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学校代码10459学号或申请号201312443333密级公开硕士学位论文重组腺病毒介导Sox9表达对人椎间盘细胞退变的影响作者姓名：邱如标导师姓名：王珏教授学科门类：医学专业名称：外科学（骨外）培养院系：郑州大学第一附属医院完成时间：2016年5月 AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheestablishmentofSox9geneadenovirusvectorsbyAdmaxpackagingsystemsanditsrelationshipofdegenerativeintervertebraldisccellByRubiaoQiuSupervisor:Prof.JueWangSurgery（DepartmentofOrthopaedics）TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay,2016 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研。究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中Ｗ明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。、学位论文作者：方斬日期：心年月曰（屋学位论文使用授权声明，知识产权归属郑州大学本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品。根据郑州大学有关保留，、使用学位论文的规定同意学校保留或向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时一，第署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者日期年月日主 重组腺病毒介导Sox9表达对人椎间盘细胞退变的影响硕士研究生：邱如标导师：王珏教授郑州大学第一附属医院骨科河南郑州450052摘要研究背景腰背部疼痛是当今困扰人类的最常见骨科疾病之一，其原因有椎间盘退行性变、腰背部肌肉劳损等，其中有约4/5的病人是以下腰痛为主要病症来医院就诊，下腰痛的最主要原因是椎间盘的退行性变。学者发现，椎间盘的退行性变与组[1]织形态学、生物力学、遗传学、基因分子学等有关。椎间盘是脊柱的重要组成部分，其在维持脊柱生理曲度及稳定性方面起着重要的作用。其主要有周围的纤维化组织，中间的髓核组织，以及上下的软骨终板组成，为脊柱应力缓冲的主要结构，起着弹性垫作用。椎间盘退变，在外力的作用下，其纤维环组织退变并破裂，中间的髓核组织通过破裂纤维环的缺口处脱出或者突出后方的椎管内，压迫相应的脊髓和神经，脊髓和神经长期受压，发生水肿、炎症，进而引起腰背痛、下肢无力、疼麻等为主、甚至截瘫的临床症状。陈立等人对椎间盘退行性变的研究表明，在正常的生物应力作用下，软骨终板上的蛋白聚糖合成和降解二者处于动态平衡，而在异常应力的作用下，软骨终板的蛋白聚糖出现合成减少、但是降解增加，打破了这种动态平衡，从而改变了椎间盘的原有组织结构成分，最终导致了椎间盘的退行性变。成年后的椎间盘细胞及组织失去了血液的营养供给，其营养主要依靠终板和纤维环的扩散方式来获取，而随着年龄的增加，椎体的终板逐渐出现钙化甚至硬化，致使椎间盘的营养途径被切断，而导致椎间盘的退行性变。目前相关学者的主要研究方向集中在椎间盘退I 行性变的临床治疗方法，目前针对椎间盘退行性变的主要方案相关的保守治疗以及不同方式的手术治疗，保守治疗包括相应的药物治疗、理疗及卧床休息等，仅能暂时起到缓解或部分缓解临床症状的效果，在身体劳累或者其他应力改变的情况下，上述症状会再次出现，甚至加重。而随着20世纪40年代，Jaslow和[2]Clowoud等人将后路腰椎椎间融合术（PostiveLumbarInterbodyFusionPLIF）的方法引入临床应用，临床上开始应用减压融合术来治疗椎间盘退行性变，其可明显的改善临床症状，但改变了脊柱本身的应力结构，对邻近阶段以及整个脊柱的生物力学的影响，暂时并不十分确切，上述方法虽能缓解或者部分缓解椎间盘退行性变引起的临床症状，但均无法从根本上来治疗椎间盘的退行性变。如何早期发现、并彻底治疗椎间盘的退行性变逐渐成了学者们研究的热点。随着分子生物学的发展，学者们开始着手对椎间盘退行性变的机制上进行基础研[3-4]究，并有部分学者开始使用动物模型来模拟椎间盘退行性变进行基因治疗，并获得了可靠的疗效。目前研究的基因主要包括椎间盘结构相关基因（COLlAl基因、Sox9基因、COL9A2、COL9A3基因、COLllA2基因、PG基因、CILP基因等）、骨质疏松相关基因（维生素D受体基因、雌激素受体基因）、椎间盘代谢相关基因（MMP-1、MMP3基因、TIMP-1、COX-2基因、TIMP-1和COX-2基因、THBS-2基因、ADH基因等）、细胞因子相关基因（炎症相关基因、生长因子类基因等）以及信号传导通路相关基因（GTP环化水解酶(GCHl)等）。而在这其中Sox9基因因其独特的生物学作用成为研究的热点。Sox9基因在Sox基因家族中占据着重要的地位，它主要调控着人以及脊椎动[5]物的生长发育，在软骨生成修复和决定性别方面起着决定作用。1994年，[6]Foster等运用荧光原位杂交等技术，在染色体的17q24位上发现人类Sox9基因。[7]Wagner等通过快速扩增cDNA末端结合人胚胎脑的cDNA文库筛选的方法，成功分离和克隆了人类Sox9基因。随着分子生物学相关技术的发展以及对椎间盘退行性变机制研究的不断深入，从越来越多的相关试验证据中，学者们发现椎间盘的发育、成熟到退变的整个变化过程均有Sox9基因的参与。如今，学者们对Sox9基因可促进II型胶原蛋白、蛋白聚糖的生成以及细胞增殖的作用已十分明确，并对相关调控机制也有[8]了很多了解。Gruber等收集了37例（年龄从15-76岁）人类椎间盘纤维环做Sox9基因的免疫组化染色，发现在年轻人的纤维环细胞中甚至髓核细胞中Sox9基因II 呈均匀染色，随着年龄的增加以及椎间盘的退行性变，纤维环细胞中的Sox9基因染色逐渐的减少甚至消失。已有学者研究证实，在关节炎等相关疾病中高度表达的致炎因子可以明显的抑制Sox9基因的生物学作用，从而减弱了病变软骨的再生和修复能力，而在[9]椎间盘退行性变过程中，Sox9基因的生物学作用是否也被抑制，从而使得退变的椎间盘难以自身修复，在椎间盘退行性变的过程中是否存在Sox9基因的点突变、调控方面的缺陷及为何会出现Sox9基因的表达降低等问题有待进一步地研[10-11]究。故构建安全、可靠、有效的Sox9基因重组腺病毒载体对相关的研究十分必要，以往学者使用较多的AdEasy系统进行腺病毒载体的构建，其在保存和产生效率方面均存在缺陷。而AdMax系统腺病毒包装系统具有操作性简便、病毒重组效率高、基因突变率低、病毒生产率高等优势，选用其构建相关Sox9基因的腺病毒载体，可为进一步研究Sox9基因在椎间盘退行性变中的作用及相关机制提供稳定可靠的腺病毒载体。应用构建的Sox9腺病毒载体感染所培养的人椎间盘髓核细胞，并观察该细胞中II型胶原蛋白及蛋白聚糖的含量发生的变化，以彻底了解该基因对人椎间盘的生物学效应。目的应用AdMax包装系统构建Sox9基因的腺病毒载体，并对其进行鉴定，为Sox9基因的相关研究提供可靠地腺病毒载体。将含Sox9基因的该腺病毒载体感染人椎间盘髓核细胞，了解其对人椎间盘细胞的生物学作用。方法1.腺病毒载体建立法运用PCR方法对Sox9基因进行扩增，将扩增后的基因筛选后重组入线性化的pAV-MCMV-GFP-3FLAG，然后转化入DH5a感受态细胞，得到转化子；运用菌落PCR技术对转化子进行鉴定，鉴定完毕后，所得到的转化子通过AdMax腺病毒包装系统转染入HEK293细胞，并在其中进行包装成熟、扩增。2.腺病毒载体的检测方法应用WesternBlot检测法对Sox9基因重组腺病毒进行检测，把建立的腺病毒载体的病毒DNA进行PCR鉴定、免疫荧光组化测定III 以及基因测序，并进行病毒滴度测定。3.培养人退变椎间盘髓核细胞并感染鉴定好的Sox9基因载体，并通过免疫荧光染色了解退变椎间盘髓核细胞的中II型胶原蛋白的变化。结果在以Sox9基因为模板PCR扩增得到的产物大小：1565bp，并经测序结果与Sox9基因对比分析，表明阳性克隆与Sox9基因一致，说明Sox9基因扩增成功。把获得的病毒DNA进行PCR鉴定，得到1565bp片段，说明Sox9基因片段已经重11组进入腺病毒。腺病毒的滴度为：2.3×10PFU/ml。通过WesternBlot检测，在72-95KDa之间可以看到阳性条带，其与Sox9-GFP-Flag的融合蛋白（56KDa+28KDa+2KDa＝86KDa）的大小吻合。在感染人椎间盘髓核细胞后荧光染色后发现较对照组其II型胶原的含量增加。结论Sox9基因增加了人退变椎间盘细胞的II型胶原蛋白的增加。关键词：Sox9基因腺病毒载体AdMax系统AdEasy系统椎间盘退行性变II型胶原蛋白IV TheestablishmentofSox9geneadenovirusvectorsbyAdmaxpackagingsystemsanditsrelationshipofdegenerativeintervertebraldisccellByRubiaoQiuSupervisor:Prof.JueWangSurgery（DepartmentofOrthopaedics）TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay,2016AbstractBackgroundLowerbackpainisisoneofthemostcommonorthopaedicdiseaseswithtroublehumantoday,itsreasonisintervertebraldiscdegeneration,strainoflumbarmuscles,etc.About4/5ofthepatientsgotohospitalbecauseoflowerbackpainasthemainsymptoms,themainreasonofwhichisintervertebraldiscdegeneration.Nowscholarsandcliniciansmainlyresearchthetreatmentofintervertebraldiscdegeneration,butthebasicresearchonthemechanismofintervertebraldiscdegenerationisrarelyresearched,relatively.Sox9geneoccupiestheimportantpositionintheSoxgenefamily,itmainlyregulatesthegrowthanddevelopmentofthepeopleandvertebrate,aswellasplayingadecisiveroleinthecartilagerepairmentandgenderdetermination.In1994,Foster,etc.foundahumanSox9geneinthechromosome17q24usingthetechnologyoffluorescenceinsituhybridizationandsoon.Wagner,etcsuccessfullyseparatedandclonedthehumanSox9genebyamplificatingrapidlycDNAterminalbindingtohumanembryonicbraincDNA.WiththedevelopmentofmolecularbiologyrelatedtechnologyandtheV