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分类号：難４：单位代码密级；学号：Ｕ巧００６６义ｆ学位论文紫藤叶斑病的病原鉴定及生物学特性硏究Ｉｄｅｎ村ｆｋａｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ化ｅａ化ｏｅｎｏｆ马ｐｇ＊如味仍ｌｅａｆｓｐｏｔｄｉｓｅａｓｅ研究生：李凯旋指导教师：檀根甲教授申请学位口类级别：农学硕壬专业名称：植物病理学研究方向；植物病害生态与绿色防控所在学院；植物保护学院答辩委员会主席：爲—若年《月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特測加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。■研究生签名；方勤Ｉ濃时间＾曰；年《月ｉ／６＿７关于论文使用授权的说明目本人完全了解安汲农业大学有关保留、使用学位论文的规定，Ｐ；学校有权保留＾送交论文的复印件和磁盘，允许论文被査阅和借阅，可采用影印、缩印或扫描等复１＾传制手段保存、汇编学位论文。同意安微农业大学可抖用不同方式在不同媒体上发表、播学位论义的全部或部分巧容。（保密的学位论文在巧密后跑奠守此协议）研究生签名；Ａ姐皮時间；＞／己年／月女曰第一导师签名；佑时间；年《月日才 摘要紫藤〔Wisteriasinensis(Sims)Sweet.〕为豆科紫藤属落叶木质大藤本,是著名的园林环保观赏花卉。紫藤集观赏、医疗、环保价值于一身，具有极高的潜在研究价值。随着紫藤种植面积的增长，自然生境下紫藤真菌性病害多有发生。尤以紫藤叶斑病发生较为普遍，严重影响紫藤的美观，发病严重时可至全株叶片枯死，对紫藤可造成毁灭性危害。但是目前国内外对紫藤叶斑病的研究鲜有报道。为了有效防控该病害的扩展和蔓延，保证观赏植物及园林产业的可持续发展，迫切需要对紫藤叶斑病进行全面的调查和鉴定。本研究在安徽省霍邱县和池州市采集有典型叶斑病的病叶，进行病原菌的分离纯化和致病性测定，对病原菌进行形态学以及分子生物学鉴定，进而研究病原物的生物学特性和药剂毒力，以期待为病害的防治奠定理论基础。主要研究结果如下：1、病原菌的分离与致病性测定于2014年8月在安徽省霍邱县和池州市采集有典型叶斑病的病叶，按常规的组织分离法进行分离。得到2株相同的病菌，将两株菌分别编号为ZT-1和ZT-2，选取菌株ZT-1进行致病性测定，结果表明无论是菌丝块接种还是孢子悬浮液接种叶片（对叶片造成伤口前提下）,均可以产生典型症状，并可以再分离得到与之相同的菌株,由此可知ZT-1菌株为该病害的病原菌。2、病原菌的鉴定以对病原菌产孢表型与孢子及菌落形态的观察为基础，对ZT-1菌株的3个基因位点序列ITS与gpd和TEF进行分析，经PCR扩增并测序并在Genbank中Blast后，利用DNAMAN软件构建系统发育树。结果显示与ZT-1同源性最高的种中有且仅有Alternariaalternata在三个系统发育树中同时出现。根据形态学的观察结果：在PCA滤纸上，25℃，12h光照和12h黑暗交替条件下，培养5d，产孢表型呈矮树状，在分生孢子的侧面和基部产生1-5个孢子的孢子链；分生孢子倒棒状、倒梨形、卵形、广椭圆形，孢身22-51×8-13m，具有1-5个横膈膜和0-3个纵、斜隔膜。与Alternariaalternata小孢子种形态一致。由此可知引起该病害的病原菌为链格孢菌Alternariaalternata（Fr.:Fr.）Keissler，将该病害定名为紫藤叶斑病。3、病原菌的生物学特性病原菌ZT-1菌丝在10-35℃温度范围内均能生长，最适生长温度为28℃，致死温度为55℃，10min。菌丝在pH4-10的条件下均可生长，菌丝生长的最适pH为6。光照利用病原菌菌丝生长，在无碳或氮源条件下均可以生长，但是在以葡萄糖和淀粉为碳源，以蛋白栋和牛肉膏为氮源时生长最好。其中氨态盐对菌丝生长有抑制作用。分生孢子在10-35℃温度范围内均能够萌发。在5-29℃随着温度的升高，孢子萌I 发率逐渐增加，最适萌发温度为29℃，致死温度为55℃，10min。在pH3-10范围内均可以萌发，最适pH为6.2。光照对孢子萌发影响差异不显著，最适碳源为蔗糖、麦芽糖、果糖和葡萄糖。4、杀菌剂对病原菌的毒力作用供试的10种杀菌剂对病原菌菌落的生长都有一定的抑制作用，吡唑醚菌酯的EC50最小，为0.0777g/mL,对菌丝的抑制作用最强。对该病原菌的抑制效果最差的是嘧菌酯和多菌灵，其两者的EC50值均高于1000g/mL。供试的10种杀菌剂对病原菌的分生孢子萌发都有一定的抑制作用。苯醚甲环唑作用效果最强，EC50为0.3513g/mL，多菌灵抑制效果最差，其EC50为16270.5916g/mL。关键词：紫藤，叶斑病，病原菌鉴定，链格孢，生物学特性，毒力作用II AbstractWisteria(Wisteriasinensis(Sims)Sweet.)belongstowoodenvineofbeanWisteria,isafamousgreenornamentalgardenflower.Wisteriaownsornamentavalue,medicalvalueandenvironmentalprotectionvalueofthree,ithasaveryhighpotentialresearchvalue.Asthegrowthofthewisteriaacreage,manyfungaldiseasesoccuronWisteriaundernaturalhabitats.EspeciallytheWisterialeafspotdieasesoccurincommon,seriouslylowertheornamentalvalueofWisteria,Itcanleadthewholeplantleaveswitherandevenbringdevastatingharmonwisteriawhenitbadlyspread.ButfewreportaboutresearchofWilterialeafspotdieseasebothinChinaandabroad.Inordertoeffectivelycontroltheexpansionandspreadofthedisease,toguaranteethesustainabledevelopmentofornamentalplantsandlandscapeindustry,iturgentneedtoconductacomprehensiveinvestigationandidentificationofwisterialeafspotdisease.ThisresearchfirstlycollectedtheleaveswithtypicaldiseasespotfromChizhoucityandHuoqiucountyinAnhuiprovince,nextseparatedandpurifiedpathogenicbacteriafromthetypicaldiseasedleaves,thenidentifiedwhichkindthetruepathogenicfungibelongtofrompathogenicdeterminationandmorphologyandmolecularbiologyidentification.Afterthat,studiedthebiologycharacteristicofthepathogensanddothefungicidetoxicitymeasurement,tolookforwardtolaytheoreticalbasisfordiseasepreventionandcontrol.Themainresultswereasfollows:1.SeparationofpathogenicfungiandpathogenicdeterminationThisstudycollectedtheleaveswithtypicaldiseasespotfromChizhoucityandHuoqiucountyinAnhuiprovinceinAugust2014.accordingtotheconventionalseparationmeathod,2fungistrainswerediscoveredandbothofthemhavesamecolonymorphology,thetwofungistrainswererespectivelynumberedZT-1andZT-2.ThisresearchselectedforZT-1straintodothepathogenicdetermination.Theresultsshowedthatbothmyceliablockandconidialsuspensioninoculatedonheathyleaves(premisethatmakewoundontheblade)canproducetypicalsymptomsontheleaves.Andthesamefungusstraincanbeisolatedfromthediseasedinoculatedleaves,whichcanprovethatthefungistrainZT-1isthepathogenicfungiofWisterialeafspotdisease.2.IdentificationofthepathogenBasedontheobservationofpathogenicsporesphenotypeandthemorphologymorphologyofcondiaandcolony,analysedwithITS、gpdandTEFthreegenesequencesofZT-1strainandwithDNAMANsoftwaretoconstructphylogenetictreeaccordingtotheIII resultofGenbankBlastafterPCRamplificationandsequencing.TheresultsshowedthatAlternariaalternataownsthehighesthomologywithZT-1foronlythiskindappearsinthethreephylogenetictreesatthesametime.Accordingtomorphologicalobservation:onthefilterpaperwithPCA,25℃,12hlightand12hdarkcultivating5days,sporulationpatternsappearsinshorttree,everyproducedconidumchainalwaysincludes1-5conidiaanddeffierentcondiumchainscanbediscoveredinthebaseandsidesoftheconidium;Conidialikedownrod,invertedpear-shaped,ovoid,broadlyelliptic,bodyofcondium22-51×8-13m,with1-5diaphragmand0-3verticalorinclineddiaphragm.AndZT-1hasthesamemorphologicalfeatureswithAlternariaalternata.SothepathogenleadtotheleafspotdiseaseisAlternariaalternata(Fr.:Fr.)Keissler,thediseasewasnamedWisterialeafspotdiease.3.BiologicalcharacteristicsofpathogenHyphaeofpathogenZT-1cangrowintherangeof10-35℃,theoptimumgrowthtemperatureis28℃,lethaltemperatureis55℃,10min.HyphaecangrowundertheconditionofpH4-10,theoptimumpHforthegrowthispH6.Hyphaeofpathogengrowfasterundercontinuousilluminationconditionsthannolightorlackoflight.Itcangrowintheabsenceofcarbonandnitrogensources.Butwhenglucoseandstarchascarbonsource,orproteinbuildingandbeefextractasnitrogensource,hyphaehaveabettergrowththanothercarbonsourcesornitrogensources.Theammoniacalsalthaveinhibitoryeffectonmycelialgrowth.ConidiaofZT-1areabletogerminateinrangeof10-35℃.Withtheincreaseoftemperaturebetween5-29℃,theconidiagerminationrateisgraduallyincreasing,theoptimumgerminationtemperatureis29℃,lethaltemperatureis55℃,10min.ItcangerminatewithinthescopeofpH3-10,theoptimumpHis6.2.Conidiaappearhighergerminationrateundertheconditionofcontinuousilluminationthannolightorlackoflight,theoptimalcarbonsourcesissucrose,maltose,fructoseandglucose.4.FungicidestoxicityfunctionforpathogenicfungusThe10kindsoffungicidesselectedforinhibitingthegrowthofpathogenicbacteriacolonyhavedifferentinhibitoryeffects.Pyraclostrobinhasthestrongestinhibitoryeffectonthegrowthofmycelium,itsEC50is0.0777g/ml,thesmallestoneof10fungicides.Theworstinhibitioneffectonthepathogenisazoxystrobinandcarbendazim,bothoftheirEC50valuesaremorethan1000g/ml.The10kindsoffungicidesselectedforinhibitingconidialgerminationofpathogenhasdifferentinhibitoryeffect.Difenoconazoleappearsthebestinhibitoryeffect,itsEC50IV valuesis0.3513g/mL,carbendazim’sinhibitingeffectistheworst,theEC50is16270.5916g/mL.Keywords:Wisteria，leafspotdisease，pathogenidentification，Alternariaalternata，biologicalcharacteristics，toxicityfunctionV 