．Ｒｉｃｅｔｕｎｇｒｏｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓｅｎｃｏｄｅｓｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＨａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ｇｙ，－１９９４９１：２６５４８．，［６３］ＨａｒｐｅｒＧ，ＨｕｌｌＲ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂａｎａｎａｓｔｒｅａｋｖｉｒｕｓＤＮＡ．ＶｉｒｕｓＧ９８－ｅｎｅｓ１９１７：２７１８．，，６４ＨａｒｅｒＧＤａｈａｌＧＴｈｏｔａｉｌｌＧＨｕｌｌＲ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅｉｓｏｍａｌｂａｎａｎａｓｔｒｅａｋ［］ｐ，，ｐｐｙ，ｐ－ＰＣＲｔ－ｂａｄｎａｖｉｒｕｓｂＩＣ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｉｃａｌｍｅｈｏｄｓ１９９９７９：１８．ｙｇ，，１３５ 广西大学博士学位论文中国请■山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究６５ＢｏｕｈＭＬｏｋｈａｒｔＢＯｌｓｚｅｗｓｋｉＮＥ．Ａｎａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆａ］ｉｄａ，ｃ，ｑ［ｙｓｕｇａｒｃａｎｅｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｔｏｂａｎａｎａａｎｄｒｉｃｅ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｅｎｅｒａｌｇ－ｖｉｒｏ：ｌｏｇｙ１９９３７４１５２２．，，［６６］ＧｅｅｒｉｎｇＡ，ＭｃＭｉｃｈａｅｌＬ，ＤｉｅｔｚｇｅｎＲ，ＴｈｏｍａｓＪ．ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｍｏｎｇＢａｎａｎａｓｔｒｅａｔｔ２０００１－ｋｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＡｕｓｔｒａｌｉａ．Ｐｈｏａｈｏｌｏ９０：９２７．ｙｐｇｙ，，［６７］ＰａｌｕｋａｉｔｉｓＰ，ＲｏｏｓｓｉｎｃｋＭＪ，ＤｉｅｔｚｇｅｎＲＧ，ＦｒａｎｃｋｉＲ．Ｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ１２４１１ｉｎｖｉｒｕｓｒｅｓｅａｒｃｈ９９：２８．，，［６８］ＦａｕｑｕｅｔＣ，ＴｈｏｕｖｅｎｅｌＪ．ＰｌａｎｔｖｉｒａｌｄｉｓｅａｓｅｓｉｎｔｈｅＩｖｏｒｙＣｏａｓｔ．ＯＲＳＴＯＭ，Ｐａｒｉｓ，１９８７．６９ＰｅｄｅｎＫＳｍｏｎｓＲ．Ｃｔ／ＣＭ／ｗｆｔｅｒｗａｙａｚｃｖ／ｒｔ／５ｃｏｎｔａｉｎｓａｆｉｉｎｃｔｉｏｎａｌｌｄｉｖｉｄｅｄｅｎｏｍｅ．［］，ｙｙｇｒｏｏ－Ｖｉ：ｌｇｙ１９７３５３４８７９２．，，ｒｃａｒｒｏｕａｅｒｅｓ－７０ＬｏｔＨＭａｈｏｕｘＧＭＪＫＪＷｔＣＶａｎＶｌｏｔｅｎＤｏｔｉｎｅｔａｈＥｖｉｄｅｎｃｅ［］，，，ｐ，，ｇＬ，ｆｏｒｔｈｒｅｅｆｉｍｃｔｉｏｎａｌＲＮＡｓｅｃｉｅｓｉｎｓｅｖｅｒａｌｓｔｒａｉｎｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｐＧｅｎｅｒａ－ｌＶｉｒｏｌｏ１９７４２２：８１９３．ｇｙ，，［７１］ＳｃｈｗｉｎｇｈａｍｅｒＭＷ，ＳｙｍｏｎｓＲＨ．ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｕｒｍａｊｏｒＲＮＡｓｐｅｃｉｅｓｏｆｍｏｓａ－ｔｃｕｃｕｍｂｅｒｉｃｖｉｒｕｓｉｎｐｌａｎｔａｎｄａｎｉｍａｌｃｅｌｌｆｒｅｅｓｙｓｔｅｍｓａｎｄｉｎｔｏａｄｏｏｃｙｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，－１９７７７９：８８１０８．，７２ＧｏｕｌｄＡＲＳｍｏｎｓＲＨ．ＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＲＮＡ３．Ｅｕｒｏｅａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆ［］，ｙｐｂ１－ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８２２６：２１７２６．，，７３ＷａｈｕｎｉＷＤｉｅｔｚｅｎＲＨａｎａｄａＫＦｒａｎｃｋｉＲ．Ｓｅｒｏｌｏｉｃａｌａｎｄｂｉｏｌｏｉｃａｌｖａｒｉａｔｉｏｎ［］ｙ，ｇ，，ｇｇｂｅｔｗｅｅｎａｎｄｗｉｔｈｉｎｓｕｂｒｏｕＩａｎｄＩＩｓｔｒａｉｎｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙｇｐ，９９２４－１１：２８２９７．，［７４］ＰｏｒｔａＣ，ＤｅｖｅｒｇｎｅＪ，ＣａｒｄｉｎＬ，ＢｒｉａｎｄＪ，ＶａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌＭ．Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｏｄｅｓｖ－ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｉｂｉｔｏｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｉｒｏｌｏ１９８９１０４：２７１８５．ｇｙ，，［７５］ＲｏｏｓｓｉｎｃｋＭＪ．ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｈｉｓｔｏｒｙｏｆＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｄｅｄｕｃｅｄｂｙｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａ－ｌｙｓｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏ２００２７６：３３８２７．ｇｙ，，ｒｓｓｎｃｋＺｈａｎｅ－７６ＲｏｏｉＭＪＨｌｌｗａｌｄＫＨ．Ｒｅａｒｒａｎｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅ５ｎｏｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｉｏｎ［］，ｇＬ，ｇｇａｎｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｅｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＲＮＡ３ｉｎｄｉｃａｔｅｒａｄｉａｌｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｐｙｇｓｕｂｒ－ｏｕｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏ１９９９７３：６７５２８．ｇｐｇｙ，，７７ＲｏｏｓｓｉｎｃｋＭＪ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈｔｏａｔｈｏｌｏ，［］ｐｙｐｇｙ－１９９７３５：１９１２０９．，１３６ 广西大学傅士学位论文中国淮出箱病毒病调Ｉ、诊断和病尿病毒分子生物学的研究－７８ＣｏｕｒｓｅＤ．ＩｎｔｅｒｎａｌｂｒｏｗｎｓｏｔａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆａｍｓｉｎＢａｒｂａｄｏｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅ［］ｙｐｙ－ＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＴｒｉｎｉｄａｄａｎｄＴｏｂａｇｏ１９６７６７：４７３８２．ｇ，，［７９］ＷａｔｅｒｗｏｒｔｈＨ，ＬａｗｓｏｎＲ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ａｎｄｓｅｒｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｗｏｏｄ－ｄｏｒｉｎｓｏｔｓｔｒａｉｎｏｆｃｈｅｒｒｌｅａｒｏｌｌｖｉｒｕｓ．Ｐｈｔｏａｔｈｏｌｏ１９７３６３：１４１６．ｇｇｐｙｆｙｐｇｙ，，［８０］ＰｈｉｌｌｉｐｓＳ，ＰｉｇｇｏｔｔＪＡ，ＢｒｕｎｔＡ．ＦｕｒｔｈｅｒｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔＤｉｏｓｃｏｒｅａｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓｉｓａｔｏｏ－ｏｅｘｖｉｒｕｓ：．ＡｎｎａｌｓｏｆＡｌｉｅｄＢｉｌｇｙ１９８６１０９１３７４５．ｐｐｐ，，８１ＦｕｋｕｍｏｔｏＦＴｏｃｈｉｈａｒａＨ．Ｃｈｉｎｅｓｅａｍｎｅｃｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．ＡｎｎＰｈｏａｔｈｏｌＳｏｃＪｎ［］，ｙ＾ｐｐ，１９７８４４－：１５．，［８２］ＲｏｓｓｅｌＨ，ＴｈｏｔａｐｐｉｌｌｙＧ．ＶｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｏｄｃｒｏｐｓｉｎｔｒｏｐｉｃａｌＡｆｒｉｃａ．ＶｉｒａｓｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｉｍｏｒｔａｎｔｆｏｏｄｃｒｏｓｉｎｔｒｏｐｉｃａｌＡｆｒｉｃａ１９８５．ｐｐ，８３ＢｒｕｎｔＡＡＣｒａｂｔｒｅｅＫＧｉｂｂｓＡ．Ｖｉｒｕｓｅｓｏｆｔｒｏｉｃａｌｌａｎｔｓ．Ｄｅｓｃｒｉｔｉｏｎｓａｎｄｌｉｓｔｓｆｒｏｍ［］，，ｐｐｐｔｈｅＶＥ）Ｅｄａｔａｂａｓｅ：ＣＡＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ１９９０．，［８４］杜琳，钟先锋，陈剑泓，易军鹏．植物病毒检测技术研究进展．农产品加工，２００７，７：４８．ｓｏｓａｎｅ－ｗｏｖｒａｓｅｓ８５ＨｏｌｌｉｎＭ．Ｈｔｒｓｔｕｄｉｅｓｗｉｔｈｆｉｆｔｙｔｌａｎｔｉ．ＡｎｎａｌｓｏｆＡｌｉｅｄＢｉｏｌｏ［］ｇｇｐｐｐｇｙ，－１９５９４７：９８１０８．，ＡＨｏｗ－８６ｌｍｅｉｄａＪＤａｔｓｏｎＡＦ．Ａｎｅｇａｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｅｌｌａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅ［］，Ｊｏｕｒｎａ１－ｌｏｆｃｅｌｌｂｉｏｌｏ１９６３６：６１６２０．ｇｙ，，［８７］ＣｈｒｉｓｔｉｅＳＲ，ＰｕｒｃｉｆｕｌｌＤ，ＣｒａｗｆｏｒｄＷＥ，ＡｈｍｅｄＮ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｏｆｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｓｔａｉｎｅｄｃｌａｒｉｆｉｅｄｖｉｒａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｓｍａｌｌｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈａｐｐｅｎｄｉｃｅｓｏｎｎｅｇａｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｌｏｒｉｄａ，１９８７．［８８］ＤｅｂｒｉｃｋＫＳ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｓｓａｙｆｏｒｐｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｓｕｓｉｎｇｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｍｉｃｒｏｓｃｏ．Ｖｉｒｏｌｏ１９７３５６：６５２３．ｐｙｇｙ，，Ｅｎｇｖａ－８９ｌｌＥＰｅｒｌｍａｎｎＰ．ＥｎｚｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａＥＬＩＳＡｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｓｓａ［］，ｙｙ（）ｑｙ－ｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｂｕｉｎＧ．Ｉｍｍｕｎｃｈｅｍｉｔｒ１９７１８：８７１４．ｇｌｏｓｙ，，９０Ｃｍｅ－ｌａｒｋＭＦＡｄａｍｓＡ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｌａｔｅｍｅｔｈｏｄｏｆｅｎｚｌｉｎｋｅｄ［］，ｐｙｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９７７，－８３３４：４７５．１３７ 广西大学博士学位论文中囯ｍ山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究９１ＭａｔｔｈｅｗｓＷＪｏｒｄａｎＣＴＷｉｅａｎｄＧＷＰａｒｄｏｌｌＤＬｅｍｉｓｃｈｋａＩＲ．Ａｒｅｃｅｔｏｒｔｒｏｓｉｎｅ［］，，ｇ，，ｐｙｔａｎｒｏｅｎ－ｋｉｎａｓｅｓｅｃｉｆｉｃｏｈｅｍａｔｏｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｄｉｔｏｒｃｅｌｌｅｎｒｉｃｈｅｄｏｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ１９９１ｐｇ，ｐｐｐｐ，６５－：１１４３５２．９２ＢｒａｔｅＣＢｕｍｓＲ．Ａｎｔｉｂｏｄｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＰｌａｎｔＶｉｒｏｌｏｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｎｅｒ１９９８［］ｙ，ｙｐｇｙＰｐｒｉｇ，，２７９－８６．［９３］ＣｏｐｅｌａｎｄＲ．ＡｓｓａｙｉｎｇｌｅｖｅｌｓｏｆｌａｎｔｖｉｒｕｓｂｙＥＬＩＳＡ．