中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究

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０２８５学校代码：１学号：２０１４４２２１１７１ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ）中国人急性髓系白血病患者ＮＰＭ１，ＩＤＨ１，ＩＤＨ２，ＷＴ１和ＣＥＢＰＡ基因突变检测及其临床特征研究ＧｅｎｅＭｕｔａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｅｓｏｆＮＰＭ１，ＩＤＨ１，ＩＤＨ２，ＷＴ１ａｎｄＣＥＢＰＡａｎｄｉａＲｅｅｖａｎｃｅＣｈｉｎｅｓｅＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＡｃｕｔｅＭｅｌｏｉｄＬｅｕｋｅｍＣｌｉｎｉｃａｌｌｉｎｙ１１研究生姓名指导教师姓名斌生物学专业名称细胞研究方向白血病的形与治疗所在院部医学部唐仲英血液学研究中心２０１７月论文提交日期 苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：説聲日期：７＋１。＾ 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年月解密后适用本规定。＿非涉密论文Ｅｆ论文作者签名－：曰期：＞＂４＋＾－导师签名７１°：日期：７ｔ 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究中文摘要中文摘要目的：本研究旨在研究NPM1，IDH1，IDH2以及WT1和CEBPA基因突变在中国人急性髓系白血病(AML)患者中的发生频率并探讨这些突变与临床特点间的关系。方法：收集2005至2011年间苏州大学附属第一医院就诊289例初治AML患者，采用PCR扩增产物测序法检测NPM1，IDH1，IDH2以及WT1和CEBPA基因基因突变情况，并通过统计学方法分析基因突变患者白血病分型，年龄，性别，细胞核型，白细胞计数，血小板计数，预后等临床特征之间的相关性。结果：（1）NPM1突变患者在273例AML中占54例，突变率为19.78%，在正常核型AML中的发生率为31.1%（P＜0.001），NPM1基因突变者发病年龄偏高(P＜0.05)，外周血白细胞和血小板数中位数高(P＜0.05)，在性别和骨髓原始细胞百分数方面差异无统计学意义(P＞0.05)，易发生在AML-M137.25%（P＜0.001)、多伴有IDH1和IDH2突变等临床特点。（2）在243例AML患者中有9例IDH1突变，突变率为3.7%，除在M1（3，6.25%）、M2,（3，4.28%）、M5（3，7.32%）亚型中发生少量突变，其他亚型均未检测到突变，在性别、年龄、血小板数、外周血白细胞和骨髓原始细胞百分数方面差异无统计学意义(P＞0.05)。（3）在243例AML患者中27例患者发生IDH2突变，突变率为11.11%，IDH2突变在AML中的中位年龄偏高(P＜0.05)，血小板数中位数高(P＜0.05),在M0患者中突变率为50%（P＜0.05），在性别比例、外周血白细胞和骨髓原始细胞百分数方面差异无统计学意义(P＞0.05)。（4）在240例AML患者中有15例发生WT1突变，突变率为6.25%，在性别、年龄、血小板数、白血病分型、核型、骨髓原始细胞百分数方面差异无统计学意义(P＞0.05)。（5）在241例AML患者中有49例发生CEBPA突变，突变率为20.33%，单突变发生在7.46％（18/241）的患者中，双突变12.86％（31/241），骨髓原始I 中文摘要中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究细胞百分数和血小板数中位数低(P＜0.05)，CEBPA突变与核型具有相关性（P＜0.001），而在性别、年龄和外周血白细胞方面差异无统计学意义(P＞0.05)。（6）未发现同一患者同时发生IDH1和IDH2这两种突变，但分别发现6例NPM1与IDH1共突变（P＜0.05）和11例NPM1与IDH2共突变（P＜0.001）。（7）NPM1、IDH2和CEBPA基因突变与BCL11A基因表达水平具有相关性。（8）所有突变在本研究中未发现与预后之间的意义结论本研究中AML常见的几种基因突变率和国外文献报道的数据有所不同，除IDH2和CEBPA基因突变外，其他基因突变在中国人中的发生率低于国外文献报道，其中CEBPA突变频率最高，20.33%，其次是NPM1突变，突变率为19.78%，11.1%的IDH2突变，IDH1突变率为3.7%，WT1突变的频率为6.25%；发现一些基因突变与的临床特征之间的关系，NPM1基因突变者发病年龄偏高，外周血白细胞和血小板数中位数高；IDH2突变在AML中的中位年龄偏高和血小板数中位数高；CEBPA突变骨髓原始细胞百分数和血小板数中位数低。且首次提出了NPM1、IDH2和CEBPA基因突变与BCL11A基因表达的关系，为进一步研究基因突变与白血病发生之间的关系提供了初步的数据支持。关键词：急性髓系白血病；NPM1;IDH1;IDH2;WT1;CEBPA；突变作者：张繁指导教师：尹斌II 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究英文摘要GeneMutationAnalysesofNPM1,IDH1,IDH2,WT1andCEBPAandClinicalRelevanceinChinesePatientswithAcuteMyeloidLeukemiaAbstractObjective:ThepuroposeofthisstudywastoinvestigatetheGenemutationAnalysesofNPM1,IDH1,IDH2,WT1andCEBPAandclinicalcharacteristicsinchinesePatientswithAcuteMyeloidLeukemiaMethods:Bonemarrowsampleswerecollectedfromnewlydiagnosed289ChinesepatientswithAMLattheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversitybetween2006and2011.NPM1,IDH1,IDH2,WT1andCEBPAMutationsweredetectedbyPCR.weanalyzedthecorrelationsbetweengenemutationandclinicalfeatures,suchasleukemiasubtypes,age,sex,cellkaryotypes,whitebloodcounts(WBC),bloodplateletcounts(PLT),bonemarrowblasts(%)(Blasts),prognosis,etc.Results：（1）NPM1mutationsinthe273casesofAMLaccountedfor54cases.,themutationratewas19.78%．TheincidenceofNPM1mutationinnormalkaryotypeAMLwas31.1%（37/119）（P<0.001）.AMLwithNPM1mutationischaracterizedbyolderage，highwhitebloodcellcounts,highnumberofplatelet，higherincidenceinAML-M1（P<0.001)，morelikelyco-existencewithIDH1,IDH2andCEBPAmutationandotherclinicalfeatures．（2）IDH1mutationsinthe243casesofAMLaccountedfor9cases,themutationratewas3.7%．TherewereonlymutationsinM1(3,6.25%),M2(3,4.28%),M5(3,7.32%)subtypes,andnomutationsweredetectedinothersubtypes.TherewasnosignificantdifferenceintheSex,age,plateletcount,whitebloodcellsandblast（%）(P>0.05).(3)IDH2mutationsinthe243casesofAMLaccountedfor27cases,themutationratewas11.11%(27/243),AMLwithIDH2mutationischaracterizedbyolderage(P<0.05)，highnumberofplatelet(P<0.05)，higherincidenceinAML-M0(P<0.05)andIII 英文摘要中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究therewasnosignificantdifferenceintheSex,whitebloodcellcountsandbonemarrowblast（%）(P>0.05).(4)WT1mutationsinthe240casesofAMLaccountedfor5cases,themutationratewas6.25%，TherewasnosignificantdifferenceintheSex,age,plateletcounts,leukemiatyping,karyotype,whitebloodcellcounts,bonemarrowblast（%）(P>0.05).(5)CEBPAmutationsinthe241casesofAMLaccountedfor49cases,themutationratewas20.33%,Singlemutationsoccurredin7.46%(18/241)ofpatientsanddoublemutationsin12.86%(31/241)ofpatients.AMLwithCEBPAmutationischaracterizedbylowbonemarrowblasts（%）,lownumberofplatelet(P<0.05),CEBPAmutationsareassociatedwithkaryotype（P<0.001）,therewasnosignificantdifferenceintheSex,ageandwhitebloodcellcounts(P>0.05).(6)IDH1andIDH2mutationswerenotfoundinthesamepatientatthesametime.wefoundthat6casesofNPM1andIDH1co-mutation(P<0.05),11casesofNPM1andIDH2co-mutation(P<0.001),respectively.(7)NPM1IDH2andCEBPAgenemutationswereassociatedwithBCL11AmRNAexpressionlevels.(8)Inthisstudy,Allmutationswerenotfoundwiththesignificanceofprognosis.Conclusion:Inthisstudy,severalcommongenemutationsinAMLweredifferentfromtothosereportedforforeignpatientswithAML.ExceptforIDH2andCEBPAgenemutations,theincidenceofothergenemutationsinChinesewaslowerthanthatreportedinforeignresearch.ThehighestfrequencyofmutationwasCEBPAmutation,whichwas20.33%.followedbyNPM1mutationwithmutationrateof19.78%,11.1%IDH2mutation,IDH1mutationrateof3.7%,WT1mutationfrequencyof6.25%.Wefoundthatrelationshipbetweensomegenemutationsandtheclinicalfeatures.AMLwithNPM1mutationischaracterizedbyolderage，highwhitecellcounts,highplateletcounts,AMLwithIDH2mutationischaracterizedbyolderage，highplateletcounts.AMLwithCEBPAmutationischaracterizedbylowbonemarrowblasts（%）,lowplateletcounts.andtherelationshipbetweenNPM1IDH2andCEBPAgenemutationandBCL11Ageneexpressionwasputforwardforthefirsttime.whichprovidedpreliminarydatasupportingforfurtherstudyoftherelationshipbetweengenemutationandleukemogenesis.Writtenby:FanZhangSupervisedby:BinYinIV 目录前言..............................................................................................................................1材料和方法......................................................................................................................3一、实验材料...........................................................................................................31.1．