目录摘要..................................................................................................................................IAbstract.........................................................................................................................III目录..................................................................................................................................VI1文献综述.........................................................................................................................11.1.1紫藤的生物学特性.......................................................................................11.1.2紫藤的药理作用及临床应用价值...............................................................11.1.3紫藤的观赏价值...........................................................................................11.1.4紫藤的主要病害...........................................................................................21.2链格孢属真菌的研究进展......................................................................................21.2.1链格孢属真菌的经济重要性.......................................................................21.2.2链格孢属的分类历史概述...........................................................................21.2.3链格孢的属级特征......................................................................................31.2.4链格孢属的种级分类研究进展...................................................................31.2.5分子生物学应用于链格孢属种级分类的研究进展...................................41.2.6链格孢的室内药剂筛选...............................................................................52引言..................................................................................................................................62.1研究目的及意义......................................................................................................62.2主要研究内容..........................................................................................................63材料与方法....................................................................................................................73.1材料..........................................................................................................................73.1.1供试病原菌...................................................................................................73.1.2供试植物.......................................................................................................73.1.3供试培养基...................................................................................................73.1.4供试实验器材...............................................................................................73.1.5供试药剂.......................................................................................................73.1.6供试试剂.......................................................................................................73.2紫藤叶斑病的病原菌分离纯化及致病性测定.....................................................73.2.1病原菌的分离及纯化...................................................................................7VI 3.2.2病原菌致病性测定.......................................................................................73.2.3病原菌的再分离...........................................................................................93.3紫藤叶斑病的病原鉴定..........................................................................................93.3.1病原菌形态学鉴定.......................................................................................93.3.2病原分子生物学鉴定...................................................................................93.4紫藤叶斑病病原生物学特性研究........................................................................103.4.1不同培养基对病原菌菌丝生长的影响.....................................................103.4.2不同温度对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响.....................................103.4.3病原菌菌丝及孢子致死温度的测定........................