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分类号：S826单位代码：10193密级：公开学号：20160790硕士学位论文珠江三角洲地区杂交尖塘鳢感染细胞肿大虹彩病毒的流行病学调查Theepidemiologicalinvestigationofhybridsnakehead（O.marmoratus×O.lineolatus）infectedMegalocytivirusintheAreaofthePearlRiverDelta作者姓名：席云清学位类别：农业硕士专业名称：养殖研究方向：鱼类病害指导教师：唐绍林、王桂芹所在学院：动物科学技术学院2018年5月 摘要杂交尖塘鳢（O.marmoratus×O.lineolatus）是我国珠江三角洲地区重要的淡水名优水产养殖品种，近年来随着杂交尖塘鳢养殖业的发展，养殖规模和养殖密度不断增大，病害问题也随之加重。从目前对其疾病的初步调查来看，细胞肿大虹彩病毒（Megalocytivirus）是对其危害最重要的病原，致使养殖杂交尖塘鳢大量死亡，从而对该品种的养殖产业造成了巨大的经济损失。细胞肿大虹彩病毒是从暴发大规模病害的杂交尖塘鳢体内分离出的病原体。经过初步调查发现由该病毒感染引起杂交尖塘鳢的死亡率可达100%，是目前发现感染杂交尖塘鳢的重要病原。本文主要从流行病学角度对该病毒在珠三角地区的杂交尖塘鳢主养区的流行情况进行了调查。首先，本研究于2017年2月至12月份对珠三角地区广州市、佛山市、中山市、珠海市、江门市、东莞市主要杂交尖塘鳢养殖区感染细胞肿大虹彩病毒的主要病症进行调查以及对部分主养区病毒的序列进行分析。结果在调查的地区中，通过对病鱼症状大量的观察结果显示被细胞肿大虹彩病毒感染的病鱼临床症状一般包括：体色发黑、尾鳍基部出血、解剖见脾脏肿大的特点，部分病鱼可见鳃丝具有黑色素细胞；组织病理变化结果显示，感染细胞肿大虹彩病毒的病鱼最突出的特点是在肝脏、脾脏、肾脏可形成嗜碱性肿大细胞。通过对珠三角各地区阳性样品进行主衣壳蛋白基因序列的扩增及测序，分析各地区获得的病毒株的同源性结果可知，同一地区病毒株的主衣壳蛋白核苷酸序列没有明显的碱基差异，不同地区之间病毒株存在地域差异，但是从总体来看整个珠三角地区病毒株的同源性维持在99.0%-100%之间。然后把各地区的病毒株与已公布的云斑尖塘鳢虹彩病毒（MSGIV）主衣壳蛋白序列进行遗传进化分析构建系统发育树，同源性都较高可达99.3%-99.9%，由此说明珠三角地区杂交尖塘鳢感染的细胞肿大虹彩病毒与云斑尖塘鳢虹彩病毒具有较近的亲缘关系。其次，经过调查2017年2月到12月份细胞肿大虹彩病毒在珠三角地区主要杂交尖塘鳢养殖地区的流行情况，结果显示，该病毒在2-12月平均检出率为29.97%。且该病毒在9月份检出率最高为49%，2月检出率最低为8.06%。并且发现该病毒在珠三角六个市区内佛山市在2-12月份检出率最高为37.06%，其次是广州市为35.20%，东莞市最低为17%。另一方面调查显示，体长小于等于5cmI 的杂交尖塘鳢鱼苗阳性检出率为40.07%，体长在5-12cm和大于12cm的鱼体阳性检出率分别是25.54%、20.87%。除此之外，通过调查发现发病杂交尖塘鳢往往不是单一的感染细胞肿大虹彩病毒，常会继发感染其他病原，如嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）、海豚链球菌（Streptococcusiniae）或寄生孢子虫（parasiticSporozoans）、神经坏死病毒（Viralnervousnecrosis，VNN）等。最后，根据调查的结果，针对病毒病的传染性提供切断其传播途径的措施，对于自然因素对发病的影响总结合理的人为补救措施，最后对人为管理操作方面提出正确实施方式。为有效预防该病提供参考，以提高杂交尖塘鳢养殖业的经济发展。关键词：杂交尖塘鳢；细胞肿大虹彩病毒；流行病学调查II AbstractO.marmoratus×O.lineolatusisanimportantspeciesoffreshwateraquacultureinthePearlRiverDeltaregionofChina.Inrecentyears,withthedevelopmentofO.marmoratus×O.lineolatusaquaculture,breedingscaleandbreedingdensityincreasing,thediseasebecomesmoreserious.Fromthepresentpreliminaryinvestigationofthedisease,Megalocytivirusisthemostimportantcauseofitsdamage,whichcausesthelargenumberofdeathofthefishhead,thuscausinggreateconomiclosstothebreedingindustryofthebreed.MegalocytivirusisapathogenisolatedfromaO.marmoratus×O.lineolatuswithalarge-scalediseaseoutbreak.AfterapreliminaryinvestigationfoundthatwerecausedbyO.marmoratus×O.lineolatusmortalityreached100%bythevirusisfoundinanimportantpathogeninfectionO.marmoratus×O.lineolatus.TheepidemicsituationofthevirusinthemaincultureareaoftheO.marmoratus×O.lineolatusinthePearlRiverDeltaregionwasinvestigatedfromthepointofviewofepidemiology.Firstly,fromFebruary2017toDecember,thisstudyinvestigatedthemaindiseasesofO.marmoratus×O.lineolatusinthemaincultureareaofGuangzhou,Foshan,Zhongshan,Zhuhai,JiangmenandDongguanCityinthePearlRiverDeltaregionwhichinfectedMegalocytivirusandanalysisofthesequenceofthevirusinsomemainareas.TheresultshowedthatalargenumberofobservationsonthesymptomsofdiseasedfishshowthattheclinicalsymptomsofthediseasedfishinfectedwithMegalocytivirusgenerallyinclude:darkeningofthebody,hemorrhageofthebaseofthecaudalfin,thecharacteristicofthespleensinanatomy,andapartofthediseasedfishthatcanbefoundtohavemelanocyticinthebranchialfilaments.Histopathologicalchangesshowedthatthemostprominentcharacteristicofthediseasedfishinfectedwithiridoviruswastheformationofbasophiliccellsintheliver,thespleenandthekidneys.AccordingtotheamplificationandsequencingofthemaincapsidproteingeneinthepositivesamplesofthePearlRiverDeltaregion,thehomologyofthevirusstrainsobtainedfromeachregionwasanalyzed,theresultsshowedthattherewasnosignificantbasedifferenceinthenucleotidesequenceofthemaincapsidproteinofthevirusstraininthesamearea.TherewasageographicIII differencebetweenthevirusstrainsindifferentregions,butthehomologybetweenthevirusstrainswasmaintainedbetween99.0%-100%inthewholePearlRiverDeltaregion.ThenputthevirusstrainsineachregionwiththepublishedstrainsofOxyeleotrismarmoratusiridovirus(MSGIV)majorcapsidproteinsequencestoconstructphylogenetictreeanalysisofgeneticevolution,theresultsshowedthatbothhomologyishighupto99.3%-99.9%.ThePearlRiverDeltaregionO.marmoratus×O.lineolatusinfectedMegalocytivirusandMSGIVhascloserelationship.Secondly,AsurveyoftheepidemicsituationoftheiridovirusinthemaincultureareaoftheO.marmoratus×O.lineolatusinthePearlRiverDeltaregionfromFebruarytoDecember2017.Theresultsshowedthattheaveragedetectablerateoftheviruswas29.97%,andthehighestdetectionrateoftheviruswas49%inSeptember,andthelowestdetectionratewas8.06%inFebruary.Itwasfoundthatthehighestrateoftheviruswas37.06%inthesixcitiesofFoshaninthePearlRiverDelta,followedby35.20%inGuangzhouand17%inDongguan.Ontheotherhand,thepositiverateofO.marmoratus×O.lineolatuswithbodylengthlessthan5cmwas40.07%.Thepositiverateofbodylengthin5-12cmandmorethan12cmwas25.54%and20.87%,respectively.Inaddition,throughthesurveyfoundthattheincidenceofO.marmoratus×O.lineolatusisoftennotasingleinfectedMegalocytivirus,itcouldinfectionofotherpathogensatthesametime,suchasAeromonashydrophila,Streptococcusiniae,parasiticSporozoansorViralnervousnecrosis.Finally,accordingtotheresultsoftheinvestigation,toprovidemeasurestocutoffthetransmissionofinfectiousaspectsofvirusdisease,tosummarizetheimpactofnaturalfactorsontheincidenceofreasonableartificialremedialmeasures.Atlast,puttingforwardthecorrectwaytoimplementtheartificialmanagementoperation,whichcanprovidereferenceforthebreedersofO.marmoratus×O.lineolatus,soastoimprovetheeconomicdevelopmentofthebreedingindustry.Keywords:O.marmoratus×O.lineolatus,Megalocytivirus,EpidemiologicalinvestigationIV 目录摘要...............................................................................................................................IABSTRACT...............................................................................................................III第一章前言.................................................................................................................11.1细胞肿大虹彩病毒的研究现状...........................................................................21.1.1种类、分离的宿主及分布地理位置.............................................................21.1.2流行病学研究.................................................................................................41.1.3检测方法.........................................................................................................41.1.4疫苗免疫研究.................................................................................................71.1.5展望.................................................................................................................91.2本研究的研究目的意义.....................................................................................10第二章病原的检测与遗传进化分析.......................................................................112.1材料与方法.........................................................................................................112.2结果.....................................................................................................................132.3讨论.....................................................................................................................192.4小结.....................................................................................................................21第三章珠三角地区杂交尖塘鳢感染细胞肿大虹彩病毒病的分布情况...............223.1材料与方法.........................................................................................................223.2结果.....................................................................................................................233.3讨论.....................................................................................................................313.4小结......................................................................................................................32第四章综合防治措施...............................................................................................34结论.....................................................................................................................37参考文献.....................................................................................................................381 作者简介.....................................................................................................................43致谢.....................................................................................................................442 第一章前言1.1细胞肿大虹彩病毒的研究现状细胞肿大虹彩病毒是目前发现的危害鱼类健康的重要病毒性病原，目前该属病毒广泛分布于日本、韩国、中国、泰国、东南亚等许多亚洲国家和地区的近百种淡水、海水鱼类中，致使感染鱼类出现大面积死亡，同时给水产养殖业造成重大经济损失。文章综述了近年来国内外对细胞肿大虹彩病毒的研究现状，主要从细胞肿大虹彩病毒的种类、分离的宿主及分布地理位置、流行病学研究、检测方法、疫苗免疫研究方面取得的成果进行综述。并对今后细胞肿大虹彩病毒的研究趋势进行展望。