主要实验试剂...........................................................................................31.2．主要实验仪器...........................................................................................31.3．主要实验耗材...........................................................................................4二、实验方法...........................................................................................................41．试剂的配制..................................................................................................42．主要实验方法..............................................................................................5实验结果........................................................................................................................121.病人样本相关临床信息....................................................................................122.突变分析............................................................................................................132.1NPM1基因PCR扩增产物测序结果..................................................132.2IDH1基因PCR扩增产物测序结果...................................................152.3IDH2基因PCR扩增产物测序结果...................................................162.4WT1基因PCR扩增产物测序结果....................................................172.5CEBPA基因PCR扩增产物测序结果...............................................183.突变与临床参数的关系......................................................................................193.1NPM1突变与AML患者FAB亚型、血液学特征及预后分析.....193.2IDH1突变与AML患者FAB亚型、血液学特征及预后分析.......223.3IDH2突变与AML患者FAB亚型、血液学特征及预后分析.......243.4WT1和CEBPA突变与AML患者FAB亚型、血液学特征及预后分析............................................................................................................264.基因共突变分析................................................................................................305.基因突变与BCL11A表达相关性分析............................................................31讨论............................................................................................................................33 参考文献........................................................................................................................36综述：急性髓系白血病中IDH基因突变研究进展...................................................43攻读学位期间本人参与发表的学术论文....................................................................57缩略词............................................................................................................................58致谢............................................................................................................................59 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究前言前言急性骨髓性白血病（Acutemyeloidleukemia,AML)又称为急性非淋巴细胞白血病（Acutenonlymphocyticleukemia,ANLL）,是一种高度异质性疾病，是造血前体细胞发生多种基因突变所导致的，这些突变干扰细胞生长、增殖和造血祖细胞的分化累积，因而导致大量未成熟的髓样细胞在骨髓和外周血中的出现和累积[1]。其诊断主要依靠形态学（morphology）、免疫学（Immunology）、细胞遗传学（Cytogenetic）及分子生物学（MolecularBiology）的检测，简称MICM诊断分型。目前来说，在众多评价AML预后危险度的因素中，细胞遗传学异常被认为是鉴定急性髓系白血病(AML)预后的最关键因素[2]。近年来，由于AML“二次打击”学说被广泛的接受，针对AML细胞里基因突变的研究开始逐渐增多，研究人员发现仍有40%－50%的AML患者在初诊时用标准的染色体显带分析技术无法检测到染色体异常，这部分患者被称之为正常核型AML(normalkaryotypicAML)[3]。因此AML开始越来越多的在特定遗传异常的基础上进行分类，预测预后和对治疗的反应，早在2008年WHO已将如NPMl、FLT3-ITD、CEBPA基因突变等作为AML预后的重要标志，因而确定突变基因对判断AML患者的预后有相当的意义，并且也会对治疗计划的选择产生影响[4-6]。核仁磷酸蛋白1（Nucleophosmingene1，NPM1）基因是位于核仁颗粒区的一种在各种类型的细胞中广泛表达的多功能蛋白质，NPM1基因突变是急性髓系白血病的一种特异性表现，其发生率在正常核型的成人急性髓系白血病患者中约占50%～60%，初步的病例研究指出，NPM1突变是预后良好的指标[3,7]，异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase，IDH)是一大类酶家族，广泛分布于人、细菌及真核生物中，IDH1是一种细胞质蛋白，能够催化异柠檬酸的氧化脱酸反应生成+a-KG,从而导致三梭酸循环中NADP的生成[8,9]。IDH2基因位于人类15号染色体带15q26，含11个外显子，定位于线粒体，IDH2蛋白是三羧酸（也称为“柠檬酸”或“Kerbs”）循环的关键组分。IDH基因突变最早报道于一例结肠癌肝转移患者的细胞中，随后在AML患者中也发现存在IDH1和IDH2突变，并发现具有IDH突变的AML患者预后较差[10,11]。WT1(Wilms肿瘤因子1)基因位于1 前言中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究染色体11p13，编码涉及细胞生长和代谢的锌指转录调节因子，N-末端编码一个锌指的转录区域，C-末端编码锌指的DNA结合区域。目前WT1在AML中的功能还未完全研究清楚，有的研究表明WT1可作为一种致癌基因，而其他一些研究则认为是一种肿瘤抑制基因[12]，有研究报道7%-10%的AML患者发生WT1基因突变，且主要发生第7和第9外显子突变，虽然有一些研究指出WT1基因突变是AML预后不良的指标，但是也有其他研究得到了相反的结论[13,14]。CEBPA（CCAAT/enhancerbindingprotein）是指CCAAT/增强子结合蛋白，它是髓系分化过程中的一种重要转录调节因子，能促使髓系细胞朝着粒细胞或单核细胞方向分化，CEBPA基因在结构上包括：两个N端的转录活性结构域，一个二聚化的亮氣酸拉链结构域，和一个C端的DNA结合结构域[15]。CEBPA的突变主要有两种形式，一种是C端的缺失或插入突变，另一种则是N端突变，N端产生突变会导致CEBPAp30蛋白的产生，此种蛋白具有部分活性，能够与DNA结合并且发挥作用，而且当其达到一定表达量时，就会抑制野生型CEBPAp42的蛋白活性，并且其C端发生突变也具有一定的功能[16]，CEBPA突变的患者可以分为两个不同的类型，分别为CEBPA基因双突变以及CEBPA基因单突变，有国外的研究报道表明，当CEBPA基因发生双突变时则提示预后良好[17]。我国对AML分子标志的研究逐步增加,也取得了一定的成果，但成果仍十分有限，尽管我们可以借鉴国外学者的研究报告，但是否存在人种上的差异,我们不十分清楚，针对中国人的研究数据对我们则更具参考意义。本研究中我们收集使用了2006年至2011年间在苏州大学附属第一医院血液科就诊的289例AML患者（主要是汉族）样本，检测NPM1、IDH1、IDH2以及WT1和CEBPA基因突变发生率以及突变与白血病分型，年龄，性别，核型，白细胞计数，血小板计数等临床参数间的相关性，初步探讨其临床价值，并且分析了这五种基因突变与BCL11A（B细胞白血病11A）基因表达的相关性，为进一步研究基因突变与白血病发生之间的关系做出一定的贡献。2 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究材料和方法材料和方法一、实验材料1.1．主要实验试剂三氯甲烷（氯仿）国药集团化学试剂有限公司，中国GoldViewⅡ型染料苏州科晴生物科技有限公司，中国异丙醇国药集团化学试剂有限公司，中国DEPC水TINGEN,中国PCR引物苏州金唯智生物科技有限公司，中国Agarose粉末苏州科晴生物科技有限公司，中国PBS本实验室配置，中国DNAMarkerTaKaRa,日本dNTPMixture(2.5mM/10mM)TaKaRa,日本Oligo(dt)15TaKaRa,日本5xReverseTranscriptaseBufferTaKaRa,日本AxyPrePDNA凝胶回收试剂盒Axygen，美国RecombinantRNaseInhibitor(RRI)TaKaRa,日本RNAisoPlusThermo,美国TMAxyPrePPCRCleanupKitAxygen，美国M-MLVReverseTranscriptaseTaKaRa,日本无水乙醇国药集团化学试剂有限公司，中国10xPCRBufferTaKaRa,日本人淋巴细胞分离液（FICOLL）天津市㵾洋生物制品科技有限公司，中国rTaqTaKaRa,日本基因组DNA提取试剂盒Axygen，美国1.2．主要实验仪器PCR仪杭州LONGGENE科学仪器有限公司，中国旋涡振荡器上海精科实业有限公司，中国4度冰箱青岛海尔集团，中国精密移液枪Thermo，美国0-80C度冰箱青岛海尔特种冰柜有限公司，中国微型离心机杭州LONGGENE科学仪器有限公司，中国3 材料和方法中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司，中国离心机Thermo，美国NanoDrop2000分光光度计Thermo,美国4度台式离心机Thermo，美国0-30C冰箱SANYO，中国超净工作台苏州净化设备有限公司，中国EppendorfPCR仪Eppendorf，德国天能电泳仪上海Tanon科技有限公司，中国Bio-rad凝胶成像仪BIO-RAD，美国电子天平上海良平仪器仪表有限公司，中国干式恒温仪杭州LONGGENE科学仪器有限公司，中国美的微波炉美的，中国二代测序仪ABI，美国1.3．主要实验耗材PE一次性手套海门三和豪发实验器材厂，中国滤芯枪头上海科进生物技术有限公司，中国PCR8连管无锡莱弗生物，中国1.5mLEP管海门陈氏实验器材厂，中国15mL/50mL离心管Thermo，美国医用乳胶手套海门三和豪发实验器材厂，中国二、实验方法1．