Ｐｌａｎｔｖｉｒｏｌｏｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｒｉｎｅｒ，ｐｇｙｐｐｇ－１９９８４５５６０．，ｒＷＴｅｎｚｍｅ－ｎｋｎｏｓｏｎａｓｓａ９４ＰａａｓＭＧＨａｋｏｗｓｋｉＲＨｏｃｋｍｅｅ．Ｄｏｔｌｉｅｄｉｍｍｕｒｂｅｔ［］ｐｐ，ｊ，ｙｙｙｏ－（ＤｔＥＬＩＳＡ）：ａｍｉｃｒｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｖｉｓｃｅｒａｌｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｎｏｃａｍｅｈｏｄｓ－ｉｍｍｕ：４ｌｏｇｉｌｔ１９８３６４２０５１．，，［９５］ＷｅｔｚｅｌＴ，ＣａｎｄｒｅｓｓｅＴ，ＭａｃｑｕａｉｒｅＧ，ＲａｖｅｌｏｎａｎｄｒｏＭ，ＤｕｎｅｚＪ．Ａｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅｏｌｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｌｕｍｏｘｏｔｙｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌｐｙｐｐｐａｏｄ－ｏｆ：２ｖｉｒｏｌｏｉｃｌｍｅｔｈｓ１９９２３９７３７．，ｇ，－ｍｕ［９６ＢｅｒｔｏｌｉｎｉＥＯｌｍｏｓＡＭａｒｔｉｎｅｚＭＣＧｏｒｒｉｓＭａＴＣａｍｂｒａＭ．Ｓｉｎｌｅｓｔｅｌｔｉｌｅｘ］ｙ，，，ｇｐｐＲＴ－ｆｏｒｓａｎｅｏｕｓａｎｄｃｏｌｏｕｒｉｍｅｒｉｃｄｅｅｃｉｏｎｏｆｓｉｘｉｒｕｓｅｉｎｏｌｉｖｅｓＰＣＲｍｕｌ．ｉｔｔｔｔＲＮＡｖｓｔｒｅｅＪｏｕｒｎａ－ｌｏｆｖｉｒｏｌｏｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ２００１９６：３３４１．ｇ，，－９７ＯｌｍｏｓＡＢｅｒｔｏｌｉｎｉＥＧｉｌＭＣａｍｂｒａＭ．Ｒｅａｌｔｉｍｅａｓｓａｆｏｒｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ［］，，，ｙｑ－ｓｅｎｔｒａｎｓｍｉｅｄＰｌｕｍｏｘｖｉｒｕｓＲＮＡａｒｅｉｎｓｉｎｌｅａｈｉｄｎｏｎｐｅｒｓｉｔｔｌｙｔｔｐｔｇｔｓｇｐｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｔ－ｖｉｒｏｌｏｉｃａｌｍｅｈｏｄｓ２００５１２８：１５１５．ｇ，，ｓａ－９８ＢｏｕｌｅｍＭａｌｌｏｔＳ，ｕｉＳａｔｓｕａｋｉＫＴ．Ｏｒｉｉｎｗｏｒｌｄｗｉｄｅｄｉｓｅｒｓｉｏｎ［］，ＤＦｊ，Ｎｇ，ｐ，－ｒａｃａｅｒｓｃａｏｎｒａａｏｎａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｏｅｏｉｌｄｉｖｉｆｉｔｉｄ：ａｎｅｖｔｏｎａｒｓｔｏｒｏｍｇｇｐｈｉｔｉｂｉｎａｔｉｏｎｏｌｕｉｈｉｆＹａ，ｙｙｔ－ｍｉｌｄｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＹＭＭＶ．ＩｎｆｅｃｉｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ２００３３：１８９２０６．（），，，ｓＭｏｒｒｉｓＴｄａｎＲＰ－９９ＤｏｄｄＪＪｏｒ．ｌａｎｔｖｉｒａｌｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆ［］，，Ｐｈ－ｔｏａｔｈｏｌｏ１９８４２２：１５１６８．ｙｐｇｙ，，ａｕａ－ｖ１００ＷｕＬｕｏＹＬｕＲＬＮＬｉＥＣＬｉＷＸｅｔａｌＶｉｒｕｓｄｉｓｃｏｅｒｂｄｅｅｓｅｕｅｎｃｉｎ［］Ｑ，，，，，，ｙｙｐｑｇａｎｄａｓｓｅｍｂ－ｔｌｙｏｆｖｉｒｕｓｄｅｒｉｖｅｄｓｍａｌｌｓｉｌｅｎｃｉｎＲＮＡｓ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｇｇｙｏｆｃ－ｉｅｎｃｅｓ：Ｓ２０１０１０７１６０６１１．，，１０１ＡｄａｍｓＩＰＧｌｏｖｅｒＲＨＭｏｎｅｒＷＡＭｕｍｆｏｒｄＲＪａｃｋｅｖｉｃｉｅｎｅＥＮａｖａｌｉｎｋｉｅｎｅＭｅｔ［］，ｓ，，ｇ，？，－ｅｎｃｍｅａＬＮｅｘｔｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｕｉｎａｎｄｔａｅｎｏｍｉｃａｎａｌｓｉｓ：ａｕｎｉｖｅｒｓａｌｄｉａｎｏｓｔｉｃｔｏｏｌｉｎｇｑｇｇｙｇｔ－ｌａｎｔｖｉｒｏｌｏ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＰａｈｏｌｏ２００９１０：５３７４５．ｐｇｙｇｙ，，１３８ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调查、诊断和病厩病毒分子生物学的研究［１０２］Ａ１ＲｗａｈｎｉｈＭ，ＤａｕｂｅｒｔＳ，ＧｏｌｉｎｏＤ，ＲｏｗｈａｎｉＡ．ＤｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｏｆＲＮＡｓｆｒｏｍａｒａｅｖｉｎｅｓｈｏｗｉｎｇＳｒａｈｄｅｃｌｉｎｅｓｍｐｔｏｍｓｒｅｖｅａｌｓａｍｕｌｔｉｐｌｅｖｉｍｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｈａｔｇｐｙｙａ－ｉｎｃｌｕｄｅｓｎｏｖｅｌｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏ２００９３８７：３９５４０１．ｇｙ，，１０３ＮａｖａｒｒｏＢＰａｎｔａｌｅｏＶＧｉｓｅｌＡＭｏｘｏｎＳＤａｌｍａｉｓｚｔｒａＧｅｔａｌＤｅｅｐ［］，，，，ｙＴ，Ｂｙ，－ｍａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｖｉｒｏｉｄｄｅｒｉｖｅｄｓｌｌＲＮＡｓｆｒｏｍｒａｅｖｉｎｅｒｏｖｉｄｅｓｎｅｗｉｎｓｉｈｔｓｏｎｔｈｅｒｏｌｅｏｆｇｐｐｇＲＮＡ－ｓｉ：ｌｅｎｃｉｎｉｎｌａｎｔｖｉｒｏｉｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＰｌｏｓＯｎｅ２００９４ｅ７６８６．ｇｐ，，［１０４］ＧｉａｍｐｅｔｒｕｚｚｉＡ，ＲｏｕｍｉＶ，ＲｏｂｅｒｔｏＲ，ＭａｌｏｓｓｉｎｉＵ，ＹｏｓｈｉｋａｗａＮ，ＬａＮｏｔｔｅＰ，ｅｔａｌＡｕｅｎｃ－－ｎｅｗｒａｅｖｎｅｖｒｕｓｃｏｖｅｒｅｄｄｅｅｓｅｉｎｖｉｒｕｓａｎｄｖｉｒｏｉｄｄｅｒｉｖｅｄｍａｓｉｉｄｉｓｂｏｆｓｌｌＲＮＡｇｐｙｐｑｇ－ｉｎＣｖＰｉｎｏｔｒｉｓ．ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ２０１２１６３：２６２８．，，ｇ５ｒｅｕｚｅｒｅｚｒｏｓＭｕｉｓｅＤＦｕｅｎｔｅｓＳＢａｒｋｅｒＩｅｔａｌ．Ｃｏｍｌｅｅｖｉｒａｌ１０ＫＪＦＰｅＡＵｎｔｉｖｅｔ［］，Ｑ，，，，，ｐｐｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅａｎｄｄｉｓｃｏｖｅｒｏｆｎｏｖｅｌｖｉｒｕｓｅｓｂｄｅｅｓｅｕｅｎｃｉｎｏｆｓｍａｌｌＲＮＡｓ：ａｇｑｙｙｐｑｇ－ｅｎｅｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｉａｎｏｓｉｓｄｉｓｃｏｖｅｒａｎｄｓｅｕｅｎｃｉｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏ２００９，３８８：１７．ｇｇ，ｙｑｇｇｙ，－－－－ａｎ－ＧｏｕＸＺｈｅｎＹＡｄａｍＭＪＣｈｅｎＨＲＣｈｅｎＪＰ１０６ＷＪＪＨｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ［］ｇ，Ｚ，ｇ，，，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｍａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓｆｒｏｍａｍｉｎＹｕｎｎａｎＣｈｉｎａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｙ，ｇｙ，－２００９１５４：１３７９８０．，［１０７］ＹａｎｇＩ，ＨａｆｉｉｅｒＧ，ＲｅｖｉｌｌＰ，ＤａｌｅＪ，ＨａｒｄｉｎｇＲ．ＳｅｑｕｅｎｃｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｏｕｔｈＰａｃｉｆｉｃｉｉｔｍｅｎｔｏ－ａｓｅｄｄａｎｏｓｃｅｓｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＴａｒｏｂａｃｉｌｌｆｏｒｍｖｒｕｓａｎｄｈｅｄｅｖｅｌｏｐｆａＰＣＲｂｉｇｔｉｔｔ．Ａｒｃｈ－ｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００３１４８：１９５７６８．ｇｙ，，Ｓ－１０８ＥＬＩＳＡ及ＰＣＲ快速检测．谢艳．粉虱传双生病［］，张仲凯毒的ＴＡ植物病理学２００２３２－报：１８２６．，，１０９ＨａＣＣｏｏｍｂｓＳＲｅｖｉｌｌＰＨａｒｄｉｎＲＭＶｕＭＤａｌｅＪＬ．Ｄｅｓｉｎａｎｄａｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｗｏ［］，，，ｇ，，ｇｐｐｎｏｖｅｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｒｉｍｅｒａｉｒｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｐｐｇｏｔｙｖ－ｐｉｒｕｓｅｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００８１５３：２５３６．ｇｙ，，－Ｍｕｒａｍｏ－１１０ＫａｉｈａｒａＨｔｏＫＦｕｉＳｉＴａｎａｋａＳＩｔｏＳｉ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ［］ｊ，，ｊ，，．’．？／咖從己ａｗ／ｗｏｓａｆｃｖｚｍｓａｎｄｙｉａ／ｗ／ｍＷｍｏｙａｚｃｖｚｒｕｓｆｒｏｍａｍｌｅａｖｅｓｕｓｉｎａｔｕｂｅｃａｔｕｒｅｙｇｐ叩ｙｒｅｅｒｓｅａｎｓｃｒｉ－ｖｔｒｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｓｓａｙ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２００９７５－：７２５．，－－－１１１ＫｏｎｄｏＴＦｕｉＳｉＹａｍａｓｈｉｔａＫＫａｎＤＫＣｈａｎＭＵ．Ｂｒｏａｄｂｅａｎｗｉｌｔｖｉｒｕｓ２ｉｎ［］，，，ｊ，ｇｇ２００５７－ａｍｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏ１：４４１３．ｙｇｙ，，１３９ 广西大学博士学位论文中国淮山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究［１１２］ＷｙｌｉｅＳ，ＷｉｌｓｏｎＣ，ＪｏｎｅｓＲ，ＪｏｎｅｓＭ．Ａｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒｃｕｃｕｍｂｅｒ－ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎｌｕｐｉｎｓｅｅｄｓ．ＣｒｏｐａｎｄＰａｓｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅ１９９３４４：４１５１．，，１１３ＡｌｅｍａｎＭａｒｃｏｓＦＢｒｕｉｄｏｕＣＢＲＮＦａｕｕｅｔＣ．ＴｈｍｌｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＭＥＪｅａｃｈｅｃｏｅ［］，，ｇ，ｙ，ｑｐｓｅｕｅｎｃｅｏｆａｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＩｖｏｒｏａｓｔｉｓｏｌａｔｅｅｎｏｍｉｃＲＮＡ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｑｙ（ｙＣ）ｇｇｙ，９９６－１１４１：１２５９７８．，［１１４］ＥｎｉＡＯ，ＫｕｍａｒＰＬ，ＡｓｉｅｄｕＲ，ＡｌａｂｉＯＪ，ＮａｉｄｕＲＡ，ＨｕｇｈｅｓＪＡ，ｅｔａｌＦｉｒｓｔＲｅｐｏｒｔｏｆＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎＹａｍｓＤｉｏｓｃｏｒｅａｓ．ｉｎＧｈａｎａＴｏｏａｎｄＲｅｕｂｌｉｃｏｆＢｅｎｉｎｉｎ｛ｐｐ），ｇ，ｐｅｓｆｒ－ＷｔＡｉｃａ．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ２００８９２：８３３．，，１１５ＨｕａｎＨａｒｔｕｎＪＳ．ＣｌｏｎｉｎａｎｄｓｅｕｅｎｃｅａｎａｌｓｉｓｏｆａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｃｌｏｎｅｏｆＣｉｔｒｕｓ［］ｇＱ，ｇｇｑｙｅ－ｍｙｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｔｈａｔｃａｎｉｎｆｅｃｔｓｗｅｅｔｏｒａｎｇｅｖｉａＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．－ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ２００１８２：２５４９５８．，，１１６ＣｈａｒｅＥＨｏｌｍｅｓＥ．ＡｈｌｏｅｎｅｔｉｃｓｕｒｖｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｆｒｅｕｅｎｃｉｎｌａｎｔＲＮＡ［］，ｐｙｇｙｑｙｐｖ２００６－ｉｒｕｓｅｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ１５１：９３３４６．，，１１７ＭｏｏｎａｎＦＭｏｌｉｎａＪＭｉｒｋｏｖＴＥ．ＳｕｇａｒｃａｎｅＹｅｌｌｏｗＬｅａｉｒｕｓ：ＡｎＥｍｅｒｉｎＶｉｒａｓ［］，，ｆＶｇｇＴｈａｔＨａｓＥｖｏｌｖｅｄｂｙＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＬｕｔｅｏｖｉｒａｌａｎｄＰｏｌｅｒｏｖｉｒａｌＡｎｃｅｓｔｏｒｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６９－２０００：１５６７１．