猪流行性腹泻病毒YX株的分离鉴定及其灭活疫苗免疫效力试验研究

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学校代码：10564学号：VM20120006分类号：S855.3密级：硕士学位论文猪流行性腹泻病毒YX株的分离鉴定及其灭活疫苗免疫效力试验研究陈振波第一指导教师：罗满林教授第二指导教师：盘伟岚高级兽医师学院名称：兽医学院专业学位类别：兽医硕士领域：答辩委员会主席：魏文康研究员中国·广州2016年6月 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要猪流行性腹泻（PED）是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以仔猪水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征的接触性肠道传染病。猪流行性腹泻是世界上流行最广泛的猪病之一。近年，猪流行性腹泻作为烈性传染病，开始疯狂肆虐我国广大养殖户。我国的广东、广西、江西、湖南、福建、浙江、安徽、江苏、湖北、河北和山东等省（自治区）均有猪流行性腹泻的发现。PED在我国的流行面逐渐扩大，对26个省市自治区的调查表明PED的总死亡率占36种疾病总死亡率的1.74%。该病多发于冬春季节，但就广东地区这个全年高湿度的环境，PED呈高发趋势，全年均可发生，7天龄内的新生仔猪在发生腹泻后3〜4天，通常因脱水导致衰竭而死亡，病死率高达100%。目前，在广东粤西地区，猪流行性腹泻呈高发趋势，一旦进入冬春季节，该病都是大规模爆发，病死率高。虽然可以采取疫苗接种方式来控制此病流行，但经典的CV777株疫苗免疫后效果并不理想，接种过疫苗的猪场仍然有此病的流行。本研究主要分为下面三个部分：1、PEDV-YX株的分离鉴定。本研究从广东粤西9个疑似发生腹泻疫情的规模化猪场采集180份病料样本。通过在Vero细胞培养基中添加胰酶的方法孵育、选取1%接毒量接种Vero单层细胞，进行病毒分离纯化，从中分离出9株未知病毒HS1、HS2、HS3、HS4、YC1、YC2、YC3、YC4和KP，经胶体金快速诊断技术、RT-PCR扩增、基因序列比对，确诊均为猪流行性腹泻病毒（PEDV）。通过猪体回归试验，选取临床症状最明显，毒力最强的YC1毒株作为研究对象，命名为PEDV-YX株。在胰酶总浓度为7.5ug/ml的作用下，盲传到第8代，能观察到细胞圆缩、聚集，空泡增多等明显的细胞病变。2、对PEDV-YX株生物学特性、中和试验及其TCID50测定研究。对PEDV-YX株生物学特性、中和试验及其TCID50研究表明，该分离株对5-BrdU不敏感，为具有囊膜的RNA病毒；对乙醚、氯仿敏感；在pH为3.0的环境下易失活；对热敏感，在50℃条件下作用1h，病毒易失活；设计特异性引物，进行RT-PCR扩增，电泳检测得到与预期长度一致的条带；与PEDV抗血清中和效价为120.23；PEDV-YXF10的TCID-5.6750为10/0.1ml。3、PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗制备及不同免疫剂量、不同免疫途径对抗体水平的影响研究。I PEDV-YX株F10经0.3%的甲醛溶液灭活，以病毒液样40ml+PBS40ml+20ml铝胶佐剂的培苗方案，配制猪流行性腹泻灭活疫苗。以口服免疫、后海穴注射免疫为免疫途径，2ml、1ml、0.5ml不同免疫剂量，研究该灭活疫苗的抗体消长规律。当免疫剂量相同时，后海穴注射免疫比口服免疫抗体效价更高，且抗体维持时间更长；当免疫途径相同时，免疫2ml的抗体整体水平比免疫1ml的更高，免疫0.5ml的中和抗体水平最低。通过分离广东粤西地区PEDV的流行性毒株，为了解该地区流行性毒株的特性及流行情况，建立PEDV快速准确的诊断方法及新型疫苗的研究提供理论依据，从而为制定有效的防控措施，促进该地区养猪业的稳定发展做好铺垫。关键词：猪流行性腹泻；Vero细胞；PEDV-YX株；灭活疫苗II IsolationandIdentificationofPorcineEpidemicDiarrheaVirusPEDV-YXstrainandEfficacyoftheinactivatedvaccineChenZhenbo(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:Porcineepidemicdiarrhea(PED)isasevereintestinalinfectiousdiseasewhichiscausedbyPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)withdiarrhea,vomit,anddehydration.Porcineepidemicdiarrheadiseaseisoneofthemostwidelyepidemicdiseasesaroundtheworld.Asafulminatinginfectiousdisease,PEDhasbroughttheenormouseconomiclosstoourbreedingindustryinrecentyears.PEDwasfoundinGuangdong,Guangxi,Jiangxi,Hunan,Fujian,Zhejiang,Anhui,Jiangsu,Hubei,Hebei,Shandongandotherprovincesinchina,anditgraduallyspreadedinourcountry.Theinvestigationamong26provincesshowedthatthemortalityofPEDaccountedfor1.74%oftotalmortalityof36kindsofdiseases.Thediseaseusuallyoccursinwinterandspring.ButduetotheenvironmentofhighhumiditythroughouttheyearinGuangdong,PEDmaycontinuesyear-round,whichshowsatrendofhighincidence.The7-days-newbornpigletssufferingdiarrheawouldusuallydiewithin3or4daysbecauseofdehydration,andthemortalityratewasashighas100%.Atpresent,inWestGuangdong,PEDshowedahightrend.Onceenteringwinterorspring,itwouldbealarge-scaleoutbreak,withthehighdeathrate.Althoughvaccinationcouldbetakentocontrolthediseaseepidemic,butimmuneeffectoftheclassicalvaccineofstraincv777wasnotideal,forthevaccinatedpigswithvaccinewasstillinfected.Thisresearchismainlydividedintothefollowingthreeparts:1.IsolationandidentificationofPorcineEpidemicDiarrheaVirusPEDV-YXstrain180copiesoftissuesampleswerecollectedfrom9industrializedpigfarmwithsuspecteddiarrheaoutbreakinWestGuangdong.9copiesoftissuesampleswereidentificatedasPEDVpositivebythecolloidalgoldrapiddiagnostictechnology,PCRamplificationandgenesequencingtechnology,includingfourHS,fourYCandoneKPstrains.Throughthepigregressiontest,YCstrainwiththemostobviousclinicalIII symptomsandthestrongesttoxicitywasselectedastheresearchobjectandwasnamedPEDV-YX.Undertheactionof7.5μg/mltrypsin,thestrainwasincubatedtothe8thgeneration.Thecytopathiceffect(CPE)wasobservedobviously,suchaspyknosis,aggregationandincreasedvacuolization,2.Biology,neutralizationtestanddeterminationofTCID50ofPEDV–YX.Theresultsofbiology,neutralizationtestanddeterminationofTCID50ofPEDV–YXshowedthat：theisolatedstrainswasRNAviruswithmembranevesicles;insensitiveto5-BrdU;sensitivetoetherandchloroform;easydeactivationatpH3.0andmoresensitivetoheat,whichwasinactivatedin50℃for1h;theresultofRT-PCRwasasexpectedandtheneutralizingtiteroftheantiserumwithPEDVwas120.23;theTCID50ofthePEDV-YXF10was10-5.67/0.1ml.3.PreparationofPEDV-YXstrainaluminumhydroxidegelinactivatedvaccinePEDV-YXF10wasinactivatedby0.3%formaldehydesolutionandthePEDinactivatedvaccinewasformulatedwith40mlseedlingsvirusliquidsample,40mlPBS,20mlalhydrogel.Thepigletswerevaccinatiedthroughorallyandhouhaiacupointwithdifferentdosagesof2ml,1mland0.5mlandthedynamicalchangesofantibodyinducedbythePEDinactivatedvaccinewasobserved.TheantibodytiterofHouhaiacupointinjectionimmunizationishigherthanorally,andtheantibodymaintainedlonger,whenimmunedwithsamedosage;Theoverallantibodylevelwhenimmunedwith2mlinactivatedvaccineismuchhigherthanthatofwith1ml,neutralizingantibodylevewasthelowestwhenimmunedwith0.5ml.ItishelpfulforustoknowPEDVepidemicstraincharacteristicsandepidemicsituationinWestGuangdongthroughseparatingPEDV.ThisstudyprovidestheorybasisesfortheestablishmentofafastandaccuratediagnosticmethodofPEDVanditsnovalvaccine.soastomakeeffectivepreventionandcontrolmeasuresandpromotethesteadydevelopmentofpigindustryintheregion.Keywords:porcineepidemicdiarrhea;Verocells;PEDV-YX;inactivatedvaccineIV 英文缩写对照表缩写英文全称中文全称AmpAmpicillin氨苄青霉素Strstreptomycin链霉素bpBasepair碱基对BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白RNARibonucleticacid核糖核酸DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylsulphoxide二甲基亚砜DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸gGram克hHour小时ntNucleotide核苷酸KbKilo-basepair千碱基对PBSPhosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液LLiter升LBLauriabrothLB肉汤mgMilligram毫克minMinute分钟ORFOpenreadingframe开放阅读框ODOplicaldensity光密度PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RT-PCRReversetranscription-PCR反转录-聚合酶链式反应ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验FBSFetalbovineserum胎牛血清DMEMDulbecco'smodifiedeaglemedium高糖型氨基酸葡萄糖培养基PEDPorcineepidemicdiarrhea猪流行性腹泻PEDVPorcineepidemicdiarrheavirus猪流行性腹泻病毒TGETransmissiblegastroenteritis猪传染性胃肠炎TGEVTransmissiblegastroenteritisvirus猪传染性胃肠炎病毒mRNAMessengerRNA信使核糖核酸IEMImmunoelectronmicroscopy免疫电镜法V