试剂的配制（1）磷酸盐缓冲液（1xPBS）化学试剂加量NaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g0使用800mL超纯水将其溶解，用HCl调PH值到7.4，最后定容到1L，121C0高压蒸汽灭菌，灭菌完成后保存于4C冰箱，以备后续使用。（2）50×TAE电泳缓冲液：4 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究材料和方法化学试剂加量Tris242g冰醋酸57.1mL0.5MEDTA(pH8.0)100mL用超纯水充分溶解后定容到1L，使用前用超纯水稀释到1×。（3）1%电泳凝胶琼脂糖粉末的量按照需要凝胶大小称取。如果我们需要配置20mL体积的胶，则需称量0.2g的琼脂糖粉末。将称好的粉末加入到装有1×TAE电泳缓冲液的三角烧瓶中摇晃、混匀，放置于微波炉中煮沸三次，注意控制无明显气泡产生，然后加GoldViewⅡ染料混匀，随后倒入制胶板中等待凝固，凝固时间为15-30min。2．主要实验方法2.1单核细胞收集:(1)从苏州大学附属第一医院血液科取得初诊AML患者的骨髓标本约5ml。(2)采用密度梯度离心法分离单个核细胞，我们将淋巴细胞分离液与骨髓液以2:1比例混合;然后2000rpm，离心20min，离心结束后会，液体将会分为三层，我们将上层液体丢弃，用移液枪小心吸取中间层细胞（千万小心，防止吸到下层液体）到另一离心管中，再加PBS将体积补充至10mL，液体混匀后，离心1200rpm10min，PBS洗3次；0（3）离心完成后，弃净上清，将收集下来的细胞冻存到-80C冰箱中。2.2骨髓总RNA和基因组DNA（gDNA）的提取2.2.1骨髓总RNA的提取0（1）至少要提前半小时预冷4C离心机，随后将从骨髓中分离的单核细胞转移到1.5mLEP管中，离心后弃净上清，加入1mLRNAisoPlus，使用移液枪反复吸吐至裂解液中无明显沉淀，室温静置5min；（2）向上一步的溶液中加入氯仿200ul（1/5体积RNAisoPlus的量），盖紧离心管盖，然后翻转震荡15s（因为氯仿具有沸点低和易挥发的特点，所以震荡时应防止离心管盖突然弹开）。等到溶液充分乳化(看不到分相现象)后，室温下静置05min；12000g4C离心15min；（3）从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层：无色上清液层，中5 材料和方法中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究间白色蛋白层以及下层有机相带颜色层。轻轻吸取上清液转移至另一新的EP管中（注意不要吸到白色中间层）；（4）向上清转移管中加入相同体积的异丙醇，上下翻转1.5mL离心管充分混匀后，室温放置10分钟；（5）12000g4度离心10min，离心之后试管底部会出现白色RNA沉淀；（6）小心弃去上层液体，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1mL（事先由0DEPC水和无水乙醇配置），上下倒置颠倒洗涤离心管的管壁，12000g4C离心5min，弃去乙醇（为提高RNA质量，应该尽可能的除净乙醇）；（7）室温静置2-5分钟以干燥沉淀，用RNAase-freewater溶解沉淀，使用移液枪轻轻吹打促进溶解；（8）用分光光度计检测提取RNA的浓度和OD值（260/280），然后根据需要0情况分装后保存于-80C冰箱。2.2.2骨髓基因组DNA的提取0（1）从-80C冰箱中拿出病人骨髓中分离的单核细胞于室温融化，2000rpm离心5分钟，弃净上清。向其中加入缓冲试剂GTL200uL和20uL的蛋白酶K溶液（20mg/mL），用漩涡振荡器，震荡样品至悬浮，为了去除RNA，再向里加入40uL的RNaseA溶液（10mg/mL），漩涡振荡15秒，室温放置2分钟。（2）加入200uL缓冲液GL，漩涡震荡混匀，56℃水浴锅水浴10-30分钟。（3）短暂离心为了除去离心管内壁的水珠，向其中加入200uL无水乙醇，充分混匀，短暂离心。（4）用移液枪将上述所有溶液加入到已装入收集管（CollectionTube）的吸附柱(SpinColumn)中。8000rpm离心1min，弃净离心管中的液体，将吸附柱重新放回离心管中。（5）向吸附柱中加入500uL的缓冲液GW1(使用前检查是否加入无水乙醇)，8000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（6）向吸附柱中加入500uL的缓冲液GW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（7）为进一步提高DNA纯度，重复步骤（6）。（8）为去除残存的乙醇，13000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，吸附6 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究材料和方法柱在室温静置数分钟。（9）将吸附柱放置于事先准备好的新的1.5mLEP管中，向吸附柱的中间部位悬空滴入80uL预热的超纯水，静置5min后，13000rpm离心2min，收集管中的DNA溶液。通过分光光度计测量DNA的浓度，按要求做好标识后将gDNA放置于-80℃冰箱保存。2.3cDNA合成由AML病人骨髓中分离的单核细胞所得到的总RNA，使用时先逆转录成cDNA，具体实验过程如下：第一步：（1）将200ng总RNA，2ulOligo(DT)15加到200ul离心管中，再用0DEPC水将反应体积补到14uL（见下表）；PCR仪上按程序反应：65C，8min；（2）取出第一步反应产物，冰上放置约2min，短暂离心；cDNA合成第一步反应体系材料加量RNA约200ngOligo(dt)152uLDEPC水补充到14uL总体积14uL第二步：（1）加入MMLV0.5uL，5xBuffer4uL，dNTP1uL，RRI0.5uL，震荡混匀，短暂离心。（PCR体系见下表）；0（2）PCR仪上程按序反应：42C，60min；将两步所得反应产物（cDNA）0保存在-30C冰箱待用，是使用时冰上融化（由于降解的影响，最好现做现用）。cDNA合成第二步反应体系材料加量第一步所得产物14uL5xReverseTranscriptaseBuffer4uLM-MLVReverseTranscriptase0.5uLRecombinantRNaseInhibitor0.5uLdNTP(10mM)1uL总体积20uL7 材料和方法中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究2.4PCR扩增NPM1基因突变热点主要集中在3"末端，以cDNA为模板，PCR扩增全长CDS，测序从3"端反向测序引物，IDH1和IDH2只检测了其4号外显子区域，WT1基因分别检测7号和9号外显子区域，CEBPA分两段检测所有编码区，选取的目的基因的PCR引物和测序引物参照NCBI数据库进行引物设计（见表1），设计好后通过Primer-BLAST数据库验证确保所测基因特异性，接下来会针对所设计的片段进行扩增，确定不能进行非特异性的扩增，随后将设计的引物和相应基因的测序引物（见表2）定送给苏州金唯智生物科技有限公司进行引物合成。于此同时在正式测试之前会摸索出条件，将摸条件时各基因的PCR产物片段进行测序分析验证。表1各目的基因的PCR引物序列GenenamePrimerssequences(5’-3’)PCRproductsize(bp)NPM1-ForGCCTTCTCTCCTACCTAAGTNPM1910NPM1-RevGCCAGATATCAACTGTTACAGIDH1-ForTGTGTTGAGATGGACGCCTAIDH1624IDH1-RevGGTGTACTCAGAGCCTTCGCIDH2-ForCTGCCTCTTTGTGGCCTAAGIDH2559IDH2-RevATTCTGGTTGAAAGATGGCGWT1-exon7-ForGACCTACGTGAATGTTCACATGWT1350WT1-exon7-RevTACAACACCTGGATCAGACCTWT1-exon9-ForTGCAGACATTGCAGGCATGGCAGG349WT1-exon9-RevGCACTATTCCTTCTCTCAACTGAGCEBPA-1-ForTCGCCATGCCGGGAGAACTCTAACCEBPA548CEBPA-1-RevAGCTGCTTGGCTTCATCCTCCTCEBPA-2-ForCCGCTGGTGATCAAGCAGGA643CEBPA-2-RevCACGGTCTGGGCAAGCCTCGAGAT表2各目的基因的测序引物序列GenenamePrimernamePrimerssequences(5’-3’)NPM1Seq-NPM1-REVGCCAGATATCAACTGTTACAGIDH1Seq-IDH1-ForCACCAAATGGCACCATACGAIDH2Seq-IDH2-ForCTGCCTCTTTGTGGCCTAAGSeq-WT1-exon7-RevTACAACACCTGGATCAGACCTWT1Seq-WT1-exon9-ForTGCAGACATTGCAGGCATGGCAGGCEBPASeq-CEBPA-1-ForTCGCCATGCCGGGAGAACTCTAACSeq-CEBPA-2-ForCCGCTGGTGATCAAGCAGGA8 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究材料和方法2.5各基因突变的PCR反应体系和程序：收到合成好的引物后，先用1xTE溶液稀释到100uM储存浓度，然后再用超纯水稀释到5uM使用浓度。WT1、IDH1、IDH2、CEBPA基因的扩增模板用步骤2.2中提取的骨髓基因组DNA，NPM1基因扩增模板用步骤2.3中逆转录所得到的cDNA。PCR反应体系和程序如下：PCR反应体系材料加量PCR级水14uL10xPCRBuffer2.5uL2.5mMdNTPs2uL上游引物（5μM）2uL下游引物（5μM）2uLrTaq0.5uL模板2uL总体积25uL2.5.1NPM1PCR反应程序:94℃2min；35cycles94℃30s，60℃10s，72℃1min30s；72℃5min；16℃forever2.5.2WT1、IDH1和IDH2PCR反应程序:94℃2min；35cycles95℃10s，60℃30s，72℃1min；72℃7min；16℃forever2.5.3CEBPAPCR反应程序:95℃2min；35cycles95℃1min，60℃30s，72℃1mins；72℃10min；16℃forever2.6琼脂糖核酸电泳和凝胶成像仪分析（1）称量根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶，并准确称量琼脂糖干粉。(2)熔胶加入到配胶用的三角烧瓶内，加入1×TAE电泳缓冲液（一般20~30ml），使用微波炉加热熔化，琼脂粉溶解并无气泡。(3)倒胶干净的胶槽内摆好梳子，往胶冷却片刻，加入一滴GoldViewⅡ染料，轻轻摇晃以充分混匀凝胶溶液，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。(4)拔梳待大约20min后，轻轻拔掉梳子（若不好拔，可以滴加适量的1×TAE缓冲液）。9 材料和方法中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究（5）向电泳槽中倒入1×TAE电泳缓冲液，没过胶面约1mm；在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loadingbuffer），振荡混匀，用移液枪将混合液缓慢加入凝胶加样孔内；留出一孔加入DNAMarker用来指示条带大小。（6）120V稳压条件下电泳约20分钟。电泳结束后，关上电源，取出凝胶，用凝胶成像分析仪对凝胶进行曝光拍照。2.7PCR产物回收2.7.1PCR产物的凝胶回收针对CEBPA和NPM1基因PCR样本进行凝胶回收（1）电泳结束后，将凝胶放置到凝胶成像仪中，打开紫外装置，切割收集目的条带，置于2mL离心管中。（2）切割得到的凝胶连同离心管进行称重，去除空离心管重量，加入3倍体积凝胶重量的缓冲液DE-A，65℃水浴约10分钟。水浴过程中时刻观察并可进行颠倒混匀，加速其融化，这时溶液呈红色。（3）凝胶完全融化后取出，加入一半缓冲液DE-A体积的缓冲液DE-B，此时溶液立刻显示为黄色。漩涡震荡，随后短暂离心。（4）用移液枪将这些溶液吸出放入事先准备好的，含有制备管的2mL离心管中，随后11200rpm离心1分钟。（5）弃掉离心管中废液，加入500uL的清洗液1，随后11200rpm离心30秒。（6）弃掉离心管中废液，向其中加入700uL的清洗液2，11200rpm离心30秒钟，重复步骤（6）。（7）弃掉离心管中废液，将带有制备管的离心管空离1分钟。（8）离心完成后，将制备管放入事先准备好的新的1.5mL离心管中，室温放置5分钟，随后将65℃预热的25uLPCR级水，精确滴于制备管中部，室温静置2分钟后，放离心机中11200rpm离心2分钟，回收溶液即为纯化后的PCR产物片段，-30℃保存，测序时取出使用。2.7.2PCR产物的PCR液回收针对IDH1、IDH2、WT1基因PCR产物进行PCR液回收（1）向PCR反应液中加入3倍体积的A缓冲液，补足到100uL。震荡混匀。10 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究材料和方法（2）将混匀好的液体吸出，加入到2mL离心管中（事先放入制备管）11200rpm离心1分钟。（3）弃掉离心管中废液，将制备管重新置入离心管中，加入700uL的清洗液2，11200rpm离心1min。（4）弃掉离心管中废液，将制备管重新置入离心管中，再次加入500uL的清洗液2，11200rpm离心1min。（5）弃掉离心管中废液，将制备管重新置入离心管中，空离1min。