，［１１８］ＭａｒｔｉｎＤＰ，ＬｅｍｅｙＰＬｏｔＭ，ＭｏｕｌｔｏｎＶ，ＰｏｓａｄａＤ，ＬｅｆｅｕｖｒｅＰ．ＲＤＰ３：ａｆｌｅｘｉｂｌｅａｎｄ，ｏｏｒｍａ－ｆａｓｔｃｏｍｕｔｅｒｒｏｒａｍｆｏｒａｎａｌｚｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｂｉｉｎｆｔｉｃｓ２０１０２６：２４６２３．ｙ，ｐ，ｐｇｇ［１１９］ＭａｒｔｉｎＤ，ＲｙｂｉｃｋｉＥ．ＲＤＰ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｍｏｎｇｓｔａｌｉｇｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｂｎｆｏｒｍａｃｓ－ｉｏｉｔｉ２０００１６：５６２３．，，１２０ＳａｗｅｒＳ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｔｅｓｔｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｅｎｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏａｎｄ［］ｙｇｇｇｙ－Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ１９８９６：５２６３８．，，［１２１ＭａｒｔｉｎＤ，ＰｏｓａｄａＤＣｒａｎｄａｌｌＫＷｉｌｌｉａｍｓｏｎＣ．Ａｍｏｄｉｆｉｅｄｂｏｏｔｓｃａｎａｌｏｒｉｔｈｍｆｏｒ］，，ｇａｕｔｏｍａｔｅｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ．ＡＩＤＳｅａｒｃｅ－Ｒｅｓｈ＆ＨｕｍａｎＲｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ２００５２１：９８１０２．，，１２２ＳｍｉｔｈＪ．Ａｎａｌｚｉｎｔｈｅｍｏｓａｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｅｎｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎ１９９２［］ｙｇｇ，，－３４：１２６９．１２３ＰｏｓａｄａＤＣｒａｎｄａｌｌＫＡ，ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｆｒｏｍＤＮＡ［］，ｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００１，９８－：１３７５７６２．１４０ 广西大学博士学位论文中国谁山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究Ｇｒ－ａＭｏｎ１２４ＧｉｂｂｓＭＪＡｒｍｓｔｒｏｎＪＳｉｂｂｓＡＪ．ＳｉｓｔｅＳｃａｎｎｉｎ：ｔｅＣａｒｌｏｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒ［］，ｇ，ｇｐｎａ－ａｓｓｅｓｓｉｎｓｉｌｓｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｅｕｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２０００１６：５７３８２．ｇｇｑ，，１２５ＢｏｎｉＭＦＰｏｓａｄａＤＦｅｌｄｍａｎＭＷ．ＡｎＥｘａｃｔＮｏｎａｒａｍｅｔｒｉｃＭｅｔｈｏｄｆｏｒＩｎｆｅｒｒｉｎ［］，，ｐｇｕｅｎｃｅ１－ＭｏｓａｉｃＳｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎＳｅＴｒｉｌｅｔｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２００７７６：１０３５４７．ｑｐ，，１２６ＴｏｍｉｔａｋａＹＯｈｓｈｉｍａＫ．ＡｈｌｏｅｏｒａｈｉｃａｌｓｔｕｄｏｆｔｈｅＴｕｒｎｉｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ［］，ｐｙｇｇｐｙｐｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｉｎＥａｓｔＡｓｉａｒｅｖｅａｌｓａｎ＾ｍｅｒｇｅｎｆｌｉｎｅａｇｅｉｎＪａｐａｎ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙ，２００６，－１５：４４３７５７．１２７ＯｈｓｈｉｍａＫＴｏｍｉｔａｋａＹＷｏｏｄＪＴＭｉｎｅｍａｔｓｕＹＫａｉａｍａＨＴｏｍｉｍｕｒａＫ扣ａ／．［］，，，，ｊｙ，，．Ｐａｔｅｒｎｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎ如腳則。ｖｉｍｖｅｎｏｍｉｃｓｅｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｈｏｔｓｏｔｓｏｆｇｑｐ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ２００７８８：２９８３１５．ｇｙ，，１２８ＡｄａｍｓＭＪＡｎｔｏｎｉｗＪＦＢｅａｕｄｏｉｎＦ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗａｎｄａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｏｌｒｏｔｅｉｎ［］，，ｙｐｙｐｍ－ｃｌｅａｖａｅｓｉｔｅｓｉｎｔｈｅｆａｉｌｙｏｔｖｉｒｉｄａｅ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏ２００５６：４７１８７．ｇＰｙｇｙ，，Ｉｔｉ－１２９ｄｏＹＮａｋａｈａｒａＫＵｅｄａＩ．Ｗｈｉｅｃｌｏｖｅｒｍｏｓａｃｖ／ｎ／５ｉｎｄｕｃｅｄｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｉｎｅａ．［］，，ｙｇｇｐｕｒｎａ－ＪｏｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏ２０１２７８：１２７３２．ｇｙ，，ａｅｅｒａｒｎｏｆｒｅｖｅｒｓｅｒａｎｓｃａｎ－１３０ＴｚａｎｅｔｋｉｓＩＥＫｌｌＫＥＭｔｉＲＲ．Ｔｈｅｕｓｅｔｒｉｔｓｅｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｔｆｉｒｓｔ［］，，ｐａｎｄ－－－ｔｓｅｃｏｎｄｓｔｒａｎｄｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｆｒｏｍｓｉｎｌｅａｎｄｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｔｅｍｌａｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｇｐ－ｏｆｖｉｒｏｌｏｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ２００５１２４：７３７．ｇ，，ｅｎｅｃｏｍｅｔｅｓｅｏｅｎｏｍｃＲＮＡｏｆ１３１ＣｈｅｎＪＳｈｉＹＨＡｄａｍｓＭＪＣｈＪＰ．Ｔｈｌｕｅｎｃｅｆｔｈｅｉ［］，，，ｐｑｇａｎ－ｉｓｏｌａｔｅｏｆＬｉｌｙｖｉｒｕｓＸｅｎｕｓＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００５１５０：８２５３２．（ｇ）ｇｙ，，［１３２］ＫａｗａｋａｍｉＫ，ＦｕｊｉＳ，ＭｉｙｏｓｈｉＫ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｎｅｗ＂ｉｒｏｍｓｓｉｎｄＬＡｒｃｈ－ＰｈａｉｕｓｖｒｕｓＸｉｓｏｌａｔｅｄｆＰｈａｉｕｆｌａｖｕＬｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００８１５３：５２７３１．＼ｇｙ，，１３３ＫｉｍＪＤＫｏｏＹＢＣｈａｎＭＵ．ＧｅｎｏｍｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａＫｏｒｅａｎｉｓｏｌａｔｅｏｆ［］，，ｇ－ｃｍｂｉｄｉｕｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｎｄｃｅｌｌｓ１９９８８：１８１８．，ｙ，［１３４］ＫｏｍａｔｓｕＫ，ＹａｍａｉＹ？ＯｚｅｋｉＪ，ＨａｓｈｉｍｏｔｏＭ，ＫａｉｗａｄａＳ，ＴａｋａｈａｓｈｉＳ，ｅｔａＬｊｇＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｅｖｅｎＪａｐａｎｅｓｅｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＰｌａｎｔａｇｏａｓｉａｔｉｃａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（Ｐ１ＡＭＶ）：ａｕｎｉｑｕｅｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓｗｉｔｈｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌｈｉｈｅｎｏｍｉｃａｎｄｂｉｏｌｏｉｃａｌｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｇｙｇｇｇｎ－ｗｉｔｈｔｈｅｓｅｃｅｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ：ｉｉｓ．Ａｒｃｈｉ２００８１５３１９３８．ｐｇｙ，，１３５ＹａｍａｉＹＫａｉｗａｄａＳＮａｋａｂａａｓｈｉＨＵａｋｉＭＮａｍｂａＳ．Ｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ［］ｊ，ｇ，ｙ，ｇ，ｐ－ｗｅｅｎｓｅｕｅｎｃｅｏｆＴｕｌｉｖｉｒｕｓＸＴＶＸＪ：ｔｈｅｂｏｒｄｅｒｂｅｔｓｅｃｉｅｓａｎｄｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅｅｎｕｓｑｐ（）ｐｇ１４－Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００１６：２３０９２０．ｇｙ，，１４１ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究１３６ＢａｎｃｒｏｆｔＪＢＲｏｕｌｅａｕＭＪｏｈｎｓｔｏｎＲＰｒｉｎｓＬＭａｃｋｉｅＧＡ．Ｔｈｅｅｎｔｉｒｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ［］，，，，ｓｅｕ－ｅｎｃｅｏｆｏｘｔａｉｌｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＲＮＡ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ１９９１７２：２１７３８１．ｑｆｇｙ，，１３７ＦｕｉＳＳｈｉｎｏｄａＫＦｕｒｕａＨＮａｉｔｏＨＦｕｋｕｍｏｔｏＦ．Ｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆ［］ｊ，，ｙ，，ｐｑＮＶＸ－ＪＮｅｒｉｎｅｖｉｒｕｓＸ（）ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅＡｆｒｉｃａｎｌｉｌｙｌａｎｔＡａａｎｔｈｕｓｃａｍａｎｕｌａｔｕｓ）ｉｎｐ｛ｇｐｐＪａａｎｌｏ２０５－．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｇｙ２００６１５１：８．ｐ，，［１３８］ＣｈｅｎＪ，ＺｈｅｎｇＨＹ，ＣｈｅｎＪＰ，ＡｄａｍｓＭＪ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆａａｎｄａ－ｏｔｅｘｖｉｒｕｓｆｒｏｍＣｈｉｎｅｓｅｓｃａｌｌｉｏｎ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ２００２１４７：６８３９３．ｐ，，［１３９］ＨａｓｈｉｍｏｔｏＭ，ＯｚｅｋｉＪ，ＫｏｍａｔｓｕＫ，ＳｅｎｓｈｕＨ，ＫａｇｉｗａｄａＳ，ＭｏｒｉＴ，ｅｔａＬＣｏｍｐｌｅｔｅｃｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｏｆａｓｐａｒａｇｕｓｖｉｒｕｓ３．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ２００８１５３：２１９２１．ｑ，，Ｌｉｎ－［１４０］ＬｉＲＧａｏＳＨｅｒｎａｎｄｅｚＡＧＷｅｃｈｔｅｒＷＰＦｅｉＺＫＳ．ＤｅｅＳｅｕｅｎｃｉｎｏｆＳｍａｌｌ，，，，，ｇｐｑｇＲＮＡｓｉｎＴｏｍａｔｏｆｏｒＶｉｒｕｓａｎｄＶｉｒｏｉｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＳｔｒａｉｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１２７：ｅ３７１２７．，－ＤｉＨＷ１４１ＤｉｚａｄｉＡＫｏｏｈｉＨａｂｉｂｉＭＩｚａｄａｎａｈＫｅｔｒｉｃｈＣｏｓｓａｈｅｂｉＧｉｎｔｅｒＳ，［］ｊ，，，Ｍｐ５，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆ／ｅｒｔｗｃｅＷｎｗＸａｎｅｗｉｎｆｅｃｔｉｎｌｅｔｔｕｃｅｉｎＩｒａｎ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆ，ｇ２００８５３－ｖｉｒｏｌｏ１：１８６７７５．ｇｙ，，［１４２ＦｕｉＳＳｈｉｎｏｄａＫ，ＩｋｅｄａＭＦｕｒｕａＨＮａｉｔｏＨＦｕｋｕｍｏｔｏＦ．Ｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ］ｊ，，ｙ，，ｐｕ＊ｓｅｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｎｅｗｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓＡｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｖｉｒｕｓＸ＼Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００５ｑｇｙ，，－１５０：２３７７８５．