IFAImmunofluorescenceantibody免疫荧光法IHAIndirecthemagglutinationtest间接血凝试验CPECytopathiceffect细胞病变NCBINationalCenterforBiotechnology美国国家生物技术信息中心InformationEDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸PPVPorcineparvovirus猪细小病毒JEVJapaneseencephalitisvirus日本乙型脑炎病毒PCV2Porcinecircovirus2猪圆环病毒2型PRVPseudorabiesvirus猪伪狂犬病毒PorcinereproductiveandrespiratoryPRRSV猪繁殖与呼吸综合征病毒syndromevirusCSFVClassicalswinefevervirus猪瘟病毒Agantigen抗原Abantibody抗体NegSNegativeSerum阴性血清PosSPositiveSerum阳性血清PAGEPolyacylamideGelElectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳Poly-APolyadenylicacid多（聚）腺苷酸5-Bromo-1-(2-deoxy-β-D-ribofuranosyl)5-BrdU5-溴尿嘧啶-2-脱氧核苷uracil5-BromouracildeoxyribosideVeroVerocellline非洲绿猴肾细胞系aaAminoacid氨基酸r/minRovolutionsperminute转/分钟secSecond秒TCID5050%TissueCultureInfectiveDose组织培养半数感染量mlmilliliter毫升µlMicroliter微升μgMicrogram微克VI 目录1前言.....................................................................................................................................11.1猪流行性腹泻病毒的发病机理及病原学特性..............................................................21.2猪流行性腹泻的临床症状及病理变化..........................................................................31.3猪流行性腹泻的诊断......................................................................................................51.3.1直接免疫荧光法............................................................................................................51.3.2免疫电镜技术...............................................................................................................51.3.3间接血凝试验...............................................................................................................61.3.4胶体金快速诊断法.......................................................................................................61.3.5酶联免疫吸附试验.......................................................................................................61.3.6微量中和试验...............................................................................................................61.3.7反转录PCR（RT-PCR）.............................................................................................71.3.8荧光定量RT-PCR检测法............................................................................................71.4猪流行性腹泻的发病原因分析及其防制措施..............................................................71.4.1猪流行性腹泻病出现的原因分析...............................................................................71.4.2猪流行性腹泻的防制措施...........................................................................................81.4.2.1做好防疫隔离消毒....................................................................................................81.4.2.2做好猪群保健............................................................................................................81.4.2.3搞好卫生和消毒工作................................................................................................81.4.2.4冬季加强防寒保暖....................................................................................................81.4.2.5疫苗或抗血清免疫....................................................................................................81.4.2.6发病紧急处理............................................................................................................91.5研究目的与意义............................................................................................................102材料和方法.......................................................................................................................112.1材料................................................................................................................................112.1.1样品来源.....................................................................................................................112.1.2引物设计.....................................................................................................................112.1.3主要试剂盒.................................................................................................................122.1.4试剂与配制.................................................................................................................12VII 2.1.5主要仪器.....................................................................................................................132.2方法................................................................................................................................132.2.1病料采集与处理.........................................................................................................132.2.2胶体金试剂盒检测.....................................................................................................142.2.3RT-PCRPEDVORF3基因扩增.................................................................................142.2.3.1Trizol法提取总RNA...............................................................................................142.2.3.2酚-氯仿法提取总DNA...........................................................................................142.2.3.3RT-PCR方法.............................................................................................................152.2.4基因送样测序.............................................................................................................152.2.5病毒分离.....................................................................................................................152.2.5.1Vero细胞复苏与传代培养......................................................................................152.2.5.2病毒的分离培养......................................