................................113.4.4不同pH对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响.......................................113.4.5不同光照条件对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响.............................113.4.6不同碳源对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响.....................................113.4.7不同氮源对病原菌菌丝生长的影响........................................................123.5杀菌剂对病原菌的室内毒力测定........................................................................123.5.1不同杀菌剂对紫藤叶斑病病原菌菌丝生长的影响.................................123.5.2不同杀菌剂对紫藤叶斑病病原菌分生孢子萌发的影响.........................124结果与分析..................................................................................................................134.1紫藤叶斑病症状....................................................................................................134.2病原菌的分离纯化及菌落形态............................................................................134.3病原菌致病性与柯赫氏法则验证........................................................................134.3.1室内离体叶片接种.....................................................................................144.3.2室外活体叶片接种.....................................................................................144.4紫藤叶斑病病原菌的鉴定...................................................................................154.4.1病原菌的形态............................................................................................154.4.2病原菌的分子生物学鉴定........................................................................154.5病原菌的生物学特性............................................................................................194.5.1不同培养基对菌菌丝生长的影响.............................................................194.5.2温度对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响.............................................204.5.3病原菌菌丝及孢子致死温度的测定.........................................................214.5.4不同pH值对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响...................................214.5.5不同光照条件对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响.............................22VII 4.5.6不同碳源对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响.....................................234.5.7不同氮源对病原菌菌丝生长的影响.........................................................244.6杀菌剂对病原菌的毒力作用................................................................................254.6.1不同杀菌剂对菌丝生长的影响................................................................254.6.2不同杀菌剂对分生孢子萌发的影响.........................................................255讨论.................................................................................................................................275.1病原菌的分离与鉴定............................................................................................275.2病原菌生物学特性的研究....................................................................................275.3不同杀菌剂对病原菌的毒力作用........................................................................286结论................................................................................................................................316.1病原菌的分离与致病性........................................................................................316.2病原菌的鉴定........................................................................................................316.3病原菌生物学特性................................................................................................316.4杀菌剂对病原菌的毒力........................................................................