［１４３ＫｏｅｎｉＲＰｌｅｉＣＷＡ，ｓｓＳＢｕｒｅｒｍｅｉｓｔｅｒＷＡｕｓｔＨＳｃｈｉｅｍａｎｎＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ］ｇ，ｊＬｏ，ｇ，，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｏｔｅｘｖｉｒｕｓｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｎｅｒａｉｎｔｈｅｆａｍｉｌｙＣａｃｔａｃｅａｅ．ｐｇＡｒｃｈ－ｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００４１４９：９０３１４．ｇｙ，，［１４４］ＳｉｔＴＬ，ＷｈｉｔｅＫＡ，ＨｏｌｙＳ，ＰａｄｍａｎａｂｈａｎＵ，ＥｗｅｉｄａＭ，ＨｉｅｂｅｒｔＭ，ｅｔａＬＣｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｃｌｏｖｅｒｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＲＮＡ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ１９９０，ｑｙｇｙ，７－１：１９１３２０．１４５ＣｏｔｅＦＰａｒｅＣＭａｅａｕＮＢｏｌｄｕｃＭＬｅｂｌａｎｃＥＢｅｒｅｒｏｎＭＧｅｔａｌＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ［］，，ｊ，，，ｇ，ｓｅｕｅｎｃｅａｎｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｅｗｏｔｅｘｖｉｒｕｓ：ＭａｌｖａＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｑｐｙｇｐ，Ｇｅｎｎ－ｅｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏ２００８８：８３９３．，，［１４６］ＫｏｍａｔｓｕＫ，ＫａｇｉｗａｄａＳ，ＴａｋａｈａｓｈｉＳ５ＭｏｒｉＴ，ＹａｍａｊｉＹ，ＨｉｒａｔａＨ５ｅｔａｌ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓＧｅｎｏｍｉｃＨｅｔｅｒｏｅｎｅｉｔａｎｄＳｍｔｏｍａｔｉｃＶａｒｉａｔｉｏｎｏｆＦｉｖｅＣｌｏｓｅｌＲｅｌａｔｅｄ，ｇｙｙｐｙａｎｅｓｅｒａ－ＪａＳｔｉｎｓｏｆＰｏｔａｔｏＶｉｒｕｓＸ．ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ２００５３１：９９１０５．ｐ，，１４２ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究１４７ＰｏｋｅＦ．Ｈｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ：ｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅａｎｄｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｔｏｏｔｈｅｒ［］ｐｐｑｐｃａｒ－ｌａｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００８１５３：１６１５９．ｇｙ，，１４８ＨａｔａａＴＵｃｈｉｎｏＫＡｒｉｍｏｔｏＲ，ＳｕｄａＮＳａｎｏＴＳｈｉｋａｔａＥｅｔａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒ［］ｙ，，，，，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＨｏｐｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｍｏｎｇｖｉｒｕｓｅｓｃｌｏｓｅｌｙｒｌａｄ－ｅｔｅｔｏｃａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２０００１４５：２５０３２４．ｇｙ，，１４９ＺｈｅｎＨＹＣｈｅｎＪＡｄａｍｓＭＪＣｈｅｎＪＰ．Ｃｏｍｌｅｔｅｎｕｌｔｉｄｕｅｎｃｅａｎｄｆｉｎｉｔｉｅ［］，ｃｅｏｅｓｅａｓｇ，，ｐｑｏｆｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡｏｆＮａｒｃｉｓｓｕｓｃｏｍｍｏｎｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓｅｎｕｓＣａｒｌａｖｉｒｕｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆ（ｇ）２００６－ｖｉｒｏｌｏ１５１：１６６７７２．ｇｙ，，［１５０］ＦｌａｔｋｅｎＳ，ＵｎｇｅｗｉｃｋｅｌｌＶ，ＭｅｎｚｅｌＷ，ＭａｉｓｓＥ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ－ｎｎｅｉｔｉ－ｆｕｌｌｌｅｇｔｈｃＤＮＡｃｌｏｏｏａｔｏｖｒｕｓＭ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００８１５３：１３８５９．ｐｇｙ，，［１５１］ＮａｙｌｏｒＭ，ＲｅｅｖｅｓＪ，ＣｏｏｐｅｒＪＩ，ＥｄｗａｒｄｓＭＬ，ＷａｎｇＨ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｅｎｅ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｖｅｃｏｒｇｇｔｂａｓｅｄｏｎＰｏｐｌａｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ｅｎｕｓＣａｒｌａｖｉｒｕｓ）．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｉｃａｌｇｇｍ－ｅｔｈｏｄｓ２００５１２４：２７３６．，，［１５２ＨｅｎｄｅｒｓｏｎＪＧｉｂｂｓＭＪＥｄｗａｒｄｓＭＬＣｌａｒｋｅＶＡＧａｒｄｎｅｒＫＡＣｏｏｅｒ几Ｐａｒｔｉａｌ］，，，，，ｐｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｐｏｌａｒｍｏｓａｉｃｖｉｍｓＲＮＡｃｏｎｆｉｒｍｓｉｔｓｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓａｃａｒｌａｖｉｒｕｓ．ｐｕｒｎａ－ＪｏｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ１９９２７３：１８８７９０．，，［１５３］ＴａｎＪＨａｒｅｒＳＷｅｉＴＣｌｏｖｅｒＧ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅａｃＷｏｒｏｒｉｃｇ，ｐ，，叩ｖｉｒｕｓａｍｍｂｅｒ－ｎｅｗｅｏｆｔｈｅｅｎｕｓＣａｒｌａｖｉｒｕｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１０１５５：７１２．，ｇｇｙ，，１５４ＯｈｋａｗａＡＹａｍａｄａＭＳａａｍａＨＳｕｉａｍａＮＯｋｕｄａＳＮａｔｓｕａｋｉＴ．Ｃｏｍｌｅｔｅ［］，，ｙ，ｇｙ，，ｐｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａＪａｐａｎｅｓｅｉｓｏｌａｔｅｏｆＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｖｉｒｕｓＢ（ｇｅｎｕｓＣａｒｌａｖｉｒｕｓ）．ｒｃｈｉｖｅｓｆ－Ａｏｖｉｒｏｌｏ２００７１５２：２２５３８．ｇｙ，，［１５５］ＬｅｅＢＹ，ＭｉｎＢＥ，ＨａＪＨ，ＬｅｅＭＹ，ＰａｅｋＫＨ，ＲｙｕＫＨ．Ｇｅｎｏｍｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｕｅｎｃｅｆｏｆ－ｏｅｎｏｍｉｃＲＮＡＤａｐｈｎｅｖｉｒｕｓ５．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００６１５１：１９３２００．ｑ，ｇｇｙ１５６Ｋ．Ｃ．ＥａｓｔｗｅｌｌＬＪｄＴａｎｄＫ．Ｌ．Ｄｒｕｆｆｅｌ．ＨｅｌｌｅｂｏｒｕｓｎｅｔｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓＡＮｅｗ［］：，５ｓＣａｒ－ｌａｖｉｒｕｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＢｌａｃｋＤｅａｔｈｏｆＨｅｌｌｅｂｏｒｕｓｓ．．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ２００９９３：３３２８．ｐｐ，，１５７ＳｃｏｔｔＳＷＺｉｍｍｅｒｍａｎＭＴ．Ｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｌｉｕｓｔｒｕｍｎｅｃｒｏｔｉｃｒｉｎｓｏｔ［］，ｐｇｇｐｖ－ｉｒｕｓａｎｏｖｅｌｃａｒｌａｖｉｒｕｓｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００：．Ａ８１５３３９３６．，，，ｇｙ［１５８ＬｉｎＹＨＤｒｕｆｆｅｌＫＬＷｈｉｔｗｏｒｔｈＪＰａｖｅｋＭＪ，ＰａｕＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ］，，，ｐｐ－ｏ－ｔｗｏｐｔａｔｏｖｉｒｕｓＳｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｌａｔｅｂｌｉｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｐｏｔａｔｏＳｏｌａｒｉｕｍ｛－ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ，２００９１５４：１８６１３．ｇｙ，１４３ 广西大学博士学位论文中国灌山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究１５９ＷｌｉｅＳＬｕｏＨＬｉＨＪｏｎｅｓＭＫ．ＭｕｌｔｉｌｅｏｌａｄｅｎｌａｔｅｄＲＮＡｖｉｒｕｓｅｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ［］ｙ，，，ｐｐｙｙ－ｏｏｌｅｄｃｕｌｔｉｖａｔｅｄａｎｄｗｉｌｄｌａｎｔｓａｍｌｅｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１２１５７：２７１８４．ｐｐｐｇｙ，，１６０ＥａｓｔｗｅｌｌＫＤｒｕｆｆｅｌＫ．ＣｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｏｒａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｍｅｒｉｃａｎｈｏｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓａｎｄ［］，ｐｇｇｐＡ－ｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｔｏｃａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓ．ｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１２１５７：１４０３６．ｐｇｙ，，１６１ＺｈｅｎＨＹＣｈｅｎＪＺｈａｏＭＦＬｉｎＬＣｈｅｎＪＰＡｎｔｏｎｉｗＪＦｅｔａＬＯｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄ［］ｇ，，，，，，ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＬｉｌｙｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓａｎｄＬｉｌｙｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓｖｉｍｓｉｎｐｌａｎｔｓｇｒｏｗｎｆｒｏｍｉｍｐｏｒｔｅｄＡｒｃｈ－ｂｕｌｂｓｉｎＺｈｅｉａｎｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．ｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００３１４８：２４１９２８．ｊｇ，ｐ，ｇｙ，［１６２］ＤｉｎｅｓｅｎＭ，ＬｕｎｄｍａｒｋＭ，ＡｌｂｒｅｃｈｔｓｅｎＭ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｉｓｏｌａｔｅｓ－ｏｆＫａｌａｎｃｈｏｅｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００９１５４：１１７３５．ｇｙ，，１６３ＳｉｅｅｌＳＺｅｉｄａｎＭＳｏｂｏｌｅｖＩＢｅｃｋｅｌｍａｎＹＨｏｌｄｅｎｒｅｂｅｒＶ，ＴａｍＹｅｔａＬＴｈｅ［］ｐｇ，，，，ｇ，ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＰａｓｓｉｆｌｏｒａｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｔｏｏｅｒ－ｔｈｃａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ２００７１５２：１８１９．，，１６４ＬａｒｓｅｎＲＷａｔｔＳＤｒｕｆｆｅｌＫ．Ｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅａｎｄｅｎｏｍｅ［］，ｙ，ｐｑｇｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｅｄｃｌｏｖｅｒｖｅｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ｇｅｎｕｓＣａｒｌａｖｉｒｕｓ）．