................................................................162.2.6猪体回归试验.............................................................................................................162.2.7病毒纯化.....................................................................................................................172.2.7.1细胞板接毒..............................................................................................................172.2.7.2细胞接YX株F9病毒并收毒................................................................................172.2.8病毒生物学特性研究.................................................................................................172.2.8.1病毒核酸类型鉴定..................................................................................................172.2.8.2乙醚敏感试验..........................................................................................................182.2.8.3氯仿敏感试验..........................................................................................................182.2.8.4耐酸性试验..............................................................................................................182.2.8.5耐热性试验..............................................................................................................182.2.9病毒中和试验.............................................................................................................192.2.10病毒TCID50测定.....................................................................................................192.2.11PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗的研究..............................................................202.2.11.1PEDV-YX株氢氧化铝胶佐剂灭活疫苗的制备...................................................202.2.11.2PEDV-YX株灭活疫苗不同免疫剂量、不同免疫途径对抗体水平的影响研究203结果...................................................................................................................................223.1胶体金试剂盒检测.........................................................................................................223.2RT-PCR............................................................................................................................22VIII 3.3测序及序列比对............................................................................................................233.4猪体回归试验................................................................................................................243.4.1猪体回归试验胶体金检测.........................................................................................253.4.2猪体回归试验病理解剖.............................................................................................263.5病毒分离后纯化............................................................................................................273.6病毒生物学特性研究....................................................................................................293.6.1病毒核酸类型鉴定.....................................................................................................293.6.2乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、耐酸性试验、耐热性试验.................................293.7PEDV-YX株F10病毒中和试验...................................................................................303.8PEDV-YX株F10的TCID50测定...............................................................................313.9PEDV-YX株灭活疫苗不同免疫剂量、不同免疫途径对抗体水平的影响研究.......314讨论...................................................................................................................................354.1猪流行性腹泻病毒YX株的分离鉴定分析................................................................354.2PEDV-YX株的生物学特性研究、微量中和试验和毒力测定分析...........................364.3PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗制备及其免疫效力分析.......................................36致谢...............................................................................................................................38参考文献.........................................................................................................................39IX 1前言猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的急性、高度接触性胃肠道疾病，感染仔猪主要的临床表现为严重呕吐、腹泻、喜打堆、精神抑郁以及食欲下降等，最后因消瘦、严重脱水而死亡（PensaertMB,etal,1978）。PED呈世界范围性流行，1971年在英国和比利时首次报道（WOODEN,etal,1977），此后加拿大、匈牙利、德国、日本及韩国等多个国家都报道了该病的发生。我国从1976年开始陆续有PED的报道，20世纪80年代后该病在中国流行面逐渐扩大，并多与猪传染性胃肠炎、轮状病毒等其他肠道病原混合感染，给养猪业造成严重经济损失（邬良贤等，2000；李龙，2011）。1992年欧洲的血清学调查阳性率只有1.07％，而美国至今仍无此病报道；然而日本曾发生因PEDV暴发超过30万头仔猪死亡等，1995年，韩国PEDV抗体阳性率达到45％，在GenBank中收录的PEDV序列，涵盖了中国包括华北、华南、华东、西北和东北区域的多个省份，可见PED在亚洲呈现大范围的流行状态（陈申秒等，2014）。近几年我国的广东、广西、江西、湖南、福建、浙江、安徽、江苏、湖北、河北和山东、东北等省（自治区）的部分地区，泰国、菲律宾、韩国等亚洲国家的规模化猪场发生严重的腹泻病例（倪艳秀等，2001；PURANAVEJAS,etal,2009；CHAECC,etal,2000；SUEYOSHIM,etal,1995；CHENJF,etal,2011）。2013年5月此病毒在美国首次发现，并在之后迅速传播至美各个州和周边的加拿大与墨西哥，席卷整个美洲，目前仍无有效的控制措施（WangL,etal,2014）。自2013年5月在爱荷华州出现以来，每周夺去10万头猪崽和小猪的生命一种致命的神秘病毒--猪流行性下痢（PEDV），这种病毒不仅给全美养猪业造成灾难，环保专家更担心死猪尸体会污染地下水。美国农业部估计，全美2014年以来屠宰的生猪数量要比2013年减少4.2%，即从2013年同期的5200万头下降到5000万头。生猪产量下降已经将2014年5月火腿和猪肉等相关产品的售价抬高12%；其中火腿价格比2013年同期上升15%，猪排上升近13%。美国全国猪肉理事会科技副主席孙德波格说，“我从1981年就当兽医，从来没有见过类似先例。它是灾难性的病毒。”由于死猪数量太大，环境专家担心各州要求掩埋死猪的法律所产生的后果，尤其是地下水可能遭污染。美国保水联盟资深律师福斯特说，我们知道这种病造成很高的死亡率，我们看到掩埋死猪之后浅层地下水受影响，而很多人都是饮用浅层地下水（HUANGYW,etal,2013；网1 易新闻，2014）。猪流行性腹泻在我国的影响不亚于美国。近年猪流行性腹泻作为烈性传染病，开始疯狂肆虐我国广大养殖户。我国的广东、广西、江西、湖南、福建、浙江、安徽、江苏、湖北、河北和山东等省（自治区）均有猪流行性腹泻的发现。PED在我国的流行面逐渐扩大，对26个省市自治区的调查表明PED的总死亡率占36种疾病总死亡率的1.74%（李蕾等，2014）。PED发生有一定的季节性，多发生在冬季，夏季也有发生，各年龄的猪均可感染PED，PEDV传播迅速，仔猪死亡率尤其高。1.1猪流行性腹泻的发病机理及病原学特性猪流行性腹泻（PED）是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以仔猪水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征的接触性肠道传染病（殷震等，1996）。发病猪和带毒猪是主要的传染源，康复猪会持续带毒，并不断地排出带有PEDV的粪便，污染环境和饲料。自然条件下，PEDV是通过口与鼻途径进入猪的体内。首先侵犯小肠集合淋巴结区，接着进入小肠黏膜上皮细胞，并在细胞内复制，病毒由感染处向周围广泛扩展，直到侵及全部小肠，使得小肠上皮细胞变性坏死，造成小肠功能障碍，其吸收电解质和水分的能力受到损伤，使细胞运输电解质和营养物质的功能紊乱，造成水和电解质的流失，造成猪只腹泻、消瘦、脱水，最终致使机体严重衰竭而死亡（李蕾等，2014；孙东波等，2006）。该病多发于冬春季节，但就广东地区由于全年高湿度的环境，PED呈高发趋势，全年均可发生，特别是7天龄内的哺乳仔猪，病死率高达100%以上。