细胞肿大虹彩病毒在分类上隶属于虹彩病毒科（Iridoviridae）[1]，病毒粒子为正二十面体，基因组为双链DNA，具有较强的抵抗力，置于-20℃以下保存可存活20个月左右。该属病毒对乙醚或氯仿等脂溶性溶剂敏感，不能保存于体积比浓度为50%的甘油中[2]。反复冻融可使病毒的感染活力显著降低。该属病毒具有较高的致死性，严重危害我国养殖业的发展，在2008年农业部公告第1125号将传染性脾肾坏死病毒（Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV）列为二类动物疫病，OIE将同病毒属的真鲷虹彩病毒（Redseabreamiridovirus，RSIV）列为必须申报的疾病。本文将从细胞肿大属虹彩病毒种类、分离的宿主及分布地理位置、流行病学研究、检测方法、疫苗免疫研究方面取得的成果进行综述，以期为细胞肿大虹彩病毒病的后续研究提供理论参考。1 1.1.1种类、分离的宿主及分布地理位置目前已被分离鉴定的细胞肿大虹彩病毒种类繁多，其中以传染性脾肾坏死病毒、大菱鲆红体病虹彩病毒（Turbotreddishbodyiridovirus，TRBIV）、真鲷虹彩病毒、大黄鱼虹彩病毒（Largeyellowcroakeriridovirus，LYCIV）、条石鲷虹彩病毒（Rockbreamiridovirus，RBIV）研究报道较多。其他种类近几年也被众多学者在不同种鱼中陆续探知，目前已被发现的细胞肿大属虹彩病毒感染的宿主有鲈形目、鲽形目、鳕形目和鲀形目等4目近百种海水、淡水鱼类，并且该属病毒广泛分布于日本、韩国、中国、泰国、东南亚等许多亚洲国家和地区，见表1-1。2 表1-1肿大细胞属虹彩病毒的种类、分离宿主及地理位置情况Tab.1-1Thepositionoftype,thehostandthegeographicaloftheMegalocytivirus病毒名称英文名称及缩写分离宿主宿主地理位置参考文献真鲷虹彩病毒Redseabreamiridovirus(RSIV)Pagrusmajor日本K.Inouye等[3]海鲈虹彩病毒SeaBassIridovirus(SBIV)Lateolabraxsp.日本、中国南海K.Nakajima等[4]传染性脾肾坏死病毒InfectiousSpleenandKidneyNecrosisVirus(ISKNV)Sinipercachuatsi中国广东J.G.He等[5]条石鲷虹彩病毒RockBreamIridovirus(RBIV)Oplegnathusfasciatus日本、韩国S.J.Jung等[6]蓝眼灯鱼虹彩病毒Africanlampeyeiridovirus(ALIV)Aplocheillichthysnormani日本、新加坡C.Sudthongkong等[7]石斑鱼虹彩病毒GroupersleepydiseaseIridovirus(GSDIV)Epinephelusmalabaricus泰国C.Sudthongkong等[8]大黄鱼虹彩病毒LargeYellowCroakeriridovirus(LYCIV)Larimichthyscrocea中国福建X.H.Chen等[9]大菱鲆红体病虹彩病毒TurbotReddishBodyIridovirus(TRBIV)Scophthalmumaximus中国山东C.Y.Shi等[10]巨鲈虹彩病毒giantseaperchiridovirus(GSIV-KI)Latescalcarifer中国湛江C.B.Chao等[11]牙鲆虹彩病毒FlounderIridovirus(FLIV)Paralichthysolivaceus韩国J.W.Do等[12]墨瑞鳕虹彩病毒Murraycodiridovirus(MCIV)Maccullochellapeeliipeelii澳大利亚J.Go等[13]丽丽鱼虹彩病毒DwarfGouramiIridovirus(DGIV)Trichogasterchuna日本、新加坡、澳大利亚J.Go等[13]台湾石斑鱼虹彩病毒Taiwangrouperiridovirus(TGIV)Epinephelus中国台湾C.M.Wen等[14]斑石鲷虹彩病毒Spottedknifejawiridovirus(SKIV-ZJ07)Oplegnathuspunctatus中国湛江C.F.Dong等[15]云斑尖塘鳢虹彩病毒Marbledsleepygobyiridovirus(MSGIV)Oxyeleotrismarmoratus中国广东王庆等[16]斜带石斑鱼虹彩病毒Orange-SpottedGrouperIridovirus(OSGIV)Epinepheluscoioodes中国广东Y.Huang等[17]褐篮子鱼虹彩病毒Siganusfuscescensiridovirus（SFIV）Siganusfuscescens中国福建雷燕等[18]3 1.1.2流行病学研究1.1.2.1发病季节及水温Jeong等[19]研究发现8，9，10三个月份在鱼体内检出病毒的阳性率最高，正是该类疾病流行的高发季节。同时有研究表明当水温在25-34℃时是病毒适合流行的水温，而28-30℃是其最适流行水温[20]；当水温低于18℃以下时可使鱼感染但不产生临床症状[21]。由此可见温度高于34℃或低于18℃时该病毒都会被抑制。1.1.2.2传播途径病毒粒子在鱼的养殖水体中可通过水平和垂直两种途径进行传播。曾慷等[20]把传染性脾肾坏死病毒无菌滤液分别通过肌肉注射、划痕浸泡、腹腔注射和口服四种途径人工感染健康鳜，结果发现，四种途径均可引起ISKNVD的典型病症，从而为病毒感染鱼体的水平传播途径提供了科学的依据。目前对于细胞肿大虹彩病毒的垂直传播途径尚未见研究报道，但有研究表明细胞肿大虹彩病毒的主要感染器官是脾脏、肾脏[21-22]。而脾脏和肾脏又是鱼类的造血器官，所以间接的可以判断病毒能随着血液循环扩散到性腺进行垂直传播。1.1.2.3易感群体细胞肿大虹彩病毒感染宿主范围极其广泛，目前已被发现的感染的宿主有鲈形目、鲽形目、鳕形目和鲀形目等4目近百种海水、淡水鱼类。另有研究发现[23]多种海水鱼感染极少量TRBRV后可呈现无症状感染的现象，这为进一步探究该病毒属的宿主范围提供有理证据。根据文献报道发现该病毒属的亲缘关系较近的不同病毒种可能具有不同的宿主范围，曾慷等[20]利用ISKNV滤液对其它五种鱼：大口黑鲈、草鱼、乌鲤、尼罗非鲫、尖吻鲈的感染实验中发现大口黑鲈对ISKNV敏感，而对其它四种鱼不敏感；而在文琳等[24]的研究中发现尖吻鲈虹彩病毒的基因序列与RSIV同源性高达98.6%，而与ISKNV亲缘关系较远，由此可见ISKNV与RSIV感染的鱼种可能不同。另外同种病毒对同种鱼之间的感染情况也不一致，宋振荣等[25]利用RSIV感染的真鲷脾脏分离提纯的病毒悬液感染鳜鱼的实验发现较小鱼体有易被病毒感染的趋势。1.1.3检测方法1.1.3.1临床症状诊断被细胞肿大病毒虹彩病毒感染的病鱼临床症状一般包括：在水中游动异常，嗜睡；体表无明显损伤，体色发黑，严重时可见眼球突出，鳃丝充血或出血；解4 剖病鱼可见贫血症状明显，肝脏发白，脾脏肾脏肿大发白或有出血点等[22,24,26]。但病鱼的临床症状也存在一定的差异，如Kim等[27]研究发现，感染TBIV的大菱鲆呈现体色发白、眼睛突出、腹部肿胀等临床症状；而Shi等[10]报道，感染TRBIV的大菱鲆病鱼症状是鳃发白且局部出血、鳍和鳍基有点状出血、肌肉和皮肤尤其出血。造成症状差异的具体原因目前没有相关研究，所以细胞肿大虹彩病毒病的临床症状仅供进行流行病学现场调查诊断时作为初级参考，具体确诊还需要进一步结合实验室检测技术。1.1.3.2显微镜观察显微镜观察是当前检测细胞肿大属虹彩病毒诊断的重要方法之一。显微镜观察既可采用光镜，也可通过电镜进行。目前细胞肿大虹彩病毒的光学显微镜检测方法主要是通过对病鱼的脾脏、肾脏等病变器官制作病理切片，然后在光学显微镜下观察肾脏、脾脏等器官组织有无特征性病变即有无嗜碱性肿大细胞从而进行有无被该病原感染的诊断[22,28]。通过制作电镜病理切片可在电子显微镜下观察到病毒粒子的大小和形态特征[29]，但是在透射电镜下不仅可清楚的观察到病毒粒子的大小和形态特征还可以了解病毒粒子在组织细胞中的分布情况，并且可以观察到受感染细胞的超微病理变化[28]。但是相比光学显微镜，电镜检测难度大，不适合生产上的应用。1.1.3.3细胞培养分离细胞培养分离技术是诊断病毒较准确的方法，也是OIE推荐的首选方法。细胞肿大属虹彩病毒其特点是不容易感染培养细胞[30]。虽然对该病毒属感染细胞的相关机制已有众多学者进行了试验研究，但到目前为止只有对几株细胞肿大虹彩病毒成功感染培养细胞的研究报道，见表1-2。5 表1-2细胞肿大虹彩病毒的敏感细胞系Tab.1-2SusceptiblecelllinesofMegalocytivirus细胞系来源组织所支持病毒参考文献牙鲆鳃细胞(FG细胞)鳃TRBIV林晓婷等[27]鳜脑组织细胞(CPB)脑ISKNVX.Fu等[31]鳜仔鱼细胞系MFF-1仔鱼ISKNV和SKIV董传甫等[32]鳜仔鱼细胞系MFF-2仔鱼ISKNV和SKIV董传甫等[15]真鲷鳍条细胞系CRF-1鳍条RSIVM.Imajoh等[33]GCB4细胞系石斑鱼脑组织GSIVC.M.Wen等[14]1.1.3.4PCR检测PCR检测方法是将DNA体外合成扩大的技术，可将体内少量的经多次扩增后达到目前检测技术灵敏度的范围，以便对病原进行体外检测及鉴定。由于该方法具有简便，快速，灵敏的特点，现已成为了检测细胞肿大虹彩病毒的主要手段。目前PCR技术依据细胞肿大属虹彩病毒的多种特异性表达基因如开放式阅读框、ATPase基因、特异性主衣壳蛋白（MCP）、核苷酸还原酶小亚单位(RNRS)基因等设计相应的引物对鱼类细胞肿大属的病毒成功的进行了检测[14,23,26,34]。为了进一步提高PCR的检测效率和检测灵敏度，一些学者优化了反应程序和反应体系的条件，如史成银等[35]通过确定最佳复性温度优化了PCR反应参数，建立了灵敏度高和特异性强的TRBIVPCR的检测方法，该方法仅需取活鱼少量血液即可在短时间内完成大批样品的病毒检测。