deepeningoftheresearchonmechanismofintervertebraldiscdegeneration,scholarsfoundthattheSox9geneparticipatesinthewholechangingprocessofupgrowthmaturityanddegenerationofintervertebraldisc,andfrommoreandmoretherelevanttestsevidence.Now,itisveryclearthattheSox9genepromotestheformationoftypeIIcollagen,proteoglycanandcellproliferation,andscholarsalsohavealotofunderstandingtorelevantregulatorymechanismGruberetc.collected37cases(agedfrom15to76)humanintervertebraldiscannulustoconducttheSox9geneimmunohistochemicalstaining,foundingthatSox9genestainshomogeneouslyinyoungpeople'sannulusfibrosuscellsandnucleuspulposuscellsandwiththeincreasementofageandintervertebraldiscdegeneration,Sox9geneintheannulusfibrosuscellsdyeinggraduallyreducesorevendisappears.Itisverifiedbyscholarsthat,pro-inflammatorycytokinehighlyexpressedinrelateddiseasessuchasarthritiscansignificantlyinhibitbiologicalfunctionoftheSox9gene,thusweakenedtheregenerationandrepairmentofabnormalcartilage,andfurtherresearchisremainedthatthebiologicalfunctionofleadingtodifficultlyrepairitselfisalsosuppressedintheprocessofintervertebraldiscdegenerationandwhetherthereexiststheSox9genepointmutationandregulationofdefectsandwhytheSox9geneexpressionreducesintheprocessofintervertebraldiscdegeneration.Sobuildingsafe,reliableandeffectiveSox9generecombinantadenovirusvectorsofrelevantresearchisquitenecessary,andpreviousscholarsusemoreAdEasysystemfortheconstructionofadenovirusvector,whichexistsdefectsinthepreservationandproducingefficiency.AdMaxsystemhasadvantageofeasyoperation,higherefficiencyofvirusrecombination,lowerrateofmutation,higherefficiencyofproductivityandsoon.ItcanprovidestableandreliableadenovirusvectorforfurtherstudyoftheroleandrelatedmechanismintheIntervertebraldisc，sdegenerationusingadenovirusvectorsrelatedtotheSox9genebyAdEasysystem.UsingSOX9adenovirusvectorinfectionofintervertebraldiscnucleuspulposuscells,andobservingthebehaviorofthecells,toacquaintancethebiologicaleffectofSox9geneonintervertebraldisc.VI ObjectiveUsingAdMaxsystemtobuildadenovirusvectorrelatedtoSox9gene,andcarryontheappraisal,providereliableadenovirusvectorforrelativeresearchofSox9gene.Infectinghumanintervertebraldiscnucleuspulposuscells,toacquaintancethebiologicaleffectofSox9geneonintervertebraldisc.Method1.Theestablishmentmethodofadenovirusvector.First,usingPCRtoamplificateSox9gene,thenrestructeditintolinearpAV-MCMV-GFP-3flagafterscreening,transfereditintoDH5acells，andwecouldgetthetransformant.IndentifingthetransformantbyPCRtechnology.Afterthat,ransfectedthetransformantintoHEK293cellsbyAdMaxadenoviruspackagingsystem,InwhichtheSox9geneadenovirusvectorscanbepackaged,maturedandamplified.2.thedetectionmethodofAdenovirusvector：UsingWesternBlotmethodtotesttheSox9generecombinantadenovirus,applyedestablishedadenovirusvectorvirusDNAforPCRidentificationandgenesequencing,andmeasuredthetiterofthevirus.3.Preparationofdegenerativeintervertebraldiscnucleuspulposuscells,throughinfectingintervertebraldiscnucleuspulposuscells,torealizetherelationshipofthegeneandintervertebraldiscnucleuspulposuscells.ResultWithfragmentof1565bpgained,whichsizeisconsistentwiththeSox9gene,ItmeansthatSox9genehadbeenrestructedintheadenovirusvectorssuccessfully.WithPCRdetectionmethods,wegotvirusDNAof1565bpfragments,itdeclaredthatSox9genefragmentshadbeenrecombinantintoadenovirus.InWesternBlottesting,therewerepositivebandsfrom72to95×103,whichhadthesamesizewithSox9-GFP-Flagprotein(56KDa+28KDa+2KDa=86KDa),andthe,sotheexpressionofSox9proteinhasbeendetectedsuccessfully.IthasimprovedtheconcentoftypeIIcollagenVII ConclusionWehaveSuccessfullyidentifiedcorrectly.IthasimprovedtheconcentoftypeIIcollagenKeywords：Sox9geneAdenovirusvectorAdMaxsystemAdEasysystemIntervertebraldiscdegenerationTypeIICollagenVIII 目录正文部分摘要.................................................................................................................IABSTRACT.......................................................................................................V中英文缩写词对照表........................................................................................X引言.................................................................................................................1实验材料仪器.....................................................................................................3方法.................................................................................................................5结果...............................................................................................................13讨论...............................................................................................................22结论...............................................................................................................26参考文献...........................................................................................................27综述部分综述...............................................................................................................30SOX9基因与椎间盘退行性变研究进展........................................................30参考文献...........................................................................................................38附录部分个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果.......................................41致谢...............................................................................................................42IX 