PEDV为冠状病毒科，冠状病毒属的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒，其平均直径约为130nm。由粪便中分离出来的病毒呈球形等多种形态，纤突长约为18～23nm，呈花瓣状规则地排列，核心中具有许多不透明的颗粒，囊膜由一半透明环隔开。PEDV对外界抵抗力弱，一般的消毒液对其有效，PEDV是囊膜病毒，所以对乙醚和氯仿等（HofmannandWyler，1988）脂溶性溶剂很敏感。该病毒的抵抗力也不强，在蔗糖中的密度不超过1.18g/cm3，而1mol/LMgCl2就能显著降低PEDV的热稳定性（HofmannandWyler，1989；PensaertandDeBouck，1978)）。当温度高于60℃并持续30分钟后，PEDV就会失去其感染细胞的能力，但是在50℃时其活性较为稳定；在4℃pH为5.0-9.0的条件下或在37℃pH为6.5-7.5时PEDV能稳定存在（SongD,etal,2012）。PEDV基因组是单股正链具有感染性的RNA，与其他冠状病毒相似，其基因组5’2 端有一个帽子结构（cap），3’端有1个Poly（A）尾，基因组全长为28033bp。基因组5’端非翻译区（5’UTR）位于基因上游，长296bp，5’UTR内含有长为65bp~98bp的前导序列（L）和1个以AUG为起始密码子并拥有Kozak序列（GUUCAUGC）和编码12个氨基酸的开放阅读框（ORF）。基因组3’端非翻译区（3’UTR）长度为334nt，末端连有Poly（A）序列。3’UTR内含有由8个碱基（GGAAGAGC）组成的保守序列，起始于Poly（A）上游的73nt处。所有冠状病毒成员都包含这个序列，只是在基因组中位置不同。剩余基因组序列包括6个ORF，从5’-3’端依次为编码复制酶多聚蛋白lab（pplab）、纤突蛋白（S）、ORF3蛋白、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）的基因(孙东波等，2006；李蕾等，2014)。如图1.1所示：PolSORF3SMMN图1.1：PEDV的基因结构ORF3基因是PEDV的唯一的附属基因，Park（2007）等对PEDV强、弱毒的ORF3序列进行了分析，发现致弱的PEDV在ORF3有17个氨基酸的缺失，推测这是和病原性密切相关的重要位点（Seaong-JunPark,etal,2007；HaijiemaBJ,etal,2004），已有的研究显示，ORF3与病毒毒力有关（Duarte，1994；吴美洲等，2016）。现在商品化的来源于CV777毒株灭活疫苗的ORF3基因都有51bp的核苷酸缺失，通过对ORF3基因的测序能更好地了解检测到的毒株是临床野毒株还是疫苗毒株（WangK,etal,2013）。因此，开展以ORF3基因为基础的PEDV序列分析具有重要意义。1.2猪流行性腹泻的临床症状及病理变化猪流行性腹泻，各种年龄段的猪都能感染发病。哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪感染发病率100%。该病传染性强，新发一窝猪未及时隔离治疗，常在几天内整条生产线都受到感染，几周内传遍整个猪场。病猪开始体温稍升高或仍表现为正常，出现食欲减退或绝食、呕吐，呕吐物有凝乳块，身体逐渐发热，毛发潮湿，喜结堆，全身发抖（如图1.1、图1.2），随后出现剧烈腹泻，粪便恶臭，如水样，严重者排便喷射状，呈黄绿色、灰黄色，并混有气泡，臀部双峡凹陷，脱水，腹泻最严重时，排出的几乎全是水。患病母猪腹泻可能较轻微，泻出水泥样稀粪，也可能呈水样下痢。粪便是很强的传染源，若母猪都开始发病，说明该病开始大规模扩散，整条生产线猪群都已经3 带毒。7天龄内的新生仔猪在发生腹泻后3-4天，通常因脱水导致衰竭而死亡，病死率高达100%。出生后立即感染本病时，病死率更高，可能是母猪体内带毒，乳汁带毒，或者本场已经有传染源；而育肥猪和成年猪常表现为萎顿、厌食和持续约1-3周左右的腹泻，若不出现脱水，会逐渐康复，部分康复猪会出现发育受阻而成为僵猪。图1.1猪流行性腹泻的临床表现图1.2猪流行性腹泻的临床表现感染猪流行性腹泻的病猪毛松，严重消瘦脱水，剖检可见，病理变化主要在小肠。小肠膨胀积气，充满淡黄色液体，肠黏膜有明显的卡他性炎症，肠壁变薄，通透，有明显出血点，肠系膜淋巴结水肿，组织学变化见空肠段上皮细胞的空泡形成和表皮脱落，小肠绒变短，严重的萎缩或消失。严重者，肠道膨胀，仅有空气无内容物。如图4 1.3所示。图1.3猪流行性腹泻的解剖检查1.3猪流行性腹泻的诊断猪腹泻病目前是我国养猪业发病率最高的疾病，有营养性、细菌性、病毒性以及寄生虫性等。由病毒所引起的腹泻，一般有猪流行性腹泻（PED），猪传染性胃肠炎（TGE）以及轮状病毒腹泻，它们的临床症状和病理特征很相近，在基层猪场单凭临床症状对它们作出的诊断，容易导致误诊。鉴别诊断病毒性腹泻病需要借助实验室手段，主要包括病原学诊断、血清学以及分子生物学方法诊断。1.3.1直接免疫荧光法免疫荧光法（immunofluorescenceantibodymethod，IFA），直接用荧光素标记的抗体检测抗原的一种免疫标记技术。取腹泻开始后48h以内剖杀猪的小肠，制成小肠黏膜抹片或冰冻切片，用丙酮固定，用荧光标记猪病毒性腹泻抗体处理，镜检。感染后18h在小肠各段可发现荧光阳性细胞。1990年，崔现兰（1990）等人应用直接免疫荧光法（IFA）来检查病猪小肠冷冻切片。1.3.2免疫电镜技术免疫电镜技术（immunoelectronmicroscopymethod，IEM）是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。1991年，王继科（1991）等人以免疫电镜技术（IEM）为基础建立了的诊断方法。5 1.3.3间接血凝试验间接血凝试验（IHA）是将抗原(或抗体)包被于红细胞表面，成为致敏的载体，然后与相应的抗体(或抗原)结合，从而使红细胞拉聚在一起，出现可见的凝集反应。致敏用的抗原或抗体要求纯度高，并保持良好的免疫活性。朱维正（1990）等人成功建立了间接血凝试验来诊断PEDV的方法。1.3.4胶体金快速诊断法胶体金快速诊断法(Immunecolloidalgoldtechnique，GIGA)又称胶体金免疫层析法，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。张利勃（2010）等人首次运用胶体金建立了一种高效、经济、简便的猪流行性腹泻疾病的检测方法。目前，市面上运用胶体金免疫层析技术制成的检测PEDV抗原快速诊断试剂盒以韩国BIONOTE为代表，这种检测方法适用于基层防疫检疫人员使用。1.3.5酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)技术，具有良好的敏感性、特异性和重复性，操作简单、检测快速、价格低、敏感性高、特异性强等优点，是当前PEDV血清学检测广泛采用的诊断技术。陈苑（1997）等人建立了斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）来检测猪群PED的血清抗体，J.S.Oh（2005）等以纯化的PEDV全病毒作为包被抗原，建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法，EnricaS（2010）等利用单克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA方法，运用其检测病猪粪便中的PEDV病原。ELISA方法为PEDV的快速诊断、免疫猪群抗体水平监测和流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。1.3.6微量中和试验中和试验(NeutralizationTest)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定血清与病毒的特异性以及评价免疫血清中和病毒的能力。林志雄（1994）等利用已适应于传代细胞生长的猪流行性腹泻病毒PEDV-G1株，测定待检血清中的特异性抗体，建立微量中和试验的方法，证实该方法可以用来检测猪流行性腹泻病毒，而且检测结果准确、可靠，具有较高的敏感性。林树根（1995）等用微量中和试验的方法，进行PED的流行病学调查。但该方法的限制因素比较多，很难在短期内应用于临床实践。6 1.3.7反转录PCR（RT-PCR）反转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR），一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增，具有快速简便、敏感性高、特异性高的优点，已成为实验室最主要的检测手段。RT-PCR被广泛地用于PEDV的检测。Kubota（1999）等人建立了可检测细胞毒和粪便毒的RT-PCR法来诊断PED，ZhaoJ（2013）等运用多重RT-PCR成功对2010年至2012年间华东地区养猪场PEDV、TGEV、GAR和PCV2，4种猪腹泻病相关病毒进行了检测，建立了多重RT-PCR方法。1.3.8荧光定量RT-PCR检测法荧光定量RT-PCR技术是将荧光标记技术和数码显相技术融合至PCR扩增反应中，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。修金生（2012）等根据PEDV野毒株和CV777弱毒疫苗株的高度保守ORF3基因核苷酸序列设计特异性荧光定量引物，建立了基于SYBRI实时荧光定量RT-PCR方法。荧光定量RT-PCR具有特异性强、敏感性高、全封闭反应、耗时短等优点。但由于对技术人员专业知识以及设备水平要求高，从而造成推广困难。目前鉴别诊断猪流行性腹泻主要就依靠直接免疫荧光法（FAT）、间接血凝试验、微量中和试验、免疫电镜技术（IEM）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、RT-PCR法以及胶体金快速诊断法，通过这些方法能够及时确诊，然后釆取相应的预防和治疗措施，进而有效地控制猪流行性腹泻病。1.4猪流行性腹泻的发病原因分析及其防制措施1.4.1猪流行性腹泻病出现的原因分析针对广东地区发病场对猪流行性腹泻病出现的原因进行了分析，主要包括以下方面：（1）猪群（尤其母猪）抗原检查阳性，猪场持续长期带毒，受到应激影响表现临床症状，如天气应激、断奶应激、打疫苗应激等；（2）传统疫苗免疫效果不理想，保护力差，可能是免疫操作的原因，也可能是病毒变异；（3）寒冷季节保温不到位是重要诱因，冬季时，栏舍温度过低，猪群抵抗力差，容易引起腹泻；（4）不合理冲栏等造成舍内湿度大，高湿环境是病原体繁殖的最适条件；（5）出猪后栏舍消毒达不到要求，空栏消毒时间太短；7 （6）病原通过引种、车辆运输或其他途径传入猪场，部分阳性场引进的后备猪抵抗力差，调入生产线后引起发病；（7）猪群膘情差，健康度低，免疫蓝耳、伪狂犬等疫苗时应激引起发病。1.4.2猪流行性腹泻的防制措施猪流行性腹泻为病毒病，只能通过疫苗免疫和抗血清等方法来预防疾病爆发。同时，做好以下6个方面：1.4.2.1做好防疫隔离消毒猪场坚持自繁自养，在后备猪引进生产线前，做好后备猪隔离。在猪场下风区，且离其他生产线至少500m建隔离舍，后备猪在隔离舍至少隔离3个月才引进生产线，能够有效避免疾病传播。1.4.2.2做好猪群保健除了提供最优质的饲料，保证能量、蛋白质供给外，要制定每月1次的西药保健（维生素、微量元素等），每季度1次中药保健（大黄苏打、鱼腥草等）的保健计划，提高猪群整体抵抗力。对猪群中膘情差、表征异常的猪只要重点关注，发现疾病及早治疗。1.4.2.3搞好卫生和消毒工作每月1次消毒猪舍周边环境消毒，每半月1次带猪消毒。善用石灰、烧碱日常消毒，清理杂草，灭蚊灭鼠。每个分娩舍实现全进全出，出猪后进行冲栏消毒。冲栏消毒至少有三个步骤，烧碱或石灰水喷洒消毒、甲醛熏蒸消毒以及寄生虫类消毒剂消毒，必要时进行火焰消毒。冲栏后至少空栏一星期再进猪。1.4.2.4冬季加强防寒保暖猪流行性腹泻多发于冬春季节，在低温环境或室内温差变化大会增加腹泻发生概率。冠状病毒怕热不怕冷，因此保持舍内温度十分重要，最好能够达到25℃左右。在冬季可以通过帐幕挡风，室内暖炉、太阳灯增温。对哺乳仔猪，在保温箱内垫茅草或布袋，适当撒些密斯陀保持保温箱干燥，打开保温灯保暖。1.4.2.5疫苗或抗血清免疫马思奇（1994）等以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活疫苗，攻毒试验取得85%的保护率；马思奇（1995）等进行了PED-TGE二联灭活苗的研究为防治猪流行性腹泻病迈上了新的台阶；牛小迎（2000）等做了猪病毒性腹泻三联疫苗的免疫研究，使腹泻疫苗能够更全方位地对猪体产生保护作用；徐宏军（2015）等进行了猪流行性腹泻病8 毒灭活疫苗的制备及攻毒保护研究，有针对性地对PEDV新流行毒株进行疫苗制备，提高疫苗保护力，更好地防控PED。目前主要用PED-TGE和轮状病毒三联灭活苗免疫，PEDV抗血清由广东大华农公司利用CV777疫苗株免疫猪只所制备并保存。后备母猪引进时先免疫1针，进入生产线前再免疫1针。怀孕母猪，在怀孕78天，99天以及112天均免疫1针，保持猪体抗体水平，为仔猪提供母源抗体。定期检查猪群抗体水平，若发现水平下降，结合实际生产情况进行补免。1.4.2.6发病紧急处理先采取紧急隔离措施，防止人员串舍，以防交叉感染，封锁场地，发病栏舍周边进行清洁消毒处理。给发病仔猪灌服抗生素，注射抗血清或干扰素，激发猪体免疫机能。