万雪等[36]通过分别筛选优化Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP、模板、引物的浓度建立了检测RSIV特异性较高的常规PCR检测方法。除此之外，在单一PCR检测的基础上其他更优化的检测方法被陆续建立并应用于临床，如王庆等[37]设计两对特异性引物并且通过优化PCR反应体系和反应的特异性和灵敏度试验，建立一种可以同时检测大口黑鲈虹彩病毒（largemouthbassranavirus，LMBV）和大口黑鲈细胞肿大属虹彩病毒的双重PCR检测方法；贾坤同等[23]依据TRBIV的ATPase基因序列设计了内外两对特异性的引物，建立了一种特异性强且比一步PCR灵敏度高104倍的套式PCR检测方法，该方法可6 检测在TRBIV含量极少时呈无症状感染状态的多种海水鱼。此外，实时荧光定量PCR检测方法目前广泛用于病毒检测，其中以TaqMan探针法和SYBRGreenⅠ染料法最为常见[38-42]。荧光定量PCR具有灵敏度高、可定量、能够实时监控、防污染等优点，克服了单一PCR存在的一些问题，而有学者在SYBRGreenⅠ染料法的基础上结合巢式PCR检测方法保证只有目标DNA片段，防止荧光定量PCR在进行多个基因同时检测时不同的荧光染料之间会发生相互干扰的现象[38]。张醴溪等[43]又以ISKNV早期基因ORF-099为靶标基因，设计特异性引物和探针，建立了ISKNV灭活快速检验的荧光定量qRT-PCR方法，该方法用于ISKNV细胞灭活疫苗生产过程中病毒的灭活检验比传统的细胞盲传法和鱼体安全试验法检测灵敏度高且稳定性好。但是从总体角度考虑实时荧光定量PCR检测方法存在费时费力且所需仪器和器材昂贵的缺点。1.1.3.5其他分子检测方法除了以上方法外荧光标记原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、超分支滚环扩增法（a60-minhyper-branchedrollingcircleamplification，HRCA）、液相芯片检测技术（liquidchip）也被用于细胞肿大虹彩病毒的检测，如Lee.N.S等[44]使用地高辛标记的FISH检测方法探究了条石鲷感染RBIV的内部特征，该方法不仅对病毒可以定性分析而且还可以对病毒在组织、细胞中定位检测。K.Subramaniam等[45]通过改进检测ISKNV的LAMP反应体系，在反应中加入稀释的吖啶橙，便可根据反应体系颜色变化用肉眼判断是否为阳性反应。该方法不仅灵敏度高特异性强而且操作方便、成本低。K.C.Jiang等[46]通过确定HRCA的锁式探针浓度、锁式探针连接时间和优化反应条件，确保ISKNV在WSSV、LDV、SVCV中的特异性检测。尹伟力等[47]通过确定探针Tm值、摸索碳二亚胺溶液最合适质量浓度、圈定微球集中地区域建立可以同时对RSIV和KHV进行快速检测的liquidchip体系，该方法不仅灵敏度高而且大大杜绝了假阳性情况的发生。1.1.3.6血清学检测酶联免疫吸附检测（ELISA）、间接免疫荧光（IFA）和蛋白质印迹（WesternBlotting）技术目前广泛用于该属病毒的免疫学检测，例如付小哲等[48]通过ELISA、IFA和WesternBlotting检测实验最终证实抗ISKNVMCP的单克隆抗体可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白。K.Seryun等[49]利用ELISA在通过预处理消除FBS的培养液中高效的检出黄鳍短须石首鱼血清中的RSIV抗体。1.1.4疫苗免疫研究防制病毒性传染病的有效方法是疫苗免疫。目前该病毒属在疫苗免疫方面取7 得了零星进展。早在日本1999年间，K.Nakajima研制的抗RSIV全细胞灭活疫苗已被商业化应用于真鲷养殖业。C.M.Caipang等[50]又利用RSIV的跨膜蛋白制备出了免疫保护率较高的DNA疫苗。在中国，C.Dong等[51]在建立的MFF-1细胞系的基础上制备出ISKNV的全细胞甲醛灭活苗。其后Y.Dong等[52]进一步验证了ISKNV甲醛灭活疫苗在预防RSIV感染网箱养殖鳜鱼中也具有一定的成效。1.1.4.1亚单位疫苗为了有效的对抗该属病毒，众多学者通过扩增该病毒属的某些基因片段构建基因表达质粒探究了重组基因的免疫原性。如付小哲等[53]对ISKNV重组MCP蛋白的免疫原性进行了初步研究，发现重组MCP蛋白有较好的免疫原性，可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答。之后在2013年付小哲等[54]又采用PCR方法扩增ISKNVORF093基因全长，构建了ISKNVORF093基因原核表达质粒。经IPTG诱导表达，Ni柱纯化后，中和实验和免疫印记分析，攻毒实验发现重组ORF093蛋白具有一定的免疫原性，可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。H.Shimmoto等[55]克隆RSIV351R蛋白，构建RSIV351R蛋白原核表达质粒获得重组RSIV351R蛋白制备了疫苗，通过腹腔注射真鲷幼鱼实验证明重组RSIV351R蛋白可作为对抗细胞肿大虹彩病毒的潜在疫苗。这些研究为进一步制备出对抗该病毒的商品化重组亚单位疫苗提供可靠的实验依据。1.1.4.2减毒疫苗除以上亚单位疫苗被不断研究之外减毒疫苗也崭露头角，郭长军等[56]通过用ISKNV和利用基因工程原理构建的缺失vSOCS基因的重组ISKNV病毒(m-vSOCS)分别人工感染鳜鱼，结果发现ISKNV感染鳜鱼的死亡率显著高于相同感染滴度的m-vSOCS病毒株，从而揭示了vSOCS是ISKNV的重要毒力因子之一，并且表明m-vSOCS病毒株有望成为抗ISKNV的重组基因缺失减毒活疫苗候选疫苗。1.1.4.3DNA疫苗近几年来DNA疫苗的研究也得到崭新的成果，M.Zhang等[57]分别对RBIV-C1P86、P137、P142、P224、P336、P453、P454七个基因克隆，建立表达载体制备疫苗，通过对大菱鲆肌肉注射实验最终结果表明，PCN86是有效的DNA疫苗，有望在养殖业中被用来控制肿大细胞虹彩病毒的暴发。周伟东等[58]以ISKNVMCP基因为目的基因，克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（+）中，构建成DNA疫苗pcMCP，通过攻毒实验表明pcMCP作为DNA疫苗浸泡免疫可降低ISKNV感染鳜鱼的死亡率。付小哲等[59]成功构建ISKNVORF086原核表达载体，并且证实了ISKNVORF086的免疫原性，可作为抗ISKNV的DNA8 候选疫苗。1.1.4.4免疫佐剂佐剂作为疫苗添加剂可通过直接刺激免疫系统来提高机体免疫。Z.X.Zhou等[60]通过把十支具有免疫刺激特性的CpG寡脱氧核苷酸抗病毒制剂作用在牙鲆上，结果发现其中三只牙鲆的肾、脾和肝病毒复制得到抑制，且表现出较强的抑制活性，促进了外周血白细胞增殖、增强头肾单核吞噬细胞的活性。当敲除TLR9，CpG寡脱氧核苷酸免疫和抗病毒活性明显受阻。结果表明，CpG寡脱氧核苷酸激活TLR9介导的免疫反应，具有抗病毒和免疫佐剂的潜力，可用于养殖牙鲆细胞肿大病毒感染的控制。但是疫苗免疫鱼体需要通过腹腔注射、浸泡和口服三种途径[61]，由于渔业养殖规模相对较大，腹腔注射的途径需要大量劳动力且难以避免对鱼体造成损伤或应激，浸泡、口服疫苗虽然操作方便但是疫苗造价昂贵这两种方法实用起来难免会铺张浪费。所以研制的疫苗该如何顺利成功的用于鱼群将是亟需解决的一大难题。1.1.5展望细胞肿大虹彩病毒现已成为危害鱼类健康养殖的重要病原，为了更好的防制该病爆发，因此，在加强研制安全、方便、特效适用于渔业生产的疫苗的同时还应加强对该属病毒的流行病学研究和疾病监测，预防病毒的传播和流行。经过大量的研究发现该属病毒可感染淡水、海水鱼类，所以在流行病学方面还应开展广泛的调查工作，进一步探究该属病毒在不同鱼类的分布情况确定其感染谱；同时还应调查该属病毒感染鱼体的传播媒介，从而直接阻断病毒的传播途径减少病毒病的发生；另一方面为降低病毒的发病率还应深入调查探讨其与温度变化、天气变化等自然因素的关系。在病毒检测方面还需进一步建立该属病毒的敏感细胞系揭示病毒发病机理从而寻找诊断该病毒病的有用指标探索有效的治疗计策；此外该属病毒具有潜伏感染的特点，当达到适宜爆发的温度，或其他因素导致鱼体抵抗力下降时，潜伏病毒易被激活，从而导致鱼群开始发病并使疾病快速传播，因此选择合理的检测方法加强对该病毒的监测对于疾病的流行具有重要意义。9 1.2本研究的研究目的意义杂交尖塘鳢，俗称笋壳鱼，是云斑尖塘鳢（Oxyeleotrismarmorata）和线纹尖塘鳢（Oxyeleotrislineolatus）的杂交品种。杂交尖塘鳢蛋白质含量高，脂肪含量少，营养丰富，肉质细嫩，味道鲜美，目前已成为珠三角地区重要的淡水名优水产养殖对象。而且销售价格一直居高不下，近两年正常的出塘价格都稳定在70-80元/kg左右，养殖效益十分可观。目前对杂交尖塘鳢的研究仅有人工养殖技术、杂交育种方面的报道[62-66]。近年来随着养殖规模的不断扩大，病害问题也随之加重。从目前对其疾病的初步调查来看，细胞肿大虹彩病毒病是对其危害最重要的疾病，养殖池塘发病率70%以上，发病池塘杂交尖塘鳢死亡率40%以上，处理不当死亡率甚至100%。尚未见杂交尖塘鳢细胞肿大虹彩病毒流行病学的相关报道。细胞肿大病毒属虹彩病毒（Megalocytivirus）是鱼类重要病毒性病原之一。