中英文缩写词对照表英文缩写英文全称中文名称AFAnnulusFibrous纤维环BMPBonemorphogeneticprotein骨形态发生蛋白CEPCartilageEnd-Plate软骨终板ECMExtracellularmatrix细胞外基质LDHLumbardischerniation腰椎间盘突出症IVDDIntervertebraldiscdegeneration椎间盘退变PLIFPostiveLumbarInterbodyFusion后路椎体间融合术TGF-βTransforminggrowthfactor转化生长因子βMMPMatrixmetalloproteinase基质金属蛋白酶IGF-1Insulin-likegrowthfactor-1胰岛素样生长因-1Sox9SRY(sexdeterminingregionY)-gene9Sox9基因PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应NPNucleusPulposus髓核FBSFetalbovineserum胎牛血清DMSODisthylsulfoxide二甲基亚砜PVDFpolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯EcoRecormethylaseecorⅱ甲基化酶LBLuria-Bertani细菌培养基MOIMultiplicityofInfection感染复数CARCoxsackievirus-AdenovirusReceptor柯萨奇病毒腺病毒受体X Sox9基因的AdMax系统腺病毒载体的建立引言腰背部疼痛是影响人们生活的骨科常见症状，又以下腰痛为症状多见，其中椎间盘退行性变(Intervertebraldiscdegeneration，IVDD)被认为是临床上引起下[12]腰痛的主要原因。椎间盘由上下的软骨板、周围的纤维环及中间的髓核组成，[13]在各种原因的作用下，椎间盘发生退行性变时，位于中间的髓核部分通过破裂纤维环的通道处突出甚至脱出到其后方的椎管内，进而压迫相应阶段的神经或脊髓，导致神经脊髓水肿，诱发其自身放电，从而引起神经性疼痛、麻木；抑或神经水肿产生的炎性因子的刺激，产生疼痛等异常感觉，影响人们的生活。椎间盘自身缺乏相应的修复机制，这种突出或脱出的椎间盘是不可逆的。目前对椎间盘的的研究，主要着重于退变椎间盘的临床治疗方法，现阶段椎间盘退行性变的治疗主要分为药物的保守治疗以及相关的减压手术治疗，药物的保守治疗只能部分缓解相关症状，且容易复发，而手术治疗又必须以牺牲脊柱的结构来换取临床症状的消失，且手术治疗的必然会引起脊柱的生物力学发生改变，其长期的邻近阶段以及对整个脊柱的稳定性的影响暂时无法确认，而上述方法均无法从根本上改变椎间盘的退行性变。随着分子生物学的相关技术的发展和应用，部分学者们开始转向研究椎间盘退行性变的机制，从分子学上了解椎间盘退变的机制，并从基因学上认识与椎间盘退变的相关基因，应用分子生物学相关技术将目的基因重新导入退变的椎间盘组织中，重建退变椎间盘的原始成分，从而达到从根源上治疗椎间盘退行性变的可能。目前，关于椎间盘退行性变机制的分子学研究，主要集中在椎间盘退变的基因及相关蛋白的方面，已探知的与椎间盘退变有关联的基因有Sox9基因、[14]MMP3基因等。其中Sox9基因作为Sox基因家族的一员，其在脊椎动物的生长发育过程中有着重要的作用，在人类和哺乳动物的软骨生成和性别决定方面起着关键的调控作用。随着对椎间盘退行性变的机制的研究不断深入，大量的试验证据表明从椎间盘的发育、成熟直到退行性变整个过程都有Sox9基因参与。[15-16]近期已有学者将Sox9基因导入腺病毒载体，并将得到的腺病毒基因载体转1 染兔椎间盘退变模型中，发现其可促进椎间盘细胞的增殖以及增加II型胶原、蛋白聚糖的合成。从而证明了Sox9基因可以促进II型胶原蛋白、蛋白聚糖的合成以及细胞的增殖，并为椎间盘退行性变的基因靶向治疗提供了可参考的理论及实[17]验基础。有学者发现在关节炎中，相关炎性因子抑制了Sox9基因生物学作用，在椎间盘退行性变的过程中，是否也存在生物活性被抑制、基因是否存在点突变等问题均需要继续行相关的研究。这就需要一种稳定、可靠的Sox9基因的腺[18]病毒载体。在以往学者们较长应用的Sox9腺病毒载体为AdEasy系统，其具有稳定性能差，病毒的生产率及基因的完整性差等相关问题，给相关实验研究带[19]来了不便。AdMax腺病毒包装系统，该系统利用Cre/loxP重组系统构建了Sox9重组腺病毒载体，具有操作简单方便、重组效率高、基因完整性高、病毒产率[20-21]高等优势，课题选用AdMax腺病毒包装系统作为介导系统，通过PCR方法对选用的Sox9基因进行扩增，将得到的基因进行筛选，并进行鉴定。后通过AdMax腺病毒包装系统进行包装，并导入所培养的HEK293细胞，得到相关载体，应用基因测序检测，WesternBlotting方法进行检测，并测出病毒滴度，经鉴定后，得[22]到了稳定可靠地Sox9基因腺病毒载体，为下一步进行相关的基因实验、椎间盘退行性变的机制研究以及可能的基因治疗提供良好的基因载体平台。将所得的腺病毒载体感染人椎间盘细胞，从而获得直接的实验证据证明Sox9基因人椎间盘退行性变的生物学作用。2 实验材料仪器1.1主要细胞和质粒Sox9基因上海生工生物工程有限公司pAV-MCMV-GFP-3FLAG加拿大Microbix公司人退变椎间盘髓核细胞上海信裕生物科技有限公司pBHGloxΔE1,3Cre加拿大Microbix公司HEK293细胞ATCC、Microbix公司DH5a感受态细胞上海生工生物工程有限公司1.2主要抗体抗体抗体名称公司货号稀释比例一抗MouseAnti-GAPDHBeyotimeAG0191：5000一抗MouseAnti-FlagSigmaF18041：3000二抗GoatAnti-mouseIgGSanta-Cruzsc-20051：30001.3主要试剂仪器试剂名称试剂来源货号PCR试剂盒上海生工生物工程有限公司SK2491EcoRI上海生工生物工程有限公司BER0271小抽试剂盒上海生工生物工程有限公司SK8161胰酶（Trypsin）Invitrogen11668-500PrestainedproteinmarkerFermentasSM1881DL2,000DNAMarker上海生工生物工程有限公司SGM01ViraDuctin™腺病毒转染试剂BioLabsAD-200胎牛血清(FBS)上海生工生物工程有限公司DAH1028ECL-PLUS/KitAmersham公司RPN21323 试剂名称试剂来源货号DMEM上海生工生物工程有限公司BC007琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒上海生工生物工程有限公司SK1136恒温摇床太仓市实验设备厂TH2-CPCR仪AppliedBiosystems2720thermalcycler稳压电泳仪北京六一仪器厂DYY-5生物安全柜上海净化BSC-Ⅱ-A2DNA电泳槽北京六一仪器厂DYCP-31DN冷冻高速离心机ThermoCL17RSDS-PAGE蛋白电泳仪上海天能科技有限公司VE-180移液器Eppendorf公司Reference荧光显微镜奥林帕斯IX71恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司GNP-9050电热恒温水槽上海一恒科学仪器有限公司DK-8D蛋白转膜仪上海天能科技有限公司VE-1865417R台式冷冻高速离心机Eppendorf公司5417R稳压电源（电泳用）上海天能科技有限公司EPS-3004 方法Sox9基因表达腺病毒载体的建立1实验流程选用NCBI基因库以Sox9基因（上海生工生物工程有限公司合成），并以此为模板进行PCR目的基因扩增。通过EcoRI酶进行酶切线性化表达载体的pAV-MCMV-GFP-3FLAG。用PCR进行鉴定所得到的转化子，将得到阳性克隆进行DNA测序（上海生工生物工程有限公司完成）。将检测正确的阳性结果进行质粒抽提。2具体实验步骤2.1Sox9基因的PCR扩增以Sox9基因为模板，Primer（－）为Sox9-EcoRI-R，Primer（＋）为Sox9-EcoRI-F，PCR的反应体积为40μl。在98℃条件下预变性3min，然后在98℃下10秒、55℃条件下15秒、72℃下2分进行循环，一共循环30次，然后72℃条件下维持10min。得到的产物在4℃条件下进行保存。以DL2,000DNAMarker进行对照，在琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳。具体方法：取PCR产物9μl，加入缓冲剂1μl，在负极点样。以80mV、50mA条件电泳40min；后进行EB染色，在紫外光下进行观察。得到大小1565bpPCR产物。2.2目的基因同源重组入表达载体20μl反应体系:反应试剂连接组(μl)自连对照(μl)阳性对照(μl)线性化表达载体40ng/µl555目的基因40ng/µl5555 10×BSA（500ug/ml）22210×ReactionBuffer222In-FusionEnzyme0.5-0.5ddH2O5.565.5将表达载体均为pAV-MCMV-GFP-3FLAG用ECORI进行酶切线性化，得到的产物加入以上三组反应体系，并加入不同的目的基因，其中自连对照组与连接组加入的为PCR扩增回收的Sox9基因，阳性对照组的目的基因为GAPDH基因，带有与Sox9基因同样的同源重组序列的。反应条件：先在37℃情况下孵育15min，然后再在50℃条件下孵育15min，而后立即进行转化。条件：在冰上解冻100µlDH5a感受态细胞，后加入10µl连接液，充分搅拌混匀，并放置冰内30min。