（6）将制备管放入事先准备好的新的1.5mL离心管中，室温静置5分钟，向吸附柱的中间部位悬空滴入25uL预热的超纯水，室温静置2分钟后，11200rpm离心2min，回收液即为纯化回收的PCR产物片段，-30℃保存，测序时取出使用。2.8PCR产物测序对NPM1、CEBPA基因的产物进行跑胶后胶回收后测序，另外IDH1、IDH2、WT1三个基因，统一对其进行PCR液清洁回收后测序。所有的回收纯化样本，我们将集中送往苏州金唯智生物科技有限公司和苏州大学附属第一医院测试中心进行检测。测序后反馈的结果首先与NCBI-Gene-BLAST数据库进行初次序列比对，并且同时通过Chromas软件对测序结果的峰图再次进行验证，从而更明确的排除杂乱峰图对突变判断的影响，以确保测序结果的可信度。2.9统计分析方法统计分析使用SPSS19.0软件(SPSS，IL，USA)，连续性变量资料采用Mann-Whitney非参数检验，数据用中位数表示。分类资料采用卡方检验。Graphpadprism6.0进行Kaplan-Meier生存曲线绘制，Log-Rank检验组间差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。11 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果1.病人样本相关临床信息本研究使用的病人样本为苏州大学附属第一医院血液科2006年至2011年期间就诊收集的289例AML患者，这些病人样本已及对应的相关临床信息由苏州大学附属第一医院血液科刘红老师等提供，且本研究通过苏州大学伦理协会审核。所有确诊的AML患者都按照FAB（French-American-British）分型标准进行分型，共分为八个亚型：M0-M7，确诊时间为2005年到2011年之间。就诊时患者年龄均小于80岁，其中男167例，女122例，中位年龄41(8-79)岁。FAB分型：M0(10例)、M1(51例)、M2(71例)、M3(43例)、M4(38例)、M5(58例)、M6(12例)、M7(2例)、未能分型(4例)，所有新诊断的中国AML患者的临床详细信息见表3，9有白细胞计数（WBC）数据的患者265例，中位数65.5（x10/L），范围1.0-490.129（x10/L）；有原始幼稚细胞百分比（Blasts%）数据的患者259例，中位数81.59（%）；有血小板计数（PLT）数据的患者263例，中位数45.0（x10/L），范围0.09-985.0（x10/L）；范围7.0-99.4（%）；拥有预后信息的AML患者131例，仍存活76例，发生死亡55例，中位生存时间为10个月。CharacteristicsAllpatient(N=289)Sex—no.(%)Male131(58.0)Female95(42.0)Age—yearsMedian42Range8~79FABsubtype—no.(%)M010(2.2)M151(21.2)M271(25.7)12 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果表3289名初诊AML患者临床信息M343(17.3)M438(11.9)M558(17.7)M612(1.3)M72(0.9)Notclassified4(1.8)Cytogeneticabnormalities—no.(%)t(15;17)33(13.7)t(8;21)11(4.9)+89(4.0)+215(2.2)Del(7)2(0.9)Del(8)2(0.9)t(9;22)3(1.3)Otherabnormalkaryotypes57(25.2)Normalkaryotype94(41.6)Unknow12(5.3)2.突变分析在本研究中选取的289例初治AML患者样本中，分别检测了NPM1273例，IDH1和IDH2均为243例，WT1240例，CEBPA241例。2.1NPM1基因PCR扩增产物测序结果野生型NPM1基因测序图表现为单一峰型(图1-a)，NPM1突变则由于碱基的插入表现为重叠峰型，测序结果与美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)基因库序列进行比对。我们检测了273例AML患者NPM1基因全长CDS序列的突变情况，下游引物反向测序，结果发现，在273例AML患者中54例检测到突变，总突变率为19.78%，其中A型突变43例(79.6%)(图1-b)，B型突变4例(7.4%)(图1-c)，D型突变4例(7.4%)(图1-d)，J型突变3例(5.6%)(图1-e)。13 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究表4NPM1基因不同突变类型突变类型DNA序列(5-3)野生型CTCTG……GCAGTGGAGGAAGTCTCTTAACAAAATAGA型CTCTGTCTGGCAGTGGAGGAAGTCTCTTAACAAAATAGB型CTCTGCATGGCAGTGGAGGAAGTCTCTTAACAAAATAD型CTCTGCCTGGCAGTGGAGGAAGTCTCTTAACAAAATAGJ型CTCTGCTTGGCAGTGGAGGAAGTCTCTTAACAAAATAG注：红色字体为插入碱基，测序为下游引物反向测序。abdec图1:NPM1基因突变测序图图1：(a)NPM1基因野生型测序图（b）NPM1基因A型碱基插入突变重叠峰型测序图（c）NPM1基因B型碱基插入突变重叠峰型测序图（d）NPM1基因D型碱基插入突变重叠峰型测序图（e）NPM1基因J型碱基插入突变重叠峰型测序图注：红色箭头为碱基插入位置14 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果2.2IDH1基因PCR扩增产物测序结果我们检测了243例AML患者中IDH1的突变情况，结果发现，在243例AML患者中检测到9例AML患者存在IDH1基因的突变，突变率为3.7%（9/243），其中有8例突变位置在其氨基酸密码子第132位，分别为6例R132H，由精氨酸（R，CGT）突变为组氨酸（H，CAT）(图2-b)，1例R132S，由精氨酸（R，CGT）突变为丝氨酸（S，AGT）(图2-c)，1例R132C，由精氨酸（R，CGT）突变为半胱氨酸（C，TGT）(图2-d)，1例突变位置在其氨基酸密码子第134位，由丙氨酸（A，GCT）突变为缬氨酸（V，GTT）（图2-e）。abcdeccc图2：IDH1基因突变测序图图2：（a）红色箭头所指处为IDH1野生型第132位氨基酸密码子精氨酸CGT测序图，蓝色箭头所指处为IDH1野生型第134位丙氨酸GCT测序图。（b）红色箭头所指处为IDH1第132位氨基酸密码子CGT突变位点，碱基由G突变为A，由精氨酸（R，CGT）突变为组氨酸（H，CAT）。（c）红色箭头所指处为IDH1第132位氨基酸密码子CGT突变位点，碱基由C突变为A，由精氨酸（R，CGT）突变为丝氨酸（S，AGT）。（d）红色箭头所指处为IDH1第132位氨基酸密码子CGT突变位点，碱基由C突变为T，由精氨酸（R，CGT）突变为半胱氨酸（C，TGT）。（e）蓝色箭头所指处为IDH1野生型第134位丙氨酸GCT突变位点，碱基由C突变为T，由丙氨酸（A，GCT）突变为缬氨酸（V，GTT）。15 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究2.3IDH2基因PCR扩增产物测序结果我们检测了243例AML患者中IDH2的突变情况，结果发现，在243例AML患者中检测到27例AML患者存在IDH2基因的突变，突变率为11.11%（27/243），其中有23例突变位置在其氨基酸密码子第140位，分别为22例R140Q，由精氨酸（R，CGG）突变为谷氨酰胺（Q，CAG）(图3-b)，1例R140W，由精氨酸（R，CGG）突变为色氨酸（W，TGG）(图3-c)，剩下4例突变为其氨基酸密码子第172位，即R172K，由精氨酸（R，AGG）突变为赖氨酸（K，AAG）(图3-e)。cabcde图3：IDH2基因突变测序图图3：（a）红色箭头所指处为IDH2野生型第140位氨基酸密码子精氨酸CGG测序图（b）红色箭头所指处为IDH2第140位氨基酸密码子CAG突变位点，碱基由G突变为A，由精氨酸（R，CGG）突变为谷氨酰胺（Q，CAG）。（c）红色箭头所指处为IDH2第140位氨基酸密码子TGG突变位点，碱基由C突变为T，由精氨酸（R，CGG）突变为色氨酸（W，TGG）。（d）蓝色箭头所指处为IDH2野生型第172位氨基酸密码子精氨酸AGG测序图。（e）蓝色箭头所指处为IDH2第172位AAG突变位点，碱基由G突变为A，由精氨酸（R，AGG）突变为赖氨酸（K，AAG）。16 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果2.4WT1基因PCR扩增产物测序结果在240例初诊AML患者中，15例（15/240，6.25%）检测到WT1突变，其中第7外显子发生突变的有9例（9/240，3.75%）；6例（6/240，2.5%）发生第9外显子突变。WT1基因野生型测序图表现为单一峰型(图4-a,c)，WT1基因突变则由于碱基的插入或缺失表现为重叠峰型(图4-b),也有部分样本发生点突变(图4-d)，WT1突变类型比较多具体见表5。表5AML患者WT1突变的分子特征WT1Age（y）sexFAB-subtypeKaryotypeDNAchangeLocation50/MM2NormalKaryotypent1297-1298(+C)Exon738/FM2NormalKaryotypent1297-1298（+T）Exon745/FM4NormalKaryotypent1316-1317（+TAGGAT）Exon756/FM2NormalKaryotypent1327-1328（+CGGTC）Exon718/MM4NormalKaryotypent1328(-C,+GG)Exon731/MM2NormalKaryotypent1328(-C,+GG)Exon772/MM5NormalKaryotypent1420-1421（+CA）Exon755/MM046,XY,7q-,inv(9)[10]nt1298-1299（+GG）Exon746/MM246,XY,9q-nt1387-1388（+AGCTCCC）Exon757/FM246,XX,t(8;21)nt1563-1564（+TT）Exon916/MM5NormalKaryotypent1565-1576(-AAGTTCTCCCG,+CCC)Exon921/FM1biphenotypic[7]/46,XY[3]nt1579（–C）Exon930/MM146,XY[20]R458P(CGA-CCA)Exon928/FM346,XY,t(15;17)(q22;q12),del(11)(p13)[10]R462L(CGG-CTG)Exon933/FM5NormalKaryotypeR462P(CGG-CCG)Exon917 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究abcd图4：WT1基因PCR扩增产物测序结果图4:（a）为WT1外显子7未突变产物测序图（b）WT1外显子7nt1297-1298(+C)插入突变测序图（c）为WT1外显子9未突变扩增产物测序图（d）红色箭头所指处为为WT1外显子9第462位氨基酸密码子CGG突变位点，碱基由G突变为C，由精氨酸（R，CGG）突变为脯氨酸（P，CCG）2.5CEBPA基因PCR扩增产物测序结果在检测的241例初治AML患者中检测到49例CEBPA基因突变，突变率为20.33%。49例突变患者中31例为CEBPA双突变（CEBPAdoublemutation），突变率为12.86%，7.46%CEBPA单突变(CEBPAsiglemutation)患者中8例突变位于氨基端（N端），10例突变位于羧基端（C端）。CEBPA基因野生型测序峰图表现为单一峰型(图5-a,c)，CEBPA基因突变则由于碱基的插入或缺失表现为重叠峰型(图5-c,d)，测序序列结果与NCBI进行比对，并且排除SNP多态性位点。18 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果abdc图5：CEBPA基因PCR扩增产物测序结果（a）为第1组引物扩增未突变产物测序图（b）为第1组引物扩增产物突变测序图（c）为第2组引物未突变扩增产物测序图（d）为第2组引物扩增产物突变测序图注：红色箭头所指处因为插入或缺失导致有规律的重叠峰图3.突变与临床参数的关系3.1NPM1突变与AML患者FAB亚型、血液学特征及预后分析3.1.1NPM1突变与AML患者FAB亚型在273例AML患者中共有54例NPM1基因突变，在AML-M1中发生率最高，为19例（19/51,37.25%）,且分布具有统计学意义（P<0.001）（表6），其次是M212例(12/60，20%)，M511例(11/57，19.3%)，M02例（2/7，22.22%）。（表6，图6）19 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究表6NPM1基因突变在不同FAB亚型AML患者中的分布NPM1p-valueNoWildtypeMutantMutant(%)FABtypeM097222.221.000M151321937.250.001M2704812200.961M34338511.630.144M43531411.430.256M557461119.30.918M6121118.30.475M722001.000unclassified4400Total2732345419.78图6：NPM1基因突变在不同FAB亚型AML患者中的分布3.1.2NPM1突变与AML患者血液学特征54例NPM1突变患者在正常核型AML中的发生率为31.1%（P＜0.001），具有统计学差异。