近年来在东亚、东南亚和欧洲地区，由该类病毒引起的鱼类疾病已呈明显上升趋势，该病毒在亚洲，特别是在22℃以上的高水温时，极易感染中国、日本和东南亚等国养殖的海水鱼类，如石斑鱼、尖吻鲈、真鲷、牙鲆和大黄鱼等，以及淡水养殖的鲈形目鱼类，如鳜、杂交鳜、云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、杂交尖塘鳢、大口黑鲈等，致使鱼类大面积的死亡，造成了严重的经济损失，因而被称之为“海洋口蹄疫”，而且患病鱼的死亡率从30%(成鱼阶段)到100%(幼苗阶段)不等，给水产养殖业造成重大的经济损失，严重阻碍了鱼类养殖业的健康发展，在国内外受到愈来愈大的关注。通过对珠三角地区主要养殖杂交尖塘鳢的几个地区的样品进行定时、随机采样，通过现场调查并结合实验室诊断的方法对所有样品进行病毒的检测，分别得到细胞肿大虹彩病毒在珠三角地区不同时间内不同地区的病毒感染率的分布情况，进行约一年时间的定点随机检测病毒的携带率变化特点；对不同地区的细胞肿大虹彩病毒阳性样本进行基因组部分测序，与已公布的相关病毒序列进行序列相似性比对，构建病毒的基因进化树，阐明珠三角地区内病毒的流行情况和变异特点；同时对珠三角地区几个杂交尖塘鳢养殖地区进行年度的宿主范围调查，调查病毒在杂交尖塘鳢不同鱼龄间的携带情况，对病毒的传播特点和宿主分布进行初步调查，对病毒的流行性做出评估。最后综合现场调查结果与阳性检出率分析该疾病在杂交尖塘鳢养殖过程中的发病机理，为养殖者有效预防提供参考。10 11 第二章病原的检测与遗传进化分析本研究在2017-2018年间，从珠三角地区杂交尖塘鳢养殖池塘收集疑似病例，根据组织病理变化观察结合OIE推荐的检测虹彩病毒的特异性引物进行PCR诊断，总结发病鱼症状，为流行病学调查的初步诊断鱼群感染细胞肿大虹彩病毒提供可靠依据。挑选广州市、佛山市、珠海市、中山市、江门市、东莞市各地区阳性样品进行主衣壳蛋白基因序列的扩增及测序，分析各地区获得的病毒株的同源性，然后在NCBI下载已公布的云斑尖塘鳢虹彩病毒（MSGIV）主衣壳蛋白序列进行遗传进化分析构建系统发育树，对病毒的病原和分子特性进行了研究。2.1材料与方法2.1.1材料病料的采集：病料主要采自珠三角地区（广州市、佛山市、珠海市、中山市、江门市、东莞市）等地的主养区池塘养殖的杂交尖塘鳢。实验试剂与仪器：实验所涉及的主要相关试剂详见表2-1。实验所涉及的主要相关仪器详见表2-2。表2-1主要实验试剂Tab.2-1Mainreagentsofexperiment试剂名称生产公司95％酒精大连宝生物工程有限公司100％酒精大连宝生物工程有限公司波恩氏液大连宝生物工程有限公司pMD19-Tsimplevector大连宝生物工程有限公司2×TaqPCRMasterMix天根生化科技（北京）有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒天根生化科技（北京）有限公司大肠杆菌DH5α天根生化科技（北京）有限公司DNA分子质量标准大连宝生物工程有限公司普通培养基（TSA）购自青岛海博生物技术有限公司。（1）琼脂糖凝胶：秤取琼脂糖1.2g加入100ml电泳缓冲液，加热煮沸5-7min，冷一下，加入50ulEb染色液，倒入刻度板，插入梳子，凝固20-30min，冷却成型。11 （2）培养基配制：在200mlLB液体培养基中加入3g琼脂粉，高压灭菌后，冷却至55℃左右，加入氨苄储存液至终浓度为100μg/ml后，倒好平板。表2-2主要实验仪器Tab.2-2Maininstrumentofexperiment仪器名称生产公司PCR仪杭州晶格科学仪器有限公司生物显微镜麦克奥迪实业集团有限公司冷冻高速离心机珠海黑马医学仪器有限公司-20℃冰箱青岛海尔股份有限公司WD-9403C紫外仪北京六一生物科技有限公司DYY-6C电泳仪北京市六一仪器厂电热恒温水箱上海益恒实验仪器有限公司电热鼓风干燥箱上海益恒实验仪器有限公司震荡培养箱上海益恒实验仪器有限公司JC202型电热恒温干燥箱上海嘉程仪器设备厂2.1.2方法2.1.2.1症状观察取发病鱼，置于解剖盘中，首先观察体表有无异常、寄生虫等，取鳃丝镜检，再解剖观察各内脏组织器官的病变情况，并做记录。2.1.2.2组织病理学观察分别取病鱼的鳃丝、肝脏、脾脏、肾脏和肠道等组织，用波恩氏液固定24h，用70%酒精换液，之后每隔4h换液一次，直至溶液无黄色，之后用梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡浸蜡包埋成块、于石蜡切片机上切成5μm蜡带，苏木精-伊红(H·E)染色后，于光学显微镜下观察并拍照。2.1.2.3PCR检测2.1.2.3.1引物设计检测引物使用OIE推荐的检测虹彩病毒的特异性引物[11]，上下游引物序列为：P1:5'-CTCAAACACTCTGGCTCATC-3'，P2:5'-GCACCAACACATCTCCTATC-3'。预扩增片段长度为570bp，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。2.1.2.3.2DNA的提取分别取肝、脾、肾、肠、鳃等组织器官，研磨后在-20℃下反复冻融4次，然后用酚-氯仿法提取组织DNA，放置在-20℃下保存备用。12 2.1.2.3.3琼脂糖凝胶电泳采用引物P1和P2，配制20μL反应体系进行PCR反应：无菌蒸馏水6μL，2×TaqPCRMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板3μL。PCR反应程序：95℃下预变性5min；95℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸30s，共进行30个循环；最后在72℃下再延伸10min，放置在4℃下保存。用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果。对PCR扩增后的产物进行回收，送往上海美吉生物医药科技有限公司广州分公司对回收基因片段进行克隆测序。将测序结果在NCBIblast上进行片段基因相似性检索。2.1.2.4主衣壳蛋白序列的测定和分析参照文献[12]中的方法，比对并合成MCP全长扩增引物，引物序列为：MCP-F:5'-GGATCCATGTCTGCAATCTCAGGTGCAAACGTAA-3'，MCP-R:5'-CTCGAGCAGGATAGGGAAGCCTGCGGCG-3'。采用引物MCP-F和MCP-R扩增MCP全长序列，大小约为1300bp，下划线标注分别是BamHI和xhoI酶切位点，能保护PCR产物得完整性，将PCR扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳，并将纯化的产物送上海美吉生物医药科技有限公司广州分公司进行测序。应用DNAstarv7.1分析软件对测序基因序列与NCBI中下载的虹彩病毒代表株进行核苷酸序列同源性分析，构建系统发育树。2.2结果2.2.1症状观察通过实验调查总结阳性病例发病后病鱼主要症状为：在水中上浮、在水面下停滞或漫游；部分病鱼体色发黑，见图2.1，尾鳍基部出血，见图2.2。部分鳃丝镜检可见黑色素细胞，见图2.3。解剖观察内脏最明显的症状是见脾脏肿大，见图2.4。13 图2.1体色发黑Fig.2.1Bodyblack图2.2尾鳍出血Fig.2.2Caudalhemorrhage14 图2.3鳃丝黑色素细胞Fig.2.3Branchialmelanocytes图2.4脾脏肿大Fig.2.4Spleenelephantiasis15 2.2.3组织病理变化组织切片显示，阳性病例在脾、肾、肠组织中均可见感染虹彩病毒后的特征性病变-直径约为20-30μm形态异常的嗜碱性肿大细胞，见图2.5。健康鱼肠组织结构一般有四层：粘膜层、固有层、肌层和浆膜层，组织轻微淤血，见图2.5A。患病鱼肠固有层可见肿大细胞，且有少量淋巴细胞浸润，见图2.5B。健康鱼脾实质细胞主要由大量的淋巴细胞、红血细胞及其数量不等的单核细胞等组成，见图2.5C。患病鱼脾组织中可见多个肿大细胞，脾实质细胞散在坏死，细胞核固缩，散布少量黑色素巨噬细胞中心，见图2.5D。健康鱼肾由泌尿组织和淋巴组织构成，泌尿组织部分可见肾小球和肾小管，肾小管上皮细胞为立方状或长方状，细胞核位于细胞中部，见图2.5E。患病鱼的肾间组织细胞散在有坏死，且可见多个肿大细胞，见图2.5F。16 图2.5组织病变情况Fig.2.5ThepathologicalchangesofthetissueA、C、E：健康组织；B、D、F：患病组织；A、B：肠；C、D：脾；E、F：肾；箭头示肿大细胞；H·E染色400XA.C.E：Thehealthtissueof；B.D.F：thediseasedtissueof；A.B：intestines；C.D：spleen；E.F：kidney；Blackarrowsindicatemastcells；H·Estaining400X2.2.4琼脂糖凝胶电泳结果分别以发病鱼和健康鱼组织DNA作为模板，采用特异性引物P1和P2通过PCR方法进行检测，发病鱼可以扩增出570bp左右的特异性条带，与预期大小17 符合，而健康鱼无任何扩增条带，见图2.6。图2.6各组织的PCR检测结果Fig.2.6PCRproductionofthetissuesinM.DL2000DNAMarker；0.为阴性对照；1-4分别为阳性病料PCR产物M.DL2000DNAMarker；0：negativecontrol；1-4：PCRproductionoftheonsetofpositive2.2.5MCP序列分析经测序获得24条细胞肿大虹彩病毒MCP序列中，广州市获得的序列同源性在99.5%-100%之间，佛山市病毒序列同源性在99.6%-100%之间，珠海市的序列同源性在99.6%-100%之间。中山市序列同源性在99.5%-99.9%之间，江门市序列同源性在99.8%-100%之间，东莞市序列同源性在99.4%-99.9%之间，见图2.7。珠三角六个市区获得的24条细胞肿大虹彩病毒MCP基因序列与NCBI提交的云斑尖塘鳢虹彩病毒（MSGIV）的MCP基因序列（NCBI登录号为：HM067835）遗传进化分析结果见图2.8，广东省五个地区多数分离株与参考株遗传距离较近，各地区大多数分离株没有明显的地域性差异，都在同一进化支上，表现出较近的遗传距离。