在42℃恒温条件下水浴热激90s，然后立即移至冰浴中冷却2-3min。取LB培养液900µl，并加入所得冷却液，37℃的摇床上温育1小时，复苏细菌。取含表达载体抗生素的LB琼脂平板，涂布适量的转化菌液。倒置平皿，37℃恒温培养箱内进行培养16小时。2.3阳性克隆的鉴定将LB琼脂平板上所长出的转化子悬浮于10µlLB培养液中。取1µl做菌落的PCR鉴定。在琼脂糖凝胶上将得到的PCR产物进行电泳。H2O为阴性对照，将阳性对照、阴性对照、DL2,000DNAMarker和其他8份连接组的转化子分别进行点样，得到1120bp的电泳片段。接种阳性克隆，保种，并提取100μl进行DNA测序（此由上海生工生物工程有限公司完成）。重组病毒的制备1培养HEK293细胞1.1细胞的复苏传代穿戴好防护设备，取出冻存于液氮中的HEK293细胞，并在密封条件下转移至实验室。取出HEK293细胞，将冻存管的下半部侵入水中在37℃水浴箱进行水6 浴1-2min，在只剩少许块时，转移至生物安全柜中，用70%酒精的棉球擦拭冻存管外部，打开酒精灯，在火焰前打开冻存管，逐滴将细胞小心的移至温育过的培养液中。在适当的温度、浓度的CO2条件下进行培养。24小时后用倒置显微镜观察细胞，观察细胞的汇合程度，排除无细菌真菌污染。去除培养液，用1/2体积的PBS清洗单层细胞3次，后加入0.25%胰酶进行消化单层细胞，剂量约为24mL/dm表面积，待胰蛋白酶完全覆盖细胞单层即可，继续培养2~10min。后用倒置显微镜观察，观察细胞是否均分离并漂浮，如发现残留的贴壁细胞则需要轻拍培养瓶的进行释放。用含新鲜血清的少量培养液悬浮细胞灭活胰蛋白酶，并取出100~200μl进行活细胞计数。进一步培养所需的细胞。取适量温育过培养液加入做好标记的培养瓶，移入细胞，在适当培养条件下重复传代培养细胞系，直至细胞状态良好、无污染，用于下一步转染，多余的细胞液氮冻存（封存于河南省高校实验室）。1.2转染前准备选取经过传代得到的状态良好、无污染的HEK293细胞，转移至六孔板，培6养传代使细胞生长均匀的铺与六孔板中，并保证每孔的细胞数量达到2×10个，各个孔基本相等。1天后，待细胞长到50~80%左右时进行转染。2AdMax腺病毒系统包装2.1AdMax腺病毒包装系统介绍AdMax腺病毒包装系统由FrankL.Graham教授建立，购买于加拿大的Microbix公司。其具体的原理为：应用Cre/loxP重组酶系统，将共同转染至HEK293细胞的基因质粒进行重组，其中质粒包括具有目的基因腺病毒穿梭质粒（pAV-MCMV-GFP-3FLAG）和带有腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒（pBHGloxΔE1,3Cre），进而产生重组腺病毒。该包装系统具有操作简单、病毒重组效率高、获得的病毒滴度高，表达目的基因水平高、得到的病毒纯度高等优点。7 2.2腺病毒的包装过程转染前一天，将HEK293细胞（<30代）接种在10cm细胞培养器皿中，在37℃、5%CO2的培养箱中进行孵育，无抗生素条件下培养至约70-90%细胞融合。转染前一小时弃去原有培养基，更换为Opti-MEM培养基10ml，继续培养。按照等摩尔比条件配置病毒质粒的复合物。用Opti-MEM培养基分别将待转染的病毒载体质粒及35μl的Trans-EZ溶液稀释并补齐到500μl，至1.5mlEp管中，轻轻混匀；然后将Trans-EZ稀释液缓慢滴加至质粒稀释液中，混匀后在室温静置孵育20min，使Trans-EZ和质粒DNA充分结合形成稳定的转染复合体。将上一步得到的DNA-Trans-EZ复合体移入HEK293细胞培养板，做好标记，继续培养。6h后更换培养基继续培养。如果细胞有大量的漂起，则保留上清，再加入完全培养基6mL，过夜培养，第二日换液。每三天更换一次培养液，在7-15天出现病毒空斑。待大部分的细胞出现变圆，颜色从橙色变为黄色，且有50%的细胞脱壁、漂浮时表明细胞已病变，收集细胞，并用37℃与-80℃反复冻融3次，收集上清并保存于-80℃冰箱，可作为重组腺病毒的种子，为以后的扩增纯化提供种子（现存于河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室）。2.3重组腺病毒扩增及鉴定在培养HEK293细胞时，观察到有80~90%细胞汇合，即弃去培养液。用移液2枪将获得的病毒液10μl加入10cm培养皿，混匀。在37℃，5%CO2条件的培养箱中培养，2h后继续补加培养液10mL，继续进行培养。培养4-5天，观察HEK293细胞，待大部分出现典型的病变后，收集保存于-80℃冰箱。后对重组腺病毒进行鉴定，按试剂盒（QIAampDNABloodMiniKit）的具体操作说明书进行，步骤如下：取20μl蛋白酶K加入至200μl病毒上清样品中混匀，加入细菌缓冲培养基AL200μl，充分振荡15s，56℃恒温水浴锅中温育10min。后加入无水酒精200μl，混匀15s，转移至离心机，用转速8000rpm离心1min。更换接收管，用500μl细菌缓冲培养基AW1及500μl细菌缓冲培养基AW2分别清洗两次。再次更换新的接收管，加200μlElution细菌缓冲培养基至离心柱内，离心。病毒DNA进入接收管内，进行PCR分析。将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。用H2O为阴性对照，分别将阴性对照、DL2,000DNAMarker及PCR产物进行点样，然后电泳得到1565bp的片段。8 2.3腺病毒的大量扩增及纯化采用Hitt等人于1998年建立的经典氯化铯梯度离心法进行。腺病毒纯化具体步骤如下：1．不连续的氯化铯密度梯度离心，去除细胞污染物和缺陷性病毒的颗粒；2．连续的氯化铯密度梯度离心，分开具有缺陷性病毒颗粒与感染性病毒颗粒；3．透析，去除氯化铯（去盐）。2.4测定病毒滴度应用终点稀释法进行滴度检测，具体的操作步骤如下：实验前1天，在96孔3培养板中加入每孔100μl约含1x10个HEK293细胞，并进行培养，条件为37℃，5%CO2。准备无菌Ep管13个，向每个Ep管中加入完全培养液，其中第一个Ep管中加990μl，其余的各加入900μl，并分别标记。在第一个Ep管中加入重组腺病毒-2原液10μl，稀释100倍（10）；取稀释后的重组腺病毒液100μl，加入第二个900μl-3-14的Ep管中，稀释至10，依次稀释直至10。取出所培养HEK293细胞（每孔的-7-14细胞生长状态均良好）。弃去培养液，分别将10至10稀释的重组腺病毒液加至96孔板中，后每孔加入90μl稀释液，每个稀释度加入一行的前10孔，其中第11、12孔加入90μl不含病毒的完全培养基作为阴性对照。在37℃，5％CO2条件下继续培养。10天后用倒置显微镜观察，进行CPE孔的计数，计算其中每行阳性率，并用Spearman-KarberMethod进行计算。具体病毒滴度=10(x+0.8)(pfu/ml)，其中x为各稀释度下CPE阳性率的总和。使用条件：阴性对照组中未发生生长抑制和CPE现象；加入最小稀释浓度病毒液的孔均有CPE。3Sox9腺病毒表达的WesternBlot检测3.1蛋白的提取取出HEK293细胞，弃培养液，平衡盐溶液洗涤2次；后弃平衡盐溶液，在加入适量预冷的Lysis细菌缓冲培养液（1MTris-HCl（pH6.8）100mM，SDS4%，甘油20%，巯基乙醇2%）。刮下细胞并装入Ep管，置于冰上，裂解细胞10-15min，用超声波击碎细胞。Ep管在4℃，以12000rpm，离心15min，取上清液并弃沉淀。检测并调整每个样品蛋白的终浓度为2μg/μl，-80℃冰箱保存。9 3.2上样样品准备保证每一个样品具有相同总蛋白量，对每个样品取样，后加入相同体积上样的缓冲液（100mMTris-HCl（pH6.8），SDS4%，甘油，巯基乙醇2%，20%，溴酚兰0.02%），轻摇混匀后，沸水浴约5-10min，后存放于4℃。3.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAG）3.3.1先进行制胶（具体体系如下表），待其凝固后，除去梳子，彻底清洗各个上样孔，将准备好的样品按每个上样孔20μl的剂量进行加样。然后应用30mA恒流模式进行电泳2h。4℃条件下，用恒电流4000mA电转2个小时，应用胶负膜正的转移电泳装置，将目的蛋白从胶上转移到PVDF膜上。配制胶的浓度应根据目的蛋白的分子量来确定，具体体系如下：分离胶（8mL体系）8%9%10%12%13%15%H2O3.73.43.12.62.31.830%PAGE2.12.42.73.23.541.5mol/LTris(pH8.8)22222210%SDS0.080.080.080.080.080.0810%APS0.080.080.080.080.080.08TEMED0.0050.0040.0040.0040.0040.004分离胶（10mL体系）8%9%10%12%13%15%H2O4.64.343.32.92.330%PAGE2.733.344.451.5mol/LTris(pH8.8)2.52.52.52.52.52.510%SDS0.10.10.10.10.10.110%APS0.10.10.10.10.10.1TEMED0.0060.0040.0040.0040.0040.004浓缩胶（5%）3mL4mL5mLH2O2.12.73.430%PAGE0.50.670.8310 1.0mol/LTris(pH6.8)0.380.50.6310%SDS0.030.040.0510%APS0.030.040.05TEMED0.0030.0040.0053.3.2免疫染色室温条件下，先将PVDF膜用5%脱脂牛奶的TBST溶液（封闭液）进行封闭90min。并用一抗、二抗以此进行孵育，并分别用TBST液进行洗膜3次，每次10min。而后应用ECL+plusTMWesternblottingsystem试剂盒进行免疫染色。人退变椎间盘髓核细胞的培养1人退变椎间盘髓核细胞选用ScienCell人椎间盘髓核细胞（购买于上海信裕生物科技有限公司）。该细胞为胎儿椎间盘进行原代培养，具有容易培养、活力强、传代率高等优点。2具体培养过程在DMEM(高糖)+10%FBS培养基中进行培养，后倒掉旧培养基加入少量新培养基洗1-2遍，洗掉漂浮着的无活性的细胞。并应用倒置显微镜进行观察。然后再加入少量新培养基直接轻微拍打，将贴壁不牢固的细胞吹净。再用培养基洗一遍，两次所得悬液混合用移液管转移至新的培养瓶中。吸干净瓶内剩余液体，加入0.3ml胰酶润洗，吸掉弃之，再加入1ml左右的胰酶进行消化。消化的同时置于显微镜下观察，待细胞与细胞之间间隙明显的时候立即吸掉胰酶与干净弹头里备用，加入新培养基开始吹打，吹打2-3遍后吸取悬液于试管或新瓶暂存。用2ml左右新培养基洗一遍与前面的混合。然后把所刚吸取的胰酶重新加进去瓶里继续消化剩余的贴壁牢固的细胞。继续镜下观察，待剩余细胞间隙明显，细胞独立开来的时候，吸掉胰酶，加入新培养基吹打。悬液传入新11 瓶培养。得到传代椎间盘细胞，用倒置纤维镜观察后，细胞发育好，形态良好，无污染放置保存。Sox9基因腺人退变椎间盘细胞的作用1Sox9基因腺病毒感染人退变椎间盘细胞将所得的培养的人椎间盘细胞转染前1天半量换液。实验分为4组，即治疗前组、空白组、空腺病毒载体组、含有Sox9目的基因腺病毒组。