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００９，－１５４：８９１４．［１６５］ＭｅｎｚｅｌＷ，ＷｉｎｔｅｒＳ，ＶｅｔｔｅｎＨＪ．ＣｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｔｙｐｅｉｓｏｌａｔｅｏｆＣｏｗｅａ－ｍｉｌｄｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓｆｒｏｍＧｈａｎａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１０１５５：２０６９７３．ｐｇｙ，，１６６ＫｒａｕｓＪＴｚａｎｅｔａｋｉｓＩＥＰｕｔｎａｍＭＬＭａｒｔｉｎＲＲ．Ｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆａｎ［］，，，ｐｑ－ｉｓｏｌａｔｅｏｆｃｏｌｅｕｓｖｅｉｎｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓｆｒｏｍｖｅｒｂｅｎａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００８１５３：３８１４．ｇｙ，，［１６７］ＮｉｅＸ，ＢａｉＹ，ＭｏｌｅｎＴＡ，ＤｅｓｊａｒｄｉｎｓＤＣ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｅｅｃｏｎｏｏｔａｏｃａ－ｄｔｔｉｆｔｒｌａｖｉｒｕｓｅｓｂｙＲＴＰＣＲ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ２００８ｐ，，１４９－：２０９１６．１６８ＣｈｅｎＪＡｄａｍｓＭＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆａｃｏｍｌｅｘｍｉｘｔｕｒｅｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎ［］，ｐｍｍｎａ－ａｒｌｉｃｗｉｔｈｍｏｓａｉｃｓｔｏｓ：ｇｙｐｉｎＣｈｉ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ２００１１４６１８４１５３．，，１６９ＫｅｎｏｎＬＬｅｂａｓＢＳＭＳｅａｌＳＥ．Ｙａｍｓｓ．）ｆｒｏｍｔｈｅＳｏｕｔｈＰａｃｉｆｉｃＩｓｌａｎｄｓ［］ｙ，，ｐｐｃｏｎｔａｉｎｍａｎｙｎｏｖｅｌｂａｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ：ｉｍｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｍｏｖｅｍｅｎｔｏｆｙａｍｅｒｍｌａｓｍ．ｐｇｐｒｃｈ－Ａｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２００８１５３：８７７８９．ｇｙ，，［１７０］ＦｕｊｉＳ，ＮａｋａｍａｅＨ．ＣｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡｏｆａＪａｐａｎｅｓｅＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆ－ｉｃｖｉｒｕｓａｎｅｗｏｔｙｖｉｒｕｓｉｎＪａａｎｖｉｒｏｌｏ：ａｍｍｏｓａ．１９９９１４４２３１４０．，ｙ＾ｐｐｇｙ，１４４ 广西大学博士学位论文中国液山苗病毒病调紊诊断和病康病毒分子生物学的研究、１７１ＦｕｉＳ，ＮａｋａｍａｅＨ．ＣｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｅｎｏｍｉｃＲＮＡｏｆａｍｉｌｄｓｔｒａｉｎ［］ｊｐｑｇｔ－ｏｉＪａｐａｎｅｓｅａｍｍｏｓａｉｃｏｖｉｒｕｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２０００１４５：６３５４０．ｙｙ，，ｐｇｙ１７２ＫｏｎｄｏＴＦｕｉｔａＴ．Ｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ［］，ｊｐｃｌｏｎｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅｙａｍｎｅｃｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｍａｃｌｕｒａｖｉｒａｓｅｓｈａｖｅｔｈｅｓｍａｌｌｅｓｔｎｏｍｍｅｍｂｅｒｓｆ－ｅｅａｍｏｎｏｔｈｅｆａｍｉｌＰｏｔｙｖｉｒｉｄａｅｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｒｏｌｏ：ｇ．Ａｉ１９．ｇｙｇｙＦｏｅｎｄｅｄｒ－Ｇｄｉｏｒｏａａ．ｈｅｃｏｍｌｅ１７３ｉｌｈＦｄＮｉｃｏｌｉｎｉＣＲｅｓＲＡｎｄａｄｅＰＲｉｂｅｉＧＮａｔＴＴｔｅ［］，，，，，ｇｐｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆａＢｒａｚｉｌｉａｎｉｓｏｌａｔｅｏｆｙａｍｍｉｌｄｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１３，ｇｑ－１５８：５１５８．１７４ＺｏｕＣＭｅｎＪＬｉＺＷｅｉＭＳｏｎＪＣｈｅｎＢｅｔａｌＦｉｒｓｔｒｅｏｒｔｏｆＹａｍｍｉｌｄｍｏｓａｉｃ［］，ｇ，，，ｇ，，ｐｖ－ｉｒｕｓｉｎａｍｉｎＧｕａｎｘｉｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ２０１１９５：１３２０．ｙｇｐ，，，１７５ＫｉｎＡＭＡｄａｍｓＭＪＬｅｆｋｏｗｉｔｚＥＪＣａｒｓｔｅｎｓＥＢ．Ｖｉｒｕｓｔａｘｏｎｏｍｙ：ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ［］ｇ，，，ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆｖｉｒｕｓｅｓＮｉｎｔｈＲｅｏｒｔｏｆｔｈｅＩｎｔｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｅｅｏｎＴａｘｏｎｏｍｏｆ：ｐｅｙＶｉｒｕｓｅｓ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ２０１２．，Ｈｅａｒｏｎ－１７６ＬａｗｓｏｎＲＳＳｍｉｔｈＦ，ＫａｈｎＲ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏａｎｄｓｅａｒａｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓ［］，，ｐｙｐｎｄ－ｉｏｓｃｏｏｒｉｂｕｎｄａｈｏａｏｌｏ：ｅｒｈｏａｔｈｏｌｏｃａｏｔＫｎｏｂｉｒｅａｆｌ．ＰｙｔｐｔｈｇｙＡｍｐｙｔｐｇｉｌＳＯＣ３３４０ＰｉｌＲｏａｄＳ１－ｔａｕｌＭＮ５５１２１９７３１４３５．，ｐ，，，［１７７］ＭｏｈａｍｅｄＮ，ＭａｎｔｅｌｌＳ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｖｉｒｕｓｓｙｍｐｔｏｍｓｉｎｙａｍ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｓｐｐ．）ｆｏｌｉａｇｅｉｎｔｈｅＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈＣａｒｉｂｂｅａｎ．ＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ１９７６．，ｅａｒｏｎＳｏｒｂｅＭａｗｓｏｎＲＧ－１７８ＨＣｔｔＬｉｌｌａｓｉｅＪｒＡＷａｔｅｒｗｏｒｔｈＨ．Ｔｗｏｆｌｅｘｕｏｕｓｒｏｄ［］，，，ｐ，ｖｉｒｕｓｅｓｉｎＤｉｏｓｃｏｒｅａｏｒｉｂｕｎｄａ：Ｓｙｍｐｔｏｍｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｐｈｔｏａｔｈｏｌｏｆｌ，，ｙｐｇｙ，１９７８，６８．１７９ＣｌａｒｋＭ．Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｓｉｎｌａｎｔａｔｈｏｌｏｇ．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈｔｏａｔｈｏｌｏ［］ｙｐｐｙｙｐｇｙ，－１９８１１９８３１０６．：，１８０ＦｕｉＳＮａｋａｍａｅＨ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＪａａｎｅｓｅａｍＤｉｏｓｃｏｒｅａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｂＩＳＡａｎｄ［］ｊ，ｐｙｙＥＬ－ａＲＴＰＣＲ．ＡｎｎｌｓｏｆｔｈｅＰｈｔｏａｔｈｏｌｏｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｏｆＪａａｎ１９９９．ｙｐｇｙｐ，１８１ＣｏｂｂＢＤＣｌａｒｋｓｏｎＪＭ．Ａｓｉｍｌｅｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｏｔｉｍｉｓｉｎｔｈｅｏｌｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ［］，ｐｐｐｇｐｙｕ－ｒｅａｃｔｉｏｎＰＣＲｓｉｎｍｏｄｉｆｉｅｄＴａｕｃｈｉｍｅｔｈｏｄｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９９４２２：３８０１５．（）ｇｇ，，１８２］ＰａｕＳＢｒａｎｄＲＰａＨＲｂｉｃｋｉＥＧｏｕｈＫＨＦｒｅｎｋｅｌＭＪｅｔａｌ．Ａｏｌｅｒａｓｅ［ｐｐ，，ｐｐｕ，ｙ，ｇ，，ｐｙｍｍ＇ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｅｔｈｏｄａｄａｐｔｅｄｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｌｏｎｉｎｇｏｆ３ｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆｑ１４５ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的所究ｏｔｖｉｒａｌｅｎｏｍｅｓ：ａｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｄａｓｈｅｅｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ１９９３ｐｙｇｐｐ，，－４１：９２０．ｄＳＡｒｅＪ－ｅ１８３ＬａｎｅｖｅｌＤｏＭＭｅｍｌｉｎｋＪＤｅｒｋｓＡ，ＶａｎｄｅｒＶｌｕｔＣＡｓｅｓＣＪｅｔａＬ［］ｇ，，，，，ｇｊＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｔｖｉｒｕｓｅｓｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒｓ．ｐｙ－ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｅｎｅｒａｌｖｉｒｏｌｏ１９９１７２：１５３１４１．ｇｇｙ，，１４６ 广西大学博士学位论文中国谁山苗病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的研究附录附录１本论文所用术语缩写及全称对应表缩写英文全称中文全称ｂｐｂａｓｅｐａｉｒ碱基对ＢＳＡＢｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ小牛血清白蛋白ｃＤＮＡｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ互补ＤＮＡＣｌｃｌｉｎｄｒｉｃａｌｒｏｔｅｉｎ圆柱状内含体ｙｐＣＰｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ外壳蛋白ｃｖ．Ｃｕｌｔｉｖａｒｓ栽培种ＣＶＣｃｌａｒｉｆｉｅｄｖｉｒａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ澄清病毒浓缩液ＣＹＳｃｎｅｒｚｎｃ－－ｙｓｔｅｉｉｃｈｉｆｉｎｇｅｒｌｉｋｅＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇ富含半胱氨酸的锌指状ＲＮＡ结合结ｄｏｍａｉｎ构域ｄｄａｙ天ＤＮＡＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ脱氧核糖核酸ｔ－Ｓ－ＤｏＥＬＩＡＤｏｔｅｎｚｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａ斑点酶联免疫吸附测定ｙｙｄ－ｓＲＮＡＤｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ双链ＲＮＡＥＬＩＳＡＥ－ｌｎｚｍｅｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａ酶联免疫吸附测定ｙｙｈｈｏｕｒ小时－ＨＣ－Ｐｒｅｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｏｈｅｌｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ辅助成分蛋白酶ｐＨＲＰＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄｅ辣根过氧化物－－ＩＣＰＣＲＩｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ免疫捕获聚合酶链式反应－－ｕ－ｎＩＣＲＴＰＣＲＩｎｕｎｕｎｏｃａｐｔｒｅＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ免疫捕获反转录聚合酶链式反应ｐｏｌｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｙ－－－－－－－ＩＰＴＧｉｓｏｒｏｌＤ１ｔｈｉｏａｌａｃｔｏｒａｎｏｓｉｄｅ异丙基Ｄ１硫代半乳糖苷ｐｐｙＰｇｐｙＰＩＳＥＭＩｍｍｕｎｏＳｐｅｃｉａｌＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＭｉｃｒｏｓｃｏｅ免疫电镜ｐＫｂｋｉｌｏｂａｓｅ千碱基对ｍｉｎｍｉｎｕｔｅｓ分钟ｅｒｍＲＮＡＭｅｓｓｅｎｇＲＮＡ信使ＲＮＡＮＣｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ阴性对照—ＮＧＳＮｅｘｔｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｕｅｎｃｉｎ新代测序ｇｑｇ’‘ＮＩａＮｕｃｌｅａｒＩｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙａｒｏｔｅｉｎ核内含体蛋白ａｐ１４７ 