NPM1基因突变者发病年龄偏高(P＜0.05)，外周血白细胞（Whitebloodcell）和血小板数(Bloodplatelet）中位数高(P＜0.05)，在性别和骨髓原始细胞百分数（Bonemarrowblast）方面差异无统计学意义（表7）。20 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果表7NPM1突变与AML患者血液学特征NPM1characteristicsMutant（N=54）Wild-type（N=219）pgendermale/female27/27129/290.263Age,yearsMedian(Range)45(16-79）40（8-76）0.033Whitebloodcell(x10E+9/L)Median53.3532.10.036Range1.1-2871-490.12Missing42Bloodplatelet(x10E+9/L)Median46.5320.05Range5-2070-985Missing43Bonemarrowblast,%Median87800.143Range34-977-99.4Missing113KaryotypeNormal3782<0.001Abnormal16117Notdetermined1203.1.3NPM1突变与AML患者预后分析在273例AML样本中，123例有预后信息，其中28例样本为NPM1基因突变，剩下95例样本为NPM1基因野生型。在本研究中未发现NPM1突变与AML患者的生存存在关系（Log-Rank检验，P=0.520）（图7-a）我们又分析了54例有生存信息的正常核型的AML（NK-AML）样本，其中19例样本为NPM1基因突变，剩下35例样本为NPM1基因野生型。同样的我们未发现NPM1突变与正常核型AML患者预后之间的相关性（Log-Rank检验，P=0.352）（图7-b）。21 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究ab图7：NPM1突变与AML患者生预后分析3.2IDH1突变与AML患者FAB亚型、血液学特征及预后分析3.2.1IDH1突变与AML患者FAB亚型在243例AML患者中共有9例IDH1基因突变，其中M13例(3/48，6.25%)、M23例(3/70，4.28%)、M53例(3/41，7.32%)，而在其他亚型中未检测到突变，且IDH1基因突变亚型散布差异不具有统计学意义((P＞0.05)（表8）。表8IDH1基因突变在不同FAB亚型AML患者中的分布IDH1NoWildtypeMutantMutant(%)p-valueFABtypeM066001.000M1484536.250.386M2706734.280.720M34040000.365M42929000.604M5413837.320.362M633001.000M722001.000unclassified4400Total24323493.722 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果图8：IDH1基因突变在不同FAB亚型AML患者3.2.2IDH1突变与AML患者血液学特征我们发现这9例IDH1突变，在性别、年龄、血小板数（Bloodplatelet）、血白细胞计数（Whitebloodcell，WBC）和骨髓原始细胞百分数（Bonemarrowblast）方面差异无统计学意义（表9）。表9IDH1突变与AML患者血液学特征IDH1characteristicsMutant（N=9）Wild-type（N=234）pgendermale/female5/4139/951.000Age,yearsMedian(Range)53(18-62）41（8-79）0.144Whitebloodcell(x10E+9/L)Median86.936.420.106Range12.6-263.40-490.12Missing14Bloodplatelet(x10E+9/L)Median60.5320.185Range14-890-985Missing12Bonemarrowblast,%Median84790.226Range43-97.7-99.4Missing03KaryotypeNormal51010.509Abnormal3122Notdetermined11123 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究3.2.3IDH1突变与AML患者预后分析在243例AML样本中，131例有预后信息，其中6例样本为IDH1基因突变，剩下125例样本为IDH1基因野生型。在本研究中未发现IDH1突变与AML患者的预后存在关系（Log-Rank检验，P=0.877）（图9）图9：IDH1突变与AML患者预后分析3.3IDH2突变与AML患者FAB亚型、血液学特征及预后分析3.3.1IDH2突变与AML患者FAB亚型在243例AML患者中共有27例IDH2基因突变，主要发生于M1和M2亚型中，7例M1(7/48，14.58%),M2(11/70，15.71%)，但未发现统计学意义。其次为M43例(3/29，10.34%)，M52例（2/41，4.88%，M31例(1/40，2.5%)。其在M0中发生率最高，为3例（3/6,50%）,且分布具有统计学意义（P=0.02）（表10，图10）图10:IDH2基因突变在不同FAB亚型AML患者中的分布24 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果表10IDH2基因突变在不同FAB亚型AML患者中的分布IDH2p-valueNoWildtypeMutantMutant(%)FABtypeM0633500.02M14841714.580.393M2705911200.146M3403912.50.528M42926310.340.058M5413924.880.272M633001.000M722001.000unclassified4400Total2432162711.113.3.2IDH2突变与AML患者血液学特征27例IDH2突变在AML中的中位年龄偏高(P＜0.05)，血小板数中位数高(P＜0.05)，且突变与核型相关（P=0.032），易发生于正常核型中，而IDH2突变在性别、外周血白细胞和骨髓原始细胞百分数方面差异无统计学意义（表11）。表11IDH2基因突变与AML患者血液学特征IDH2characteristicsMutant（N=27）Wild-type（N=216）pgendermale/female16/11128/881.000Age,yearsMedian(Range)54(20-71）40（8-79）0.015Whitebloodcell(x10E+9/L)Median44.636.420.77Range1.5-2351-490.12Missing24Bloodplatelet(x10E+9/L)Median51300.02Range5-1650-985Missing2725 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究Bonemarrowblast,%Median79800.92Range48-97.97-99.4Missing76KaryotypeNormal17890.032Abnormal9116Notdetermined1113.3.3IDH2突变与AML患者预后分析在243例AML样本中，128例有预后信息，其中12例样本为IDH2基因突变，剩下116例样本为IDH2基因野生型。在本研究中未发现IDH2突变与AML患者的预后存在关系（Log-Rank检验，P=0.4642）（图11）。图11图11:IDH2突变与AML患者预后分析3.4WT1和CEBPA突变与AML患者FAB亚型、血液学特征及预后分析3.4.1WT1与AML患者FAB亚型在检测的240例AML样本中，共有15例患者发生WT1基因突变，其中M26例(6/69，8.69%)、其次是M53例(3/41，7.31%)、M1和M4各2例，M0和M3各1例。而在其他亚型中未检测到突变，WT1基因突变亚型分布差异不具有统计学意义((P＞0.05)（表12，图12）。26 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果表12WT1突变与AML患者FAB亚型WT1p-valueNoWildtypeMutantMutant(%)FABtypeM065116.670.324M14745210.640.742M2696368.690.32M3393812.560.476M4292726.890.700M5413837.310.726M633001.000M722001.000unclassified4400Total240225156.25图12:WT1突变与AML患者FAB亚型27 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究3.4.2CEBPA突突变AML患者FAB亚型在检测的241例AML样本中，共有49例患者发生CEBPA基因突变，主要发生在M1和M2亚型中，且都具有统计学意义。其中M222例(22/69，31.88%)（P=0.005）、其次是M119例(19/48，31.88%)（P=0.001）、M5和M6各2例，同时在未分型样本中发现2例突变（2/2,50%），M3和M4各1例。具体见（表13，图13）表13CEBPA突变与AML患者FAB亚型CEBPAp-valueNoWildtypeMutantMutant(%)FABtypeM066000.352M148291939.580.001M269472231.880.005M3393812.560.003M4292813.450.016M5413924.880.005M631266.60.106M722001.000unclassified42250Total2411924920.33图13：CEBPA突变与AML患者FAB亚型28 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果3.4.3WT1、CEBPA突变与AML患者血液学特征15例WT1突变AML患者，在性别、年龄、血小板数、血白细胞计数和骨髓原始细胞百分数方面差异无统计学意义。49例CEBPA突变在AML中的骨髓原始细胞百分数偏低(P＜0.001)，血小板数中位数低(P＜0.05)，且突变与核型相关（P＜0.001），在性别比例、外周血白细胞方面差异无统计学意义（表14）。表14WT1、CEBPA突变与AML患者血液学特征WT1CEBPAcharacteristicsMutantN=15)Wild-type(N=225)pMutant(N=49)Wild-type(N=192)PGendermale/female7/8134/910.32626/23116/760.350Age,yearsMedian(Range)38（16-72）41（8-79）0.61540（11-72）42（8-79）0.182Whitebloodcell(x10E+9/L)Median44.6538.90.8724039.150.762Range3.12-135.911-490.127.7-490.121-277.63Missing1562Bloodplatelet(x10E+9/L)Median3132.50.68719.533<0.001Range7-2490-9850-1015-985Missing2772Bonemarrowblast,%Median70.2580.50.09567.580.250.039Range36.5-917-99.47-99.424-98Missing5813KaryotypeNormal9940.1673866<0.001Abnormal611910116Notdetermined0121103.4.4WT1、CEBPA突变与AML患者预后分析在240例AML样本中,127例有预后信息，其中8例样本为WT1基因突变，剩下119例样本为WT1基因野生型。在本研究中未发现WT1突变与AML患者的生存存在关系（Log-Rank检验，P=0.7045）（图14-a）。此外在240例CEBPA基29 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究因检测的AML样本中,127例有预后信息，其中28例样本为CEBPA基因突变，剩下99例样本为CEBPA基因野生型。在本研究中未发现CEBPA突变与AML患者的生存存在关系（Log-Rank检验，P=0.8366）（图14-b）。ab图14:WT1、CEBPA突变与AML患者预后分析a:WT1,b,CEBPA4.基因共突变分析在对289例AML患者进行综合分析后，我们发现所有突变分布在226例患者中，在49例具有NPM1基因突变的患者中，我们发现有6例是NPM1和IDH1基因共突变，两者具有相关性(P<0．05)，而49例具有NPM1基因突变的患者中有11例同时具有IDH2基因突变，两者具有相关性(P<0．001)，49例具有NPM1基因突变的患者中有3例具有CEBPA基因突变，具有统计学意义(P<0.05)，其他基因突变则无明显相关性，具体见表15。表15NPM1、IDH1和IDH2基因突变间的相互关系WT1WT1WildMutantPWildMutantPNPM1Wild116110.745CEBPAWild16990.066Mutant454Mutant426IDH1IDH1WildMutantPWildMutantPNPM1Wild17430.004CEBPAWild17080.688Mutant436Mutant471IDH2IDH2WildMutantPWildMutantPNPM1Wild16710<0.001CEBPAWild159190.26130 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究实验结果Mutant3811Mutant462CEBPAWT1WildMutantPWildMutantPNPM1Wild132450.03IDH1Wild202151.000Mutant463Mutant90IDH1WT1WildMutantPWildMutantPIDH2Wild19691.000IDH2Wild190150.372Mutant210Mutant2105.