感染复数（multiplicityofinfection，MOI）分别为0∶1（对照组）、10∶1、20∶1，每组设8孔。根据感染复数计算，加入所需的SOX9基因腺病毒悬液的体积数，并将其加入无血清的DMEM/F12培养液，混匀，将所得混合液按照分组分别加入到每组细胞中，每孔0.2ml。37℃、5%CO2条件培养，4h后用DMEM/F12清洗细胞2次，弃病毒残液。每8h观察表达情况，常规半量换液。转染后48h，在200倍荧光显微镜下观察2免疫荧光染色用Nestin荧光免疫细胞化学染色法对培养的细胞球进行鉴定。12 结果1PCR扩增得到的Sox9基因片段以Sox9基因为模板PCR扩增得到大小1565bp片段产物。PCR产物电泳图谱见图1。2Sox9基因克隆载体的鉴定2.1阳性菌落的鉴定挑取的8个转化子做PCR扩增模板，使用MCMV-F及Sox9-R1为引物进行菌落PCR扩增检测阳性菌落。阳性克隆得到881bp条带，其中1为阴性对照（H2O），2为阳性对照（GAPDH），4、5、6、8、9、10、11为阳性克隆，结果见图2。2.2阳性克隆测序结果分析经测序结果与Sox9基因对比分析，表明阳性克隆与Sox9基因一致，说明Sox9基因扩增成功，Sox9基因的过表达质粒（pAV-MCMV-GFP-3FLAG-Sox9）构建成功，见图3。3组腺病毒的包装、鉴定及滴度检测3.1重组腺病毒的包装：共转染HEK293细胞后48h即可见到GFP的表达，但其表达的数量和强度还较弱。第9天时可见到大量出现、增强的荧光。第13天时，HEK293细胞完全病变。表明AD-Sox9病毒包装成功，见图4。3.2重组腺病毒的鉴定：把获得的病毒DNA进行PCR鉴定，得到1565bp片段，与所选的Sox9基因片段吻合，表明Sox9基因已经进入重组腺病毒载体，见图5。3.3重组腺病毒的滴度检测：经过测定腺病毒滴度为：2.3×1011PFU/ml13 4Westernblot检测重组腺病毒表达AD-GFP-3FLAG-Sox9为Sox9的过表达腺病毒，目的基因Sox9融合GFP与FLag共同表达，目的基因的片段大小：1548bp。实验结果表明：通过WesternBlot检测，可以看到在72-95KDa之间有阳性条带，其大小和Sox9-GFP-Flag的融合蛋白（56KDa+28KDa+2KDa＝86KDa）的大小相吻合。综上：基本判断Sox9蛋白表达，见图65Sox9基因对人退变椎间盘细胞的作用通过免疫组化染色发现人正常髓核细胞核人的退变椎间盘细胞中的II型胶原含量明显增加。见图7。附图图1目的基因PCR扩增电泳图谱DL2,000DNAMarker：2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bpPCR产物大小：1565bp14 图2阳性菌落PCR鉴定图1.阴性对照（H2O）2.阳性对照（GAPDH）3.DL2,000DNAMarker：2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp4~11所挑取的8个转化子150pSB701-3(1)GGTACACTGCGTGCGTCTCGGTCTGACACCGTAGAACGCAGATCAGATCTA1715SOX9(1)--------------------------------------------------51100pSB701-3(51)CGAGCTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGAACCTGTTGGACCCATTTATGA1715SOX9(1)--------------------------ATGAACCTGTTGGACCCATTTATG101150pSB701-3(101)AAGATGACCGATGAGCAAGAGAAGGGGCTCTCTGGAGCGCCATCCCCTACA1715SOX9(25)AAGATGACCGATGAGCAAGAGAAGGGGCTCTCTGGAGCGCCATCCCCTAC151200pSB701-3(151)GATGAGTGAGGACAGCGCCGGCTCCCCATGCCCATCCGGGTCCGGCAGCGA1715SOX9(75)GATGAGTGAGGACAGCGCCGGCTCCCCATGCCCATCCGGGTCCGGCAGCG201250pSB701-3(201)ACACTGAGAATACCCGCCCCCAGGAGAATACCTTTCCAAAAGGAGAGCCAA1715SOX9(125)ACACTGAGAATACCCGCCCCCAGGAGAATACCTTTCCAAAAGGAGAGCCA251300pSB701-3(251)GACCTTAAGAAGGAGAGTGAGGAGGACAAGTTTCCCGTTTGTATCCGGGAA1715SOX9(175)GACCTTAAGAAGGAGAGTGAGGAGGACAAGTTTCCCGTTTGTATCCGGGA301350pSB701-3(301)GGCTGTTTCACAGGTTTTGAAAGGCTATGATTGGACCCTGGTCCCAATGCA1715SOX9(225)GGCTGTTTCACAGGTTTTGAAAGGCTATGATTGGACCCTGGTCCCAATGC35140015 pSB701-3(351)CCGTGCGGGTCAACGGATCTAGCAAAAACAAGCCACATGTGAAGCGACCCA1715SOX9(275)CCGTGCGGGTCAACGGATCTAGCAAAAACAAGCCACATGTGAAGCGACCC401450pSB701-3(401)ATGAACGCTTTCATGGTCTGGGCCCAAGCCGCCAGAAGGAAGCTCGCCGAA1715SOX9(325)ATGAACGCTTTCATGGTCTGGGCCCAAGCCGCCAGAAGGAAGCTCGCCGA451500pSB701-3(451)TCAGTATCCACACTTGCATAACGCCGAGCTTTCCAAGACACTGGGAAAACA1715SOX9(375)TCAGTATCCACACTTGCATAACGCCGAGCTTTCCAAGACACTGGGAAAAC501550pSB701-3(501)TGTGGAGACTGCTGAACGAGAGCGAGAAGAGACCATTTGTCGAAGAGGCGA1715SOX9(425)TGTGGAGACTGCTGAACGAGAGCGAGAAGAGACCATTTGTCGAAGAGGCG551600pSB701-3(551)GAAAGACTGCGAGTGCAGCATAAGAAGGACCACCCCGACTATAAATATCAA1715SOX9(475)GAAAGACTGCGAGTGCAGCATAAGAAGGACCACCCCGACTATAAATATCA601650pSB701-3(601)GCCGAGGCGGCGCAAAAGCGTGAAAAACGGCCAAGCTGAAGCTGAGGAGGA1715SOX9(525)GCCGAGGCGGCGCAAAAGCGTGAAAAACGGCCAAGCTGAAGCTGAGGAGG651700pSB701-3(651)CAACTGAGCAGACCCATATCAGCCCGAACGCTATCTTCAAAGCGCTGCAGA1715SOX9(575)CAACTGAGCAGACCCATATCAGCCCGAACGCTATCTTCAAAGCGCTGCAG701750pSB701-3(701)GCTGATTCACCACACAGCTCCAGCGGCATGTCCGAGGTTCACAGCCCCGGA1715SOX9(625)GCTGATTCACCACACAGCTCCAGCGGCATGTCCGAGGTTCACAGCCCCGG751800pSB701-3(751)CGAGCACTCAGGACAGTCCCAGGGGCCACCAACACCCCCAACCACACCCAA1715SOX9(675)CGAGCACTCAGGACAGTCCCAGGGGCCACCAACACCCCCAACCACACCCA801850pSB701-3(801)AGACTGACGTGCAGCCTGGAAAGGCCGACCTTAAGCGGGAAGGCAGGCCGA1715SOX9(725)AGACTGACGTGCAGCCTGGAAAGGCCGACCTTAAGCGGGAAGGCAGGCCG851900pSB701-3(851)CTGCCCGAAGGGGGTCGCCAGCCGCCGATAGATTTCCGCGACGTGGACATA1715SOX9(775)CTGCCCGAAGGGGGTCGCCAGCCGCCGATAGATTTCCGCGACGTGGACAT901950pSB701-3(901)TGGGGAACTCAGTAGCGATGTGATTTCCAACATCGAGACATTCGACGTCAA1715SOX9(825)TGGGGAACTCAGTAGCGATGTGATTTCCAACATCGAGACATTCGACGTCA9511000pSB701-3(951)ATGAATTCGACCAGTACCTCCCGCCGAATGGCCACCCCGGTGTGCCGGCAA1715SOX9(875)ATGAATTCGACCAGTACCTCCCGCCGAATGGCCACCCCGGTGTGCCGGCA10011050pSB701-3(1001)ACCCACGGGCAAGTCACCTACACTGGCTCATACGGCATCTCATCCACTGCA1715SOX9(925)ACCCACGGGCAAGTCACCTACACTGGCTCATACGGCATCTCATCCACTGC10511100pSB701-3(1051)CGCCACGCCCGCCTCTGCCGGGCACGTGTGGATGTCCAAGCAACAAGCACA1715SOX9(975)CGCCACGCCCGCCTCTGCCGGGCACGTGTGGATGTCCAAGCAACAAGCAC16 