................32参考文献...........................................................................................................................33附录.....................................................................................................................................37致谢.....................................................................................................................................38作者简介...........................................................................................................................39VIII 1文献综述1.1紫藤概述紫藤〔Wisteriasinensis(Sims)Sweet.〕别称藤萝、藤花、黄环、绞藤、朱藤[1]。为豆科紫藤属落叶木质大藤本,是著名的园林环保花卉。它的花叶果的观赏价值很高，得到古今中外各路文豪的赞美。紫藤原产原产于东亚和北美东部，我国南北气候均适合紫藤生长，在全国多数地区均有栽培,在我国已有两千多年栽培史。作为药用植物其医疗价值已得到广泛肯定，具有抗氧化、凝集、抑菌、抗肿瘤、蛋白酶抑制等活性[2]。紫藤叶片还对于二氧化硫、氯气、氯化氢等有毒气体具有很强的吸收能力。紫藤集观赏、医疗、环保价值于一身，具有极高的潜在研究价值。我国现有栽培的品种和变种有：短齿紫藤、多花紫藤、白花藤萝、藤萝、美国藤、丰花紫藤、重瓣紫藤、白花紫藤(银藤)、乌龙藤等[1,3]。1.1.1紫藤的生物学特性紫藤生长期为3-12月。花梗密被黄褐色柔毛；花粤宽针状，花冠紫色或深紫色；种子灰褐色，扁回形。花期4-5月(有的在9月也可开花)[5]，果期5-10月。木质茎粗壮，干皮灰白，表面皮孔明显。芽外被深褐色的鳞片，茎皮灰黄褐色。叶片着生方式为羽状复叶，每串叶片数为奇数，卵状披针形或长圆形[3,4,6]。紫藤为暖带和温带植物,喜阳光，耐寒、耐寒、耐盐碱、耐水湿，生命力旺盛。疏松、湿润、肥沃的砂质土壤中适合紫藤的生长[3,4]。1.1.2紫藤的药理作用及临床应用价值(1)抗氧化作用紫藤花中的酚类物质、黄酮类化合物具有清除自由基的作用[7]。(2)凝集作用紫藤中提取的凝集素类物质，可凝集各种血型。在临床免疫及细胞遗传研究中有一定的应用前景[8,9]。(3)抑菌作用紫藤叶片丙酮溶剂提取物对细菌性病害具显著的抑制作用，作为新型环保的植物源抑菌剂，其将会有很大的绿色防控应用前景[10,11]。(4)抗肿瘤作用经研究发现，多花紫藤的胆汁提取物可以限制小鼠黑色素瘤B16F1细胞的转移[12]。紫藤黄酮可以起到抑制皮肤肿瘤的作用[13]。紫藤的茎、皮、花、果均可入药。茎、皮入药，止痛杀虫。花性味甘、微温，入药利小便。根性味甘，温，入药活络筋骨，治风湿骨痛。果实性味甘、微温，有小毒，入药治筋骨疼痛[14,15]。于金平等[15]还提出了用紫藤治疗治关节炎、腹痛烧虫病和腹水肿胀的三种紫藤入药方法。1.1.3紫藤的观赏价值《花经》中“紫藤”篇中说道:“瞻彼屈曲蜿蜒之状，有若蛟龙出没波涛间;…坐卧其1 下，浑可忘世”。高度赞扬紫藤，在其下坐卧，恰似人间仙境，而脱离尘俗，忘却事件万物。古往今来，咏赞紫藤的脍炙人口的名篇层出不穷。唐代李德裕《忆新藤》：“遥闻碧潭上，春晚紫藤开。水似晨霞照，林疑彩凤来”。体现了紫藤的无限美妙和无穷的魅力。当代作家宗璞在其散文《紫藤萝瀑布》用了及其细腻的修辞手法赞美了紫藤花开的可爱，以及对生命的强烈渴望。紫藤的美丽及其观赏价值之高，受到古今人们的高度认可。如今上海市闵行区紫藤棚镇有一颗藤围达165cm，至今已有近500多年历史，躯干苍劲粗壮,有蟠龙腾空之势的古紫藤，传说由明代正德年间文人董宜阳所种植[1]。每逢春夏之际，这里便成为上海市民及国内外游客前来观景摄影的好去处。1.1.4紫藤的主要病害目前国内外对紫藤病害的报道较少，危害紫藤的病害主要有菌核病、炭疽病、紫藤脉花叶病、叶斑病等，紫藤菌核病可使根皮腐烂变成褐色，并生有黑色菌核。紫藤炭疽病初生黑色或黑褐色圆形小斑点，后病斑上产生大量橙红色粘状粒点；紫藤花叶病由病毒引起，叶片侧脉变黄或明脉，可致叶片畸形。紫藤叶斑病初发生时形成黄色小点后逐渐扩大变为黑褐色，病斑周围出现黄色晕圈。1.2链格孢属真菌的研究进展1.2.1链格孢属真菌的经济重要性链格孢属（AlternariaNees）属于半知菌丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目，暗色菌科。在自然界中分布广泛，对生态环境和寄主的适应性强，既是引起植物病害的重要真菌类群之一又是常见的腐生菌[16]。现已报道的链格孢菌可侵染危害包括玉米、小麦、烟草、马铃薯、核桃、苹果、梨等在内的几十种农业经济作物，引发病害，给农业生产和贮运中的农产品造成重大损失[17,18]。在美国，由瓜链格孢Alternariacucumerina侵染危害甜瓜和西葫芦引起的的叶斑病，给产量造成严重的损失[19]。在美国伊利诺伊州，细极链格孢A.tenuissima侵染当地大豆引发的猝倒病，曾致使大豆的产量损失达15%[20]。世界各主要烟草种植区，主要是由长柄链格孢A.longipes感染引起而大面积发生的烟草赤星病，在烟叶成熟时危害，影响烟草的成熟度，外观等级和内在质量[21]。在我国南方的马铃薯和番茄的早疫病，由茄链格孢(A.solani)引起，危害番茄的叶、茎和果实，严重时可造成50%以上的产量损失。在我国华北、西北、东北等地区大爆发的大白菜等十字花科蔬菜黑斑病，造成严重的经济损失[22]。2010年，由Alternariaalternata侵染造成的枣果黑斑病在南疆多个地区的枣园中大面积发生，使得整个农一师的商品果平均产量损失达到30%-60%[23]。在远东地区的日本和韩国，人参链格孢菌产生的黑斑病给经济造成了严重损失[24]。综上所述，链格孢在农业生产上有着重大的影响，与我们人类的生产、生活息息相关。1.2.2链格孢属的分类历史概述2 链格孢属Alternaria是C.G.Nees以细链格孢(A.tenuis)为模式种建立起来的[25]。自该属建立起来，其分类地位经过了多次改变。1832年，Fries将Nees描述的A.tenuis作为色串孢(Torulaalternate)的异名。Fries还以Macrosporiumcheiranthi(Libert)Fr.,M.convallariae(schumacher)Fr.,M.tenuissimum(Nees)Fr.,M.caricinumFr.为基础，建立了新属MacrosporiumFr.[17],并没有给予定义准确的概念，以至于在之后的100年间概念混乱。Elliott[26]指出真菌分生孢子的典型特征是棒状，长喙，孢子链特征表现不稳定，受到人类活动和环境条件的影响较大，此观点促进了现代链格孢属概念的形成。1912年，Keissler把A.tenuis和T.alternate组合为AlternariaalternateKeissl.nov.nom。Wiltshire[27]总结了Nees(1816)，Corda(1840)，Saccardo(1881)，Elliott等人的观点之后，经过发展，才有了今天所描述的现代概念。1.2.3链格孢的属级特征人工培养条件下，菌落通常初为无色，后为青褐色至暗褐色，菌落直径通常等长。分生孢子褐色或青、黄褐色，倒棒状、倒梨形、卵形或椭圆形，表面光滑或具疣、刺，具有若干横、斜隔膜。菌丝淡色至褐色，分隔。分生孢子梗分枝或少分枝，直立或弯曲，单生或簇生；喙分隔或不分隔，色淡，有时转化为假喙，并产孢，可形成短或长、分枝或少分枝的孢子链[28]。