广西大学博士学位论文中国灌山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究缩写英文全称中文全称‘’ＮｉｂＮｕｃｌｅａｒＩｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｂｐｒｏｔｅｉｎ核内含体蛋白ｂｎｔＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ核苷酸ＮＴＣＮｏｔｅｍｐｌａｔｅｃｏｎｔｒｏｌ无模板对照ＯＲＦｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ开放阅读框Ｐ一Ｉｆｉｒｓｔｒｏｔｅｉｎ第蛋白ｐＰ３ｔｈｉｒｄｒｏｔｅｉｎ第三蛋白ｐＰＢＳＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ憐酸盐缓冲液ＰＣｐｏｓｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ阳性对照ＰＣＲＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ聚合酶链式反应ＰＩＰＯｒｅｔｔｙｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇｏｔｉｒａｓＯＲＦ有趣的马铃薯Ｙ病毒属病毒的ＯＲＦｐｐｙｖＰＲａｓｐａｒｔｉｃｒｏｔｅａｓｅ天冬氨酸蛋白酶ｐＰＶＤＦＰｏｌｖｉｎｌｉｄｅｎｅＤｉｆｌｕｏｒｉｄｅｍｅｍｂｒａｎｅ聚偏氣乙稀膜ｙｙＰＶＰＰＣｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇｐｏｌｙｖｉｎｇｙｐｙｒｔｏｌｉｄｏｎｅ交联聚乙稀比略焼酮ＲＡＣＥＲａｐｉｄＡｎｐｌＵｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄｓｃＤＮＡ扩增ｄＲＲＮＡ－ｄＲｅｅｎｄｅｎｔＲＮＡｏｌｒａｓｅ依赖ＲＮＡ的ＲＮＡｐｐｐｙｍｅ于聚合酶ＲＦＬＰＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ限制性片段长度多态性ＲＨＲＮａｓｅＨＲＮＡ酶ＨＲＮＡＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ核糖核酸－ＲＮＡＲＮＡＳｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎＲＮＡ测序ｑｇｒｐｍｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓｅｒｍｉｎｕｔｅ每分钟转速ｐｒＲＮＡｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ核糖体ＲＮＡＲＴｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ逆转录酶－ＰＣＲｒｅｖｅｒｓｅＰＣＲＲＴｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＰＣＲ反转录ＳＤＳ－ＰＡＧＥｓｏｄ二－ｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｏｌａｃｒｌａｍｉｄｅｅｌ十院基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳ｐｙｙｇｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓｐＳｅｃｓｅｃｏｎｄ秒ＲＮＡＳｉｎ－ｓｓｌｅＳｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ单链ＲＮＡｇＴＧＢＴｒｉ－ｐｌｅｅｎｅｂｌｏｃｋ三联基因块ｇＵＴＲＵｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ非翻译区ＶＰｖｒ－ｎｋｒｉａｌｅｎｏｍｅｌｉｅｄｏｔｅｉｎ病毒基因组连接蛋白ｇｇｐ一６Ｋ１ｔｈｅｆｉｒｓｔ６Ｋｒｏｔｅｉｎ第个６Ｋ白ｐ蛋６Ｋ２ｔｈｅｓｅｃｏｎｄ６Ｋｐｒｏｔｅｉｎ第二个６Ｋ蛋白１４８ 广西大举博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究附录２本论文所用病毒缩写及全称对应表缩写英文全称中文全称ＡＨＬＶＡｍｅｒｉｃａｎｈｏｐｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ美国啤酒花潜隐病毒ＡｌｓＶＸＡｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｖｉｒｕｓｘ六出花Ｘ病毒ａｒａｕｓｉＡＶ３Ａｓｐｇｖｒｕｓ３芦努病毒３ＢＣＴＩＶＢｅｅｔｃｕｒｌｙｔｏｐＩｒａｎｖｉｒｕｓ伊朗甜菜曲顶病毒ＢＣＴＶＢｅｅｔｃｕｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ甜菜曲顶病毒ＢＧＹＭＶＢｅａｎｏｌｄｅｎｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ菜豆金色花叶病毒ｇｙＣＢＳＶＣａｓｓａｖａｂｒｏｗｎｓｔｒｅａｋｖｉｒｕｓ木薯褐色条纹病毒ＣＭＶＸＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍｍｏｓａｉｃｖｉｍｓＸ黎花叶病毒ＸＣＰＭＭＶＣｏｗｐｅａｍｉｌｄｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓＩｔ豆轻斑驳病毒ＣＳＳＶＣｏｃｏａｓｗｏｌｌｅｎｓｈｏｏｔｖｉｒｕｓ可可肿枝病毒ＣＶＢＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｖｉｒｕｓＢ菊花Ｂ病毒ＣＶＮＶＣｏ／ｅｗ＾ｖｅ刼銷蕊花脉坏死病毒ＣｙｍＭＶＣｙｍｂｉｄｉｕｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ建兰花叶病毒ＣＹＭＶＣｌｏｖｅｒｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ三ｙ叶草黄花叶病毒ＣＹＮＭＶＣｈｉｎｅｓｅａｍｎｅｃｒｏｔｉｃｍｏｓａｉｃｖｉｍｓ中国淮山药坏死花叶病毒ｙＣＹＶＭＶＣｒｏｔｏｎｅｌｌｏｗｖｅｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ巴豆黄脉花叶病毒ｙＤＢＶＤｉｏｓｃｏｒｅａｂａｃｉｌｌｉｆｒｏｍｖｉｒｕｓ薯菌杆状病毒ＤａＢＶＤｉｏｓｃｏｒｅａａｌａｔａｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ参薯杆状病毒ＤＡＲＭＶＤ．ａｌａｔａｒｉｎｇｍｏｔｔｌｅｖｉｍｓ参薯环斑病毒ＤＤＶＤ．ｄｕｍｅｔｏｒｕｍｐｏｔｙｖｉｒｕｓ灌丛薯領病毒ＤＧＢＭＶＤｉｏｓｃｏｒｅａｒｅｅｎ－ｂａｎｄｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｍｓ著蓣绿带花叶病毒ｇｇＤＧＢＶＤｉｏｓｃｏｒｅａｒｅｅｎ－ｂａｎｄｉｎｇｖｉｒｕｓ暮截绿带病毒ｇＤＬＶＤｉｏｓｃｏｒｅａｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ薯蓣潜隐病毒ＤＭｏＶＤｉｏｓｃｏｒｅａｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ薯蓣斑驳病毒ＤＴＶＤ．ｔｒｉｆｉｄａｐｏｔｙｖｉｒｕｓ三裂叶薯領病毒ｅＤＶＳＤａｐｈｎｖｉｒｕｓＳ瑞香Ｓ病毒ＥＣＳＶＥｒａｇｒｏｓｔｉｓｃｕｒｖｕｌａｓｔｒｅａｋｖｉｍｓ弯叶画眉草条纹病毒１４９ 广西大学博士学位论文中国淮山箱病毒病调查诊断和病康病毒分子生物学的研究、缩写英文全称中文全称ＦＭＶＦｏｘｔａｉｌｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ狐尾草花叶病毒ＧＣＬＶＧａｒｌｉｃｃｏｍｍｏｎｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ大蒜普通潜隐病毒ＧＬＶＧａｒｌｉｃｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ大蒜潜隐病毒ＨｄＣＭＶＨｙｄｒａｎｇｅａｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ绣球花褪绿斑驳病毒ＨｅＮＮＶＨｅｌｌｅｂｏｒｕｓｎｅｔｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ铁疾子属网坏死病毒ＨｐＬＶＨｏｐｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ酒花潜隐病毒ＨｐＭＶＨｏｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ酒花花叶病毒ＩＢＳＶＩｎｔｅｒｎａｌｂｒｏｗｎｓｐｏｔｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ内部褐白斑杆状病毒ＪＹＭＶＪａａｎｅｓｅａｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｐｙ日本淮山药花叶病毒ＫＬＶＫａｌａｎｃｈｏｅｌａｔｅｎｔｖｉｍｓ高凉菜潜隐病毒ＬｅＶＸＬｅｔｔｕｃｅｖｉｒｕｓＸ生菜Ｘ病毒ＬＮＲＳＶｌｉｇｕｓｔｒｕｍｎｅｃｒｏｔｉｃｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ女贞属坏死环斑病毒ＬＳＶＬｉｌｙｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓｖｉｒｕｓ百合无症病毒ＬＶＸＬｉｌｙｖｉｍｓＸ百合Ｘ病毒ＭａＭＶＭａｌｖａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ锦葵花叶病毒ＭａＹＳＶＭａｃｒｏｐｔｉｌｉｕｍｙｅｌｌｏｗｓｐｏｔｖｉｒｕｓ大翼豆黄斑病毒ＭＳＶＭａｉｚｅｓｔｒｅａｋｖｉｒｕｓ玉米条纹病毒ＭＶＸＭｉｎｔｖｉｒｕｓＸ薄荷Ｘ病毒ＮＣＬＶＮａｒｃｉｓｓｕｓｃｏｍｍｏｎｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ水仙普通潜隐病毒ｒｉｎｅｖｉｒｕｓＮＶＸＮｅＸ尼润属Ｘ病毒ＯＶＸＯｐｕｎｔｉａｖｉｒｕｓＸ仙人掌Ｘ病毒ＰｅｐＭＶＰｅｐｉｎｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ凤果花叶病毒ＰｈａＶＸＰｈａｉｕｓｖｉｒｕｓＸ鹤顶兰Ｘ病毒Ｐ１ＡＭＶＰｌａｎｔａｇｏａｓｉａｔｉｃａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ车前草花叶病毒ＰＬＶＰａｓｓｉｆｌｏｒａｌａｔｅｎｔｃａｒｌａｖｉｒｕｓ西番莲潜隐病毒ＰｏｐＭＶＰｏｐｌａｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ杨树花叶病毒ＰｏｔＬＶＰｏｔａｔｏｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ马铃薯潜隐病毒ｒｕｓｅｖｅｒｅＰＳＬＤＶＰａｓｓｉｏｎｆｉｔｌｅａｆｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｖｉｒｕｓ百香果严重畸叶病毒１５０ 广西大学博士学位论文中国乘山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究缩写英文全称中文全称ＰＶＭＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＭ马铃薯Ｍ病毒ＰＶＳＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＳ马铃薯Ｓ病毒ＰＶＸＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ马铃薯Ｘ病毒ＰＹＭＶＰｏｔａｔｏｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｙＲａＭｏＶＲａｍｉｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ芒麻花叶病毒ＲＣＶＭＶＲｅｄｃｌｏｖｅｒｉｉｉｒｕｓ红三ｖｅｎｍｏｓａｃｖ叶草脉花叶病毒ＳｃａＶＸＳｃａｌｌｉｏｎｖｉｒｕｓＸ葱油Ｘ病毒ＳＬＶＳｈａｌｌｏｔｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ葱潜隐病毒ＳＰＣＳＶＳｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｃｈｌｏｒｏｔｉｃｓｔｕｎｔｖｉｒｕｓ甘薯褪绿矮病毒ＳＰＦＭＶＳｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｅａｔｈｅｒｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ甘薯羽状斑驳病毒ｆｙｍＳＶＸＳｃｈｌｕｍｈｅｒｇｅｒａｖｉｒｕｓＸ树栖仙人掌Ｘ病毒ＴＡＶＴｏｍａｔｏａｓｐｅｒｍｙｖｉｒｕｓ番前不孕病毒ＴＣＴＶＴｕｒｎｉｐｃｕｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ萝卜曲顶病毒ＴＧＷＴｏｍａｔｏｇｏｌｄｅｎｖｅｉｎｖｉｒｕｓ番煎金脉病毒ＴｏＩＣＶＴｏｍａｔｏｉｎｔｅｒｖｅｉｎａｌｃｈｌｏｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ番葙脉间褪绿病毒ｍａｏｓｅｕｄｏ－ｃｕｒＴＰＣＴＶＴｏｔｌｔｏｖｉｒｕｓ番煎曲顶病毒ｐｙｐＴＶＸＴｕｌｉｐｖｉｒｕｓＸ郁金香Ｘ病毒ＷＣ１ＭＶＷｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ白三叶花叶病毒ｉｉｒＷＴＭＶＷｉｌｄｔｏｍａｔｏｍｏｓａｃｖｕｓ野生番前花叶病毒ＹＬＶＹａｍｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ淮山药潜隐病毒ＹＭＭＶＹａｍｍｉｌｄｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ淮山药温和花叶病毒ＹＭＶｙａｍｍｏｙａｆｅｖ／ｍｙ淮山药花叶病毒ＹＶ－ＮＮｅｒｉａｎａｍｏｉｃｖｉｒ山药花叶病毒ｉｇｍｓａｕｓ尼日利亚淮ｙＹＶＸＹａｍｖｉｒｕｓＸ淮山药Ｘ病毒ＹＹＳＭＶＹａｍｅｌｌｏｗｖｅｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｍｓ淮山药黄斑花叶病毒ｙＺＶＸＺｙｇｏｃａｃｔｕｓｖｉｒｕｓＸ蟹爪兰Ｘ病毒１５１ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究附录３本论文所用物种拉丁名与中文学名对应表拉丁名中文学名ＡｐｈｉｓｃｒａｃｃｉｖｏｒａＫｏｃｈ．