11011150pSB701-3(1101)CTCCGCCTCCGCCCCAACAGCCACCCCAGGCTCCCCCTGCGCCCCAGGCCA1715SOX9(1025)CTCCGCCTCCGCCCCAACAGCCACCCCAGGCTCCCCCTGCGCCCCAGGCC11511200pSB701-3(1151)CCTCCTCAACCTCAGGCCGCACCCCCCCAGCAGCCTGCCGCCCCCCCTCAA1715SOX9(1075)CCTCCTCAACCTCAGGCCGCACCCCCCCAGCAGCCTGCCGCCCCCCCTCA12011250pSB701-3(1201)GCAGCCCCAGGCACACACGCTCACCACCCTGAGTAGTGAACCCGGTCAATA1715SOX9(1125)GCAGCCCCAGGCACACACGCTCACCACCCTGAGTAGTGAACCCGGTCAAT12511300pSB701-3(1251)CCCAGCGGACGCACATCAAAACAGAACAGCTGTCTCCCTCTCATTACTCCA1715SOX9(1175)CCCAGCGGACGCACATCAAAACAGAACAGCTGTCTCCCTCTCATTACTCC13011350pSB701-3(1301)GAACAGCAGCAGCATTCTCCTCAGCAGATCGCTTACAGTCCTTTCAACCTA1715SOX9(1225)GAACAGCAGCAGCATTCTCCTCAGCAGATCGCTTACAGTCCTTTCAACCT13511400pSB701-3(1351)GCCCCACTACTCCCCTTCATACCCTCCCATTACCCGCAGTCAGTACGACTA1715SOX9(1275)GCCCCACTACTCCCCTTCATACCCTCCCATTACCCGCAGTCAGTACGACT14011450pSB701-3(1401)ACACAGATCACCAGAATAGCTCTAGCTACTACTCTCACGCGGCAGGGCAAA1715SOX9(1325)ACACAGATCACCAGAATAGCTCTAGCTACTACTCTCACGCGGCAGGGCAA14511500pSB701-3(1451)GGCACCGGCCTCTACAGCACGTTCACATACATGAATCCCGCCCAGCGCCCA1715SOX9(1375)GGCACCGGCCTCTACAGCACGTTCACATACATGAATCCCGCCCAGCGCCC15011550pSB701-3(1501)GATGTATACCCCTATTGCCGATACGTCCGGAGTGCCCAGCATCCCCCAGAA1715SOX9(1425)GATGTATACCCCTATTGCCGATACGTCCGGAGTGCCCAGCATCCCCCAGA15511600pSB701-3(1551)CCCACAGCCCTCAGCATTGGGAACAGCCCGTGTATACCCAGCTGACTAGGA1715SOX9(1475)CCCACAGCCCTCAGCATTGGGAACAGCCCGTGTATACCCAGCTGACTAGG16011650pSB701-3(1601)CCCGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCGTCACCGGGTTTAA1715SOX9(1525)CCCTGA--------------------------------------------1651pSB701-3(1651)CTTTA1715SOX9(1531)----图3阳性克隆基因测序结果分析经基因测序的结果与Sox9基因对比分析，阳性克隆与Sox9基因序列一致，说明Sox9基因扩增成功，及Sox9基因的过表达质粒（pAV-MCMV-GFP-3FLAG-Sox9）构建成功。17 图4包装后拍照检测结果（100×）其中A组为白光组，B组为荧光组，C组为对照组；1为转染后2天，2为转染后9天，3为转染后13天。可见至转染后的第13天时，HEK293细胞大量飘落，细胞已经完全病变。18 图5包装后腺病毒DNA的PCR鉴定将获得的病毒DNA用PCR进行鉴定，其中1为PCR得到的DNA，2为DL2,000DNAMarker（2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp），3为阴性对照组（H2O）。得到大小为1565bp片段，说明Sox9基因片段已经重组进入腺病毒。19 图6Westernblot检测结果通过WesternBlot进行检测感染HEK293细胞样品，发现在72-95KDa之间有阳性条带，其大小与Sox9-GFP-Flag融合蛋白（56KDa+28KDa+2KDa＝86KDa）大小吻合。从而可以判断Sox9蛋白表达。20 图7正常椎间盘细胞及三组治疗后8周时的II型胶原免疫组化染色图中A为正常椎间盘细胞组织，B、C、D分别为含Sox9基因腺病毒治疗组、无基因病毒组及空白对照组治疗后8周后进行II型胶原免疫组化染色。可见治疗后的无基因病毒组及空白对照为弱阳性，而含Sox9基因腺病毒治疗则表现为强刚性。说明ADSox9治疗增加了人椎间盘细胞的II型胶原蛋白表达。21 讨论椎间盘的退行性变（IVDD）是骨科的常见疾病，目前其具体发病原因并不是十分确切，学者发现，椎间盘的退行性变与组织形态学、生物力学、遗传学、基因分子学等有关。椎间盘是脊柱的重要组成部分，其在维持脊柱生理曲度及稳定性方面起着重要的作用。其主要有周围的纤维化组织，中间的髓核组织，[23]以及上下的软骨终板组成，为脊柱应力缓冲的主要结构，起着弹性垫作用。当人由高处坠落或者肩、背、腰部等受到外力作用而发生生物力学改变时，通过力的传导作用而作用于椎间盘组织，椎间盘组织发生自身变形来缓冲、减少、传递压力。起到保护椎体、脊髓及机体其他重要器官的作用。由上述机制可知，[24]椎间盘在发生退行性变时，椎间盘中的纤维坏组织等在外力的作用下，发生退变破裂，其中的髓核组织通过破裂的缺口进入后方的椎管内，压迫相应的脊髓和神经，引起脊髓神经的水肿、炎症，进而引起腰背痛、下肢无力、疼麻等为[25]主、甚至截瘫的临床症状。陈立等人对椎间盘退行性变的研究发现，在正常生物应力的作用下，软骨终板的蛋白聚糖合成和降解的状态处于相对平衡，而在异常应力作用下发现软骨终板的蛋白聚糖明显合成减少、而降解增加，从而改变了椎间盘的原组织结构成分，导致了椎间盘的退行性变。成年后的椎间盘细胞及组织失去了血液的营养供给，其营养主要依靠终板和纤维环的扩散方式来获取，而随着年龄的增加，椎体的终板逐渐出现钙化甚至硬化，致使椎间盘的营养途径被切断，而导致椎间盘的退行性变。目前对椎间盘退行性变的临床治疗方案主要有临床治疗方法主要包括药[26][27]物、物理康复及手术治疗。其中药物治疗主要包括消炎止痛、活血化瘀、营养神经等，其可起到局部消炎的作用，缓解部分或者全部的症状，但当遇到劳累或其他因素的情况下，先前的症状可能再次出现，甚至更为严重。物理康复治疗包括卧床休息、理疗、热敷牵引、推拿按摩等，可局部缓解症状，无法彻[28]底治疗椎间盘退行性变。手术治疗包括椎单纯的椎间盘摘除术、椎间盘摘除植骨融合固定术、椎间盘的射频消融术、人工椎间盘置换手术以及其它微创治疗椎间盘退行性变的手术，其中以椎间盘摘除合并植骨融合固定术临床上最为常用。总的说来，手术治疗可以解除神经脊髓的压迫，但是其以去除压迫神经脊髓的人体的正常组织换取神经脊髓的减压释放，虽有强有力的内固定物支撑，22 [29]暂时保持了脊柱的稳定性，但是改变了脊柱的生物力学及本身的结构，长期对临近阶段的影响以及对整个脊柱的稳定性的影响暂时并不十分明确。目前很多学者正从事于该项手术的长期效果的临床研究。目前的所有治疗椎间盘退行性变的方案，均无法从根本上解决椎间盘的退行性变，因此迫切需要一种能早期发现诊断，可逆性治疗椎间盘退行性变的方法。[30]随着分子生物学的发展及人们对椎间盘退变机制研究的不断深入，学者[31]们发现在椎间盘的退变过程中起到直接或者间接作用的相关基因和蛋白，包括椎间盘结构相关基因（COLlAl基因、Sox9基因、COL9A2、COL9A3基因、COLllA2基因、PG基因、CILP基因等）、骨质疏松相关基因（维生素D受体基因、雌激素受体基因）、细胞因子相关基因（炎症相关基因、生长因子类基因等）、椎间盘代谢相关基因（MMP-1、MMP3基因、TIMP-1、COX-2基因、TIMP-1和COX-2基因、THBS-2基因、ADH基因等）以及痛信号通路相关基因（GTP环化水解酶(GCHl)）等。并开始从基因学和分子生物学的角度寻求治疗椎间盘退行性变的方案。Sox9基因作为Sox基因家族的成员，在性别决定、软骨的发育以及椎间盘的[32]退行性变方面均有相应的生物学作用。学者们发现从椎间盘的发育、成熟到退行性变整个变化过程中均有Sox9基因参与，其具有增加II型胶原蛋白、蛋白聚糖合成及细胞增殖的作用，且学者们其调控机制也已有很多了解。已有学者通过[33]实验研究证实，在关节炎等相关免疫性疾病中，Sox9基因的生物学作用被高度表达的致炎因子抑制，从而使软骨组织的自身修复及再生功能减弱，发生不可逆的损伤。在椎间盘退行性变的发生过程中，Sox9基因的生物学作用是否被抑制，是否存在基因的点突变、调控方面是否存在缺陷等以及Sox9基因表达是否被抑制等一系列问题还有待进一步地研究。故构建Sox9基因重组腺病毒载体，[34]将为进一步探讨Sox9基因在IVDD中的分子致病机制及其对IVDD的基因治疗作用提供可靠的原料。[35-36]随着对腺病毒载体的研究的不断深入，目前将其作为介导基质进行外源性目的基因的转导入细胞已成为目前相关研究的常用方法。应用腺病毒作为目的基因载体拥有以下特点：(1)宿主细胞广，腺病毒载体借助结合于细胞膜表面的柯萨奇病毒腺病毒受体(Coxsackievirus-AdenovirusReceptor，CAR)进入宿主细胞，大部分的人体细胞的细胞膜均表达该受体。且无论是分裂期或者静止期的宿主细胞均能被腺病毒感染感染率近乎100%。(2)可携带大片段外源性基因，23 第三代腺病毒载体可携带外源基因的长度最高可达35kb；(3)安全性好，腺病毒携带的外源性基因不整合于宿主基因组，所以无插入突变和激活癌基因的危险，[37]第三代腺病毒载体却大所有的自身蛋白编码碱基序列，故宿主感染后不会表达病毒自身的蛋白，进而大大降低了机体的免疫反应和细胞的毒性；(4)病毒的滴度高，腺病毒感染细胞后目的蛋白可高水平的表达，目的基因的表达时间长，甚至可达1年之久。腺病毒载体已发展至第三代，学者们习惯一般将缺失早期转化因子中的E1或E3基因的腺病毒称为第一代腺病毒，其具有病毒感染率高、宿主广、病毒滴度病毒高等优点；但因其可携带外源性基因的长短与8kb，使得外源性基因表达的时间过短、浓度较低，并可以使机体产生强烈的炎性和免疫反应，目前已被淘汰。第二代腺病毒是指缺失早期转化因子中的E2或E4基因的腺病毒载，其优点是提高了携带外源基因表达能力以及增加了载体的安全性以及对宿主产生的炎症及免疫反应较弱，但其病毒载体的滴度过低，仅为第一代的1/1000~1/10，故在平素的研究中既不可靠也不经济。第三代腺病毒是指缺失了全部或大部腺病毒基因的腺病毒，具有携带外源基因容量大，最高可达35kb，目的基因表达浓度高、表达时间长，对机体的致炎性和免疫性大大减弱，但其分离较为困难，并且需要借助腺病毒突变体作为辅助病毒[38]目前应用较多的Sox9基因的腺病毒载体是AdEasy病毒包装系统，Ad-Easy系统，工作原理为利用同源臂重组方式，在细菌中获得重组腺病毒基因组质粒。将所克隆的外源性基因的腺病毒穿梭质粒和携带的腺病毒大部分的基因组的质粒共同转化至RecA+细菌，在细菌RecA+的重组酶作用下通过抗性筛选从而获得重组腺病毒目的基因组质粒，在其线性化以后转染至HEK293细胞并获得重组病毒,但其病毒重组效率低，一般情况下20个克隆能得到2-3个正确重组的克隆，操作复杂，如若为新手，则重组效率会更低。且在发生同源重组的时候，穿梭质粒和病毒质粒可能会在腺病毒的骨架载体的两个位置同时发生重组，因此重组后质粒在PacI酶切后可能出现两种重组后的产物，其重组时得到的病毒载体并不纯。综上所述,AdEasy腺病毒包装系统操作复杂，病毒重组效率低、得到的产物不纯等缺点，因此作为Sox9基因的腺病毒载体既不经济，也不可靠。所以需要一种更为安全、高效、可靠的腺病毒载体。[39]本课题使用的AdMax腺病毒包装系统由FrankL.Graham教授建立。其工作[40]原理是通过质粒Cre/loxP系统获得重组腺病毒，该过程发生在HEK293细胞中，故避免了细菌中重组，因此重组后只会得到目的基因一种产物。将克隆了外源24 性目的基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒得大部分基因组包装质粒共同转染入HEK293细胞，利用质粒Cre/loxP系统的作用进行病毒重组，得到重组腺病毒。