1.2.4链格孢属的种级分类研究进展孙霞在其博士论文中再次指出由于Alternaria的培养特性容易受到环境条件和培养条件的影响而发生较大的变异[29]，使得该菌容易鉴定到属却很难鉴定到种。Simmons认为若使分类研究有较大准确性和科学性，必须在一致培养条件下培养[30,31,32]。在中国，张天宇（2003）经过长期研究，也试图找出一套“标准培养条件”，对他们所有采集到的种在“标准条件下”进行比较，却发现许多小孢子种在相同培养条件下有形态趋同的趋势，不少大孢子种在培养条件下的形态与在自然基质上常有很大不同。故而找到能够适应所有种去表现各自性状特征的“标准条件”是不可能的。在实际操作中，并不像Simmons所描述的那样简单，有很多不确定因素，仍然很难将一些孢子鉴定到种。张天宇认为在适宜条件下（自然条件或自然基质）生长的菌株能够充分表现种级自身的形态特征，针对以此产生的多份标本进行类比，再分类，这样会更加可靠[17]。随着分子生物学技术的飞速发展，许多分子生物学技术和方法被广泛地应用于Alternaria的分类研究，在分子水平推断Alternaria的种的所属得到空前的发展与提高。自分子生物技术广泛流行之初，便有人利用同工酶和限制性片段长度多态性(RFLP)分析、随机扩增多态性(RAPD)分析、核糖体DNA序列分析等[28,33,34,35]进行分子生物学在菌类种属间的分类初探。近几年来，由于DNA自动测序技术的快速发展，3 基因序列分析以其成本低、耗时短、准确性高等绝对优势，在Alternaria的分类研究中应用潜力巨大[36,37]。1.2.5分子生物学应用于链格孢属种级分类的研究进展Jasalavich等(1995)对从十字花科植物上分离的四种链格孢菌的18srDNA，5.8srDNA和ITS区的基因进行分析，发现rDNA序列分析可以作为一有效辅助手段应用于是链格孢种级分类的研究。Kusada和Tsuge(1995)对链格孢菌株DNA的ITS1和ITS2的之间序列进行PCR扩增测序并进行系统发育分析，表明该方法可以明确区分大孢子种与小孢子种。何劲、康冀川等（2009）使用通用引物ITS4和ITS5对34个菌株进行ITS基因序列的分析，发现ITS序列分析法可为链格孢属的分子生物学鉴定提供理论依据[38]。当然，也有许多其他研究结果表明仅利用ITS基因序列分析，不能明确区分多数形态学极其相似的小孢子种和部分大孢子种[37-41]。仅通过单一基因序列进行系统发育关系分析，并不可以得到明确的结果。故而，更倾向于采用多基因位点序列联合分析对链格孢属真菌进行种类鉴定。目前广泛使用的基因序列有核糖体DNA（rDNA）的内部转录区间（internaltranscribedspacerregions1and2intervening5.8snrDNA,ITS)[42]、甘油醛-3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,gpd)和翻译延伸因子1-α（translationelongationfactor1-alpha,TEF或EF1-α）。还包括Alta1过敏原(Alternariamajorallergengene,Alta1)[43]、线粒体核糖体DNA和内聚半乳糖醛酸酶(endopolygalacturonase,endoPG)[44]、细胞核核糖体DNA小亚基和大亚基(the18SrDNAgeneandthe28SrDNAgene,SSU和LSU)[45]、质膜腺苷三磷酸酶(plasmamembraneadenosinetriphosphatase,ATPse)[46]、RNA聚合酶第二大亚基(RNApolymerasesecondlagestsubunit,RPB2)、几丁质合成酶(chitinsythase,CHS)、激动蛋白(actin,ACT)、微管蛋白(β-tubulin,BT1和BT2)[47,48]和钙调蛋白(calmodulin,CAM)。Park等(2008)利用EF1-α、BT1、Alta1和gpd这4个基因序列进行联合分析，明确了两个形态相似种系统发育关系。Lawrence等(2014)用ITS、gpd和ATPse三个基因序列对infectoria组进行联合分析，明确了该组内种间的遗传关系。Gannibal等[49]利用Alta1、gpd和CAM序列分析，在遗传关系上证明了所供试的两个大孢子种属于不同的种。综上所述，多基因序列分析可以明确区分部分形态相似种以及多数大孢子种。分子生物学方法以其成本低，用时短，可从本质上去认识了解各菌株的遗传差异。使得其在链格孢属种内及种间的鉴定工作中正在逐渐被重视。虽然通过多基因序列分析仍然不能够很好地区分鉴别一些形态学相似的Alternaria小孢子种，但是随着分子生物学技术在真菌分类领域的进一步的渗透发展，更多的特异性基因位点将被发现并被利用。作为链格孢属种级形态学鉴定的强有力补充，在以后的研究中还将还会发挥巨大4 的作用。帮助科研工作者发现解决现阶段乃至历史所遗留的种级分类的有争议性的难题。1.2.6链格孢的室内药剂筛选龙亚琴[50]（2009）对金刚藤叶斑病分离得到的病原菌Alternarialongipes进行室内药剂筛选，结果为10%的苯醚甲环唑的抑制效果最好，代森锰锌，百菌清和多菌灵的抑制效果较差。王龙[51]（2007）对其所分离万寿菊叶斑病病原菌Alternariasp.进行的药剂防治研究结果表明50%的异菌脲可湿性粉剂和75%的百菌清对该病原菌有较理想的抑制效果，70%的甲基托布津抑制效果较差。王志霞等[52]（2013）对新疆枣黑斑病的主要病原菌链格孢菌Alternariaalternata进行药剂防治的研究，发现70%的代森锰锌的抑制效果最好。本文共选择10种药剂对紫藤叶斑病所分离病原菌进行室内药剂的筛选，此10中杀菌剂分别属于现代选择性杀菌剂的甲氧基丙烯酸脂类杀菌剂（吡唑醚菌酯、嘧菌酯）、甾醇生物合成抑制剂及其复合物（丙环唑、苯醚甲环唑、咪鲜胺锰盐等），传统多作用位点杀菌剂如有机硫类杀菌剂（代森锰锌）和芳烃类杀菌剂（百菌清）。选择以上各种类杀菌剂进行实验，可以更为方便全面地比较各种不同类型杀菌剂对病原菌的抑制作用，更为有效地筛选适合的药剂。5 2引言2.1研究目的及意义紫藤〔Wisteriasinensis(Sims)Sweet.〕别称藤萝、藤花、黄环、绞藤、朱藤[1]。为豆科紫藤属落叶木质大藤本，是著名的园林环保花卉。它的花叶果的观赏价值很高，得到古今中外各路文豪的赞美。作为中药其药用价值极高，可用于治疗关节炎、腹痛烧虫病、腹水肿胀等顽固性疾病，多花紫藤的胆汁提取物甚至对肿瘤能够起到很好的抑制作用。紫藤叶片对二氧化硫、氯气、氯化氢等有害气体具有吸收能力，抗污染能力特别强。紫藤集观赏、药用、环保价值于一身，具有极高的潜在研究价值。随着人类科技水平的提高，其更多的药用机理及各种潜在价值将被人们进一步发现、研究并利用。紫藤对于人类而言，无疑是块珍宝。随着紫藤种植面积的扩大，紫藤所发生的病害也需要得到更多的重视。笔者走访安徽省南方城市紫藤种植区调查发现，自然生境下紫藤真菌性病害多有发生。紫藤叶斑病发生较为普遍。该病害可致叶片遍布黄点，严重影响紫藤的美观。发病严重时可至全株叶片枯死，对紫藤可造成毁灭性危害。但有关对紫藤叶斑病病原的研究，目前国内外未见相关报道。为了有效防控该病害的扩展和蔓延，保证观赏植物及园林产业的可持续发展，迫切需要对紫藤叶斑病进行全面的调查和鉴定。因此本试验采集紫藤典型叶斑病病叶，进行分离纯化并利用柯赫氏法则进行致病性研究，找到病原菌。对其进行形态学以及分子生物学鉴定，明确病原的种类及其分类地位[53]。研究病原的生物学特性和药剂毒力，以期待做到有效预防和控制病害的发生，为病害的进一步防治奠定理论基础。2.2主要研究内容（1）病害症状诊断及致病性测定①病害症状观察②柯赫氏法则验证（2）病原菌的形态学以及分子生物学鉴定①病原菌产孢表型以及分生孢子的形态学观察②利用ITS、gpd、TEF-1三个基因位点序列分析鉴定病原菌所属种（3）病原菌生物学特性的研究（4）10种杀菌剂对病原菌的毒力测定6 3材料与方法3.1材料3.1.1供试病原菌分离自从安徽省霍邱县和池州市的紫藤叶斑病病叶，4℃冰箱保存3.1.2供试植物紫藤健康叶片，采自安徽农业大学校林学院3.1.3供试培养基见附录。3.1.4供试实验器材见附录。