18 （注：GZ：广州市；FS：佛山市；ZH：珠海市；ZS：中山市；JM：江门市；DG：东莞市）图2.7各地区细胞肿大虹彩病毒同源性比对结果Fig.2.7ThehomologyanalysisofMegalocytivirusfromallregions19 （注：GZ：广州市；FS：佛山市；ZH：珠海市；ZS：中山市；JM：江门市；DG：东莞市）图2.8各地区细胞肿大虹彩病毒的系统发育树Fig.2.8ThephylogenetictreeofMegalocytivirusfromallregions2.3讨论随着细胞肿大虹彩病毒对养殖鱼类危害的不断增加，对其的研究报道也陆续增多，虽然目前对该病毒的研究已取得大量的成果，但该病的爆发仍呈上升趋势，给渔业养殖造成重大经济损失。究其原因主要是欠缺该病流行病学方面的广泛调查研究。在本研究中我们通过流行病学调查，结合症状观察、组织病理学观察及PCR检测技术对珠三角地区养殖的杂交尖塘鳢进行大量的调查研究工作，根据调查对该病毒引起病鱼的症状及组织病理变化上取得一些成果为该病的初步诊断和确诊提供可靠依据。通过对病鱼症状观察的大量结果显示被细胞肿大病毒虹彩病毒感染的病鱼临床症状一般包括：体色发黑、尾鳍基部出血、解剖见脾脏肿大的特点，部分病鱼可见鳃丝具有黑色素细胞。通常黑色素细胞大量出现时是鱼体受到应激或机体非健康状态的表现。杂交尖塘鳢发生虹彩病毒病以后，观察有黑身的症状，就是体表的黑色素细胞增加、扩散，鳃丝上的黑色素细胞增加也是其主要症状之一。由于鳃丝上黑色素细胞与感染鳃霉的病鱼的鳃丝在显微镜下观察出现的部位及特点类似，常把细胞肿大虹彩病毒病误诊为鳃霉病。所以在生产养殖过程中建议检测人员应对这一情况进行认真准确的诊断。组织病理变化结果显示，感染细胞肿大虹彩病毒的病鱼最突出的特点是在肝脏、脾脏、肾脏可形成嗜碱性肿大细胞，目前这一病变被认为是感染细胞肿大虹彩病毒的特征性病变，其他鱼类感染该病毒也会产生相同的组织病理变化，如云斑尖塘鳢、鳜鱼、尖吻鲈、大菱鲆、大口黑鲈等[16,22,24,28-29]海、淡水鱼类。有时在实验室检测过程中通过PCR技术可扩增出阳性条带，而在病鱼组织中并不能发现嗜碱性肿大细胞，通过大量实验证明产生这一现象的原因是病鱼体内病毒含量较低，不足以对器官组织造成严重损伤，以此说明当组织产生嗜碱性肿大细胞时是病毒感染鱼体的中后期。因此根据组织病理变化可跟进鱼群病程发展情况。根据珠三角各地区阳性样品进行主衣壳蛋白基因序列的扩增及测序，通过分析各地区获得的病毒株的同源性结果可知，同一地区病毒株的主衣壳蛋白核苷酸序列没有明显的碱基差异，不同地区之间病毒株存在地域差异，但是从总体来看整个珠三角地区病毒株的同源性维持在99.0%-100%之间，这说明感染珠三角地区杂交尖塘鳢的细胞肿大虹彩病毒亲缘关系较近突变现象较少。然后把各地区的病毒株与已公布的云斑尖塘鳢虹彩病毒（MSGIV）主衣壳蛋白序列进行遗传进20 化分析构建系统发育树，同源性都较高可达99.3%-99.9%，由此说明珠三角地区杂交尖塘鳢感染的细胞肿大虹彩病毒与云斑尖塘鳢虹彩病毒具有较近的亲缘关系或为同一种。2.4小结（1）经调查发现感染细胞肿大病毒虹彩病毒的病鱼临床症状一般表现为体色发黑、尾鳍基部出血、解剖见脾脏肿大的特点，部分病鱼可见鳃丝具有黑色素细胞。（2）同一地区病毒株的主衣壳蛋白核苷酸序列没有明显的碱基差异，不同地区之间病毒株存在地域差异。（3）珠三角地区杂交尖塘鳢感染的细胞肿大虹彩病毒与云斑尖塘鳢虹彩病毒具有较近的亲缘关系或为同一种。21 第三章珠三角地区杂交尖塘鳢感染细胞肿大虹彩病毒病的分布情况近年来随着杂交尖塘鳢养殖规模的不断扩大，病害问题也随之加重。从目前对其疾病的初步调查来看，细胞肿大虹彩病毒病是对其危害最重要的疾病，养殖池塘发病率70%以上，发病池塘杂交尖塘鳢死亡率40%以上，处理不当死亡率甚至100%。所以对珠三角地区杂交尖塘鳢的虹彩病毒感染情况进行系统、全面的调查，已刻不容缓，且具有十分重要的意义。为了揭示珠三角地区细胞肿大虹彩病毒的流行对杂交尖塘鳢年龄、时间季节、地区分布、池塘环境和混合感染的关系以及了解全年感染情况和池塘发病情况，对2017年2月到12月珠三角地区的近700个池塘进行调查，分析其阳性率，初步掌握该地区细胞肿大虹彩病毒混合感染的病原种类和流行情况，为制定适合本地区的杂交尖塘鳢虹彩病毒病防控方案、提高杂交尖塘鳢科学化养殖水平打下坚实的基础。3.1材料与方法3.1.1材料病料的采集：病料主要来源为珠三角地区（广州市、佛山市、珠海市、中山市、江门市、东莞市）等地的主养区池塘养殖的杂交尖塘鳢，一方面通过利洋水产科技有限公司门下相关各地区的药店部门送至研究所病害室进行疾病检测，另一方面通过出差去发病杂交鳢鱼塘调查并采集样品，带回实验室进行检测，统计病料感染细胞肿大虹彩病毒的情况。实验试剂与仪器参照第二章1.1。3.1.2方法3.1.2.1流行病学调查调查发病鱼的鱼龄、苗种来源、池塘发病率、池鱼死亡率和传染性；发病水温等水质理化、生物指标和发病前后天气变化、水质变化情况；发病前后的给药、投喂等与发病有关的池塘管理情况。3.1.2.2实验室诊断参见第二章1.2.1，1.2.2，1.2.3。3.1.2.3混合感染调查3.1.2.3.1寄生虫检查22 主要检查病鱼的鳃丝、血液和内脏器官，参照文献[18]中的方法，取少许鳃丝置于载玻片上制作水浸片，于光学显微镜下观察有无寄生虫。推片法制作血涂片，于光学显微镜下观察有无寄生虫。肝脏、脾脏、肾脏和肠道采用压片法，于光学显微镜下观察有无寄生虫。3.1.2.3.2细菌分离鉴定用70%酒精棉球擦拭鱼体，无菌条件下，以平板划线法从患病鱼的肝、脾、肾、脑等处分离细菌，分别接种于营养琼脂培养基，倒置于28℃恒温培养箱中培养24h，观察细菌的生长情况。对分离的细菌进行革兰氏染色，最终通过16SrDNA测序鉴定确诊，引物见表3-1。表3-116SrDNA鉴定反应所用引物Tab.3-1Primersusedin16SrDNA目的基因引物序列（5，-3，）目的片段大小/bp细菌16SrDNAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1500通用引物TACGGCTACCTTGTTACGACTT3.2结果3.2.1流行情况细胞肿大属虹彩病毒病主要发生于水温在20-30℃，在该养殖地区内一年四季都可发生，因为珠三角地区冬季养殖搭设简易冬棚，一般棚内水温最低也在20℃以上，在该病毒的适宜发病水温之内。一般在冬季、春节前后的温棚养殖期间和夏季七八月份的苗种阶段发病严重。另外水温在30℃以上时当天气连续闷热阴雨天或水质各指标不在标准水平时该病易发。从体长5厘米的鱼苗到500克左右的成鱼都可发病。正常情况下死亡率较低，约5%-30%，当有药物刺激或投喂量大、水质剧烈变化等其它应激因素时日死亡量迅速增加，有些发病池塘最后累计死亡率可达90%。多数池塘是在适宜水温范围内受到强烈应激后池鱼发病或注入未经处理的河道水后发病。3.2.1.1珠三角地区杂交尖塘鳢感染细胞肿大虹彩病毒总体情况表2统计2017年2月-2017年12月总体的阳性检出情况，本次调查共在6个市池塘养殖地区收集到1515份样品，采用PCR检测方法和组织病理学检测技术对病样进行检测。阳性样品共有454份，总体检出率为29.97%。从图3.1折线图中可以直观的看出其中9月份检出率最高为48.53%，其次是6月份为43%，见表3-2。23 表3-22-12月份杂交尖塘鳢细胞肿大虹彩病毒检测情况Tab.3-2DetectionofMegalocytivirusinHybridOxyeleotrismarmoratusinFebruaryandDecember月份检测样品数（尾）阳性样品数（尾）阳性率（%）2月6258.063月41614.634月1562616.705月1344835.826月1426142.967月2255122.678月1874624.609月2049948.5310月1525938.8211月1123026.7912月1002323合计151545429.9760%50%40%30%20%10%0%2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月图3.12-12月阳性检出率Fig.3.1PositivedetectionratefromFebruarytoDecember3.2.1.2池塘发病率根据调查统计在2017年2月到12月期间珠三角地区养殖杂交尖塘鳢的鱼塘约有700个，据统计在该地区在5、6、9、10月份由细胞肿大虹彩病毒引起鱼塘的发病率普遍较高，见图3.2。24 50%45%40%35%30%25%池塘发病率20%15%10%5%0%2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月图3.22-12月池塘发病率Fig.3.2IncidenceofpondinFebruaryandDecember3.2.1.3不同地区的杂交尖塘鳢阳性检出率情况表3-3统计了各市区每个月份的阳性检出率及各地区2-12月份的总的阳性检出率，从表中可以看出广州市在2-12月份检出率最高为，东莞市检出率最低为17%。图3.3直观的反映了2017年2月到12月份之间，除珠海市2月份，东莞市2月和11月未检出阳性病例外其他地区在各月份均有检出。并且得知在5、6、9、10月份大部分市地区检出率较高，广州市在6月份检出率最高为60%。