该系统较AdEasy腺病毒包装系统具有操作简便、重组的效率高、获得病毒产率高、目的基因的表达水平高等优点。AdMax包装系统，包含以下几个组件：(1)具有复制缺陷型腺病毒的载体穿梭质粒pAV-MCMV-GFP-3FLAG，该质粒的外源性基因克隆位点的下游带有终止信号SV40polyA，其上游含有人类巨细胞病毒(CMV)的启动子；(2)具有腺病毒的大部分基因组pBHGloxΔE1,3Cre质粒：其中含有除E1和E3区编码碱基序列外的人类的5型腺病毒中的全部基因组，并含有[41]Cre/loxP系统。其通过Cre/loxP系统获得重组病毒：其中的Cre/LoxP系统来自P1噬菌体，该系统由重组酶Cre和靶序列loxP两部分组成，其中重组酶Cre可同时介导两个均含有loxP序列的分子进行特异性重组、整合。将携带腺病毒大部分的基因组骨架质粒和克隆的外源性基因腺病毒的穿梭质粒共同转染入HEK293细[42]胞，然后再利用Cre/loxP系统来实现腺病毒的重组，从而得到重组腺病毒。因该过程中重组病毒是在真核细胞中进行，而不是细菌中，所以保持了对腺病毒生存压力，因此能使重组腺病毒产生效率提高约30～100倍，从而提高外源性目的基因表达水平，并且有助于保持重组腺病毒的目的基因组的完整性。11通过实验获得了病毒滴度达到2.3×10PFU/ml的Sox9基因重组腺病毒，运用PCR方法、免疫荧光组化及WesternBlot检测证实腺病毒载体构建成功，均检测无误，成功构建了以AdMax系统为载体的Sox9基因重组腺病毒，为下一步对椎间盘退变的治疗研究提供可靠保障。将得到的Sox9基因腺病毒载体感染体外培养的人退变椎间盘细胞，腺病毒治疗组、无基因病毒组及空白对照组治疗后8周后进行II型胶原免疫组化染色。可见治疗后的无基因病毒组及空白对照为弱阳性，而含Sox9基因腺病毒治疗则表现为强刚性。说明ADSox9治疗增加了人椎间盘细胞的II型胶原蛋白表达。从而直接证明了Sox9基因可增加人椎间盘盘细胞中II型胶原蛋白的含量，进而可以延缓椎间盘退行性变，为椎间盘退行性变的可逆性基因治疗提供可靠的实验支持。25 结论1.Sox9基因可提高人椎间盘细胞中II胶原蛋白的含量，可以延缓椎间盘的退变。26 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综述Sox9基因与椎间盘退行性变研究进展邱如标综述王珏审校1椎间盘退行性变[1]椎间盘的退行性变（IVDD）是骨科常见的疾病，其主要引起腰背部疼痛、下肢麻木无力等相关症状，甚至会发生截瘫，严重影响患者的正常生活。其发病原因及机制目前尚无确切定论，多数学者认为其与遗传、生物力学改变、细[2]胞衰老、椎间盘的营养以及自身免疫等多方面因素有关。椎间盘退变具体过程为在各种损伤因素作用于下，椎间盘细胞内的炎症因子增加、基质金属蛋白酶以及其他的蛋白水解酶活性和含量增加，从而引起细胞外基质的降解增加、髓核细胞的数量和水分的含量减少，导致髓核细胞生物合成蛋白多糖和胶原蛋白的活性下降，椎间盘张力及弹性下降，最终引起椎间盘的退行性变。而退变的椎间盘周围的纤维环发生破裂，其中的髓核组织突出至椎管内，压迫相应阶段的脊髓或者神经，引起脊髓水肿、炎性因子释放，出现相应的症状。目前针[3]对椎间盘退行性变的治疗主要集中在药物的保守治疗，以及手术的减压治疗[4]。前者只能部分缓解相应的症状，突出至椎管内压迫神经脊髓的退变椎间盘及相应的钙化的韧带仍存在，在遇到外力等作用下，临床症状会再次出现；或者以手术方式切除、突出的椎间盘组织、压迫神经的韧带、骨性组织，解除神经脊髓的压迫，得到相应的治疗效果，但手术创伤大，以破坏人体的相应组织换取神经的减压，虽然有牢固的内固定和融合技术，但其将使脊柱的生物力学发生改变，该方案是否会加速临近阶段的椎间盘的退变、是否会引起整个脊柱的稳定性的改变，进而引起其他的脊柱方面的疾病，均有待进一步检验。而目[5]前的基因靶向治疗，可以从退行变椎间盘的分子学、基因学基础上对椎间盘的退行性变进行逆向治疗，重塑正常的椎间盘结构各成分，从根本上解决椎间30 盘的退行性变。2椎间盘的研究的相关基因随着分子生物学等相关学科及技术的发展，近年来学者们开始逐渐转向椎间盘退变的分子生物学方面研究。目前对椎间盘基因的分子生物学的研究有椎[6-7]间盘结构相关基因（COLlAl基因、Sox9基因、COL9A2、COL9A3基因、COLllA2基因、PG基因、CILP基因等）、骨质疏松相关基因（维生素D受体基因、雌激素受体基因）、椎间盘代谢相关基因（MMP-1、MMP3基因、TIMP-1、COX-2基因、TIMP-1和COX-2基因、THBS-2基因、ADH基因等）、细胞因子相关基因（炎症相关基因、生长因子类基因等）以及信号转导通路相关基因（GTP环化水解酶(GCHl)等）。引起椎间盘退行性变的因素较多，其发生为多种因素共同作用的结果，在上述基因以及相关因子的作用下，椎间盘细胞的基质金属蛋白酶以及其他的蛋白水解酶活性和含量增加，从而引起细胞外基质的降解增加、髓核细胞的数量和水分的含量减少，导致髓核细胞生物合成蛋白多糖和胶原蛋白的活性下降，椎间盘张力及弹性下降，最终引起椎间盘的退行性变。在这些因[8]子中，其结构相关基因Sox9基因因其特殊的生物学作用及可逆的增加退变椎间盘细胞的II型胶原蛋白、从而修复受损的椎间盘细胞，成为目前学者研究的热点。3Sox9基因Sox9基因作为Sox基因家族中的一个成员，具有重要的地位及作用。主要负责调控人类以及脊椎动物的生长发育，并再软骨的生成修复以及性别决定方面[9]有着决定性作用。1994年，Foster等学者通过荧光原位杂交等相关技术，在染[10]色体的17q24的长臂位置上发现人类的Sox9基因，其主要结构为：在N端拥有两份用于核定位信号的序列(N-terminalbipartiteNLS),以及一段含有亮氨酸核输出信号(NuclearExportSignalNES)和C端的用于核定位信号序列(C-terminalbasicNLS)，拥有一个二聚化作用的结构域(dimerization,Dim)，在C端含有由脯氨酸-谷氨酸-丙氨酸PQA(proline–glutamine-AlaninePQA)以及脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸PQS(proline-glutamine-serinePQS)组成的转录激活域，拥有两个内含子和三个外显子，是目前报道的首个拥有内含子的Sox基因。不同于其他SRY31 (sexdeterminationregionofYchromosome)基因拥有的单一的外显子结构，Sox9基因中含有一个开放式的可读框(ORF)；含有HMG基序和4个潜在的起始密码，一共可以编码509个氨基酸序列，而其中104-182位的79个氨基酸残基共同构成HMG盒，其与SRY基因的HMG盒的同源性高达71%。因此可以看出Sox9基因是一个典型的转录因子，拥有DNA结合需要的二聚化结构域以及转录激需要的结构域。Sox9基因的HMG盒与所有的SOX基因家族一样,具有与SRY有高亲和力的结合位点碱基序列AACAAT以及TCF1结合位点碱基序列AACAAAG。在人类的Sox9基因中，与SRY高具有亲和力的结合位点碱基序列是AGAACAATGG。Sox9基因的HMG盒可以与人类以及其他哺乳类动物的Ⅱ型胶原基因中的有软骨细胞特异性的增强子碱基序列结合，在与DNA相结合后可使DNA碱基序列发生弯曲成角，从而改变了DNA碱序列的空间构型，进行达到对相应DNA或者目的受体的表达调控。4Sox9基因在组织中的表达[11]研究表明，Sox9基因并不局限于某各器官或组织，而是存在于人类的多个器官脏器及组织细胞中。ThomasWagenr等运用NorthernBlots方法发现，在人体的大脑、心脏、结肠、胎盘、肺脏、肝脏、胰腺、骨骼肌、前列腺、精巢、女性的卵巢、椎间盘组织以及白细胞中均有不同程度的Sox9基因的表达，其中在精巢中表达显著，而在白细胞中则较为微弱。并通过应用原位杂交技术进一步的研究发现，在7周的胎儿的肢体骨的长骨以及处于活动或者静止期的软骨细胞中均有显著的表达，在生长的肋骨软骨区也有较强的表达，但在长骨的钙化区域则表达明显较少，甚至不表达，间接表明Sox9基因与长骨及软骨的生长发[12]育有关。5Sox9基因的生物学作用[12]Sox9基因对椎间盘的作用：1994年，Wagner等学者通过应用快速扩增cDNA末端结合人胚胎脑的cDNA文库的筛选方法，成功分离以及克隆了人类的[13]Sox9基因。其后Sowa等发现，在退变的椎间盘髓核细胞中Sox9基因的表达和Ⅱ型胶原蛋白的表达不协调，成负相关性，且其表达较正常的椎间盘细胞明显32 [14]减少。2003年，Paul等学者将获得的设计合成了AdEasy系统的Sox9基因腺病毒载体，并通过人工的兔椎间盘退变模型，将腺病毒介导Sox9导入三只椎间盘退变的兔退变的椎间盘细胞中，5周后取出椎间盘组织，其中的一半进行苏木精和伊红染色，发现退变椎间盘中央的髓核组织外观受损、内部纤维细胞增生、细胞外基质减少，而注入AdSox9基因的退变椎间盘组织，保持了原有的组织形态和细胞外基质。通过免疫印迹分析发现其中的Ⅱ型胶原蛋白表达明显增多，应用统计学分析其损伤修复明显超过了未导入Sox9基因的退变椎间盘细胞；从而证实了Sox9基因具有增加Ⅱ型胶原蛋白合成、修复椎间盘退变的作用。其研究为椎间盘退行性变的基因治疗提供了可靠的理论依据。[15]Sox9基因对软骨发育的作用：Sox9基因表达于除肥大软骨细胞外的所有软骨细胞和软骨前体细胞。其参与软骨形成引调控的分子机制为：Sox9基因的HMG-盒与DNA上的特异碱基序列结合，使DNA链发生弯曲，发生双螺旋结构解链，从而激活靶基因的转录。学者们研究发现在Sox9蛋白中存在一种强有力的转录激活子，Sox9基因与Col2al基因(Ⅱ型胶原蛋白基因)的内含子的特异点相结合，从而直接调控软骨细胞标志Col2al蛋白的表达。研究发现，在软骨生成的初始期，Sox9基因参与软骨细胞的未分化干细胞向定向干细胞的分化和间充[16]质细胞聚集的整个过程。Gordon等提出Sox9基因上游序列的移位发生点突变，从而引起短指等骨骼发育异常（CampomelicDysplasiaCD）。如Sox9基因发生杂合突变，会导致人核型男性的个体发生反转，导致严重的骨骼发育不良，包括肩胛骨发育不全、天生的驼背以及骨盘的不发育，引起常染色体显性的疾病矮小综合征。Sox9基因的性别决定作用：Sox9基因作为Sox家族的一员，是继SRY基因后又一个参与性别决定的相关基因，但其具体的机制尚不十分名明确，目前有多[17]种假说，Graves等学者认为SRY基因并不是直接参与在人类性别决定，而是通过Sox3和Sox9基因的相互作用；在雌性个体中并没有SRY基因，Sox3基因抑制Sox9基因的生物学功能，进一步导致Sox9基因的睾丸决定启动作用被抑制；雄性个体中含有SRY基因，其抑制了Sox3基因的活性，使得Sox9基因得以发挥其睾丸决定的启动作用，最终参与性别的作用。另一种则是目前较为被学术界[18-19]接受的假说，有学者l等提出的，性别决定是一系列基因共同相互作用的结果，多基因级联调控反应模型。他们认为在WT1和SF1在双性腺的初级即开始表达，二者在性别决定期，共同作用于Sox9基因，使其表达，性别开始相雄性33 方面发展。而在雌性个体中，不存在SRY基因，WT1激活DAX1转录，而转录的DAX1可抑制Sox基因的表达，并促使性别向雌性方向表达。此外，Sox9基因还有可以参与神经系统的发育、胰腺的发育，以及其表达[20]异常，可以导致肿瘤的发生等相关功能。