3.1.5供试药剂10%苯醚甲环唑（世高）WG，先正达（苏州）作物保护有限公司；75%肟菌·戊唑醇（拿敌稳）WG，德国拜耳作物科学公司；250g/ml嘧菌酯（阿米西达）SC，先正达（苏州）作物保护有限公司；50%咪鲜胺锰盐（使百功）WP，江苏辉丰农化股份有限公司；70%代森锰锌WP，利民化工股份有限公司；80%多菌灵WP，宁国市朝农化工股份有限公司；75%百菌清WP，陕西亿农高科药业有限公司；42.4%唑醚·氟酰胺（健达）SC，巴斯夫（中国）有限公司；250g/ml吡唑醚菌酯（凯润）EC，巴斯夫（中国）有限公司；250g/ml丙环唑EC，山东潍坊双星农药有限公司。3.1.6供试试剂70%酒精、1%升汞、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%酒精、通用引物ITS‐4和ITS‐5、特异性引物GPD与TEF、dNTP、TaqDNA聚合酶、EDTA、Biomiga公司产品2×TaqPCRMasterMix（产品编号：AT1101）、无菌水、超纯水3.2紫藤叶斑病的病原菌分离纯化及致病性测定3.2.1病原菌的分离及纯化于2014年8月在安徽省霍邱县和池州市采集具有典型叶斑病症状的紫藤叶片。按照常规组织分离法（方中达，1979）分离病原菌[54,55]。采用单孢分离法[55]对病原菌进行纯化，选出容易挑取的单孢子移入试管斜面PDA上4℃条件下保存。3.2.2病原菌致病性测定7 将纯化后的病原菌根据柯赫氏法则进行病原菌的致病性测定[56]。将所分离菌株进行编号，按照分离数量，依次编号为ZT-1、ZT-2···这种形式。取分离纯化后同类菌株中长势较好的菌株按照按照柯赫氏法则进行回接验证。致病力测试在紫藤叶片上进行。按照下列3.2.2.1和3.2.2.2接种方法进行接种试验，若接种发病症状与原发病症状相同，则再次采用3.2.1方法进行分离纯化病原菌，将分离得到的病原菌与原接种菌进行菌落形态以及分生孢子形态的比较，观察是否与接种菌株相同。进而确定该菌是否为紫藤叶斑病的病原菌。3.2.2.1室内离体叶片接种将纯化后保存在PDA斜面上的菌种接种在在PDA平板上，25℃培养8d。选择健康的紫藤叶片，用清水冲洗干净，70%酒精进行表面消毒、无菌水冲洗。进行伤口侵染的，利用灭菌的接种针在叶片主叶脉两侧针刺紫藤叶片形成创伤。在无菌条件下，将有创伤叶片至于已灭菌15cm培养皿中（培养皿内铺有湿润灭菌滤纸片以及湿润灭菌棉絮），每皿放置3个叶片，备用。(1)菌丝块接种：a、创伤接种：在培养了8d的纯化菌种菌落的边缘用打孔器打孔，每叶片用灭菌针刺两处伤口，取直径6mm菌丝块于叶片伤口处，接5个叶片，以在叶片伤口处贴湿润灭菌小滤纸片为对照。25℃恒温箱中保湿培养，3d后去菌丝块，连续10d观察发病情况。b、无创伤接种：挑取上述已经准备好的菌丝块，于叶片主叶脉两侧，与伤口侵染的放置位点相同，每株菌种接5个叶片，以在相同接种位点贴湿润灭菌小滤纸片为对照。25℃恒温箱中保湿培养，3d后去菌丝块，连续10d观察发病情况。(2)孢子悬浮液接种：a、创伤接种：向接种位点分别喷洒各菌株孢子悬浮液，以喷洒无菌水为对照。每处理组5个叶片。25℃恒温箱中培养，连续10d观察发病情况。b、无创伤接种：分别喷洒各菌株孢子悬浮液（接种位点与伤口侵染相同，但未造成伤口），以喷洒无菌水为对照。每处理组5个叶片。25℃恒温箱中培养，连续10d观察发病情况。3.2.2.2室外活体叶片接种：在室外选择健康叶片，用75%酒精表面轻轻擦拭消毒，无菌水冲洗2-3次，利用灭菌的接种针在叶片主叶脉两侧针刺紫藤叶片形成创伤，每个叶片两处伤口。（1）菌丝块接种：a、创伤接种：取6mm菌饼于叶片伤口处，并用保鲜膜缠绕覆盖，每处理5个叶8 片，每叶片两处接种位点，以在叶片伤口处贴湿润灭菌小滤纸片为对照。外套保鲜袋放入湿棉球保湿，3d后移去菌丝块，连续10d观察发病情况。b、无创伤接种：取6mm菌丝块，于叶片主叶脉两侧，与伤口侵染的放置位点相同，并用保鲜膜缠绕覆盖，每处理5个叶片，每叶片两处接种位点，在相同侵染位点贴湿润灭菌小滤纸片为对照。外套保鲜袋放入湿棉球保湿，3d后移去菌丝块，连续10d观察发病情况。（2）孢子悬浮液接种：a、创伤接种：分别向各接种位点喷洒各菌株孢子悬浮液（不产孢菌株以25℃摇床上液体培养5d的菌丝悬浮液代替），以喷洒无菌水为对照。每处理组三个叶片。外套保鲜袋放入湿棉球保湿，连续10d观察发病情况。b、无创伤接种：分别向接种位点喷洒各菌株孢子悬浮液（接种位点与伤口侵染相同，但未造成伤口），以喷洒无菌水为对照。每处理组三个叶片。外套保鲜袋放入湿棉球保湿，连续10d观察发病情况。3.2.3病原菌的再分离若接种的叶片与原病叶症状相同，将发病的叶片按照3.2.1的方法再次进行病原物的分离，再与原接种菌进行比较是否一致，完成柯赫氏法则验证。3.3紫藤叶斑病的病原鉴定3.3.1病原菌形态学鉴定将供试菌株接种到PDA平板上，于28℃培养箱中培养，连续10d观察菌落形态特征及分生孢子形态。链格孢种产孢表型的观察：将一滤纸片剪成比载玻片略小的长方形，中心剪约10mm*10mm的方孔,经过湿热灭菌后并烘干后，用无菌水润湿置于无菌载玻片上。在PCA上培养了6d的菌落边缘打取菌碟，将菌碟均匀涂抹于中央方孔周围，在25℃恒温12h光照/12h黑暗条件下保湿培养5d，在200倍显微镜下拍摄方孔內缘的分生孢子链，并测量分生孢子大小[17]。3.3.2病原分子生物学鉴定参照何劲等[38]以及Park等[33]的方法中采用ITS4和ITS5之间的ITS序列和另外两个基因位点甘油醛-3-磷酸（gpd）和翻译延伸因子1-α（TEF）进行PCR扩增并测序。并分别基于以上三个基因序列构建系统发育树，进行系统发育关系的综合分析。3.3.2.1病原菌DNA提取：[53]CTAB法提取病原物DNA，加入50LddH2O溶解；加入适量RNaseA去除RNA。3.3.2.2病原菌PCR扩增9 （1）病原菌ITS区、gpd与TEF基因区的PCR反应体系表1病原菌rDNA-ITS区、gpd与TEF基因区的PCR反应体系（40μL）Tab1.PCRreactionsystemintherDNA-ITSregion、gpdgeneregionandTEFgeneregion（40μL）组分用量（单位：）μL组分用量（单位：）μL组分用量（单位：）μLTemplate1Template1Template1引物ITS41引物gpd11引物TEF11引物ITS51引物gpd21引物TEF212×MasterMix202×MasterMix202×MasterMix20ddH2O17ddH2O17ddH2O17（2）病原菌ITS区、gpd与TEF基因区的PCR反应条件PCR反应条件：ITS区引物于94℃预变性90s，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸5min，冷却至25℃。引物GPD与TEF的PCR反应条件与ITS相同。3.3.2.3PCR产物测序取扩增产物5l用于琼脂糖凝胶电泳法检测并拍照。将出现明显特异性条带的PCR产物所剩余部分送至上海英捷维基公司进行测序。将测序后的核苷酸序列在GeneBank中Blast搜索相关序列，用DNAMAN软件进行比对并用邻接法构建系统发育树，确定真菌的分类地位。3.4紫藤叶斑病病原生物学特性研究3.4.1不同培养基对病原菌菌丝生长的影响配置PDA、PCA、PSA、CA、OMA和10%V8培养基上（配方如上述材料方法），用直径为6mm的打孔器在培养了5d的病原菌菌落边缘打取菌碟，将菌碟接种于上述培养基，每处理3次重复，于25℃恒温箱中培养，3d后用十字交叉法测量菌落直径，比较各培养基影响的差异。3.4.2不同温度对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响将已经接种了菌丝块的PDA培养基分别置于5、10、15、20、25、28、30、35和40℃不同温度梯度下培养，每处理3次重复，3d后测量菌落直径，比较各温度影响的差异。在PDA培养基上生长了9天的菌落表面加入适量无菌水，用三角玻璃棒在菌丝表面来回摩擦使孢子脱落，用三层纱布过滤得到分生孢子悬浮液，加入无菌水调制成每视野100个孢子左右（100倍镜下）。