基因突变与BCL11A表达相关性分析BCL11A（B细胞白血病11A基因），也称做EVI9或者CTIP1，最早发现在人类B细胞-非何杰金氏淋巴瘤中免疫球蛋白基因染色体转位，通过小鼠白血病逆转录病毒插入位点所鉴定，本实验室前期研究结果表明BCL11A在中国AML患者中表达失调，可能预示其在AML发病过程中起到重要作用[18]。是以我们又分析了BCL11AmRNA表达与NPM1，IDH1，IDH2，WT1以及CEBPA突变之间是否存在着一定的相关性。本研究中，有273例的病人检测了NPM1突变，检测到突变的患者有49例，突变率为19.78%，与BCL11AmRNA表达水平具有相关性（P=0.027）（图15），并且NPM1突变更易发生在BCL11AmRNA高表达患者中（P<0.001）（表15）；有243例的病人检测了IDH1，检测到突变9例，突变率为3.7%，且与BCL11AmRNA表达水平及表达没有相关性（P>0.05）（图15,表15）；有243例患者检测了IDH2突变，检测到IDH2突变的患者有27例，突变率为11.11%,IDH2突变患者与未突变患者的BCL11AmRNA表达水平比较有显著差异（P=0.007），IDH2突变易发生于BCL11AmRNA高表达患者中（P=0.005）（图15,表15）。有240例的病人检测了WT1突变，检测到突变15例，突变率为6.25%，且与BCL11AmRNA表达水平及表达没有相关性（P>0.05），有241例的病人检测了CEBPA突变，检测到突变患者49例，突变率为20.33%，且与BCL11AmRNA表达水平及表达没有相关性（P>0.05）（图15），但我们发现CEBPA突变易发生于BCL11AmRNA低表达患者中（P=0.009）（表15）。31 实验结果中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究abced图15：基因突变与BCL11A基因表达水平分析a,NPM1;b,IDH1;c,IDH2;d,WT1;e,CEBPAH-BCL11AL-BCL11AP-valueNPM1(273)Wildtype76148<0.001Mutant3811IDH1(243)Wildtype1061280.960Mutant45IDH2(243)Wildtype911250.005Mutant198WT1(240)Wildtype1041210.332Mutant510CEBPA(241)Wildtype95970.009Mutant1435H-BCL11A：High-BCL11AL-BCL11A:Low-BCL11A表15：基因突变与BCL11A基因表达水平相关性分析32 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究讨论讨论急性髓系白血病(AML)是一组具有高度异质性的恶性克隆性疾病，随着AML“二次打击”学说的广泛接受，对AML基因突变的研究也逐渐增多，由于各种测序技术的迅速发展，陆续报道如NPM1、CEBPA、C-KIT等基因突变会造成白血病细胞增殖失控、凋亡受阻以及分化障碍等现象。这些研究都提示基因改变是AML发病的重要基础。因此这些异常基因的检测对AML患者的治疗和预后判断具有重要的意义。本研究中，我们从苏州大学附属第一医院血液科收集到了289例中国初诊AML患者，并且选取了NPM1，IDH1，IDH2，WT1，CEBPA共五个AML常见基因对它们进行突变检测，用来探讨所选取的AML相关基因在中国初诊AML患者中的突变频率以及这些基因的突变频率在海内外AML患者中的不同，并分析其突变与一些临床指标间的关系。在本研究中，我们发现NPM1突变发生率为19.78%，低于德国（27.5%），日本（22.6%），美国（30.9%），韩国（24.7%）和印度（28.4%）[19-23]，与此前国内的一些研究报道的15–20%的发生率一致[24-26]。NPM1突变主要发生在正常核型的成人急性髓系白血病患者中为31.1%，与此前的报道也是一致的[3]，NPM1基因突变者发病年龄偏高，外周血白细胞和血小板数中位数高，与此前的研究报道一致的[27,28]。有研究指出，NPM1突变患者良好的预后[3,7]，但在本研究中我们未发现NPM1突变与预后之间具有相关性。此外我们还发现NPM1突变易在M1亚型中发生，不仅易与IDH1/IDH2还易与CEBPA基因突变伴随发生。IDH基因突变是AML患者常见的突变类型，在本研究中发现IDHl突变和IDH2突变均存在于AML中。IDH1突变发生率为3.7%，其发生率低于包括美国、英国、加拿大等在内的西方国家的报道[11,29-33]，国内报道2%-6.3%[34-37]，与本研究基本一致。本研究中IDH1突变与CEBPA，WT1突变没有明显关系，这也符合国外的相关报道[38,39]。而在性别、年龄、血小板数、外周血白细胞和骨髓原始细胞百分数方面差异无统计学意义，这可能与我们所用的样本有关。IDH2和IDH1基因是同源基因，且IDH2突变在AML中的发生率比IDH1高，贾祝霞[40]等发现国外报道的IDH2在AML中的突变率为1.4%-23.4%，综合多篇研究发现其突变率为9.3%（336/3613），我们的研究结果为11.11%与上述综合检测结果相近[11,30,31,33 讨论中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究33],且与贾祝霞等研究一致。IDH2突变与正常核型有关，而IDH1突变未发现与正常核型之间的相关性，这与此前报道有些不同[34]。有研究表明，IDH突变与FAB分型有关，主要发生于M1、M2[41]。我们同样发现了这种现象，但不具统计学意义，却发现IDH2突变与M0亚型具有相关性。众多研究表明，IDH2突变的AML患者具有年龄偏大，血小板高的特征，但与性别、白细胞计数、血红蛋白水平、骨髓原始细胞数无相关性，在本研究中我们发现IDH2突变在AML中的中位年龄偏高，血小板数中位数高，在性别比例、外周血白细胞和骨髓原始细胞百分数方面差异无统计学意义，这与之前的研究报道也是一致的[33,39]。IDH1/2突变对于AML预后的影响仍然存在争议，有的研究表明其突变与不良后果有关[11]，也有未能明确对临床反应或生存的影响[39]，还有人报告提高生存[28]，在我们的研究中我们未发IDH1/2突变对生存有影响。WT1突变发生率为6.25%，所有突变都是在外显子7号和9号，未检测该基因其他位置的突变情况，且几乎都为成年患者（表5），低于泰国12.24%[42]，韩国11.8%[23]，也低于英国和法国研究表明成人AML患者中WT1基因突变率为10%左右[43,44]。Hou等[45]研究表明中国成人急性髓系白血病患者中WT1基因突变率为6.8%，本研究与此一致。我们发现在15例WT1突变患者有6例合并CEBPA的突变，有4例合并有NPM1的突变，或但是没有发现WT1突变合并IDH1或IDH2的突变。有研究报道WT1突变患者年龄越小突变率越高，易发生于M6，少发生与M0，在性别、白细胞计数、血小板计数等方面没有差异[45]。然而我们未发现WT1突变与年龄之间有相关性，突变多发生于M2型，这与此前的研究有所不同，在性别、白细胞计数、血小板计数等方面没有差异，与此前研究一致。虽然有一些研究指出WT1基因突变是AML预后不良的指标，但是也有其他研究得到了相反的结论[13,14]，我们则发现WT1突变对预后没有影响。CEBPA基因编码CCAAT增强子结合蛋白，一种粒细胞分化因子，是转录因子家族中的重要成员，在髓系分化中起重要作用[46,47]，国外研究报道CEBPA在AML中的突变率约为5%～14%[48]。本研究检测的AML患者中CEBPA突变的频率为20.33%，其中7.47%的患者为单突变,12.86%的患者为双突变。与先前的中国人群研究报道一致[24,25]。但高于瑞士PabstT等报道的在224例初治AML患者中,CEBPA突变率为8.5%,3.1%为单突变,5.4%为双突变[49]荷兰HollinkIH等报道的在252例初治AML患者中,CEBPA突变率为7.9%，2.4%为单突变，5.6%为双突变[50]，法国PreudhommeC等报道的在135例初治AML34 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究讨论患者中,CEBPA突变率为11.1%,5.2%为单突变,5.9%为双突变[51]，在对CEBPA突变患者的临床分析中,我们发现CEBPA突变多集中在FAB的M1,M2型,这与之前的报道相似[17,52-54]。多个研究表明CEBPA突变患者初诊时更高的血红蛋白计数、白细胞计数、骨髓原始细胞比例和更低的血小板计数[48,55,56]，我们的研究也与之符合，但在性别、年龄和外周血白细胞方面差异无统计学意义。目前认为，CEBPA突变尤其是CEBPA双突变是AML患者预后相对较好的标志[11,17,49,52],我们的分析结果表明CEBPA突变与预后无关。同时本实验室前期研究结果表明BCL11A在中国AML患者中表达异常，可能预示其在AML发病过程中起到重要作用[18]，在本文中我们发现NPM1、IDH2基因突变易发生于BCL11AmRNA高表达患者中，而CEBPA基因突变易发生于BCL11AmRNA低表达患者中。综上所述，本研究检测了NPM1，IDH1，IDH2以及WT1和CEBPA基因突变在中国人群中初诊AML的发生率，及其部分临床特征进行了报道。我们发现CEBPA突变高于国外报道，NPM1，IDH1，WT1基因突变发生率均低于国外报道，IDH2基因突变发生率与国内外报道相似，且每种基因突变都有其独特的临床特征，在本研究中未发现突变与预后之间存在相关性。我们发现NPM1、IDH2和CEBPA基因突变与BCL11A基因表达水平具有一定的相关性，这些研究发现为进一步研究基因突变与白血病发生之间的关系提供了初步的数据支持。35 参考文献中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究参考文献1.ChesonBD,BennettJM,KopeckyKJ,BuchnerT,WillmanCL,EsteyEH,SchifferCA,DoehnerH,TallmanMS,ListerTA,Lo-CocoF,WillemzeR,BiondiA,HiddemannW,LarsonRA,LowenbergB,etal.RevisedrecommendationsoftheInternationalWorkingGroupforDiagnosis,StandardizationofResponseCriteria,TreatmentOutcomes,andReportingStandardsforTherapeuticTrialsinAcuteMyeloidLeukemia.Journalofclinicaloncology.2003;21(24):4642-4649.2.GrimwadeD,WalkerH,HarrisonG,OliverF,ChattersS,HarrisonCJ,WheatleyK,BurnettAKandGoldstoneAH.Thepredictivevalueofhierarchicalcytogeneticclassificationinolderadultswithacutemyeloidleukemia(AML):analysisof1065patientsenteredintotheUnitedKingdomMedicalResearchCouncilAML11trial.Blood.2001;98(5):1312-1320.3.FaliniB,MecucciC,TiacciE,AlcalayM,RosatiR,PasqualucciL,LaStarzaR,DiverioD,ColomboE,SantucciA,BigernaB,PaciniR,PucciariniA,LisoA,VignettiM,FaziP,etal.Cytoplasmicnucleophosmininacutemyelogenousleukemiawithanormalkaryotype.TheNewEnglandjournalofmedicine.2005;352(3):254-266.4.ForanJM.Newprognosticmarkersinacutemyeloidleukemia:perspectivefromtheclinic.HematologyAmericanSocietyofHematologyEducationProgram.2010;2010:47-55.5.SantamariaCM,ChillonMC,Garcia-SanzR,PerezC,CaballeroMD,RamosF,deCocaAG,AlonsoJM,GiraldoP,BernalT,QueizanJA,RodriguezJN,Fernandez-AbellanP,BarezA,PenarrubiaMJ,BalanzateguiA,etal.Molecularstratificationmodelforprognosisincytogeneticallynormalacutemyeloidleukemia.Blood.2009;114(1):148-152.6.TakahashiS.Currentfindingsforrecurringmutationsinacutemyeloidleukemia.Journalofhematology&oncology.2011;4:36.7.SchnittgerS,SchochC,KernW,MecucciC,TschulikC,MartelliMF,HaferlachT,HiddemannWandFaliniB.Nucleophosmingenemutationsarepredictorsoffavorableprognosisinacutemyelogenousleukemiawithanormalkaryotype.Blood.2005;106(12):3733-3739.36 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中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究综述综述：急性髓系白血病中IDH基因突变研究进展摘要：异柠檬酸脱氢酶（Isocitratedehydrogenase，IDH)基因突变是急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)中的一类新的突变，在大约20％的成年急性骨髓性白血病患者中检测到异柠檬酸脱氢酶（IDH）基因的突变，尤其在正常核型AML(normalkaryotypic,AML)中的发生率较高，不同的亚型对成人AML预后影响各异，同时还受其他分子生物学的影响。