Ａｐｈｉｓｆａｂａｅ豆卫矛蜂ＡｍａｒａｎｔｈｕｓｒｅｔｒｏｆｌｅｘｕｓＬ．反枝宽ＡｍａｒａｎｔｈｕｓｖｉｒｉｄｉｓＬ．皱果觅Ａｐｈｉｓｇｏｓｓｙｐｉｉ棉姆Ｃｅｌｏｓｉａａｒｇｅｎｔｅａ菁葙Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ览色藜ＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍｕｉｎｏａＷｉｌｌＡ黎麦ｑＣｒｏｔａｌａｒｉａｓｔｒｉａｔａ圆叶猪屎显ＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬ．黄瓜ａｌａｔａ．ＤｉｏｓｃｏｒｅａＬｉｎｎ．参薯ｉｏｓｃｏｒｅａＤ．Ｄｂａｔａｔａｓｅｅｎｅ长薯蓣ＤｉｏｓｃｏｒｅａｂｕｌｂｉｆｅｒａＬ．黄独ＤｉｏｓｃｏｒｅａｃａｙｅｎｅｎｓｉｓＬａｍ．几内亚薯蓣Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｏｍｐｏｓｉｔａ墨西哥菊叶薯蕷ＤｉｏｓｃｏｒｅａｄｕｍｅｔｏｒｕｍＰａｘ．灌丛薯蓣ＤｉｏｓｃｏｒｅａｅｓｃｕｌｅｎｔａＬｏｕｒ．甜墓ＤｉｏｓｃｏｒｅａＪｌｏｒｉｂｕｎｄａ多花薯蓣ＤｉｏｓｃｏｒｅａｈｉｓｐｉｄａＤｅｎｎｓｔ．白薯莫ＤｉｏｓｃｏｒｅａｊａｐｏｎｉｃａＴｈｕｎｂ．日本薯菌ＤｉｏｓｃｏｒｅａｏｐｐｏｓｉｔａＴｈｕｎｂ．普通山药Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｅｎｔａｈｌｌａ五叶薯蓣ｐｐｙＤｉｏｓｃｏｒｅａｅｒｓｉｍｉｌｉｓＰｒａｉｎ．ｐ褐袍薯蓣Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｒｅｕｓｓｉｉ普氏薯蕷ｐＤｉｏｓｃｏｒｅａｒｏｔｕｎｄａｔａＰｏｉｒ．白薯蕷ＤｉｏｓｃｏｒｅａｔｒｉｆｉｄａＬ．三裂叶薯蕷Ｄｉｇｉｔａｒｉａｓａｎｇｕｉｎａｌｉｓ（Ｌ．）Ｓｃｏｐ．马唐１５２ 广西大学博士学位论文中国淮山箱病毒病调查诊断和病康病毒分子生物学的研究、拉丁名中文学名Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｓｐｐ．淮山药ＥｌｅｕｓｉｎｅｉｎｄｉｃａＬ．Ｇａｅｒｔｎ．牛筋草（）一ＦｌｅａｓｕｒｕｉＰ．ｕｇｌｌ．Ｂｉｌｌｇｆｔｃｏｓａ（ａ）ａ叶荻Ｇｏｍｐｈｒｅｎａｇｌｏｂｏｓａ０ＳｉＭｙｚｕｓｅｒｓｉｃａｅ桃姆ｐＮｉｃｏｔｉａｎａｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ兰烟ＮｉｃｏｔｉａｎａｌｕｔｉｎｏｓａＬ．粘毛烟草ｇＮｉｃｏｔｉａｎａｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ麦格隆息丰烟草Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ美花烟草Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ普通烟草ＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａＬ．本氏烟草ＯｘａｌｉｓｃｏｒｙｍｂｏｓａＤＣ．红花醉衆草Ｐｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ菜豆ＰｉｌｅａｍｉｃｒｏｐｈｌｌａＬ．）Ｌｉｅｂｍ．小叶冷水花ｙ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ豌豆Ｐ＊ｌａｎｏｃｏｃｃｕｓｃｉｔｒｉＲｉｓｓｏ柑橘粉阶Ｒｈｏａｌｏｓｉｈｕｍｍａｉｄｉｓｐｐ玉米姆Ｔｉｎａｎｔｉａｅｒｅｃｔａ硬筵鸭妬草Ｔｏｘｏｐｔｅｒａｃｉｔｒｉｃｉｄｕｓ橘既Ｖｉｄａａｂａ蚕豆ｆＶｉｇｎａｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ５ＬＳ１５３ 广西大学博士学位论文中国淮山药病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究附录４ＹＹＳＭＶ－ＦＸ１的基因组序列ａｃｃｇｇａｔｇｇｇｃｇｃｃｇｃｃｔｇｇｇｔｇｔｔｇｔｃｃａｔｇｔｇｇｃａａｇａｔｃｃｔｔａｃｃｃｔｃｃａｔｔｔｇａａｔｔａａａｇｇｔｃｃｃａｃｃｃｔｔｃｇｔｔｇｇｔｇａｃｃｃｇｇａｔｔｃｔｔｔｔｔｃｇｔｃｔｔｃｃｃｃｔａｔｃｔｔａｔｔｔａｃｃａｔｔｃｔｔａａｔａａｔａｔｃｔｃｃｃａｃｃａｔｔａｃｔｔａｔｔｔｔｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇａｇｔｔｇｔａｔｇｔａｇｔａｃａｔａｔｃａｔａｔｃａｇｃｇｔａａｃａｇｔｔｇｔｃｇｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｇｔｇｔｇａｔｇａｃｃａｔｃｃｃａａｃｃｃｇａｔｇｔｃｇｇａｔｇｔｇｇｔｇａｇａｔｇａｃｇａｃｃａｃｇａｔａｃｔｔｇｔａｔａｇａｃｇａｔｇｇａｔｇｔｇｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇａｃｃｔａｇａｔｔｔａｃａｔｇｔｇｔａｇａｃａａｃｇｃｇｇｔｇｔｇａｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｃｔｇａｔｃｔａａａｇａａａｇｃｔｔｔｇｃｇｇｔｃｇｇｔｇｇｔｔｇｔｇｔｔｔｔｇａｇｇｃｔｃａｇａｔａａａａｔｇａａｔａａｃａａｃｇｇｔｇｃａａｔａａａａｔｇａａａａｔａｇｔｇｔａａａａｔｇｇｔａｃｔａｔｔａｔａａｔａａｔａｔｔａｔａａｔａｔａａａａａａｔｔｔｔｔａａｔａａｔｔｔｃｃａｔａｃｔｃｃａｔａｃａｃａｔａａｃｃａｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇａｔｔａａａｃａｔｃｔｔａｔａａｔｔａｔａｔｃｔｔｔｃｃａｔｔａｔｇｇａａｔａｔａｃｔａｔｃｔａｔａａａａｔａｔａａｔａｔｔｔａｔａａａｃａｔｔｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｔａｃｇｔａｔｇａｃｔａｔｔａａａａｔｔｃａｔａａｃｔａｔａｔｔｔｃｔｇｔｔｔｔｔｔｔａａｔａｔａｃｔａａａａａａａａｃａｃａｃｔａｔａａｔｃａａａｃａｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｃｔａｔｔｃａｔｔａｃａｔｃａｃａｔｇａａｇｔａｇｔｇｔａｃｇｔｃａａａｔｇｇａａｃｃｔｃｔｇｔｔｔｔａｔｔｔａｇｃａａｇａｇａｔｔｇｇａｇｔａｔｔｔｃｔａｇａｇａａｃａｇｇｔｇｇｇｔａｔｔｔｔａａａａｔａｔｔｃｇａｔｃａｔｔａｃｃｔｔｔｔａａｔｔａｃａａａａｔｔｔｃａｔａｔａｔｃａｃｔａｔａｔｔａａａｃｔｃａｃａａａｃｔｔｔｇａｔｃｔｇａｔａｔａｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｔｔｃａｔａｔｔｃａａｔａｔｔｔｔｔａｔｔｔｃａｔｔａｔａｔｔａａｇａａｃａｔｔａｔａａａａａｃｔａａｔａａａａｃａｃａｔａｔｔｔｔａｃｔｔｔａｔｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｔａｔａｔｃｇａａｔａａｔａａａｇｇｔｇｇｔｇｔｃａａｃｇｔｇａｇｃｃｔａａａｔｔａａｔａａｇａａａｇａａａｔａｇｔａａｔａａａｇｇｔｔｇｔａｃｔｔｔａｔａｔｃｇｇａａｔａｔｔｇｔｇｃｔａｃａｔｃｇａｔａａｔａｔｇｔｃｔｔｔｇｃａｔｃｃｇａｔｔａａｃａａａｇｔａｇｃｔｔａｃａａｃｃｃｇａａｔａａｃａｔｔｇｔａａｔｔｇａａａｔｔｇｃａｃｃｔａｇａｔｔｇｔｃｃａａａａａａｔａｃａｔｇａｃａｔａａａａｃｃｇａａａａａｔｃｃｔａａｇｇａａｇｃｔａｇａａｃｇａｃｇｇｇｇａｇｔｔａａｔｇｔｔｇｔｔｔａｇａｔｔｔｔｇａａａｔｃｔａｔｃｃａａｃａｔｔｔｇｔｇａａｔｃｃｔｃａａｔｃｔｔｔｃｃｔｃａｔｔａｔｔａａｃｔｔａｔｃｔａａｃｔａａｔａａｔｔｔｃａｔｔｔｔａａｔａｃｔｔｃｔａｃｔｃｔｃｃｃｃｔａｔｔｔａｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇａａａａｔａｔａｔｇｇｇａｔｔｔｇｇａｔｃｔｇｇｃａｇａｔａａａａａｔｇｃｃａｔｔｃｔｃｔｇｃｃｔｇｔｇｇｔｇｃａｇｔｔａａｇａｔｔｔｃｃｃｃｃｃａｇｔａｃｇｔｇａａｔｃｃａｔｇｔｃｃｔｔｃａａａｇｔｃｇａｔｇｇａｇａｃｇｔａｔａｃｃｇａａｃａｇｃａｇｇａａｔｇｇａａｇｔｃａａｇｔｃａｔｃｇｔｃａａｔｇｔｃｇｔａｔｃａａｔａｔｃａｔｃｃｃｔｔｔｇｃａａｇｇｔｇｔａｇａｇｇｇｇｇｇａｇｇｔａａｔｇａａｃｔｃｇａａｃａｇｃｇｃａｔｔｔｔｇａｃｇｇｇｔｃｃａｃｔｇｃｃｔｔａａａｇａａａｇａｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａｔｃｇａｇａａａｔｔｃｃｇａａｔａｃｔａａｔｃｔｇａａｃｃｇｇａｔｔｃａａａａｃａｔａｃａａａｔａｃｃｔｃｃｔｔａａｔｔａａｃｔｔｔｔｃｃｃｔａｃｔｔａｃａｔｔｔｇｃｔｇｃｃａｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｔｃｔｃｔｃｔｃｔｇｃａｃｃａａｔｔａａｔｔｔｃｔｔｃｃａａｔｇｃｔｔｔｇａｔｔｔｔａｇａｔａｇｔｇｔｇｇｔｇｃｔａｔｇｃｔａｔｃｇａｔｇａｃｇｔｔａｔａｃａｔｇａｃａｔｃａｔｔｇｃａａｇｇｇｇｃｇｔｇｔｇｔｇｔｔｇａａａｔｃｃａｔｇｔａｇｃｃｇｃａｔａｔａｔａａｔｔａｔｇｔｇｇｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｇａｇｃｃｃａｔｔｃｔｇｔｃｔｔｃｃｃｃｇｔｔｃｇｇｃｔｔｇｇｔｃｃｔｔｃｃａａｇａｔａａｇａｃｔｇａｔｔｇｇｃｃｇａｔｃａａｔａｔｔｔｔｔｔｔｔｇａｇａａｔａａａｔａｔａｔｔａｔｔｃｔｃａａａｔｇｇｃｔｇｃｇｃａｇｃｇｇａａｔｔｃｔｃａｔｃａａａａｔｔｇｇｔａａｃｔａｃｃａｃｔｃｔａａｔａｃｃｔｔａｔｔａｃｔｇｇａａａｃｔｔｇａｇｔａａｃｃｃａｔｔｃａｔｃａａｃａｔａｃｔａｃｃａｃｔｃａａａｔａｔａｃｔｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｔｃａｇｃａｃｔｃｇｃｔａｔｇａｔｃｔｔｇｔｇａｔａｃｔｇｃａａｔａｃａａａｃｇａｃｃｇｇｇｇａｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｔｔａｔａａｔｃｔｇｔａａｃａａｔｔｃｔｇｃａｃｇｇａａｇｔａｃａｔｇｔｔｇａｇｇｃｇｔｔａｇｃａｔａｃａｃａｇｔｔｇｃｔａａａｔｃａｃｇａｇｔａｃｃｔｃｃｔｃｔｔｇａａｇａａｃｔａｃｃａｔｃａｔｃｔｇａａａｃｔｃａｃｃｃｃａａｔｃｔａｔｇｔａａｔｃｃｇｃｃｇｔｃｃｔｔｃａａｃａｔａｇｇｃｃｔｔｇａｃａｔｃｇｇａｇｃｔｇｇａｔｔｔｇｇｃａｃｔｃｔｇａａｔｇｔｔｔｇｇａｔｇａａａｇｃｔｃｃｔｇａａａｇｔｇｇｇａａａａｔｇａｃｇｔａｇａｔｃｇａａｔａｇｔｃｔｔｔｇａｔｔｔｇｔｇａｔｃｔｇｔｇｃｔｔｔｇｃｃｔｔｔｇａｇｔｔｇｔａｔｇａｇｃｇｃａｔｇｔａｔａｔｇａａｇｇｃａｔｃｃａｔｃｔｔｇｇｔｇａａｇｔｔｃａｃａｇｇｃａａｃｃｃｇａａｔｇａａｃｔｔｃｔｔａｔｔａｇｔｃａｇａａｔｇｇｔｔａｔｇｇｔｇａｔａｇｇｔｔａｔｇｃｃａｇａｇｃｔｔｃｔｔｃｔｔｇｇａｔａｇｇｇａａｃａｔｔａａｇｇａｔａｔｇｔｔａｇｇａａａａａａａａｔｔｔａｇｃａｃｔｇａａａｔｇｇａｃｃｃａｔｔｔｔｇｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｃａｔａｔｔｔｇｔａａｔａａａｔｇｇｔｔｔｇｔａｃａｃｃｇａｔｔｇｇａｇｃｔｃｔｃｃｃｔａｔａａａｔｔｔｃｃｔｔｃｔｔｇｃｇｔｇｔａａｔｇｇｔｇａｃａａｔａｔａｔａｔｃｃｃｔｃｔｃｃｔｔｇｔｇｇｃｃａｔａｃｇｔｔｔａａｔａｔｔ１５４ 