6椎间盘退行性变的临床治疗[21]6.1保守治疗，传统的药物、激素封闭、按摩理疗以及卧床休息等。其中药物包括消炎止疼、活血化瘀以及营养神经等，具有无创伤副作用小，易复发的特点。而其他理疗、局部封闭等也只是暂时缓解临床症状的症状，在身体劳累或者其他应力改变的情况下，上述症状会再次出现，甚至加重。[22-25]6.2手术治疗；目前的手术治疗方案主要包括减压椎间融合术、单纯的髓核摘除术、微创的减压手术。其中微创手术主要存在减压不彻底的问题，并存在复发的可能。而单纯的髓核摘除术，手术适应症较窄，且改变了脊柱的稳定性。目前应用最广的减压椎间融合术，自20世纪40年代，Jaslow等将后路腰椎椎间融合术（PLIF）的概念引入临床，不断发展，其可充分减压，并保持脊柱的稳定，但其改变了脊柱本身的结构，其长期对脊柱的影响暂不十分明确。7椎间盘退行性变的基因治疗[26]基因治疗是直随着现代科学技术的发展而产生的一种将目的基因通过载体或者直接导入到对应靶细胞中，通过进行相应基因的补充或者纠正相应的基因，从而达到治疗相应疾病的一种新型的治疗疾病的方法。随着目前椎间盘退行性变的相关基础研究的深入，学者们开始尝试应用退变相关基因的靶向进行椎间盘退行性变的逆向治疗。基因治疗，首先需要的了解相关基因的与椎间盘退行性变的关系，其中目前已知的对椎间盘退行性变有负相关作用的基因有Sox9基因、骨形成发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)、转化生长因子β(TransformingGrowthfactor－β，TGF－β)、基质金属蛋白酶抑制剂（TissueInhibitorsofmetalloproteinases，TIMPs）等，而与椎间盘退行性变呈正相关的基因有基质金属蛋白酶家族（matrixmetalloproteinases，MMPs）等。而目前所知的与椎间盘退行性变负相关的基因，34 及在随着其含量的减少，椎间盘发生退行性变程度加重。[27]7.1骨形成发生蛋白(BoneMorphogeneticProtein，BMP)的基因治疗。1963年，MarshallR.Urist等教授发现了骨形成发生蛋白BMP，它是一类多功能的转化诱导因子，具有引导间充质细胞转化为骨、肌腱、软骨、韧带等组织。目前发BMP家族中，BMP-2、BMP-4及BMP-7等在椎间盘退行性变中发挥重要的作用。通过相关实验发现BMP-2可促进BMP-7基因的表达来增加椎间盘细[28]胞中蛋白多糖及胶原蛋白的含量。近期EllmanMB等将乳铁素B和BMP-7联合导入退变椎间盘髓核细胞中，发现其较单一使用时，明显增加了其中的蛋[29]白多糖及胶原蛋白含量。ElfieKRo等，应用腺病毒相关载体将BMP-2转导入兔的退变椎间盘模型中发现，其可明显延缓椎间盘退行性的发展。7.2Sox9基因：目前在椎间盘退行性变基因治疗方面研究最多的基因。较为多见的是应用腺病毒载体将Sox9基因转导入退变的椎间盘模型中观察其效果。腺病毒相关载体已发展至第三代，一二代的腺病毒模型在病毒的稳定性、基因的转染率以及病毒的纯化方面存在相应的缺陷。目前的第三代腺病毒载体[32]AdMax腺病毒包装系统，该系统具有操作简单方便、基因突变率低、重组效率、获得的病毒产率及导入目的基因后的表达均很高等优点，可作为Sox9基因[33]的可靠的腺病毒载体。Paul等构建了腺病毒载体AdSox9基因模型，并将其转染入软骨母细胞系的HTB-94和人的退变椎间盘细胞中，发现其能明显增加二者细胞的II型胶原含量，后将腺病毒介导的Sox9基因导入至3只兔的椎间盘退变模型中。5周后与对照组相比，发现导入Sox9基因的退变椎间盘模型中的椎间盘细胞保持了原有的细胞外基质及II胶原蛋白的含量，而对照组则细胞破外基质及II型胶原蛋白含量明显较少进一步研究现，Sox9基因生物学作用可以[34]被某些特殊的细胞因子进行有效地调控。有学者利用自行制备的兔的退行性变模型成功转染了Sox9基因，并通过实验证实转染Sox9基因后的II型胶原蛋白mRNA获得了高表达，并且随着时间的边长，其含量越来越多。在将Sox9基因转染如退变椎间盘模型2、4、8周后，与对照组相比，II型胶原蛋白的含量及表达明显增加，且经过统计学分析有显著的统计学差异。应用病理学检查发现，组织中的椎间盘髓核细胞较之前明显增加，且结构稳定；从MRI影像学表现上发现蜕变的椎间盘的信号较前好转，所有的实验证据表明，导入Sox9基因的椎间盘退变模型在进行自我修复，且稳定可靠。35 8存在问题[33]目前对椎间盘的退行性变的基因治疗主要存在于理论和动物实验中，在基因的选择方面主要有骨形成发生蛋白(BMP)、转化生长因子β(GF－β)、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）、Sox9基因等，这些基因与椎间盘退行性变的主要作用为负相关，及其含量和表达的减少，可直接或间接的引起椎间盘退行性变的加剧。而应用上述基因进行相关的研究，主要包括有病毒载体和无病毒载体，无病毒载体的单纯基因体外稳定性差、基因完整率低，故主要应用病毒载体基因。目前常用的病毒载体有腺相关病毒(AAV)、单纯疤疹病毒(HSV)、腺病毒(Ad)[35]以及逆转录病毒(Retrovirus)等。较前几种病毒载体，腺病毒载体具有宿主细胞广、可携带大片段外源性基因（第三代腺病毒可携带外源基因长度达35kb）、安全性好、病毒的滴度高等优点，故目前学者常应用腺病毒载体作为目的基因[36]的病毒载体。而目前常用的Sox9基因腺病毒载体为AdEasy包装系统，在发生同源重组的时候，穿梭质粒和病毒质粒可能会在腺病毒的骨架载体的两个位置同时发生重组，因此重组后质粒在PacI酶切后可能出现两种重组后的产物，其重组时得到的病毒载体并不纯。该系统存在操作复杂，重组腺病毒的保存不易、产生效率低以及所得产物不纯方面等方面的缺陷，因此对Sox9基因的生物学作用研究以及可能的基因治疗，均不是很可靠。所以需要一种可靠的稳定的腺病毒包装系统，目前由FrankL.Graham教授设计建立第三代腺病毒包装系统[37]AdMax，具有操作简单方便、基因重组效率高、病毒产率高等优势，可作为[37]该基因的相关研究提供可靠的腺病毒载体。学者们对椎间盘退行性变的分子生物学研究及基因治疗主要还是在体外人椎间盘细胞或者退变的动物模型上，真正能应用到人的活体上，仍需要大量的可靠的相关实验提供相应的理论和实验依据，并需通过伦理学、遗传学、循证医学等相应学科的验证，仍有很长的路要走。9展望椎间盘退行性变是骨科的常见疾病，现代影像学的发展，其在诊断上已很明确，目前对其治疗主要集中在药物的保守治疗、手术的减压治疗等方面。前者只能单纯的减轻症状和炎症反应，遇到劳累或其他因素，先前的临床症状将会36 再次出现，甚至加重；而后者是通过去除压迫脊髓神经的人体组织来达到神经减压的目的，其本身破坏了脊柱的正常结构，改变了脊柱的生物力学，对临近阶段以及整个脊柱的稳定性的影响目前尚不得而知。二者均无法从根本上改变椎间盘退行性变。随着分子生物学等相关科学的发展，学者们开始从分子生物学的角度来研究椎间盘退行性变的机制，目前已所知的椎间盘退行性变有关的[38-40]相应基因或分子有椎间盘结构相关基因（COLlAl基因、Sox9基因、COL9A2、COL9A3基因、COLllA2基因、PG基因、CILP基因等）、骨质疏松相关基因（维生素D受体基因、雌激素受体基因）、细胞因子相关基因（炎症相关基因、生长因子类基因等）、椎间盘代谢相关基因（MMP-1、MMP3基因、TIMP-1、COX-2基因、TIMP-1和COX-2基因、THBS-2基因、ADH基因等）以及痛信号通路相关基因（GTP环化水解酶(GCHl)等），运用相关的基因逆向转导入退变的椎间盘细胞，发现可增加椎间盘中蛋白多糖、细胞外基质以及II型胶原蛋白的表达，延缓椎间盘的退变，并可修复受损的椎间盘细胞。为今后彻底治疗椎间盘退行性变提供了新的方向，相信随着相应技术的不断完善，基因治疗必将成为椎间盘退行性变治疗的一种真实、可靠的治疗方案。37 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个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果个人简历邱如标，男，江苏东海人，1987年02月28日出生；2011年7月毕业郑州大学并获得临床医学学士学位，2011年7月至2013年4月在山东省济南市第三人民医院工作，2013年9月进入郑州大学第一附属医院骨科攻读医学硕士学位，进行全日制硕士阶段学习。在学期间发表的学术论文与研究成果王珏，邱如标，王义生等.B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白27在中心型软骨肉瘤组织的表达及临床意义[J].中华实验外科杂志，2014,6(31):1300-1302王珏，邱如标，王义生等.性别决定区Y框蛋白9基因的AdMax系统重组腺病毒载体的建立及其表达[J].中华实验外科杂志，2014,7(31):1475-1476WangJue,QiuRubiao,YuanLianjing,et.AnalysisontheAlpiniakatsumadaicomponentsofZingiberaceaeplantsandtheirfunctionsonmyelomaresistance[J].PakistanJournalofPharmerceutialSciences.2015May;28(3Suppl):1065-1068孟飞，邱如标，王珏等.早期股骨头坏死治疗：髓芯股方肌骨块植入优于骨浆植入[J].中国组织工程研究，2015,12:1817-1821在研究生学习期间跟随导师王珏教授参加河南省科技厅“腺病毒介导的SOX9对兔退变椎间盘的治疗作用”，河南省教育厅项目“Sox9重组腺病毒载体对兔腰椎间盘退变模型的治疗”，“腺病毒介导的MMP-3基因与椎间盘细胞质基质降解的关系”的实验研究。2014年获得郑州大学国家奖学金，郑州大学三好研究生、百名研究生优秀科研奖，郑州大学第一附属医院优秀研究生2015年获得郑州大学三好研究生、百名研究生优秀科研奖，郑州大学第一附属医院优秀研究生2016年获得河南省优秀毕业生、郑州大学优秀毕业生41 致谢时光匆匆，三年的硕士研究生很快就要结束了，在这几年中我学到了很多东西，要感谢的人也很多。首先，我要感谢我的恩师王珏教授，王老师严谨的做学态度、负责的工作热情以及对手术的精益求精都让我受益匪浅。作为一名研究生，在王老师的指导下，学会了如何认真做科研；而作为一名临床医师，在王老师的教导下，学会了专业知识，外科技能，更重要的是活跃而又科学的临床思维。感谢郑大一附院骨科的各位教授及骨科五病区全体医护人员，你们教会了我在工作中不仅要博学、更要认真较劲、一丝不苟；感谢2013级研究生喻志、张迪、周全、郝志全等以及我的舍友韩钰、冯光、万家晗在我平时的学习生活中给予我的帮助；感谢我的师兄刘杨青在我的科研实验中给予我的帮助和指导，并感谢郑大一附院重点实验室的各位老师和同学给予的帮助；感谢我的师兄弟原涟靖、张雷、唐骞、王奇在我工作中提供的帮助；感谢郑州大学研究生院及郑大一附院研究生处的各位老师的精心培养；感谢答辩委员会的各位老师以及审稿的各位专家在百忙之中评阅我的论文、并给予指导意见；最后，我要感谢我的父母，正是他们的精心栽培和无私的奉献才有了今天的我，百尺竿头，我将继续扬帆航行。42