研究表明IDH突变与AML的复发、治疗反应等相关，因此是AML的一种合适的分子标志，作为其MRD（minimalresidualdisease）的监测。本文就急性髓性白血病中IDH基因突变及其与分子遗传学、细胞遗传学、临床特征和相关抑制剂研发等方面的研究进展进行了综述。关键字：急性髓系白血病，IDH，突变前言急性髓系白血病(AML)是一种分子异质性的疾病，其主要特征为遗传学和表观遗传学异常导致造血干/祖细胞的增殖和分化以及自我更新异常，AML的特征在于骨髓谱系分化不良细胞的克隆增殖[1]。这些异常表现为染色体的易位、倒位和缺失等。研究指出约有50%的急性髓系白血病没有染色体异常，而表现为正常染色体核型[2]。近年来，IDH1和IDH2基因的突变被发现在包括AML的一系列恶性肿瘤中，为AML靶向治疗提供新的位点。恶性肿瘤发生IDH1/2突变的一个重要的方面是α-酮戊二酸的消耗并产生异常的代谢产物2-羟基戊二酸（2-HG），这可能起着关键的致癌作用。最近有研究报道，IDH1/2突变体AML患者的血清，骨髓和尿液中2-HG显着升高，并且该代谢物的水平与疾病进展和治疗反应直接相关。IDH1/2突变的发现及其对重要的蛋白质和代谢途径的影响，为开发靶向治疗提供了理论支持。IDH1/2抑制剂目前正在进行临床前期研究，其他治疗方法包括DNA甲基转移酶抑制剂和通过抑制谷氨酰胺酶靶向谷氨酰胺代谢的试剂也处于临床前和临床研究中。一、IDH的结构与功能异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase，IDH)是参与多种细胞过程的同型43 综述中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究二聚酶，包括适应缺氧，组蛋白去甲基化和DNA修饰[3]。IDH蛋白依靠辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）来催化异柠檬酸产生α-酮戊二酸（α-KG）。IDH1基因位于人类2号染色体2q33,包含10个外显子,IDH1蛋白位于胞浆和过氧化物酶体内，是TCA循环中的一种重要催化酶，它的作用是将细胞质中存在的异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸，参与三羧酸循环氧化供能，此外还参与了细胞质中NADPH的产生和脂肪酸的生物合成，是谷胱甘肽还原反应过程中所需细胞NADPH的主要来源[4]编码IDH2酶的IDH2基因位于人类15号染色体带15q26，含11个外显子，定位于线粒体，IDH2蛋白是三羧酸（也称为“柠檬酸”或“Kerbs”）循环的关键组分。IDH3也位于线粒体中，但迄今为止还没有报道IDH3基因的致癌突变[5]。IDH2除参与机体抵御λ－射线、高糖环境等作用外，还在癌细胞对TNF-α和抗癌药物敏感性方面起作用[6]。二、AML中IDH基因突变特点与其临床意义IDH1/IDH2基因突变是AML中的一种常见突变，自2009年Mardis等[7]第一次报道了AML患者存在IDH1基因突变以来，越来越多的研究开始发现IDH1和IDH2基因突变在AML患者中具有重要意义。在AML中，IDH突变随年龄增加而增加，IDH2突变比IDH1突变更常见，IDH1和IDH2不易同时发生突变，共同突变仅发生在少数病人中[8,9]。IDH基因在4号外显子上发生突变，从而引起其编码的精氨酸(R)被其他氨基酸代替,从而影响蛋白质功能，主要包括IDH1-R132、IDH1-R134、IDH2-R140、IDH2-R172几种突变类型。在这四种突变中，IDH1-R132突变的位点为132密码子，目前检测发现5种不同类型的精氨酸被其他氨基酸取代，分别为组氨酸(R132H)，亮氨酸(R132L)，半胱氨酸(R132C),甘氨酸(R132G)和丝氨酸(R132S),其中R132H突变最为常见(50%)，其次是R132C(30%)[10-13]。IDH2-R140突变的位点为140密码子，可检测到3种不同的精氨酸被其他氨基酸取代，分别为谷氨酸(R140Q)、亮氨酸(R140L)和色氨酸(R140W),IDH2-R172突变是指172密码子位点的突变，除了少数的精氨酸被蛋氨酸取代(R172M)外，其余均为精氨酸被(R172K)赖氨酸取代，其中R140突变约占70%-80%[14-16]。文献报道IDHl和IDH2突变在正常核型AML患者中的突变率分别为5.5%-10.9%[10,17,18]和3%-17.7%[11,19,20],国内报道IDH144 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究综述和IDH2突变率分别为4.3%-14.6%,2.2-11%[21-23]。临床研究表明，与野生型IDH相比，IDH突变的患者年龄较大，往往具有较高的血小板和骨髓细胞计数,低的外周血白细胞计数[9,14,24,25]。但Abbas等[26]的临床研究结果显示两者之间的差异无统计学意义IDH基因突变易发生于正常核型，约25-30%正常核型发生突变，IDH经常和NPM1基因同时发生突变,因为IDH突变与TET2和WT1突变导致了类似的表观遗传学改变，可能在白血病发生中具有重叠作用。所以IDH突变几乎总是与Wilms肿瘤1（WT1）基因和TET2突变相互排斥[1,10,14,17,18,25,27,28]。IDH突变和FMS相关酪氨酸激酶3的共同发生（FLT3）突变较少。Marcucci等[14]报道358例新生CN-AML患者的临床疗效,结果显示IDH1突变患者不太可能有FLT3-ITD。有趣的是，比较与其他类型的IDH突变，IDH2-R172突变不太可能伴随着AML中另外经常发生的突变（例如，FLT3-ITD，CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPA）或NPM1）[27,29].研究发现，不论成人及儿童，伴IDH突变的AML在FAB分型中多表现为M1、M2亚型[30-32].目前，IDH1/2突变对于AML预后的影响仍然存在争议，几项研究表明与不良后果有关[10,14,24,33,34]，而其他人未能明确对临床反应或生存的影响[9,17,26,35],还有人报告改善生存[28,29],一项包括8121例AML患者的Meta分析显示，与没有突变的患者相比，IDH1突变患者的OS较差，IDH1突变CN-AML患者的细胞毒性诱导化疗具有较低的完全缓解率（CR）。有研究表明发现IDH1-R132突变对OS没有影响，但IDH1单核苷酸多态性rs11554137变体与不良预后相关[17]，同样的IDH2突变的预后影响分析也显示除了不一致的结果，例如，在一项关于CN-AML患者的研究中，与IDH2野生型相比，IDH2突变对OS或CR率无影响[19]。但在另一项研究中IDH2突变表现出较低的CR率，高复发率和较短的OS[27]。研究方法的差异可能导致预后研究结果的差异。一些研究通过点突变评估IDH突变，其他研究则结合IDH1/2突变进行分析[26,34,36]。具体来说，关于IDH2突变，R172和R140突变经常一起分析,尽管数据表明这些突变对预后有不同的影响[1,14,20,27,28,37]。最近，Papaemmanuil等人[37]提出了新的基因组分类AML，包括“IDH2-R172突变”作为一个新的分类，并建议将IDH2测试添加到预后指南，在他们针对1540例AML患者的研究中，IDH2-R172突变没有伴随其他类别定义的病变（例如FLT3，NPM1），与其他类型的IDH突变相比，代谢活动异常更加严重。45 综述中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究然而，与以前的报告不同[14,20,27]研究人员发现IDH2-R172突变对AML预后相对有利[20]。目前尚不清楚突变背景是否可能影响AML预后，例如，有关于存在NPM1+和FLT3-ITD-的IDH1/2突变患者，一些数据表明预后更好，一些显示预后变差或没有影[10,20,26,28,34,38,39]。血清中（R）-2-HG浓度也可作为预后指标，高浓度的（R）-2-HG显示出低的CR率和OS，药物治疗后（R）-2-HG的水平也可能具有预后意义，在223例标准诱导化疗药物治疗的年轻患者中，包括62例IDH突变患者，（R）-2-HG的血清水平较高的患者CR率较高但OS较差。关于（R）-2-HG水平和临床结果之间的关系还需要进一步调查[40]。三、IDH基因突变与AML的发生在体外和体内的研究表明，突变的IDH酶具有新的形态活性，能依赖NDAPH催化α-KG转化为（R）-2-HG，也称为2-HG[41-43]。在AML中尚未报道（S）-2-HG对映异构体水平升高。在利用IDH1突变和核磷酸1（NPM1）突变的患者建立的AML异种移植模型中，（R）-2-HG而不是（S）-2-HG作为代谢产物，并且每日给予（R）-2-HG的小鼠与每日（S）-2-HG处理的小鼠相比，有显著的低血小板计数和更短的生存时间[44]。在未成熟的造血细胞中高浓度的（R）-2-HG产生增殖曾速和分化阻滞现象[45]。具有内源性IDH突变的细胞系（例如，CS-1软骨肉瘤）或被工程化以表达突变体IDH蛋白（例如，TF-1人红白血病）显示（R）-2-HG的水平显著增加和细胞分化受损[45-47]。IDH突变的AML的患者的血清中（R）-2-HG的水平比正常生理条件下预期高100倍以上[43,48（]R）-2-HG在结构上于α-KG类似，并已显示出与α-KG竞争抑制α-KG依赖性酶，包括十一位易位（TET）家族的5-甲基胞嘧啶羟化酶，jumonji结构域的蛋白质家族和组蛋白赖氨酸脱甲基酶，导致DNA损坏，改变DNA的表观遗传学，引发白血病的发生[3,49,50]。虽然IDH1突变酶和IDH2突变酶都产生（R）-2-HG，但它们具有不同的酶活性。或许是因为在线粒体中具有比细胞质中更多量的α-KG底物,研究表明细胞质IDH1突变酶比线粒体IDH2突变酶产生较少的（R）-2-HG[42]。在IDH1突变/IDH1野生型异聚体的存在下可以促进（R）-2-HG的产生，这提示IDH1野生型酶可以催化部分α-KG转化为（R）-2-HG。而IDH2突变酶同二聚体却可以产生大量的（R）-2-HG，且IDH2-R172突变比IDH2-R140突变产生更多的（R）-2-HG[45,47,51]。46 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究综述四、IDH基因突变AML患者治疗策略1、诱导化疗化疗是治疗AML患者最常见手段，所有患者均可使用，包括那些具有IDH突变的患者。有报道显示，具有IDH突变的诱导化疗患者与IDH野生型患者相比，治疗效果没有差异或者依赖于NPM1突变或其他共突变的存在相关。一项针对AML治疗的患者进行的大型回顾性研究中发现，接受前线诱导或挽救化疗的IDH突变患者的反应率与IDH未突变患者的反应率无关，且与其他共突变也无关。相++-反，在[14]等人的研究中患有CN-AML和IDH1/NPM1/FLT3-ITD基因型的患者明显较短的后诱导无病生存期,IDH2-R172突变患者获得CR的可能性也明显较低[9,10,14,28,52]。2、DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTI，去甲基化药物（HMA））氨氮西啶和地西他滨是美国食品和药物管理局（FDA）批准用于治疗MDS患者的DNA甲基转移酶抑制剂，这些药物已被广泛用于不能耐受或其疾病侵袭性治疗失败的AML患者，作为替代高剂量诱导化疗的一种手段，因为甲基化是髓系恶性肿瘤中IDH1/2突变的致病特征，这为使用去甲基化药物提供了理论支持。约30-50％的AML和MDS患者对去甲基化药物反应[53-55]。然而，IDH突变能提高患者疗效的证据还不充足[56,57]。对于11名IDH突变的MDS患者的回顾性研究显示，地西他滨的去甲基化治疗效果优于化疗[58]。相反的，对68名年龄较大的IDH1/2突变患者（＞60岁）进行了初诊，继发性或治疗相关性AML的研究发现，治疗效果与一线去甲基化药物治疗，使用或不使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂治疗无关[57]。HMAs在IDH突变AML中模棱两可的功效可能与组蛋白和DNA超甲基化以外的过量（R）-2-HG有关[48]。Heuser等人[59]预测，HMA在与IDH突变体抑制剂的组合可以增强和加速治疗反应。3、IDH突变体抑制剂选择性突变IDH1和IDH2抑制剂正在临床开发中[60,61]，这些药物在突变的IDH酶的活性催化位点内结合，并防止IDH突变所需的构象变化将α-KG转化为（R）-2-HG[62-64]。