广西大单博士学位论文中国浪山班ｒ病毒病谓查诊断和病康病毒分子生物学的研究、附录５用于制备抗体的病毒外壳蛋白氨基酸序列－ＹＭＭＶＮＩｂＣＰ：ＭＳＨＫＡＶＫＲＥＧＩＦＩＰＫＬＥＥＥＲＩＶＡＩＬＥＷＳＲＴＥＮＹＥＨＲＬＥＡＩＣＡＡＭＥＡＷＧＹＤＥＬＬＲＱＩＲＬＦＹＳＷＶＬＥＱＥＰＹＲＴＬＡＳＥＧＲＡＰＹＩＳＥＹＡＬＲＲＬＹＬＧＤＤＤＳＤＡＥＬＹＮＲＹＬＲＡＬＩＤＮＹＴＨＤＤＳＤＩＶＶＨＱＡＳＫＥＱＴＦＤＡＧＱＦＡＳＫＱＡＨＰＱＧＳＡＳＳＳＥＧＰＧＫＤＶＮＶＧＴＫＧＴＦＳＩＰＲＩＫＡＰＭＳＫＬＴＬＰＫＬＫＧＫＶＬＶＮＬＥＨＬＶＥＹＥＰＥＱＶＤＩＳＮＫＲＡＳＱＥＱＬＧＱＷＶＥＳＶＫＴＳＹＤＶＤＤＥＱＬＫＩＩＬＮＧＦＭＶＷＣＩＥＮＧＳＳＰＮＩＮＧＮＣＹＭＩＥＮＧＥＱＩＥＦＰＬＫＰＩＶＥＮＡＫＰＴＬＲＱＩＭＡＨＦＳＤＩＡＥＡＹｍＫＲＮＡＫＫＡＹＭＰＧＹＧＬＫＲＮＬＮＤＹＳＬＡＲＹＡＦＤＦＦＥＩＴＳＫＴＰＶＲＡＲＥＡＨＭＱＭＫＡＡＡＬＲＮＴＲＴＲＬＦＧＬＤＧＳＶＧＴＮＤＥＮＴＥＲＨＴＳＤＤＶＮＫＤＭＨＳＬＬＧＶＲＮＩＹＶＸ－ＣＰｓＭＩＥＳＭＳＴＰＧＰＳＶＴＳＡＳＡＴＡＲＡＤＡＡＦＫＡＳＶＡＰＫＶＫＦＤＶＳＮＡＡＳｆＳＭＡＤＬＫＬＩＫＹＳＰＥＳＮＡＶＡＳＰＳＱＩＥＭＩＦＴＬＷＲＡＡＧＶＰＥＱＹＬＳＬＦＡＩＤＩＡＲＨＣＡＤＶＧＳＳＫＫＡＶＬＳＧＶＡＮＦＶＥＤＴＮＥＧＴＧＳＬＶＡＲＲＳＬＡＡｎＫＴＷＰＬＲＱＦＣＲＹＹＡＲＷＷＮＭＬＮＤＰＥＮＰＴＰＰＡＮＷＳＡＬＥＹＫＤＥＳＫＦＡＡＦＤＦＦＤＡＩＤＨＴＡＡＬＱＭＰＬＩＲＥＰＴＥＩＥＲＶＡＨＡＴＱＴＲＬＴＬＴＲＲＡＫＥＳＧＮＡＳＷＳＹＥＶＴＡＧＲＬＧＫＳＰＧＬＬＮＬＰＥＰＪＹＭＶ－ＣＰ：ＥＫＤＶＮＶＧＴＩＧＴＦＡＶＰＲＬＫＧＬＡＴＫＭＮＭＰＲＶＲＧＫＰＡＬＮＬＤＨＬＬＬＹＮＰＥＱＶＤＬＳＮＴＲＡＴＲＫＱＦＤＴＷＹＤＧＶＫＲＤＹＥＬＤＤＮＳＭＱＩＩＬＮＧＬＭＶＷＣＩＥＮＧＴＳＰＮＩＮＧＭＷＶＭＭＤＧＨＥＱＩＥＹＰＩＫＰＬＩＤＨＡＫＰＴＦＲＱＩＭＡＨＦＳＮＶＡＥＡＹＩＥＫＲＮＱＥＫＡＹＭＰＲＹＧＬＱＲＮＬＴＤＭＳＬＡＲＹＡＦＤＦＹＥＩＴＳＫＴＰＡＲＡＲＥＡＨＩＱＭＫＡＡＡＬＲＧＴＱＳＫＬＦＧＬＤＧＮＶＳＴＭＥＥＮＴＥＲＨＴＡＥＤＶＮＲＴＭＨＳＬＬＧＶＲＧＹＬＶ－ＣＰ：ＭＶＤＰＰＫＳＱＳＱＧＳＤＰＱＮＡＡＡＧＤＡＴＭＱＲＥＰＲＶＥＳＡＲＡＫＧＫＥＳＡＳＫＰＲＡＳＧＭＤＫＪＦＩＤＳＥＡＷＤＤＰＡＴＥＱＭＬＥＱＲＬＡＮＬＫＥＹＬＲＫＲＲＳＡＶＩＶＴＮＡＧＬＥＴＧＲＰＫＬＱＶＰＤＤＭＬＰＤＰＴＮＰＹＮＲＰＴＬＥＡＬＣＫＩＫＰＫＰＶＳＮＮＭＡＴＳＥＤＭＭＲＩＦＴＤＬＥＧＬＧＶＰＳＥＨＶＱＱＶＬＩＱＡＶＩＹＣＫＤＡＳＳＳＶＹＬＤＰＲＧＴＦＥＷＰＱＧＡＩＡＡＤＳＶＩＡＶＬＫＫＤＡＥＴＬＲＲＶＣＲＬＹＡＰＶＴＷＡＹＭＬＡＨＮＡＰＰＳＤＷＡＡＭＧＦＨＹＮＤＲＦＡＡＦＤＣＦＤＹＶＥＮＰＡＡＶＱＰＡＥＧＬＶＲＲＰＴＰＲＥＫＬＡＨＧＴＨＫＤＩＡＬＲＡＡＮＲＮＱＡＦＧＮＦＳＡＥＩＴＧＧＫＤＧＰＥＬＶＲＤＹＳＫＳＳＮＫＣＹＮＭＶ－ＳＳＹ－ＣＰ：ＭＤＬＳＳＰＰＱＮＰＰＫＫＱＰＬＥＥＲＫＫＡＰＡＥＤＳＴＡＴＴＳＫＥＳＮＱＧＨＱＰＩＥＥＰＮＮＤＰＧＴＦＤＤＥＤＩＥＷＲＩＰＡＩＱＫＧＦＧＨＹＫＩＰＫＶＫＧＫＪＵＷＮＰＫＩＬＫＫＩＳＱＥＱＦＴＴＴＳＱＭＶＴＴＳＫＬＥＱＷＩＥＥＶＫＲＤＬＶＶＴＳＤＴＤＦＱＩＣＬＴＳＷ１５５ 广西大学博士学位论文中国灌山箱病？病调查诊断和病康病？分子生物学的研究、ＣＬＷＣＡＮＮＧＴＳＳＥＬＤＶＳＱＦＭＥＶＨＡＮＧＱＶＭＧＩＰＩＱＩＦＶＥＰＡＶＬＨＧＧＬＲＫＶＭＲＨＦＳＧＩＴＳＫＭＬＳＥＧＧＫＭＴＡＷＧＫＫＲＧＦＴＱＲＳＭＩＰＹＡＦＤＦＦＶＰＴＤＴＴＰＫＴＶＲＥＱＬＳＱＳＫＡＡＡＩＧＲＧＶＱＲＶＭＬＬＤＧＫＶＨＧＳＲＴＳＹＥＲＨＴＤＮＤＱＤＥＹＥＨＧＧＳＤＤＱＲＰＡＬＹ－－ＢＢＷＶＲＮＡ２ＣＰＬ：ＧＬＭＥＥＤＶＬＮＶＱＴＮＮＦＡＩＥＳＡＴＥＴＭＲＬＬＦＳＧＹＡＳＩＰＬＮＶＴＰＲＴＫＩＴＶＡＹＬＮＥＬＳＫＨＳＡＶＨＴＧＬＬＮＭＬＳＲＩＰＧＳＬＫＩＫＩＮＣＱＶＡＰＴＣＧＩＧＬＡＶＳＹＶＥＧＮＥＳＴＮＬＧＳＳＬＧＲＬＬＧＩＱＨＹＫＷＮＰＡＩＥＰＹＶＥＦＶＦＫＰＦＳＣＡＤＷＷＮＭＨＹＬＧＳＦＫＹＡＰＶＷＩＱＴＬＳＫＷＬＮＡＰＫＶＤＡＲＩＳＦＡＩＹＹＥＰＴＴＶＬＰＫＱＩＡＴＬＥＨＡＰＡＦＭＦＲＫＥＬＧＴＬＡＦＫＱＧＧＲＶＡＹＳＦＥＶＮＦＧＫＰＱＴＤＧＫＥＶＴＳＴＦＡＳＳＹＣＧＬＳＱＹＭＱＳＤＶＩＬＤＦＴＬＭＳＳＰＭＩＧＧＴＦＳＩＡＹＶＡＧＡＹＩＥＫＶＧＮＭＱＩＬＤＳＬＰＨＩＤＦＴＦＳＳＧＡＫＳＴＲＳＶＲＦＰＫＡＶＦＧＶＹＱＡＬＤＲＷＤＬＤＳＡＲＧＤＤＶＳＧＮＦＶＬＹＱＲＤＡＶＳＳＡＬＥＧＥＬＴＦＲＶＡＡＲＬＳＧＤＩＳＦＴＧＶＳＡＧＹＰＴＴＶＴＲＩＧＫＧＫＴＩＧＲＳＬＤＰＥＩＲＫＰＬＲＹＭＬＧＱ１５６ 广西大学博士学位论文中国浪山苗病毒病调查、诊断和病康病毒分子生物学的研究致谢六月徂暑，山有佳卉。在本论文完成之际，在此谨向所有关心和帮助过我的老师、同学和朋友们致以最诚挚的谢意！首先衷心感谢我的导师陈保善教授，感谢他对我的学习和科研的谆谆教诲，对我的生活如慈父般的关怀。本论文是在陈老师的悉心指导下完成的，从论文的选题、实验的心血和智慧、开设计到论文的撰写，无不凝聚着导师的大量的。陈老师严谨的治学态度阔的视野、敏捷的思维和以身力行的处事作风以及高深的学术造诣是我终身学习的榜样。特别感谢我们实验室的蒙姣荣老师、廖咏梅老师、温荣辉老师、何熙璞老师、彭好文老师、罗继景老师、商巾杰老师和李文兰老师等在学习和科研中给予我的指导、关心和帮助。。感谢李茹老师作为答辩秘书付出的辛勤劳动感谢广西大学生命科学与技术学院和亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的唐纪良教授、冯家勋教授、何勇强教授、李有志教授、陆光涛教授、徐远金教授、王志强老师、付强老师、朱平川老师、周洁老师和岑卫健老师的关心和帮助。感谢广西农科院蔡健和研究员、朱桂宁研究员、韦本辉研究员、广西大学农学院何龙飞教授在样品采集过程中给予的帮助。感谢广西医科大学的蓝秀万老师对我的关心和帮助。感谢分子病毒实验室已毕业的姚姿婷博士、王方贞博士、朱英芝博士和王金子博士后对我的关心和帮助，感谢已毕业的硕士韦茂春、李战彪、蔡埼和曾泉等的关心和帮助，、施李鸣和陈琦感谢博士研究生宋静静、全睿，硕士研究生张蕾、卢晓静、何芳练、李璞、杨彦彦、欧阳秋飞、卢立丹、潘瑞兰、吕榜丽、陆群凤、白山、胡逸超、鹿宗贵、周礼玮、、梁彩云、司慧娟、朱丽玲、王君、唐瑶、、白凌云、宁小清、陆志翔周龙武蒙月月等同学的关心和帮助。感谢闭海老师在资格审查和论文送审中的帮助。感谢生科院和国家重点实验室所有老师和同学对我的关心和帮助。心感谢罗杰、苏辉昭、刘国芳和刘伟等同学的关和鼓励。、徐强胜、安世琦、李瑞芳心、鼓助。感谢我的家人，是他们给予我最多的关和支持使我能顺利完成学业一业）行业研究专项２００９０３０２２的资助。本研究受国家公益性（农（），在此并致谢邹承武２０１４年５月６日于广西大学１５７ 广西大学博士学位论文中国灌山班病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的研究攻读学位期间发表的学术论文学术论文＊１．ＣＺＪ．ＭｅｎＺ．ＬｉＭ．ＷｉＪ．ＳｏｎＢ．ＣｈｅｎａｎｄＢ．Ｗｅｉ．ＦｉｒｔＲｒｔｏｆＹａｍｍｉｌｄ．ｏｕｅｓｅｏ，ｇ，，，ｇ，，ｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎＹａｍｉｎＧｕａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ９５１０２０１１：１３２０．，，（），＝ＩＦ２．４４９（）＊２．ＹａｏＺＺｏｕＣＺｈｏｕＨＷａｎＪＬｕＬＬｉＹＣｈｅｎＢ．，，，ｇ，，，＾－－ｕＡＰｙｒｒｏｌｉｎｅＳＣａｒｂｏｘｙｌａｔｅ／ＧｌｕｔａｍａｔｅＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓＩｓＲｅｑｉｒｅｄｆｏｒＦｕｎｇａｌＶｉｒｕｌｅｎｃｅａｎｄ＝Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳＯＮＥ８（９）２０１３：ｅ７３４８３．（ＩＦ３．７３），ＰＰ．Ｌ．．Ｚｏｕ＊３．Ｊ．Ｒ．Ｍｅｎ．ｉｕＣＷＺ．．ＷａｎＪ．Ｈ．ＣａｉＢ．Ｘ．ｉｎａｎｄＢ．Ｓ．Ｃｈｅｎ．Ｆｉｒｓｔｇ，，，Ｑｇ，，Ｑ＝ｒｅｏｒｔｏｆＴｏｓｏｖｉｒｕｓｉｎｍｕｌｂｅｒｒｙ．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ９７７２０１２：１００１．ＩＦ２．４５５ｐｐ，（），（）－－＊ａｏＬｅ－Ｗ－ａｎ－ｅｎａｎｄ－ｒｓｅｏｒ４．ＹＭ．ＬｉＦ．ＨＣ．ＺｏｕＰ．ＬｉＺ．ＷＳ．ＣｈＸＰ．ＬｕＦｉｔＲｔ，，，，Ｑｇ，Ｂ，，ｐ＝ｏｆＴｅｌｏｓｍａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｏｎＰａｓｓｉｏｎｆｉｎｉｔｉｎＣｈｉｎａ．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ．ＡｃｃｅｔｅｄＩＦ２．４５５（ｐ，）＊５－．．．２００９２２（１：１５２０邹承武，陈保善基因组学与植物病害控制广西植保，，）６．宋静静，蒙姣荣，邹承武，李璞，王志强，陈保善气用小ＲＮＡ深度测序鉴定广西冬－４０１．２０１３４６１９：４０７５８种马铃薯病毒中国农业科学，，（）＊７．王志强，蒙姣荣，邹承武，黄锦宽，林纬，黎起秦，陈保善．罗汉果查尔酮合成酶１－．基因组学与应用生物学．２００２９：５７７８３．基因的生物信息学分析；＊８．７．宋静静，蒙姣荣，卢晓静，部承武，陈保善马铃薯汾ｒ〇Ｍ和汾双千扰植物双元表达载体的构建及转化验证－．基因组学与应用生物学，２０１４，３３（１）：２２２８＊９．蒙姣荣，李战彪，韦茂春，邹承武，廖咏梅，陈保善．广西部分烟区烟草曲叶病病原的分子鉴定．植物保护，２０１２，３８：３７４１．＊１０．．蒙姣荣，赵家新，蔡琦，邹承武，李战彪，廖咏梅，陈保善广西烟草病毒病发生－情况调查和病原病毒的鉴定．广西植保２０１２，２５：１２．，＊１１．．朱英芝，韩英，蒙姣荣，廖咏梅，邹承武，陈保善小西葫芦黄化花叶病毒罗汉果－分离株抗血清的制备和应用．热带作物学报，２０１１，３２：１６８３６．１２．张蕾，邹承武，蒙姣荣，卢晓静，陈保善抗病毒药剂处理脱除淮山药温和花叶病毒的研究．南方农业学报．（已接收）１５８ 广西大学博士学位论文中国淮Ｏｉ箱病毒病调查、诊断和病尿病毒分子生物学的研究国际会议论文＊１．Ｃ．Ｗ．ＺｏｕＪ．Ｒ．Ｍｅｎ．．ＷａｎＬ．ＺｈａｎａｎｄＢ．Ｓ．Ｃｈｅｎ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓ，ｇ，ＺＱｇ，ｇｔｈ－ｉｎｆｅｃｔｉｎａｍｉｎＣｈｉｎａ．１０ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｒｅｓｓｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏ２０１３Ａｕｕｓｔ２５３０ｇｙｇｇｙ，，ｇ，ＢｅｉｉｎＣｈｉｎａ：４５０ｊｇ，＊２．Ｙａｏ．ＺＨ．ＺｈＪ．Ｚ．ＷａＹ．ＬｉＬ．Ｄ．ＬｕａｎｄＢ．Ｓ．Ｃｈｅｎ．Ｉｍｌｉｔｉｏｎｏｆ．Ｚ．ＴＣ．Ｗｏｕｏｕｎｇｃａ，，，，，ｐ會Ｖｉｇｌｕｔａｍａｔｅｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌａｎｔｆｕｎａｌｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．１０ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｒｅｓｓｏｆｐｇｇａｎｕｓ－ＰｌｔＰａｔｈｏｌｏｙ２０１３Ａｕｔ２５３０ＢｅｉｉｎＣｈｉｎａ：２６４ｇ，，，，ｇｊｇ３Ｚ．ＷａｎＹＭ．ＬｉａｏＧＮ．ＺｈｕＣ．Ｗ．ＺｏｕＹ．ＲｅｎＺ．Ｍ．ＺｈｏｕＹ．Ｆ．ＣｈｅｎＬＭ．．．Ｑｇ．．ｅｎｇ．，，，，，，，Ｑ，＊Ｓｈ．Ｌｉ．ａｎａｎｄ．Ｓｈｅｎ．ｅｎｏｍｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｓｅｕｅｎｃｅｏｆｈｅｓｕａｒｃａｎｅｓｍｕｔｉＰＬＷＢ．ＣＧｔ，，ｇｑｇｔｈｒｎａｏｎａ－ｎｆｕｎｇｕｓ．１０ＩｎｔｅｔｉｌＣｏｎｒｅｓｓｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏ２０１３Ａｕｕｓｔ２５３０ＢｅｉｉＣｈｉｎａ：ｇｇｙ，，ｇ，ｊｇ，２３７－２３８＊４．Ｊ．Ｒ．Ｍｅｎｇ．Ｐ．ＬｉｕＣ．Ｗ．ＺｏｕＺ．．ＷａｎＹ．Ｍ．ＬｉａｏＪ．Ｈ．ＣａｉＢ．Ｘ．ｉｎａｎｄＢ．Ｓ．Ｃｈｅｎ．，Ｐ，，Ｑｇ，，，ＱｔｈＦｉｒｓｔＲｅｐｏｒｔｏｆａＴｃｗｐｏＷｍｓｉｎＭｕｌｂｅｒｒｙ．１０ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒｅｓｓｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，－ｕｓ－ｅ２０１３Ａｕｔ２５３０Ｂｉｉｎｈｉｎａ：４５４４５５，ｇ，ｊｇ，Ｃ国内会议论文＊１、．．邹承武；蒙姣荣；韦本辉；陈保善利用深度测序技术鉴定淮山药病毒病新病原中国植物病理学会２０１２年学术年会论文集：２２５＊一２、蒙姣荣；刘平平；邹承武；廖咏梅；蔡健和；秦碧霞；陈保善．侵染桑的种新病—毒番茄斑萎病毒属成员病毒：２．中国植物病理学会２０１２年学术年会论文集２６＊３、邹承武；蒙姣荣；宋静静；韦本辉；蔡健和；陈保善．广西淮山药病毒病调查及病毒病原鉴定．中国植物病理学会２０１１年学术年会论文集：２８８春＊４、宋静静战彪．玉；邹承武；蔡骑；韦茂；李；蒙姣荣；陈保善林市马铃薯病毒病Ｙ病２０１１：发病情况调查及马铃薯毒株系的鉴定．中国植物病理学会年学术年会论文集３３４＊５、朱英芝；韦茂春；陈保善．小；邹承武；蒙姣荣西葫芦黄化花叶病毒罗汉果分离物进化分析．中国植物病理学会２０１１年学术年会论文集：３２８＊６、朱英芝．．；邹承武；廖咏梅；蒙姣荣：陈保善罗汉果病毒病侵染源及流行病学研究中国植物病理学会２００９年学术年会论文集：３７６１５９ 广西大学博士学位论文中国淮山苗病毒病调查、诊断和病屎病毒分子生物学的研究发明专利１、．：．陈保善，邹承武，蒙姣荣．淮山药Ｘ病毒的多克隆抗体制备检测及其应用申请号－－进入实质审查阶段２０１３１０５４１２７４．７：２０１３１１０５。；申请日；２．陈保善，邹承武，蒙姣荣，张蕾，卢晓静．淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备、－２０－１３１０５４１２９７．８；：２０１３１１０５。检测及其应用：申请日；进入实质审查阶段；申请号３．陈保善，姚姿停，邹承武，周辉，王金子，卢立丹．板栗疫病菌致病力基因Ｐｒｏｄｈ及－－入实质审查阶段：２０１３１０２３３２２８．０：２０１３０６１３。其应用；申请日；进；申请号４．陈保善，姚姿捧，邹承武，周辉，王金子，卢立丹．板栗疫病菌产孢基因Ｐｒ〇２及其－－入实质审查阶段应用；申请号：２０１３１０２３３２２８．０；申请日：２０１３０６１３；进。５．．陈保善，姚姿婷，邹承武，周辉，王金子，卢立丹，李洋板栗疫病菌致病力基因Ｐ５Ｃｄｈ及其应用－－：２０１３１０２３３２６１．３请日：２０１３０６１３进入实质审查阶段。；申请号；申；６．陈保善，姚姿捧，邹承武，周辉，王金子，卢立丹．板栗疫病菌产孢基因Ｐｒｏｌ及其－－入实质审查阶段应用；申请号：２０１３１０２３３２６７．０；申请日：２０１３０６１３；进。１６０
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