表3-3各地区在2-12月的阳性检出率Tab.3-3PositiveratesbyregioninFebruarytoDecember地区广州市佛山市中山市江门市珠海市东莞市总计月份2月17.00%10.00%7.14%8.33%008.00%3月12.50%16.67%10.00%020.00%50.00%14.63%4月13.50%21.40%11.10%20.00%25.00%0.00%17.00%5月38.46%41.00%40.91%40.91%14.00%18.00%35.82%6月60.00%46.34%34.61%31.58%33.33%36.36%43.00%7月25.87%30.65%7.69%17.14%23.00%33.00%22.67%8月35.48%34.04%17.14%25.93%14.29%10.53%24.60%9月48.57%54,55%48.94%46.43%40.00%25%48.53%10月38.89%38.71%45.45%36.00%29.41%40.00%38.82%11月47.83%40.00%10.53%15.38%10.00%026.79%12月33.33%43.75%26.09%14.29%10.00%8.33%23.00%总计35.20%37.06%28.14%25.86%21%17%29.97%25 70%60%50%广州市阳性检出率40%佛山市阳性检出率中山市阳性检出率30%江门市阳性检出率20%珠海市阳性检出率10%东莞市阳性检出率0%图3.3各地区的阳性检出率Fig.3.3Positivedetectionratebyregion3.2.1.4不同规格杂交尖塘鳢细胞肿大虹彩病毒检测情况根据杂交尖塘鳢在养殖过程中摄食食性的不同，将病样分为体长小于等于5cm，5-12cm，大于12cm三个阶段。通过对这三个阶段的阳性病样检出统计，结果发现细胞肿大虹彩病毒可感染各生长阶段的鱼，在2-12月份体长小于等于5cm的病样阳性检出率最高，见表3-4。表3-4杂交尖塘鳢不同生长阶段的病毒检测情况Tab.3-4DetectionofvirusesindifferentgrowthstagesofHybridOxyeleotrismarmoratus规格（cm）检测样品数（尾）阳性样品数（尾）阳性率（%）5≤51920840.075-1260315425.54＞123938220.87总计151545429.973.2.1.5不同规格的杂交尖塘鳢分别在2-12月份阳性检出率不同规格的杂交尖塘鳢在2-12月份的阳性检出情况，其中5月份是体长小于等于5cm以下的杂交尖塘鳢的发病高峰，6月份是体长5cm以上杂交尖塘鳢的发病高峰，见图3.4。（由于杂交尖塘鳢亲鱼生殖季节一般在3到10月份，人工繁殖水温要达到27-28度，所以在2-3月份和12月份这段气温较低的时间内几乎没有体长小于等于5cm以下的鱼苗故不做统计）。26 0.70.60.50.45cm≤5-12cm0.3>12cm0.20.102月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月图3.4不同规格的杂交尖塘鳢分别在2-12月份阳性检出率Fig.3.4ThepositiverateofHybridOxyeleotrismarmoratusinFebruaryandDecemberwasdifferent3.2.2混合感染调查3.2.2.1寄生虫检查经过大量的调查工作发现有孢子虫与细胞肿大虹彩病毒共同感染杂交尖塘鳢的病例。佛山市荷塘地区的病样镜检鳃部可见孢子虫包囊，见图3.5。通过病理切片观察鳃组织多红染质团及嗜酸性粒细胞，可见孢子虫包囊、个别样品包囊较多，见图3.6。并且在同一样品中脾组织可见零星肿大细胞（感染虹彩病毒的特征性病变），见图3.7。图3.5镜下孢子虫Fig.3.5Microscopicsporidium27 图3.6病变鳃丝；H·E染色400XFig.3.6Thepathologicalchangesofgill；Blackarrowsindicatemastcells；H·Estaining400X图3.7病变脾脏；箭头示肿大细胞；H·E染色400XFig.3.7Thepathologicalchangesofthetissueofspleen；Blackarrowsindicatemastcells；H·Estaining400X3.2.2.2细菌培养结果目前经过对病样的诊断发现嗜水气单胞菌、海豚链球菌可分别与细胞肿大虹彩病毒同时感染杂交尖塘鳢。在对佛山市勒流地区的病样采集中，将鱼的肝、脾、肾脏分别接种于普通培养基，恒温培养24h后，接种肝脏、脑处组织的培养皿上均长出圆形、边缘整齐、隆起、表面平滑，灰白色不透明的菌落，经革兰氏染色呈单个或者成双的阴性短杆菌，见图3.8。经16SrDNA测序鉴定为气单胞菌(Aeromonashydrophila)，见图3.9。同时通过对病鱼组织PCR检测细胞肿大虹彩28 病毒得到570bp大小的阳性条带。对佛山市杏坛地区从病鱼的肝脏和脾脏中分离出大量细菌，革兰氏染色镜检可见许多呈链状排列的革兰氏阳性菌，见图3.10，经过16SrDNA测序鉴定为海豚链球菌（Streptococcusiniae）见，图3.11。并且对病鱼组织PCR检测细胞肿大虹彩病毒结果呈阳性。图3.8嗜水气单胞菌Fig.3.8Aeromonashydrophila图3.9气单胞菌16SrDNA测序鉴定结果Fig.3.9SequencingofAeromonasaeromonas16srDNA29 图3.10海豚链球菌Fig.3.10Streptococcusiniae图3.11海豚链球菌16SrDNA测序鉴定结果Fig.3.11SequencingofStreptococcusiniae16srDNA3.3.4病毒混合感染经过调查发现神经坏死病毒与细胞肿大虹彩病毒可共同感染杂交尖塘鳢。在广州市、佛山市、中山市的养殖鱼群中发现病鱼有体色发黑、上浮、水面下停止不动，有的鱼苗腹部朝上，或在水中螺旋状游动，偶尔见个别鱼苗在水面打转。从症状看与陈晓艳等[67]报道的感染鱼类神经坏死病毒（Viralnervousnecrosis，VNN）的症状相似，初步怀疑感染了神经坏死病毒，引用刘晓单等[68]根据神经坏死病毒主衣壳蛋白基因序列设计的引物，通过PCR检测技术在病鱼的脑、眼组织，结果在多数病鱼组织扩增出427bp左右的阳性条带，并且对细胞肿大虹彩病毒进行PCR检测，同时扩增出阳性条带。在组织切片中发现病鱼眼多数正常，但组织不规整，个别可见零星空泡；脑组织局部多空泡、组织稀疏，见图3.12。30 图3.12病变脑和眼；H·E染色400XFig.3.12Thepathologicalchangesofbrainandeye；Blackarrowsindicatemastcells；H·Estaining400X3.3讨论3.3.1流行概况本章调查了2017年2月到12月份杂交尖塘鳢细胞肿大虹彩病毒在珠三角地区内几个主要杂交尖塘鳢养殖地区的流行情况，其中在本研究中共检测1515份样品，检出阳性样品454份，结果表明该病毒在2-12月平均检出率为29.97%，且由统计数据得知该病毒发病具有明显的时间季节性，该病毒在9月份检出率最高为49%，2月检出率最低为8.06%。并且得知该病毒感染普遍存在，但不同地区感染率存在差异性，珠三角六个市区内佛山市在2-12月份检出率最高为37.06%，其次是广州市为35.20%，东莞市最低为17%。经统计早期摄食轮虫、枝角类体长5cm以下的稚鱼的发病率较高于摄食冰鲜、人工配合饲料的幼鱼和成鱼。经过调查发现池塘发病率可达40%以上，发病池塘杂交尖塘鳢死亡率5%-40%，处理不当死亡率甚至达到90%。综合调查数据可知在2017年2月到12月这段时间由该病毒引起的杂交尖塘鳢发病的时间集中在5、6、9和10月份。3.3.2病因分析引发该病毒病的原因可能是多方面的，与鱼种生活的水温、池塘环境、鱼体体质及人为管理方面都有着密切的关系。本研究调查发现该病广泛流行在5月、6月和8月、9月，且与温度有着紧密联系，当水温为25-28℃时该病发病达到高峰，低于20℃或高于32℃时该病较少发生，这与JungSJ等[19]、ChoiSK等[20]和曾慷等[21]研究报道的温度影响该属病毒发病的情况基本一致；并且调查显示多数池塘是在适宜水温范围内鱼群受到强烈应激后池鱼开始发病；经过大量调查发现，在低温的冬季，一些杂交尖塘鳢养殖地区依靠搭冬棚保暖过冬，由于棚内温度超过25℃以上，从而易引发该病毒发病；在8、9月份，温度高于32℃时由于31 持续的台风影响使得该病爆发，以此表明该病的发生不仅与温度关系紧密而且与天气影响关系同等密切。经过调查发现当鱼开始发病后有药物刺激或投喂量大、水质剧烈变化时死亡量迅速增加，很多养殖池塘在此期间不能很好地做好鱼群的管理工作，鱼群因不当管理产生应激，导致鱼群免疫力下降，患病率和死亡率也相应增高。由此可以看出引起该病发生或加剧死亡的因素与人为管理操作方面有着紧密联系。另一方面调查显示鱼种阶段要比成鱼阶段发病几率要高，这可能与鱼自身机体免疫力强弱关系密切，同时这也揭示了该病毒与易感鱼群年龄间的分布关系。对于细胞肿大属虹彩病毒疾病在临床上尚无有效的治疗措施，目前主要以防控为主。在本研究中经过调查，有些池塘养殖环境独立，单养杂交尖塘鳢，无其他传染源，通过综合分析推测，病毒可能来自鱼苗自身携带，也可能养殖过程中因为注入未经彻底消毒的水感染，或是当水温达到病原适宜发病的温度如再加其他刺激性因素导致杂交尖塘鳢机体抵抗力下降时就易诱发该病，所以在加强购买苗种的检疫和处理水源的同时，控制药物刺激、过量投喂、水质剧变等应激因素是控制该病的另一个关键点。此外当发现养殖鱼群开始发病时建议从事渔业管理人员应首先从发病鱼的病症上对该疾病做出相应的诊断，及时做好初步的补救措施，如停止喂料，停止换水等应激操作，以期为减少发病后续的死亡量做奠定。3.3.3混合感染细胞肿大虹彩病毒感染通常是一种慢性的感染过程，可以引起细胞的凋亡，使机体免疫受到抑制，为其他病原的入侵提供了便利。通过调查发现发病杂交尖塘鳢往往不是单一的感染细胞肿大虹彩病毒，鱼群在感染病毒后机体免疫力下降，常会继发感染其他病原，如嗜水气单胞菌、海豚链球菌或寄生孢子虫、神经坏死病毒等。细胞肿大虹彩病毒与其他一种或几种病原体的混合感染，使得病情更加严重和复杂，这也是造成鱼群死亡的主要原因之一。并且根据调查发现混合感染对鱼群的危害程度远高于单纯感染造成的危害，所以杂交尖塘鳢养殖池塘预防和控制混合感染尤为重要。