全场母猪紧急免疫接种，先免疫无病区，最后才免疫发病区。及时送样进行实验室诊断，根据实际情况制定整体防控计划。低温是腹泻发生的重要诱因，无论生产中还是试验结果都证明，保温对控制腹泻有突出效果，利用各种手段提高舍内温度达25℃左右。注重湿度控制，针对猪场冬春季节湿度难以控制的情况，可以探索使用抽湿机，控制湿度。停食1-2天，仔猪发生腹泻后，首要工作是防止因迅速脱水及酸中毒而死亡。口服补液盐，全群饮水补液的配方是：每1000ml水中加葡萄糖20.0g+氯化钠3.5g+氯化钾1.5g+小苏打2.5g，每天3~5次，连用3天。针对脱水较严重的猪只，要进行个体静脉推注。用腹腔注射补液，配方是：5%葡萄糖氯化钠注射液20-40ml+维生素C5-l0ml，每天3~5次，连用3天。返饲法：返饲病料选用正在腹泻的仔猪（出现拉稀24小时内的仔猪）的胃、肠及内容物，用机器磨碎（不允许过滤），加适量的生理盐水和和白糖，拌在饲料里饲喂空怀或怀孕母猪，连续饲喂2-3天，间隔3周后再返饲一次。一般一头仔猪的病料返饲20-40头母猪。母猪经感染后15天便能激发产生抗体和乳汁免疫力，并通过初传递给哺乳仔猪，仔猪经被动免疫后可持续到断奶而不发病，并能缩短该病的流行时间。返饲效果判定，返饲猪群返饲后一周内如果有50%以上出现减料或者腹泻，返饲效果判定为良好。不足的，针对没有表现症状的母猪再返饲一次。对于腹泻母猪要在母猪卡上做好记录，方便跟踪和对腹泻的分析。返饲后防疫。返饲后3-7天是高排毒时间，应加强怀孕舍与产房的隔离，避免各类（人、猪、物资）交叉污染。返饲母猪9 发病高峰过后，及时使用中药（健胃散）、微生态制剂、消毒药等护理清理病毒，减少环境带毒。1.5研究目的与意义猪流行性腹泻（PED）是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以仔猪水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征的接触性肠道传染病。据前文综述介绍，2010年以来，猪流行性腹泻疯狂肆虐我国广大养殖户，给我过养殖业造成巨大的经济损失。目前，在广东粤西地区，猪流行性腹泻呈高发趋势，一旦进入冬春季节，该病都是大规模爆发，病死率高。虽然可以采取疫苗接种方式来控制此病流行，但疫苗不能对整个猪群提供完全的保护效果，据报道2010年至今，经典的CV777株疫苗免疫后效果并不理想，接种过疫苗的猪场仍然有此病的流行（甘振磊等，2010）。Sun（2012）等报道S基因遗传进化树分析提示其分离毒株与泰国分离毒株关系较近和疫苗毒株CV777遗传关系较远，刘孝珍（2012）等报道与经典疫苗毒CV777相比新分离毒株S基因发生了变异出现了新的基因型。自2012年以来，广东粤西地区猪流行性腹泻十分严重，呈高发趋势，一旦进入冬春季节，该病都是大规模爆发，利用CV777毒株疫苗免疫，免疫效果不理想，多个猪场仍有PED发生，病死率高，严重影响了当地养猪业。除了饲养管理因素外，流行毒株与疫苗毒株抗原差异导致免疫失败也是一个重要原因。PEDV为冠状病毒科，冠状病毒属的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。据研究表明，直接将PEDV接种在细胞上，前者对细胞的适应难度很大，而且培养出来的病毒效价很低。人们试图用小肠绒毛上皮细胞进行试验，结果病毒仅能在其上1-2代后，效价不稳定或消失，无法继续传代。所以，兽医界认为猪流行性腹泻病毒是一个很难在细胞上培养的特殊病毒（钱永清等，1999）。直到1988年，瑞士苏黎世大学的HofmannM和WylerR（1998）首次报道了在细胞培养液中加入适量胰酶的方法，成功将PEDV毒株在Vero传代细胞上成功培养，并适应传代细胞。这证实了，在胰酶激活作用下，猪流行性腹泻病毒粒子会释放出来，从而在细胞上生长并发挥作用。有研究表明，胰酶对PEDV纤突蛋白具有切割作用，能够增强PEDV对细胞的感染能力（古洪浪等，2013；张志等，2012；庄金秋等，2013；张桂红，2008）。王琳和邢育刚（2014）等通过不同的胰酶浓度比对研究猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞10 中的繁殖规律。参照文献资料，本研究从暴发腹泻的猪场采集母猪和仔猪腹泻粪便，通过解剖病死猪，取其小肠组织及内容物，用在Vero细胞培养基中添加50ug/ml胰酶孵育PEDV，病毒盲传到第8代后，出现了明显的细胞病变，呈现圆缩，颗粒变性，融合和脱落等，再在胰酶总浓度为7.5ug/ml的作用下，选取1%接毒量接种Vero单层，从中分离到一株猪流行性腹泻病毒，命名为PEDV-YX株。从2010年开始，广东地区猪场都发生大规模的仔猪腹泻性致死的疾病，临床症状呕吐、消瘦、剧烈腹泻、脱水，粪便恶臭、如水样，严重者排便喷射状，呈黄绿色、灰黄色，7天龄内发病仔猪死亡率高达100%，经抗生素治疗无效后采集病料送实验室。本研究采集来自粤西某9个规模化养猪场（广东省鹤山市4个、阳春市4个，以及开平市1个）的病料，9个猪场规模相当，能繁母猪数均在1000头左右，采集病料为发病猪场病死猪的粪便、小肠组织及其内容物。用采集回来的180份病料样本，进行胶体金快速诊断、PCR扩增和基因测序技术，判定该病由PEDV引起的；由此进行PEDV猪体回归试验，接种在Vero细胞上，在Vero细胞培养基中添加胰酶孵育PEDV，从中分离出新毒株，目的是了解广东粤西地区PEDV的流行性毒株的特性及流行情况；以该毒株制备氢氧化铝胶灭活疫苗，对该疫苗进行免疫效力研究，为今后的研究中对疫苗的生产工艺改进，提高疫苗对猪体的保护力，优化免疫程序，为建立PEDV快速准确的诊断方法及新疫苗的研究提供理论依据，从而为制定有效的防控措施，促进该地区养猪业的稳定发展做好铺垫。2材料和方法2.1材料2.1.1样品来源2013年9月～2015年7月期间，收集粤西某9个规模化养猪场（广东省鹤山市4个、阳春市4个，以及开平市1个）病料，经抗生素治疗无效后，初步推断为病毒性腹泻。发生疫情时进行采样，采集病死猪的粪便、小肠组织及其内容物，约每个场采样数量20份，共180份。冷冻保存，送实验室检验。病料分类后得到9组样品：HS1，HS2，HS3，HS4，KP，YC1，YC2，YC3，YC4。2.1.2引物设计引物的设计与合成根据GenBank上公布的PEDVORF3蛋白的保守序列设计1对特异性引物：11 P1：5’-TTATGTTGGCAGCGCGTTTT-3’P2：5’-TCGCAACAGCTGTAGGTCAG-3’扩增长度为675bp由大连宝生物工程有限公司合成。2.1.3主要试剂盒猪流行性腹泻病毒抗原快速检测试剂盒AnigenRapidPEDAgTestKit购于韩国BIONOTE公司、猪传染性胃肠炎病毒抗原快速检测试剂盒AnigenRapidTGEAgTestkit购于韩国BIONOTE公司、ExTaqDNA聚合酶和RT-PCR试剂盒PrimeScriptIStepRT-PCRKitVer2购于TaKaRa公司、总RNA抽提试剂盒购于天根公司、DNA分子量标准Marker2000购于TaKaRa公司，小量质粒提取与胶回收试剂盒为爱思进公司产品。2.1.4试剂与配制细胞：本研究采用Vero细胞，来自哈尔滨兽医研究所，在本实验室已扩增冻存，目前在本实验室最高传至69代。冻存代次为28代。基础DMEM培养基（Hyclone）、胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Gibco）细胞培养液：DMEM(HyClone)营养液+10%FBS+1%双抗细胞维持液：DMEM+2%FBS+50ug/ml胰酶+1%双抗细胞消化液：①0.05%的胰蛋白酶-EDTA消化液、②0.25%胰酶Ph=8-9、③0.25%胰酶+0.03%EDTAPBS液：称取KH2PO40.2g，12水合Na2HPO42.83g，NaCl8g和KCl0.2g，加ddH2O定容至1000ml，调PH至7.2，用0.22um孔径的微孔滤膜过滤，灭菌后4℃保存。青霉素(l000U/ml)，链霉素(300U/ml)无菌条件下溶于超纯水中，定容至100ml，0.22um滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃保存备用。TAE电泳缓冲液：贮存液(50×TAE电泳缓冲液，称取Tris碱242g，Na2EDTA-2H2O37.2g，ddH2O800ml充分溶解混匀，再加入冰乙酸57.1ml搅拌混匀，调节PH为8.5后定容到1L。工作液：(1×TAE电泳缓冲液)取1/50贮存液，49/50H2O混合而成。Hanks液：NaCl8g，KCl0.4g，12水合Na2HPO40.06g，葡萄糖1g和酚红粉0.02g，加ddH2O定容至1000ml，用0.22um孔径的微孔滤膜过滤，灭菌后4℃保存。0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,12 溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌（至少20分钟），保存存于室温或4℃冰箱中。琼脂糖凝胶(1.0%)：称取琼脂糖l.0g(购自BIOWEST)溶解在100ml1×TAE电泳缓冲液中，充分混匀后加入3ulGreenview，微波炉加热至琼脂糖完全融化后倒至凝胶板制胶。2.1.5主要仪器表2.1本试验主要仪器仪器名称厂家超净工作台苏净集团安泰空气技术有限公司FA1604S电子天平上海天平仪器厂iCyclerPCR扩增仪Bio-Rad公司高速冷冻离心机德国eppendorf公司蛋白质电泳仪德国Eppendorf公司全自动凝胶图像分析系统美国UVP公司LRH-250A-1生化培养箱广东省医疗器械厂隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂光学倒置显微镜TE2000Nikon公司CO2细胞培养箱德国Memmert公司PCR仪德国Eppendorf公司电热恒温干燥箱上海精宏实验设备有限公司紫外透射仪TR-3121A美国Spetroms公司电热三孔恒温水槽上海恒一科技有限公司超净工作台SWCJ-2F苏州安泰空气技术有限公司微量振荡仪TL-2000MM-1姜堰市天力医疗器械有限公司恒温水浴振荡器HZS-HA哈尔滨市东明医疗仪器厂2.2方法2.2.1病料采集与处理从粤西某9个规模化养猪场（广东省鹤山市4个、阳春市4个，以及开平市1个）病料，采集回来的粪便、小肠组织及内容物样品置于-70℃超低温冰箱保存备用。将病料研磨粉碎，用Hanks液作10倍稀释，反复冻融3次后，以4℃8000r/min13 离心15min，取上清，再12000r/min，4℃离心10min，取上清。上清液先经0.45um滤膜过滤，取滤液再经0.22um滤膜过滤，过滤完成后置于-70℃冰箱保存备用。将9个规模化养猪场病料液，以HS1，HS2，HS3，HS4，KP，YC1，YC2，YC3，YC4的名称分别存放。2.2.2胶体金试剂盒检测用猪流行性腹泻病毒抗原快速检测试剂盒、猪传染性胃肠炎病毒抗原快速检测试剂盒进行粪便样品检测。（1）用药签采集猪粪便；把药签插入样品管（内含1ml稀释液），使采样的药签和稀释液混合，充分萃取。（2）把试剂板取出，用一次性滴管从样品管中吸取样品萃取液3-4滴，滴至试剂板的样品孔。（3）当试验开始反应，可以看到紫色的小色带出现在结果视窗。5-10分钟内，当标准线和测试线同时出现在结果视窗，则说明样品为阳性。为了更好的结果，每个场检测至少5份腹泻的粪便样本。2.2.3RT-PCRPEDVORF3基因扩增2.2.3.1Trizol法提取总RNA(1)从-70℃冰箱取出50-100mg病料，加入1mol双抗，反复冻融3次充分研磨后置于离心管中加入1mlTrizol，充分混匀，室温静置5min；(2)加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min，12000r/min，4℃离心15min，取上清，将上清转移至新的1.5ml离心管；(3)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；(4)4℃，12000r/min离心10min，弃上清；(5)加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500r/min离心5min，弃上清；(6)晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。2.2.3.2酚-氯仿法提取总DNA(1)采集样品反复冻融三次，充分研磨，5000r/min离心5min，弃去细胞碎片；(2)取上清500ul，加入75uL10%SDS，25ul蛋白酶K(30mg/ml)，充分混匀后置于55°C水浴箱裂解Ih；(3)12000r/min离心10min，取上清，加入800ulTris-饱和酚，充分混匀，室温静置5-l0min；(4)12000r/min离心5min，取上清，加入等体积氯仿，充分混匀后静置l0min；14 (5)12000r/min离心10min，取上清，加入2倍体积的无水乙醇,1/10体积的乙酸钠，充分混匀后-20℃静置30min；(6)12000r/min离心15min，弃上清，加75%乙醇200ul，洗涤沉淀2-3次；(7)待乙醇充分挥发后加30-50ulddH20充分溶解沉淀。2.2.3.3RT-PCR方法通过2.2.3.1方法获得病料组织的总RNA，再进行反转录得到检测的模版cDNA，步骤按照反转录试剂盒进行。