在临床前研究中，AGI-6780是IDH2-R140Q突变的选择性抑制剂，被证明可以快速降低组蛋白的高甲基化和几周内逆转DNA超甲基化[62,47 综述中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究63]。AG-120，AG-221，AG-881，IDH305和FT-2102是IDH突变蛋白的小分子变构抑制剂，AG-120是突变体IDH1-R132酶的口服抑制剂,，目前正在一期剂量递增和扩张试验[44,60,61]。AG-120和AG-221都显示出促进AML患者白血病细胞分化的作用[61,65]。这些药物被认为是没有细胞毒性的，并且与传统化疗药物相比，发生血小板减少症和中性粒细胞减少症的概率也较低。因此，在理论上，复发或难治性（R/R）疾病的IDH突变患者中，单独或在组合使用这些药物或许是一种最佳的治疗方案。药物的研究进展具体见下表1。表1BCMedeirosetal.2017药物作用机制临床时期病人类型临床效果IDH2蛋白突变体小1期剂量递增和扩张研AG-221分子抑制2和3R/RAML(二期)，年龄大于60，R/RAML(三期)究中41％ORR剂，降低2-HGIDH1蛋白突变体小1期剂量递增和扩张研AG-120分子抑制2IDH1突变造成的髓系血液病究中5％ORR剂，降低2-HGIDH1/2蛋白突变体小分AG-8811mIDH1和mIDH2复发或难治晚期血液恶性肿瘤未知子抑制剂，降低2-HGIDH1蛋白突变体小IDH3051IDH1突变造成的血液病未知分子抑制剂未充分阐FT-21021/1bAML或高危MDS与mIDH1评估为单一疗法未知明5.5％ORR（5/32）;在Bcl-2小分并与R/RAML和不适合化疗阿胺嘧啶的患者结合使ABT-19926/11（54％）mIDHAML子抑制剂用患者展现抗白血病活性谷氨酰胺初步数据显示2/16名可CB-8391R/RAML和老年患者（大于60岁）（包括ALL患者）酶抑制剂评估患者获得CR结语IDH基因突变是AML患者常见的一种分子突变类型，鉴定AML中的IDH突变并阐明改变的分子途径，对我们理解AML的形成和治疗具有重要意义。IDH突变所得到的代谢产物2-HG及其表观遗传调节作用为代谢组学与肿瘤进展之间的复杂关系提供了新的见解。这些研究还为发现新的肿瘤标志物和靶向治疗的发展提供了新契机。DNA和组蛋白的异常甲基化使基因组表观遗传学发生改变，目前去甲基化药物已应用于临床治疗，并取得了振奋人心的效果。针对IDH突变对表观遗传学的影响来寻找新的血液系统肿瘤治疗靶点，找到更多靶向药物，为患者提供个体化治疗,这将有益于改善AML患者的治疗，提高AML患者的预后。48 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究综述参考文献1.DohnerH,WeisdorfDJandBloomfieldCD.AcuteMyeloidLeukemia.TheNewEnglandjournalofmedicine.2015;373(12):1136-1152.2.ByrdJC,MrozekK,DodgeRK,CarrollAJ,EdwardsCG,ArthurDC,PettenatiMJ,PatilSR,RaoKW,WatsonMS,KoduruPR,MooreJO,StoneRM,MayerRJ,FeldmanEJ,DaveyFR,etal.Pretreatmentcytogeneticabnormalitiesarepredictiveofinductionsuccess,cumulativeincidenceofrelapse,andoverallsurvivalinadultpatientswithdenovoacutemyeloidleukemia:resultsfromCancerandLeukemiaGroupB(CALGB8461).Blood.2002;100(13):4325-4336.3.ClarkO,YenKandMellinghoffIK.MolecularPathways:IsocitrateDehydrogenaseMutationsinCancer.Clinicalcancerresearch.2016;22(8):1837-1842.4.LeeSM,KohHJ,ParkDC,SongBJ,HuhTLandParkJW.CytosolicNADP(+)-dependentisocitratedehydrogenasestatusmodulatesoxidativedamagetocells.Freeradicalbiology&medicine.2002;32(11):1185-1196.5.WillanderK,FalkIJ,ChairetiR,PaulE,HermanssonM,GreenH,LotfiKandSoderkvistP.Mutationsintheisocitratedehydrogenase2geneandIDH1SNP105C>Thaveaprognosticvalueinacutemyeloidleukemia.Biomarkerresearch.2014;2:18.6.KilIS,KimSY,LeeSJandParkJW.SmallinterferingRNA-mediatedsilencingofmitochondrialNADP+-dependentisocitratedehydrogenaseenhancesthesensitivityofHeLacellstowardtumornecrosisfactor-alphaandanticancerdrugs.Freeradicalbiology&medicine.2007;43(8):1197-1207.7.MardisER,DingL,DoolingDJ,LarsonDE,McLellanMD,ChenK,KoboldtDC,FultonRS,DelehauntyKD,McGrathSD,FultonLA,LockeDP,MagriniVJ,AbbottRM,VickeryTL,ReedJS,etal.Recurringmutationsfoundbysequencinganacutemyeloidleukemiagenome.TheNewEnglandjournalofmedicine.2009;361(11):1058-1066.8.PlattMY,FathiAT,BorgerDR,BrunnerAM,HasserjianRP,BalajL,LumA,YipS,Dias-SantagataD,ZhengZ,LeLP,GraubertTA,IafrateAJandNardiV.DetectionofDualIDH1andIDH2MutationsbyTargetedNext-GenerationSequencinginAcuteMyeloidLeukemiaandMyelodysplasticSyndromes.TheJournalofmoleculardiagnostics:JMD.2015;17(6):661-668.49 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综述中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究MurrayS,,etal.IDH2mutation-inducedhistoneandDNAhypermethylationisprogressivelyreversedbysmall-moleculeinhibition.Blood.2015;125(2):296-303.64.RohleD,Popovici-MullerJ,PalaskasN,TurcanS,GrommesC,CamposC,TsoiJ,ClarkO,etal.AninhibitorofmutantIDH1delaysgrowthandpromotesdifferentiationofgliomacells.Science.2013;340(6132):626-630.65.YenK,TravinsJ,WangF,DavidMD,ArtinE,StraleyK,PadyanaA,,etal.AG-221,aFirst-in-ClassTherapyTargetingAcuteMyeloidLeukemiaHarboringOncogenicIDH2Mutations.Cancerdiscovery.201756 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究发表论文攻读学位期间本人参与发表的学术论文论文：1.张繁，尹甲伟，谢晓丽等.中国人急性髓系白血病患者NPM1、IDH1和IDH2基因突变检测及其临床特征研究[EB/OL].北京：中国科技论文在线[2016-12-20].http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201612-394.##2.JiaweiYin,FanZhang,HuiquanTao,XiaoMa,guangsongSu,XiaoliXie,ZhongjuanXu,YanwenZheng,HongLiu,ChaoHe,ZhengweiJennyMao,ZhiweiWang,WeirongChang,RobertPeterGale,DepeiWu,BinYin.BCL11AExpressioninAcutePhaseChronicMyeloidleukemia.LeukemiaResearch.2016,47:88-92.#Co-firstauthor###3.JiaweiYin,XiaoliXie,FanZhang,ZhengChen,ChenxiHu,GuangsongSu,HongLiu,YanwenZheng,ChaoHe,HongjieShen,QiaohongQiu,JunHe,ZhirongPan,RPGale,DepeiWu,BinYin.LowfrequencyofmutationsinChinesewithacutemyeloidleukemia:Differentdiseaseordifferentaetiology?LeukemiaResearch.2015;39(6):646-8.#Co-firstauthor57 缩略词中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究缩略词英文缩写中文名称AML急性髓系白血病AML-M0急性髓系白血病微分化型AML-M1急性粒细胞白血病未分化型AML-M2急性粒细胞性白血病部分分化型AML-M3急性早幼粒细胞白血病AML-M4急性粒单核细胞白血病AML-M5急性单核细胞白血病AML-M6红白血病AML-M7急性巨核细胞白血病IDH1异柠檬酸脱氢酶1NCBI美国国立生物技术信息中心IDH2异柠檬酸脱氢酶2NPM1核仁磷酸蛋白1WT1Wilms肿瘤因子1CEBPACCAAT增强子结合蛋白ADEPC焦碳酸二乙酯PBS磷酸盐缓冲液WBC白细胞计数PLT血小板计数Blasts原始幼稚细胞CR完全缓解OS总生存率h小时min分钟s秒CN-AML染色体核型正常的急性髓细胞白血病FAB法-美-英分型58 中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究致谢致谢光阴似箭，岁月如梭。又到一年春暖花开，又是一年离别之时，三年的研究生生活转眼间即将画上句号，思绪万千，却有更多感激之情。临近毕业，谨向给予我指导、关心、帮助和支持的老师、同学和家人表示最真挚的感谢！衷心感谢我的导师尹斌教授。感谢您三年年如一日，不厌其烦，孜孜不倦的指导，是您的指导与鼓励，您的兢兢业业，以身作则和勇攀高峰的精神深深感染着我，您对科研的热爱和执着熏陶着我，这将都是我人生行进路上的宝贵经验和重要财富。三年前我来到这里，您为我选题，指导实验，解答疑惑，争执讨论，从课题的设计、反复实验到论文的撰写您付出了巨大的心血和汗水，您的细致耐心让我感到羞愧之余更感觉自己存在诸多不足，今后将继续以此为标准和榜样，继续前行。衷心感谢实验室的郑彦文老师、何超老师在我课题进行中遇到的实验问题上给予的悉心指导和讲解。感谢实验室陶惠泉博士、尹甲伟博士和苏光松师兄以及马佳博士、赵文俊、连雪琪、魏丽蓉、谢晓丽师姐等同学对我的热心帮助和支持，回忆往昔，历历在目和你们曾经一起走过的日子，令人深刻，收获得感动，也让我终生不忘。衷心感谢苏州大学唐仲英血液研究中心，感谢中心提供的先进的仪器设备和优异的实验坏境，衷心感谢苏州大学唐仲英血液研究中心的何苏丹教授、宋耀华教授、赵昀教授、王志伟教授对我课题思路和实验验证方面提出的建议和指导，以及周泉生教授和杨林教授在论文修改方面给予的指导。感谢中心王志伟老师实验室苏静娜同学和殷旭圆同学以及王利霞师姐在我做实验过程中给予的建议和热心帮助。另外，衷心感谢叶明昌老师、李国平老师和陈巧巧老师等在工作学习和生活中给我的诸多帮助，让我倍感温暖。衷心感谢江苏省血研所阮长耿院士和苏州大学附属第一医院刘红老师、沈宏杰老师在临床病人标本和临床信息及测序方面给予的支持。在三年辛苦而又充实的研究生生活中，家人一直都是我前进的源泉和动力。每次遇到挫折时，你们对我的牵挂和教导总给我带来鼓舞。你们默默无私的奉献59 致谢中国人急性髓系白血病患者NPM1,IDH1,IDH2,WT1和CEBPA基因突变检测及其临床特征研究着自己的一生，在物质和精神上都给与我巨大的支持，使我完成了学业。同时感谢我身边的朋友，虽然你们不能给我科研的指导，但是在我遇到问题，迷茫不知得时候，但你们总是耐心的倾听，帮我排除疑惑，疏导心情，让我时刻保持清醒的头脑和乐观的态度，让我能够继续前进，不会迷失方向，在此献上我最深的感谢。我相信，毕业不是终点，毕业是人生一个新的起点，我将会用这三年来所学去书写接下来更精彩的未来。张繁2017年4月于苏州大学唐氏中心60 苏州大学硕士学位论文（钟對立）ｊＩ苏州大学研究生院统一印制＾；－－；