本试验为了解珠三角地区养殖的杂交尖塘鳢感染细胞肿大虹彩病毒及其混合感染的病原，分析混合感染的新趋势，为今后诊断，预防该病毒病与其他病原混合感染及继发细菌感染情况提供一定参考依据。3.4小结（1）该病毒在2-12月平均检出率为29.97%。且该病毒在9月份检出率最高为49%，2月检出率最低为8.06%。（2）该病毒在珠三角六个市区内佛山市在2-12月份检出率最高为37.06%，32 其次是广州市为35.20%，东莞市最低为17%。（3）体长小于等于5cm的杂交尖塘鳢鱼苗阳性检出率为40.07%，体长在5-12cm和大于12cm的鱼体阳性检出率分别是25.54%、20.87%。（4）通过调查发现发病杂交尖塘鳢往往不是单一的感染细胞肿大虹彩病毒，常会继发感染其他病原，如嗜水气单胞菌、海豚链球菌或寄生孢子虫、神经坏死病毒等。33 第四章综合防治措施从生态环境调查得知，杂交尖塘鳢细胞肿大虹彩病毒病的发生和流行与鱼体、病原、环境三者关系甚为密切。病害较重的池塘，再加长期不清塘或清塘不彻底，饲养管理不善，投喂饵料饱饥不定，池塘水质过浓或恶化，溶氧量不足和有机物耗氧量过多，这样的条件更容易引起该病的发生。另外，混合感染也是引起鱼体大量死亡的原因。所以在杂交尖塘鳢的养殖过程中既要增强鱼体抗病力，还要结合良好的饲养管理，保持水质清新和控制不利于鱼的发病条件，是防控工作的期望和目标。本章根据调查的结果，针对疾病的传染性提供切断传播途径的措施，对于自然因素对发病的影响总结合理的人为补救措施，最后对人为管理操作方面提出正确的实施方式。为有效预防该病提供参考，以提高养殖业经济的发展。4.1自然因素天气：该病的发生与温度、气象有密切联系，目前调查的病例在珠三角地区，发病时间在5月、6月和8月、9月，且与温度有着紧密联系，当水温为25-28℃时该病发病达到高峰，低于20℃或高于32℃时该病较少发生。另外，在今年珠三角地区遭遇持续的台风袭击，导致天气急剧降雨或连续大雨从而使得该病的池鱼发病率显著增高，是该病流行的重要诱发因素。水变：调查中发现池塘水质清瘦明显比肥水池塘发病率高，鱼池环境清新，发病率就少，如中山市民众养殖池塘水源洁净、杂交尖塘鳢养殖过程中整体死亡甚少。反之，广州市石楼某养殖鱼塘由于鱼池环境极度污染、水质发黑或常出现油膜，发病率普遍较高。4.2人为管理在人为管理方面不合理的鱼苗放养密度、换水、给药和喂料等管理方面也成为导致该病发生和流行的诱发因素。经调查发现高密度养殖比低密度养殖的鱼群发病会高，在广州市石楼某养殖池塘总面积8亩，共计约10万条鱼，池塘被布料分隔两半，其中一半鱼塘面积三亩半有6万条鱼，在今年细胞肿大虹彩病毒发病期该半池塘发病明显高于另一半。由此可见养殖密度对鱼群的发病情况有着重要影响。江门市荷塘某杂交尖塘鳢养殖鱼塘由于养殖户养殖经验少，给鱼群进行大量换水导致鱼群出现大量死亡。在鱼群有发病现象时未能准确诊断病因错用杀孢子虫的药后致使死亡量加大，造成了巨大损失。饲养管理不善的佛山市勒流地区某鱼塘，今年比往年多投了一倍的冰鲜，杂交尖塘鳢成活率不到50%。而仅一水相隔、条件基本相仿的鱼塘，每天喂以定量34 的冰鲜及配合饲料，从没发现死鱼。由此看来，掌握适量的投饵亦是防病的重要关键。4.3混合感染影响鱼种体质差，出现肠炎、出血、寄生虫或形成并发症时，由于抗病能力的减弱，都给细胞肿大虹彩病毒病的发生创造了发病条件。在大多数情况下，细胞肿大虹彩病毒病的发生不是孤立的原因，是鱼体、病原体和生活环境的相互作用。本研究表明近年来已经在珠三角地区杂交尖塘鳢养殖池塘中广泛流行，而且经过检测鱼群中阳性率有上升的趋势，病毒的混合感染与继发的细菌感染情况也较为严重，这也是导致鱼群死亡率大大增加的重要原因。在本课题调查中发现与细胞肿大虹彩病毒混合感染致鱼发病死亡的病原有气单胞菌、海豚链球菌及神经坏死病毒，说明目前养殖过程中细胞肿大虹彩病毒病并不是单一发病，这些混合感染导致鱼群死亡率增高，给养殖业带来极大的损失。4.4综合防治措施4.4.1防传染病毒病一般都具有传染性，控制或消灭传染源和切断传播途径是防止疾病传播的根本。由于养殖鱼群发生传染病时难以确定发病个体，所以很难对传染源进行单独隔离，所以切断传播途径是控制疫病传播的重要措施。据目前报道可知病毒粒子在鱼的养殖水体中可通过水平和垂直两种途径进行传播[20]。目前对于杂交尖塘鳢养殖水体中的水生生物是否携带细胞肿大虹彩病毒尚存在疑问，但做好养殖期间特别是前期用水消毒处理非常必要，以便杀死底泥中的生物。进水后建议使用药物杀死枝角类等浮游动物。另一方面，发病鱼体中可能含有病原体，需正确地处理病鱼尸体，如选择距离养殖池塘较远的地方深埋发病死亡鱼体。最后避免与发病池塘共用网具以防池塘间互相传染等，以切断疾病的水平传染途径。调查表明不同孵化场来源的笋壳鱼苗都有发病，经过统计检测结果显示，脾脏为病毒感染的重要器官，而脾脏又是鱼的造血器官间接推测病毒粒子可能随血液循环扩散到鱼的性腺从而进行垂直传播。所以在病毒的垂直传播过程中亲鱼携带病毒是造成该病肆虐的重要原因，因此在杂交尖塘鳢培育时选择不携带病原的亲鱼是防控该病的重要途径。在节约成本的前提下可对前期的受精卵进行病毒检测等方便可行的方法清除携带病毒的亲鱼。以确保仔鱼苗不携带病毒，再引入繁殖场。另一方面在鱼苗下塘之前应对鱼苗进行常规的病毒监测以便后期养殖过程中的疾病的发生将经济损失降到最低限度。4.4.2人为管理天气变化通常会引起养殖水环境的变化，水质环境的剧烈变化是诱发该病爆35 发的重要因素。根据多次调查发现在强降雨或连续降雨后由该病的发病率非常高，所以应及时做好降雨前稳水的工作及降雨后抗应激的防护措施。另一方面保持水体稳定是发病后减少死亡的关键，同时也是发病鱼体后期恢复的重要条件。稳定水环境需选择合理的稳水、改底的药物制剂，如使用低剂量高分子多元有机酸稳水并且搭配弱氧化性底质改良剂改底。另外防止倒藻情况的发生，可根据水质情况适量补充碳肥以促进藻类生长。此外，在杂交尖塘鳢放苗前期该病发病较为严重且此时水质更不易稳定，建议在放苗前将水中生物培育时间延长，待二十天以后水体中所需生物种类丰富、数量多时再放苗。在放苗后及时做好给水体补肥和调水的工作，保持水体长时间稳定。4.4.3人为操作人为操作方面包括拉网、换水、给药、投喂等方面。在拉网方面，当发现鱼体不适时做到不拉网，待病情治愈后再拉网以免应激使病情加重，同时防止传染其他健康鱼体。对于换水时做到一次性适量换水，天气有变化时不换水，发现鱼有病时不换水。目前细胞肿大虹彩病毒病没有针对性的治疗药物，所以发病后减少死亡是成功的关键。该病发生后鱼体对药物的刺激敏感性增加，所以在治疗控制该病时需注意选择用药，应避免使用刺激性较强的药物否则会使发病鱼死亡率迅速增加。鱼体发病后体质变弱消化系统功能下降，所以需适当停止投喂以避免增加消化器官的负担，减少细菌继发性死亡。同时停止投喂可减少病鱼缺氧的机率，从而减少由水体缺氧造成的应激性死亡。但是由于杂交尖塘鳢具有自残的现象所以也不宜长期停喂，所以适当降低放养密度是成功养鱼的关键技巧。36 结论1.通过大量的调查发现被细胞肿大虹彩病毒感染的病鱼临床症状和组织病理特征主要是体色发黑、尾鳍基部出血、解剖见脾脏肿大的特点，部分病鱼可见鳃丝具有黑色素细胞；组织病理可见肝脏、脾脏、肾脏可形成嗜碱性肿大细胞。2.珠三角各地区阳性样品进行主衣壳蛋白基因序列的扩增及测序结果表明杂交尖塘鳢感染的细胞肿大虹彩病毒与云斑尖塘鳢虹彩病毒具有较近的亲缘关系。3.该病具有一定的时间分布，发病期多集中在8-10月份；该病易感染较小鱼龄的鱼体，体长小于等于5cm的杂交尖塘鳢鱼苗该病的检出率最高。4.该病常会继发感染其他病原，如嗜水气单胞菌、海豚链球菌或寄生孢子虫、神经坏死病毒。5.该病发生与连续的阴雨天气、不合理的人为管理方面有着莫大的关系。通过增强鱼体抗病力，结合良好的饲养管理，保持水质清新控制导致鱼体发病的因素。减少病毒在特定空间、时间上的爆发和在易感群体上的发病率。37 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作者简介姓名席云清性别女民族汉吉林省吉林籍贯政治面貌群众入学时间2016年市论文答辩日申请学位类别农学硕士2018/5/26授予学位年月期就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2012年9月-2016年7月吉林农业大学2016年9月-2018年7月吉林农业大学攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息刊物名称（级署名发表情况题目署名单位别）次序(刊出时间/录用)发表学术论文眼斑拟石首鱼虹彩病水生生物学报吉林农业1/7待发表毒病的诊断（重点）大学黑龙江畜牧兽细胞肿大虹彩病毒的吉林农业医1/4待发表研究现状大学（核心）43 致谢时光飞逝，岁月如梭。感谢时间让我不断成长，毫无疑问的说研究生两年是我成长中最重要的时光，她承载着我的青春、我的懵懂无知、我的喜怒哀乐，并且使我不断认识到真正的自己，在喧嚣中沉淀了我的浮躁，在颓废中唤醒了我的心声。同时也感谢自己能坚持到了现在，并且从未放弃自己。在这两年的研究生学习生活中我要特别感谢唐绍林老师和王桂芹老师的倾囊相授，指导我论文的选题、试验的开展及论文的写作。唐老师在淡水鱼病害研究方面的深刻见解、对流行病学的全面认知传授了我坚实的科研理论基础。王老师在科研道路上给予的指导犹如醍醐灌顶，她渊博的学识和严谨的治学作风让我更加深刻的理解了作为一名科研工作者的使命。这两年在两位老师的指导下我有了长足的进步，这些进步对于将来的工作和学习将产生深远的影响。在此对两位老师表示诚挚的感激。衷心感谢利洋水产科技股份有限公司病害研究所一室戚瑞荣、张东霞、张会军，技术部张吉鹏、章明凤、肖艳翼、游永飞、王林锁、吴佳燕在实验操作方面的耐心指导及关怀。同时，感谢吉林农业大学田佳鑫师兄、陈秀梅师姐、瞿子惠师姐及段晶同学的热心帮助和互勉。最后感谢父母给予我生命，感谢家人支持我追随梦想，并且在我情绪低落时鼓励我，让我能够继续前行！在今后的学习和工作中，我定会更加勤奋，不辜负所有关心我的亲人、老师和朋友！衷心祝愿所有关心和帮助过我的人们永远健康幸福！44