PCR反应体系如下：10×PCRBuffer5ul，2.5mmol/LdNTP1ul，上、下游引物(20umol/L)各1ul，模板1ul，TaqDNA聚合酶0.5ul，补水至25ul。反应程序为：95℃预变性4min；95℃40s，56℃40s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，使用l×TAE缓冲液配制1.0%琼脂糖悬液，微波炉加热溶解后冷却至50℃~60℃左右，加入lmg/ml溴化乙锭(EB)溶液至终浓度为0.05％，混匀，再将其倒入准备好的凝胶板中。待胶凝固后，在加样孔分别加入PCR产物样品及阴性对照及标准的DNAMarkerDL2000样品，100V电压电泳20min左右后，在紫外检测仪下观察电泳结果并照相。2.2.4基因送样测序当结果出现与预期大小相似条带时，进行切胶回收，按胶回收试剂盒的方法回收产物，将回收产物与pMDl8-T载体相连后，反应体系（10ul）为：基因片段4.5ul，LigationSolutionІ5.0ul，pMDl8-T载体0.5ul，在16℃金属浴中连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，转化产物涂布于琼脂平板，于37℃恒温培养箱中倒置培养8-12h。挑取单个菌落加入含有的液体培养基中扩大培养，于37℃摇床中过夜培养，将鉴定正确的阳性克隆质粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，利用MEGA6.0等软件分析序列，所得序列和在GenBank上登录的PEDVCV777序列进行比对。2.2.5病毒分离2.2.5.1Vero细胞复苏与传代培养由液氮罐中迅速取出冻存的Vero细胞F281管，立即放入37℃水中水浴，快速打圈，融化后用枪头移至盛有8mlDMEM液的无菌离心管中，15000rpm/min室温离心5min，弃上清，将沉淀放入盛有10ml含10％胎牛血清及1％双抗的DMEM培养液的无菌培养瓶中，37℃培养24-36h，倒置显微镜观察细胞生长情况。待Vero细胞长成单层后进行细胞传代，弃去培养液，用无菌PBS洗两次，加入15 0.25％胰酶-EDTA消化液2-3ml，轻摇数次，消化液尽量覆盖整个细胞单层，平放消化4-5分钟，边消化边在显微镜下观察，直至细胞分散、变圆，即将脱落时，弃胰酶，用移液管吸取含有10％FBS的DMEM培养液反复吹打细胞，使细胞充分混匀后调PH至7.0左右，37℃继续培养，备用。2.2.5.2病毒的分离培养取2.2.1初步处理后的病料，进行初步分离。取冻存中的VeroF28细胞复苏，传代5代后，能得到稳定生长的VeroF33，用于接种病料液。取已生长单层的Vero细胞10ml，将培养液弃掉，用PBS洗1次，加入10ml无血清DMEM（内含总浓度为50ug/ml的胰酶），加入已进行2.2.1初步处理好的1ml病料液，37℃吸附1h后，弃去培养液。加入新的维持液（10mlDMEM+2%FBS+50ug/ml胰酶+1%双抗），记为Vero-X-F1（X为病料的组别），置于37℃CO2培养箱培养72h作为一个传代周期。每24h在倒置显微镜下观察细胞状态，若72h内出现病变，则冻存细胞培养物。盲传细胞培养液为：10mlDMEM(HyClone)营养液+10%FBS+1%双抗。2.2.6猪体回归试验猪体回归试验，目的为了让病毒在猪体内提高敏感性，增强毒力，观察能否得到预期临床症状。在回猪试验中，实验员以1天龄，还没有吮吸过初乳的初生仔猪为实验对象。实验人员取上述2.2.5.2已冻存的细胞培养物，反复冻融3次后，4℃8000r/min离心15min，取上清，再经0.22um滤膜过滤，取滤液用于猪体回归试验。给它们口服或注射分离后的病毒液，观察新生仔猪的发病症状。猪体回归试验具体操作：(1)实验动物1天龄未吃初乳的仔猪（未吃初乳，没有母源抗体）。(2)实验材料选用经2.2.5.2处理后的病毒液作为攻毒毒种。(3)实验时间仔猪出生时间，2015年6月24日晚上；灌喂人用婴儿奶50ml（奶粉购自新兴县好邻居商场，以1:10兑水）及30ml5%葡萄糖-氯化钠溶液；(4)实验过程初生仔猪分组打耳号，各组隔离饲养。攻毒时间为6月25日9：30和17：30，喂食之前攻毒。(5)猪体回归试验结果检测若发现猪只死亡，先进行病理解剖检查，再收集病料进行胶体金快速检测。记录16 发病最典型，病程最短最急且胶体金检测最明显的一组病毒。2.2.7病毒纯化选取猪体回归试验中发病最典型，病程最短最急且胶体金检测最明显的那组病毒，取其2.2.5.2冻存后的细胞培养物进行病毒纯化，反复冻融3次，5000r/min离心10min，取上清；在收集的病毒液里面加入猪圆环病毒、猪细小病毒、猪蓝耳毒、猪瘟病毒、猪乙脑病毒等病毒的阳性血清（各病毒阳性血清可从广东大华农公司生药研发室获得），37℃温育培养1h后继续在细胞上盲传，传至第8代开始，CPE（Vero细胞空泡状病变）于接种后16h开始出现，以后就一直有规律地稳定出现。CPE的主要表现为细胞的折光度降低，细胞圆缩，颗粒变性。至40-48h，CPE明显，细胞部分脱落（钱永清等，1999）。收集病毒液，将该毒株命名为PEDV-YX株，继续做RT-PCR检测。2.2.7.1细胞板接毒据王琳（2014）等在猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞中繁育条件的优化的研究中，在对加入不同胰酶浓度进行比较中发现在浓度为5ug/ml-7.5ug/ml范围内病毒增殖速度随胰酶浓度的增加上升，胰酶浓度在7.5ug/ml以上时对细胞产生毒性。因此，为了使病毒在细胞中更好地增殖而又不损害细胞，应以总浓度为7.5ug/ml的胰酶加入细胞培养液中。制备Vero细胞12孔板单层，YX毒株反复冻融3次后接种于细胞12孔板，第一行按0.1%接毒量，第二行按0.5%接毒量，第三行按1%接毒量，细胞维持液：DMEM+1%FBS+7.5ug/ml胰酶+双抗。置于37℃CO2培养箱培养。每12h取出，在倒置显微镜下观察，挑选病变最快且病变孔数最多的接毒量病变孔，-20℃冻存细胞板，该细胞板为PEDV-YXF9。2.2.7.2细胞接YX株F9病毒并收毒在斜颈透气细胞培养瓶中制备Vero细胞单层。将2.2.7.1中的细胞板，反复冻融3次，以挑选出来的病变孔为病毒源，同时以2.2.7.1选出来的最优接毒量接种Vero细胞单层，为PEDV-YXF10，置于37℃CO2培养箱培养72h，每12h在倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞出现病变时，冻存细胞培养物。2.2.8病毒生物学特性研究2.2.8.1病毒核酸类型鉴定取2瓶（瓶号为A、B）长满单层的Vero细胞，A、B两瓶均常规方法接种PEDV-YX17 F10病毒液后，其中在A瓶细胞中加入5-BrdU（5-溴-2-脱氧尿苷，可作为DNA病毒的抑制剂）终浓度为50ug/ml，B瓶细胞不加入5-BrdU，最后均加入含5ug/ml胰酶的维持液置于37℃CO2培养箱中培养，逐日观察细胞病变。2.2.8.2乙醚敏感试验取2管含0.8ml病毒液的离心管。其中1管加入0.2ml乙醚（相对密度0.71），为处理组病毒液，4℃不断振荡24h，弃去上层乙醚；另1管加入0.4ml无血清细胞培养液，为对照组病毒液。两组8000r/min离心5min，取上清（付梦瑾等，2013；张婉华等，2014；包振中等，2015）。将两组病毒液均作10倍倍比稀释后，接种于已平铺Vero细胞单层的96孔板，37℃吸附1h后弃病毒液，加入含胰酶的维持液，置37℃CO2培养箱培养，每隔12h观察并记录有细胞病变的细胞孔（CPE），计算试验组和对照组的TCID50。如是乙醚敏感病毒，其感染滴度将明显下降，常比对照组降低2个对数滴度以上，甚至完全灭活。2.2.8.3氯仿敏感试验取2管含2.38ml病毒液的离心管。其中1管加入0.12ml氯仿（相对密度1.48），为处理组病毒液；另1管加入0.4ml无血清细胞培养液，为对照组病毒液。充分混合后4℃不断振荡24h，8000r/min离心5min，收集上清（付梦瑾等，2013；张婉华等，2014；包振中等，2015）。将两组病毒液均作10倍倍比稀释后，接种于已平铺Vero细胞单层的96孔板，37℃吸附1h后弃病毒液，加入含胰酶的维持液，置37℃CO2培养箱培养，每隔12h观察并记录有细胞病变的细胞孔（CPE），计算试验组和对照组的TCID50。以病毒效价下降2个滴度为对氯仿敏感的判定标准。2.2.8.4耐酸性试验取2管含1ml病毒液的离心管。其中1管用0.1mol/L的盐酸将病毒液调至pH3.0，为处理组病毒液，置37℃恒温培养箱中作用2h后，再用5.6%的NaHCO3将处理病毒液调至pH7.2，同时设生理盐水对照组（付梦瑾等，2013；张婉华等，2014；包振中等，2015）。将两组病毒液均作10倍倍比稀释后，接种于已平铺Vero细胞单层的96孔板，37℃吸附1h后弃病毒液，加入含胰酶的维持液，置37℃CO2培养箱培养，每隔12h观察并记录有细胞病变的细胞孔（CPE），计算试验组和对照组的TCID50。以病毒效价下降2个滴度为对酸性敏感的判定标准。2.2.8.5耐热性试验取3管含1ml病毒液的离心管。其中两管分别置于50℃、60℃温水水浴1h，为18 处理组病毒液，另一管作为对照组。将两组病毒液均作10倍倍比稀释后，接种于已平铺Vero细胞单层的96孔板，37℃吸附1h后弃病毒液，加入含胰酶的维持液，置37℃CO2培养箱培养，每隔12h观察并记录有细胞病变的细胞孔（CPE），计算试验组和对照组的TCID50。2.2.9病毒中和试验阴性血清与PEDV抗血清均采集母猪血进行8000r/min，离心10min。阴性血清为PEDV抗体检查阴性的血清，PEDV抗血清为利用PEDV-CV777疫苗株所制备，猪只抗体检查阳性的血清。动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。所以，中和试验前应当对阴性血清和PEDV抗血清进行56℃，30min的水浴灭活。（1）将病毒悬液作10倍倍比稀释，选择10-1-10-6病毒稀释液，分别加入96孔细胞培养板内，每个稀释度2列，25ul/孔，设立2列阴性对照；每孔加入与病毒液等量的血清，25ul/孔，一侧加阴性血清（该血清PEDV抗体检查阴性，为对照组），另一侧加PEDV抗血清（该血清PEDV抗体检查阳性），充分混合后置37℃作用1h。（2）于上述作用后的培养板内加入Vero细胞悬液，25ul/孔；混合后置37℃CO2培养箱培养，每隔12h观察并记录有病毒增殖的细胞孔（CPE）。（3）按Reed-Muench法计算结果并计算血清中和效价。注：1-6列操作，倍比稀释后的病毒液25u/孔+阴性血清25u/孔+Vero细胞悬液25u/孔；7-12列操作，倍比稀释后的病毒液25u/孔+PEDV抗血清25u/孔+Vero细胞悬液25u/孔。2.2.10病毒TCID50测定TCID50测定是作为病毒感染力测定的常用方法，用来掌握半数细胞培养物感染量。该试验用96孔细胞培养板进行。（1）常规方法消化生长良好的Vero细胞，取原细胞量的1/5制成悬浮液，在96孔细胞培养板上每孔加100ul，37℃CO2培养箱培养24h，形成致密的单层细胞；（2）在1.5ml离心管中用DMEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-9这9个病毒稀释度；（3）弃去培养板上各孔的细胞培养液，换取新的DMEM（无血清），每孔各100ul，第1列孔内加入细胞培养液作为空白对照，第11列孔内加入病毒原液作为阳性对照，第2-10列按照每列一个稀释度接种病毒稀释液，每孔100ul（如表2.2），置于37℃CO219 培养箱培养，每隔12h观察并记录有病毒增殖的细胞孔（CPE）。CPE一般在第4天开始出现，稀释度越低的孔出现病变越慢，整块细胞板一般需要观察5-7天；（4）结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法。空白对照孔为100ul细胞培养液（DMEM+2%血清），其他孔为100ul按比例稀释后的病毒液+100ulDMEM。2.2.11PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗制备及不同免疫剂量、不同免疫途径对抗体水平的影响研究2.2.11.1PEDV-YX株氢氧化铝胶佐剂灭活疫苗的制备（1）制苗细胞毒液的灭活：PEDV-YX株F10反复冻融三次，加入最终浓度为0.3%的甲醛溶液，充分振荡，置37℃灭活24h，灭活结束后加5%亚硫酸钠终止灭活。灭活后取少量病毒液，接种于普通营养琼脂平板，37℃培养24-48h，进行灭活检验。菌液灭活后应无菌生长。（2）疫苗配制方法：半成品灭活样40ml+PBS40ml+20ml铝胶佐剂进行均匀混合，可用微量搅拌仪混合，在室温下沉淀24h，配苗完成。2.2.11.2PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗不同免疫剂量、不同免疫途径对抗体水平的影响研究（1）动物分组与免疫将配制好YX株氢氧化铝胶灭活苗按照使用剂量为0.5ml/头、1ml/头、2ml/头，分别免疫PEDV抗体阴性的25天龄断奶仔猪（正常食料），分别进行后海穴免疫和口服免疫。同时设阴性对照每窝1-2头，同条件下分组饲养，定期采血分离血清，以血清中和试验法测定PEDV抗体效价。首免后3周以相同的疫苗、免疫剂量及免疫途径二免。二免后当抗体效价降到1∶32时必须补充免疫。如二免后21天达不到1∶32。该组试验结束。20 表2.2疫苗免疫分组情况免疫动首次免疫二免疫苗物数量免疫途径免疫剂量免疫途径免疫剂量52ml2ml后海穴后海穴51ml1ml免疫免疫PEDV-YX株50.5ml0.5mlTCID50/0.1ml52ml2ml5口服免疫1ml口服免疫1ml50.5ml0.5ml未免疫组2////（2）免疫后抗体检测安全性监测：免疫后观察免疫猪的生长状况和应激反应等至免疫后21天。抗体监测：首次免疫前用前腔静脉采血法采集每头猪2ml全血液，监测抗体是否为阴性。首次免疫后7天、14天和21天采集所有猪血液，分离血清，检测中和抗体产生情况。首免后21天进行二免，监测二免后7天、14天和21天的抗体产生情况。血清分离处理方法：血液2-8℃静置过夜后8000rpm离心5min吸取血清。血清以12000r/min以上离心10min，无菌操作吸取上清至无菌离心管中，－20℃以下长期保存备用（如果3天内使用放2-8℃）。使用前按计划使用量的1.1倍取样，用含抗生素的无血清细胞培养基（Ph7.2）4倍稀释后，再以12000r/min以上离心10min，无菌操作吸取上清至无菌离心管中。56℃热灭活30min用于中和试验。中和抗体检测操作方法：取50ul含抗生素的无血清细胞培养基到无菌96孔细胞板中，然后加等量待检血清到第一孔，混匀后再吸等量到第二孔，如此2倍稀释至1:256的稀释度。每孔加入等量用含抗生素、2％FBS的细胞培养基稀释为200TCID50/0.1ml的病毒液，混匀后置湿盒中37℃中和1h，期间摇动2-3次，每个样作4孔。中和完成的中和物加入到生长24h以内铺满80％左右单层细胞的细胞板中。37℃吸附作用1h后，放置在37℃5％二氧化碳培养箱中培养3-5天判断结果。设立病毒对照：用含抗生素、2％血清的细胞培养基将200TCID50/0.1ml病毒液稀释成0.1、1、10和100TCID50/0.1ml回归，作为病毒对照，同样放37℃中和1h，病毒对照组最后接种。同21 时设置健康对照细胞（即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔）。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征。整个过程必须注意要在无菌操作完成。中和抗体检测结果判断，以50％以上不出现CPE的血清最高稀释度倍数判定为该血清的抗体效价滴度或按Reed-Muench法计算中和指数。3结果3.1胶体金试剂盒检测结果用猪流行性腹泻病毒抗原快速检测试剂盒和猪传染性胃肠炎病毒快速检测试剂盒对分离后的病料液进行检测，结果如图3.1所示。HS1，HS2，HS3，HS4，KP，YC1，YC2，YC3，YC4共9组病料均检出PED阳性，TGE均为阴性。初步证明，HS1，HS2，HS3，HS4，KP，YC1，YC2，YC3，YC4共9组待测病毒为PEDV，而非TGEV。图3.1胶体金试剂盒检测结果3.2RT-PCR结果经PED胶体金检测后，对HS1，HS2，HS3，HS4，KP，YC1，YC2，YC3，YC49组病料进行RT-PCR检测，以蒸馏水为阴性对照，PEDV-CV777疫苗株为阳性对照，方法按2.2.3.3进行。在阴性、阳性对照成立的情况下，9个样品均出现特异性扩增条带，条带大小为675bp左右，与预期大小一致，如图3.2所示。22 图3.2猪流行性腹泻病毒（PEDV）抗原检测结果M：DNAMakerDL2000；1为阴性对照；2为PEDV-CV777疫苗株；3-10均为检测样品的RT-PCR产物。3.3测序及序列比对结果测序结果表明，目的序列长为675bp-682bp之间。YC1，YC2，YC3，YC4序列之间同源性为99.5-99.7%；HS1，HS2，HS3，HS4序列很接近，相差不到1%；KP株与其他都差别较大，相差1.4%左右。从GenBank查找CV777ORF3基因序列作比对（GeneID:935183），绘制基因遗传进化关系树，表明2013-2015年间粤西这9个猪场发生的猪流行性腹泻毒株序列与CV777序列有差异，核苷酸同源性在96.9%-97.8%之间，结果如图3.3、3.4所示，与CV777毒株不在同一分支上，这说明了PEDV-CV777疫苗已不能对当地猪群提供很好的免疫保护作用。除了饲养管理因素外，流行毒株与疫苗毒株抗原差异导致免疫失败也是一个重要原因。本研究从抗原相关指数和进化树分析发现，该场流行毒株的抗原性与CV777差异较大。用基于CV777毒株的疫苗免疫，该地区猪场仍然发生猪流行性腹泻。鉴于该地区流行的猪流行性腹泻病毒已发生毒株上的变异，应当有针对性地对当地流行的腹泻毒株进行分离鉴定研究，为新疫苗的研究提供理论依据，利用分离出来的新毒株进行灭活疫苗的配制，从而制定有效的免疫计划和防控措施，促进该地区养猪业的稳定发展。23 图3.3测序及序列比对结果图3.4基因遗传进化树3.4猪体回归试验结果据3.3的结果可将序列接近的HS1、HS2、HS3、HS4合并为HS组，YC1、YC2、YC3、YC4合并为YC组，KP组以及空白对照组共4组，每组2头初生仔猪，进行猪体回归试验。喂食方式：30ml5%葡萄糖-氯化钠溶液+50ml1:10兑水婴儿奶，喂食时间9：30，11：30，14：30，17：30，20：00。具体攻毒操作按下表安排，见表3.1所示。24 表3.1猪体回归试验攻毒操作安排仔猪耳所用病料攻毒（用量/次数）时间号口服：5ml/次，2次6月25日9：30和17：301、2HS病毒液注射：2ml/次，2次喂食之前攻毒饲喂口服：5ml/次，2次6月25日9：30和17：303、4KP病毒液注射：2ml/次，2次喂食之前攻毒饲喂口服：5ml/次，2次6月25日9：30和17：305、6YC病毒液注射：2ml/次，2次喂食之前攻毒饲喂6月25日9：30和17：307、8空白对照不攻毒喂食之前饲喂3.4.1猪体回归试验胶体金检测结果，见表3.2所示。表3.2猪体回归试验结果表PED胶体金试仔猪耳号所用病料攻毒（用量/次数）死亡时间剂盒检测结果口服：5ml/次，2次1、2HS病毒液攻毒后48h+注射：2ml/次，2次口服：5ml/次，2次3、4KP病毒液攻毒后72h+注射：2ml/次，2次口服：5ml/次，2次5、6YC病毒液攻毒后36h+注射：2ml/次，2次7、8空白对照不攻毒无死亡-1、2号仔猪攻毒后变化：攻毒当天，仔猪开始表现精神沉郁，食欲不振，第二天开始发生剧烈呕吐和腹泻，逐渐消瘦、脱水，第三天早上死亡，当天早上胶体金快速试剂盒检测Test线较浅，12h后Test线较明显。3、4号仔猪攻毒后变化：发病较缓慢，攻毒后只表现精神沉郁，攻毒后第三天才25 开始出现呕吐和腹泻，发病比其他组的迟了约24h，第四天死亡，死亡早上胶体金快速试剂盒检测Test线很浅。5、6号仔猪攻毒后变化：攻毒当天晚上开始发生严重的呕吐和腹泻，全身发抖，精神状态极差，食欲废绝，由于腹泻严重很快就出现脱水，第二天晚上死亡，死亡当天晚上胶体金快速试剂盒检测Test线十分明显。7、8号仔猪为空白对照，无发病无死亡，胶体金快速试剂盒检测阴性。3.4.2猪体回归试验病理解剖结果1、2、5、6号仔猪病理症状基本一致：腹腔积液；胃积水；肺、肝、脾、肾淤血，异常肿大明显；肠系膜出血，肠系膜淋巴结肿大，小肠大肠扁平透空，几乎无内容物，少量积水。如图3.4、图3.5所示。图3.4小肠大肠少量积水图3.5肺、肝、脾、肾淤血，异常肿大26 3、4号仔猪病理症状基本一致，发病较缓慢，症状较轻：腹腔积液；胃积水，肠系膜出血，肠系膜淋巴结肿大，小肠大肠扁平透空，少量积水。猪体回归试验表明，除空白对照组外，其他各组的临床病理症状与猪流行性腹泻症状基本一致，其中5、6号仔猪病程短，25日下午开始发病，气味大，发病明显26日晚上死亡，为典型的猪流行性腹泻症状，呕吐腹泻严重，严重消瘦，露骨，双髂内陷，无力精神状态差，怕冷喜结堆，发抖，全身湿透，毛发有焦黑的斑点；根据试剂盒检测结果和病理解剖结果来看，YC病毒液毒力最强，其次HS病毒液，KP病毒液独立相对较弱。YC组5、6号仔猪的攻毒病毒液毒力最强。选取YC1攻毒病毒液，PEDV-YC1-F1，用来作后面病毒纯化工作。3.5病毒分离后纯化取2.2.6.2冻存后的细胞培养物PEDV-YC1-F1，反复冻融3次，8000r/min离心10min，取上清；在收集的病毒液里面加入猪圆环病毒（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（PRRS）、猪瘟病毒（CSFV）、猪日本乙型脑炎病毒（JEV）等病毒的阳性血清，37℃温育培养1h后继续在细胞上盲传，前3代细胞均未出现细胞病变，盲传到第4代时，于接种后72h开始出现CPE，即在显微镜下观察到空斑，部分细胞圆缩，如图3.6所示。一直盲传至第8代，在接种后24h出现CPE，培养72h后细胞培养物出现细胞圆缩、聚集，空泡增多，呈拉丝网状，如图3.7所示。同时以正常健康Vero细胞做对照，如图3.8所示。取病毒液上清，进行RT-PCR检测，方法同2.2.3.3，RT-PCR能扩增出特异性条带，条带大小为675bp左右，如图3.9所示。收集病毒液于-70℃冰箱保存备用，将该毒株命名为PEDV-YX株。图3.6盲传至第4代72h后27 图3.7盲传至第8代72h后图3.8观察接毒前健康Vero细胞图3.9M：DNAMakerDL2000；1为PEDV-YX株；按2.2.8.1细胞板接毒，选取1%接毒量接种Vero单层，记为PEDV-YX株F10，72h后细胞圆缩、聚集，细胞开始脱落，空泡增多，如图3.10所示。收集病毒液，于-70℃冰箱保存备用。28 图3.10细胞板1%接毒量72h后观察3.6病毒生物学特性研究结果3.6.1病毒核酸类型鉴定结果经5-BrdU处理的A瓶细胞不能明显抑制PEDV-YX株增殖，与B瓶一样于接毒96h后开始出现细胞病变，细胞圆缩、聚集，折光性增强，表明该病毒为RNA病毒。3.6.2乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、耐酸性试验、耐热性试验结果按照Reed-Muech法计算TCID50，公式如（3.1）、（3.2）所示：距离比例=（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）（3.1）lgTCID50=距离比例*稀释液对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数（3.2）结果见表3.3。29 表3.3乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、耐酸性试验、耐热性试验结果处理后病毒的病毒对照试验项目处理方法结论TCID50/0.05mlTCID50/0.05ml脂溶剂敏感性乙醚处理检测不到10-4.5对乙醚敏感脂溶剂敏感性氯仿处理检测不到10-4.5对氯仿敏感耐酸敏感性pH=3.01h10-1.510-4.5对酸敏感耐热敏感性50℃1h10-1.6710-4.5对热敏感耐热敏感性60℃1h10-1.3310-4.5对热敏感PEDV-YX株F10在乙醚、氯仿作用下，培养12h后测其TCID50为0，则说明该病毒对脂溶剂乙醚、氯仿敏感，证明该病毒有囊膜；PEDV-YX株F10在pH=3.0环境下作用1h后，培养过夜测该病毒TCID-1.5/0.05ml，该病毒对酸敏感，易失活；50为10PEDV-YX株F10在耐热性处理1h后（50℃、60℃处理1h），培养过夜测其TCID50分别为10-1.67/0.05ml、10-1.33/0.05ml，说明该病毒不稳定，对热敏感。3.7PEDV-YX株F10病毒中和试验结果以2.2.9病毒中和试验的方法，将PEDV-YX株F10作10倍倍比稀释与阴性或阳性血清混合37℃吸附1h后，再加入Vero细胞悬液，每隔12h观察并记录有病毒病变的细胞孔（CPE），接种后第5天观察结果，对出现CPE和未出现CPE进行记数，结果见表3.3，PEDV抗血清中和指数（公式3.3）为120.23，大于50，则PEDV抗血清能中和该病毒，可基本确定该分离株为PEDV。表3.7病毒中和试验结果组别病毒稀释度TCID50/0.025mlCPE数/810-110-210-310-410-510-6阴性血清8/87/85/84/82/81/810-3.33PEDV抗血清5/82/81/80/80/80/810-1.25注：分子为CPE孔数，分母为细胞孔数。血清中和指数=试验组TCID50/对照组TCID50（3.3）=10-1.25/10-3.33=120.23>5030 3.8PEDV-YX株F10的TCID50测定以2.2.10病毒TCID50测定的方法，将PEDV-YX株F10作10倍倍比稀释后接种Vero细胞，接种后第5天观察结果，对出现CPE和未出现CPE进行记数，结果见表3.4所示：表3.8TCID50测定结果病毒液稀释度出现CPE孔数未出现CPE孔数CPE出现效率10-180100%10-280100%10-380100%10-47187.5%10-56275%10-64450%10-73537.5%10-81712.5%10-9080按照Reed-Muech法计算TCID50：距离比例=（75%-50%）/（75%-37.5%）=0.67lgTCID50=lg0.67*（-1）+（-5）=lg（-5.67）-5.67/0.1ml，则PEDV-YX株F10的TCID由此可以得到所分离病毒的TCID50为1050为10-5.67/0.1ml。31 3.9PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗不同免疫剂量、不同免疫途径对抗体水平的影响研究表3.6免疫剂量为2ml，免疫途径分别为后海穴和口服中和效价结果血清中和价（YX株）免疫免疫耳号剂量途径3w0w1w2w4w5w6w7w二免12ml后海穴12512890.5128178.689.112.722ml后海穴847.8178.6128178.620012847.832ml后海穴111.9160100128178.610222.242ml后海穴432147.179.3112.212890.510.652ml后海穴11.26412874.110012890.511.962ml口服10.62210047.889.110079.3472ml口服11.96412874.1102147.174.111.282ml口服42279.33779.312810018.592ml口服10.647.510944.689.110047.84102ml口服41190.53776112.279.111.2表3.7免疫剂量为1ml，免疫途径分别为后海穴和口服中和效价结果血清中和价（YX株）免疫免疫耳号剂量途径3w0w1w2w4w5w6w7w二免11ml后海穴11.947.810274.190.510274.122.221ml后海穴422.2112.289.110012879.33231ml后海穴10.63710279.3102147.190.52741ml后海穴42790.56474.11026411.251ml后海穴12.732178.6112.1128147.1100861ml口服83212890.510212889.112.671ml口服11689.147.86490.547.81081ml口服418.51006489.110264491ml口服11.222.212874.189.112874.113.5101ml口服13.532112.274.190.5147.110211.932 表3.8免疫剂量为0.5ml，免疫途径分别为后海穴和口服中和效价结果血清中和价（YX株）免疫免疫耳号剂量途径3w0w1w2w4w5w6w7w二免10.5ml后海穴10.744.612889.1102147.189.13220.5ml后海穴432112.26410012879.33230.5ml后海穴11679.347.8641006418.540.5ml后海穴12.647.8112.244.679.390.547.811.250.5ml后海穴83790.56490.5112.26422.260.5ml口服11.247.81006489.1102642770.5ml口服822.289.1376490.544.613.580.5ml口服13.550.9112.289.1100147.174.13290.5ml口服10.7321023774.11003711.9100.5ml口服11.22779.33247.879.33211.2由表3.6、3.7、3.8数据可说明，当免疫剂量相同时，不同的免疫途径对免疫后中和抗体水平有影响，以后海穴注射和口服疫苗作为免疫途径，抗体效价在首免后2周达到峰值，而后消降；在首免后第3周二免，抗体在首免后第5周再次出现峰值，而后消降。且后海穴注射免疫比口服免疫抗体效价更高，且抗体维持时间更长。见图3.11。图3.11免疫剂量为2ml，免疫途径分别为后海穴和口服中和效价消长规律图33 由表3.6、3.7、3.8数据可说明，当免疫途径相同时，不同的免疫剂量对免疫后中和抗体水平有影响，以2ml、1ml、0.5ml免疫剂量免疫实验猪，抗体效价在首免后2周达到峰值，而后消降；在首免后第3周二免，抗体在首免后第5周再次出现峰值，而后消降。且免疫2ml的抗体整体水平比免疫1ml的更高，免疫0.5ml的中和抗体水平最低。见图3.12。图3.12免疫剂量为2ml，免疫途径分别为后海穴和口服中和效价消长规律图34 4讨论4.1猪流行性腹泻病毒YX株的分离鉴定分析猪流行性腹泻是世界上流行最广泛的猪病之一。自2010年开始，我国都大部分地区有大规模的仔猪腹泻性致死的疾病发生，临床症状呕吐、消瘦、剧烈腹泻、脱水，粪便恶臭、如水样，严重者排便喷射状，呈黄绿色、灰黄色，7天龄内发病仔猪死亡率高达100%。猪流行性腹泻具有季节性，多发于冬春季节，但就广东地区这个全年高湿度的环境，PED呈高发趋势，全年均可发生。每年因为流行性腹泻造成的仔猪死亡给我国养殖户造成严重的经济损失，极大地打击了我国养猪业。虽然可以采取疫苗接种方式来控制此病流行，但经典的CV777株疫苗免疫后效果并不理想，接种过疫苗的猪场仍然有此病的流行。因此，本研究着重解决经典CV777株疫苗效果不理想的原因，分离鉴定该地区的流行毒株以及如何解决PEDV不适应细胞生长的问题。本文对广东粤西9个疑似发生腹泻疫情的规模化猪场采集180份病料样本。经胶体金快速诊断技术、对其进行RT-PCR扩增，确诊均为猪流行性腹泻病毒（PEDV）。从病料中分离出9株未知病毒HS1、HS2、HS3、HS4、YC1、YC2、YC3、YC4和KP，进行ORF3基因测序，通过与经典株CV777比对，发现2013-2015年间粤西这9个猪场发生的猪流行性腹泻与CV777不在同一分支，同源性在96.9%〜97.8%之间，与传统疫苗毒株CV777基因存在差异是造成免疫失败和仔猪死亡率高的主要原因。经猪体回归试验，选取临床症状最明显，毒力最强的YC1毒株作为研究对象，进行病毒纯化培养。猪流行性腹泻分离难度大，细胞适应性差是目前疫苗毒株难以更换的主要原因。瑞士苏黎世大学的HofmannM和WylerR（1998）首次报道了在细胞培养液中加入适量胰酶的方法，成功将PEDV毒株在Vero传代细胞上成功培养，并适应传代细胞，胰酶对PEDV纤突蛋白具有切割作用，能够增强PEDV对细胞的感染能力（古洪浪等，2013；张志等，2012；庄金秋等，2013；张桂红，2008）。参照文献资料，本研究从暴发腹泻的猪场采集病料，经初步处理后，将病毒液接种于Vero细胞单层上。在Vero细胞培养基中添加50ug/ml胰酶孵育PEDV，避免因胰酶浓度过高而对细胞产生毒性，抑制病毒孵育。病毒盲传到第8代后，出现明显的细胞病变，呈拉丝网状，细胞呈现圆缩，颗粒变性，融合和脱落等，收集并冻存病毒液。据王琳（2014）等在猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞中繁育条件的优化的35 研究中，在对加入不同胰酶浓度进行比较中发现在浓度为5ug/ml-7.5ug/ml范围内病毒增殖速度随胰酶浓度的增加上升，胰酶浓度在7.5ug/ml以上时对细胞产生毒性。本文为使病毒在细胞中更好地增殖而又不损害细胞，以总浓度为7.5ug/ml的胰酶加入细胞培养液中。将第8代病毒液以0.1%、0.5%和1%的接毒量接种细胞单层，挑选病变最快且最明显的病变孔（1%接毒量孔）作为YX-F9，再以1%YX-F9为病毒源放大，接种Vero单层，72h内出现细胞病变，收集病毒液PEDV-YX-F10。4.2PEDV-YX株的生物学特性研究、微量中和试验和毒力测定分析该分离株对5-BrdU不敏感，对乙醚、氯仿敏感，为具有囊膜的RNA病毒；在pH为3.0的环境下易失活；对热敏感，在50℃条件下作用1h，病毒易失活；与PEDV（CV777）抗血清中和效价为120.23；PEDV-YXF10的TCID-5.6750为10/0.1ml。通过对该毒株进行生物学特性研究，为临床上防控该病指明了方向，脂类溶剂可破坏该病毒的囊膜结构，该病毒对酸性敏感，对热敏感，可使用脂类溶剂或酸性消毒液对带毒器具浸泡，对环境以冰醋酸熏蒸，酸性消毒液喷洒消毒，利用火焰消毒法对产床和定位栏进行消毒，能够杀灭PEDV，从而达到防控目的。对于粤西地区的PED流行，可用该毒株进行灭活疫苗制备，优化免疫程序，制定有效的防控措施。4.3PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗制备及其免疫效力分析PEDV-YX株F10经0.3%的甲醛溶液灭活，以病毒液样40ml+PBS40ml+20ml铝胶佐剂的培苗方案，配制猪流行性腹泻灭活疫苗。以口服免疫、后海穴注射免疫为免疫途径，2ml、1ml、0.5ml不同免疫剂量，研究该灭活疫苗的抗体消长规律。当免疫剂量相同时，后海穴注射免疫比口服免疫抗体效价更高，且抗体维持时间更长；当免疫途径相同时，免疫2ml的抗体整体水平比免疫1ml的更高，免疫0.5ml的中和抗体水平最低。本疫苗最佳免疫方案为，后海穴注射免疫，剂量为2ml/头。后海穴位于肛门与尾根之间的凹陷处，在此穴位对症注射药物，能刺激动物的神经系统，对治疗胃肠道系统疾病有很好效果。但免疫本疫苗的抗体消减快，持续时间短（3周左右），对整个哺乳阶段不能提供完整的保护。因此，在今后的研究中对本疫苗的进行生产工艺改进，也可以从油佐剂疫苗方向研究，目的是提高疫苗对猪体的保护力，优化免疫程序，制定有效的防控措施，促进该地区养猪业的稳定发展。36 5结论5.1从广东粤西地区9个发生腹泻的规模化猪场采集病料，通过胶体金诊断、RT-PCR扩增，基因测序及动物回归试验等方法进行鉴定，通过在细胞培养基中添加胰酶的方法孵育PEDV，分离获得一株猪流行性腹泻病毒株，命名为PEDV-YX株。5.2PEDV-YX株对5-BrdU不敏感，对乙醚、氯仿敏感，为具有囊膜的RNA病毒；在pH为3.0的环境下易失活；对热敏感，在50℃条件下作用1h，病毒易失活；经RT-PCR扩增，电泳检测得到与预期长度一致的条带；与PEDV抗血清中和效价为120.23。PEDV-YX株F10进行TCID-5.6750测定，TCID50为10/0.1ml。5.3用PEDV-YX株F10制备出一种PEDV氢氧化铝胶灭活疫苗并研究该灭活疫苗在不同免疫途径、不同免疫剂量下的抗体消长规律。当免疫剂量相同时，后海穴注射免疫比口服免疫抗体效价更高，且抗体维持时间更长；当免疫途径相同时，免疫2ml的抗体整体水平比免疫1ml的更高，免疫0.5ml的中和抗体水平最低。37 致谢衷心感谢我的导师罗满林教授，他深厚的学术修养，严谨细致的治学态度、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样，他强烈的责任心和对学生的无私关怀、耐心的指导，将令我受益终身。本论文从选题、设计、开展、结果和分析，以及论文的开题、撰写和最后定稿，都离不开罗老师的细心指导。谨向罗满林老师致以深深的谢意!衷心感谢第二导师盘伟岚高级兽医师，她既是我的良师，又是我的益友，以她从事兽医工作十多年的经验，在工作和学习中不断激励和帮助我。同时，也要衷心感谢本学院兽医传染病室的李小鹏同学、陈华良同学、周霞同学以及禽病室的陈亮同学对本次试验研究提出的各种优质建议，为我理清本论文写作思路。衷心感谢广东温氏大华农生物科技有限公司生药研发室的领导和同事们，为我本次的试验研究给予了无私的配合和谅解，使本研究得以顺利完成。最后，衷心感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的专家和教授们！38 参考文献包振中,雷程红,蔡元庆,高窦,卞赛赛,葛婷.牛病毒性腹泻-黏膜病病毒分离鉴定及生物学特性研究[J].中国畜牧兽医.2015,42(9):2391-2398.陈茹,罗琼,李树根.间接法Dot-ELISA检测猪流行性腹泻抗体的研究[J].中国兽医杂志.1997,23(8):11-13.陈申秒,牛成明.何福庆等.猪流行性腹泻病毒研究进展及疫苗应用前景[J].中国畜牧兽医.2014,41(3):223-229.崔现兰,马思奇,王明.应用免疫荧光法诊断猪流行性腹泻的研究[J].中国畜禽传染病,1990(5):20-24.甘振磊,汤德元,李春燕等.猪流行性腹泻流行特点及流行现状的研究[J].猪学,2010(12):24-28.古洪浪,邓胜朝,崔进等.猪流行性腹泻病毒PEDV-GDl2株的分离与鉴定[J].中国兽医杂志,2013,49(11):22-26.付梦瑾,朱玲,吴云飞,唐蕊涵,徐志文,郭万柱.猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及增殖规律[J].中国兽医科学.2013,43(11):1133-1139.李蕾,刘新文,殷颖珊.猪流行性腹泻研究进展[J].南方农业,2014,8(15):136-137.李龙.仔猪流行性腹泻的最新流行情况[J].养猪,2011(5):87-88.李树根,李力复,李力施,林志雄,霍燕琼,林诚斌,陈茹,童昆周.猪流行性腹泻病毒株的建立与应用[J].中国进出境动植检,1995,1:30-32.林志雄,李树根,李力复,陈茹,童昆周.猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用[J].中国兽医科技.1994,24(11):3-4.刘孝珍,陈建飞,时洪艳等.2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J].中国预防兽医学,2012,34(3):180-183.刘小兰,贺笋,陈兰玲,杜久斌.猪流行性腹泻病毒(XJ-DB2)株的分离鉴定[J].中国兽医杂志.2016,52(1):17-19.美国数百万猪崽死于神秘病毒,养猪业陷入灾难.网易新闻,2014,07.倪艳秀,林继煌,何孔旺等.猪流行性腹泻研究概况[J].畜牧与兽医,2001,33(1):38-40.钱永清,闻人楚,唐永兰,孙智锋.猪流行性腹泻病毒的分离培养与鉴定[J].上海农业学报,1999,15(2):41-44.孙东波,冯力,时洪艳等.猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展[J].动物医学进39 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