将凹玻片放于铺有湿润滤纸的15cm培养皿底，将200L孢子悬浮液滴于凹玻片上分别置于4、10、15、20、25、28、30、35和40℃不同温度条件下保湿培养，重复3次，14h后观察统计分生孢子萌发情况，计10 算孢子萌发率，比较不同温度的影响的差异。孢子萌发率=孢子萌发数/孢子总数3.4.3病原菌菌丝及孢子致死温度的测定取28℃培养5天的病原菌的菌碟于7个试管中，每管10个菌碟，放入水浴温度40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65和70℃，七个处理中水浴10min（1min预热），每个处理3次重复，即每皿放3个处理后的菌碟，2d后观察菌落生长情况。取1mL配好（100倍下100个孢子左右）的孢子悬浮液于1.5mL灭菌离心管中，将离心管分别放于45℃、50℃、55℃、60℃和65℃五个处理温度水浴10min后，迅速冷却，每处理各取200L于灭菌凹玻片上25℃恒温下保湿培养，重复3次，24h后观察孢子萌发情况。3.4.4不同pH对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响在无菌操作台上，用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液将已灭菌冷却至不烫手的PDA培养基（每瓶约50ml）的pH值调节至3、4、5、6、7、8、9、10和11，（每瓶一个pH梯度）并分别将每瓶调配好的不同pH的培养基倒入3个灭菌培养皿内，冷却凝固至室温，即为每处理三次重复。置于25℃恒温培养箱种培养5d，测量各菌落直径，比较不同pH影响的差异。在无菌操作台上，用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液将孢子悬浮液的pH分别调节至为3、4、5、6、7、8、9、10和11等9个梯度。取配置好的不同pH条件下的孢子悬浮液200L滴于凹玻片上，25℃保湿培养，每处理3次重复。12h后统计萌发孢子数，并计算孢子萌发率，比较不同pH对孢子萌发的影响。3.4.5不同光照条件对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响取菌饼接种于PDA培养基，置于全光照、全黑暗和光暗交替（12L/12D），25℃恒温箱中培养，每处理3次重复。5d后测量菌落直径，比较不同光照影响的差异。取200l已经调配好的孢子悬浮液于灭菌后的凹玻片上，分别置于全光照、全黑暗、光暗交替（12L/12D），25℃恒温保湿培养，每处理3次重复。16h后统计萌发孢子数，并计算孢子萌发率，比较不同光照对孢子萌发的影响。3.4.6不同碳源对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响以查彼（Zapek）培养基[17]为基础，以不加碳源为对照，用含有相当碳的不同碳源（甘油、乳糖、葡萄糖、淀粉、果糖、麦芽糖和蔗糖）代替其中的蔗糖，配成含有不同碳源的固体培养基。每处理3次重复，于25℃恒温培养，5d后测量菌落直径，比较不同碳源影响的差异。分生孢子悬浮液的制备方法同分生孢子悬浮液的制备方法同3.4.2。以含有相当碳为标准，分别称取甘油、乳糖、葡萄糖、淀粉、果糖、麦芽糖和蔗糖，加入无菌水11 配置成含有2%碳的溶液。取1ml孢子悬浮液与1ml各配置好的含不同碳源的溶液混合于灭菌后的2ml离心管，以加等量无菌水与孢子悬浮液混合为对照，取200l混合液于灭菌凹玻片中，于25℃恒温箱中保湿培养，每处理3次重复，1h后观察孢子萌发率，比较不同碳源对孢子萌发的影响。3.4.7不同氮源对病原菌菌丝生长的影响以查彼（Zapek）培养基为基础，以不加氮源为对照，用含有相当氮的不同氮源（尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出膏、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3和KNO3）代替其中的KNO3，配成含有不同氮源的固体培养基（1L查彼培养基加入17g琼脂）。每处理3次重复，于25℃恒温黑暗培养，5d后测量菌落直径，比较不同氮源对菌丝生长的影响。3.5杀菌剂对病原菌的室内毒力测定3.5.1不同杀菌剂对紫藤叶斑病病原菌菌丝生长的影响采用菌丝生长速率法，取适量供试药剂加入试管中，用无菌水稀释并配置成一定浓度梯度的药剂（根据预实验结果在不超过95%的抑制率范围内选取5个质量浓度梯度）。在无菌操作台上，取5ml配置好的各浓度梯度的药剂加入到冷却至约不烫手的45mlPD液体培养基中摇匀，平均倒入3个灭菌培养皿中，以加等量无菌水做空白对照。每处理重复3次。接种时注意先ck后以低向高药剂浓度梯度接种菌丝块。在培养皿表面标明接种日期，药剂名称及浓度，于25℃恒温箱内黑暗培养，4天后用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。利用DPS软件，计算各药剂对链格孢菌的毒力回归方程、相关系数和EC50值，并比较分析各药剂的毒力。抑制率=（对照菌丝净生长直径-处理菌丝净生长直径）/对照净生长直径*100%菌丝净生长直径=所测菌丝直径-菌碟直径3.5.2不同杀菌剂对紫藤叶斑病病原菌分生孢子萌发的影响采用凹玻片法[17]测定杀菌剂对分生孢子萌发的影响，将各药剂配置成一定的浓度梯度。用无菌水清洗在PDA培养基上培养10天的菌落的孢子，将孢子悬浮液浓度控制在100倍镜每视野100个左右（孢子过多加水稀释，过少则采用离心法取下层液重新配置）。分别取0.5mL各浓度梯度药剂与0.5mL孢子悬浮液等量混合于1.5mL离心管，以无菌水与孢子悬浮液等量混合为对照。取混合液100L于凹玻片，将凹玻片放于铺有湿润滤纸的培养皿底，每处理3次重复，25℃恒温保湿培养。24h后观察孢子萌发情况并计算孢子萌发率抑制率。（标准：芽管长度超过孢子长度直径一半）萌发抑制率=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100%[57]孢子萌发率=孢子萌发数/孢子总数利用DPS软件，根据浓度对数和孢子萌发抑制率几率值计算各药剂的毒力回归方程、相关系数和EC50值，并比较分析各药剂对孢子的毒力。12 4结果与分析4.1紫藤叶斑病症状紫藤叶斑病主要发生在叶片上，发病初期，叶片上会出现零星浅黄色小点，随后黄色部位颜色加深，并沿直径向周边延伸，扩展为圆形或近圆形病斑，最后病斑直径保持稳定，不再继续扩大，黄点中央位置转变为黑褐色，周围有明显黄色晕圈。尤其是发病后期严重影响紫藤的美观，可至大量叶片遍布枯斑而枯死。（图1）图1紫藤叶斑病症状Fig.1TypicalsymptomsofleafspotinChinesewisteria4.2病原菌的分离纯化及菌落形态采集典型紫藤叶斑病病叶，按常规的组织分离法进行分离。得到2株病原菌，经过培养观察，这两株菌具有相同的培养性状和形态特征。菌落均如图2所示。2株分离株在PDA培养基上菌丝初为无色，呈放射状扩展，菌丝颜色逐渐变为逐渐加深，后期变为灰褐色或墨绿色，菌落边缘均匀生长，菌落为圆形，边缘整齐，菌丝旺盛稠密。图2.分离菌株菌落形态（正反面）Fig.2Colonyofseparatedstrains（frontandback）13 4.3病原菌致病性与柯赫氏法则验证用ZT-1菌株按照柯赫氏法则进行回接。如图3和图4所示结果，取发病叶片，对其病斑进行再次分离纯化后，所得菌株菌落形态特征及产孢类型与ZT-1菌株一致，由此可以确定ZT-1为该病害病原菌。4.3.1室内离体叶片接种无论是离体菌丝块伤口接种还是离体孢子悬浮液伤口接种，Alternaria均能够引起紫藤叶片发病，菌丝块伤口接种发病明显。而对照不发病，如图3。取发病叶片病组织进行再分离纯化，培养性状与接种菌一致。被试菌株的无伤口接种（菌丝块接种与孢子悬浮液接种）均未造成叶片发病。AB图3.室内离体叶片接种ZT-1菌株5d和15d后发病症状（每张图的左为对照，右为处理）A：第5d发病症状B：第15d发病症状Fig.3SymptomsofChinesewisteriaaferinoculationwithseparatedfungusZT-1intheroomat5thdayand15thday(leftiscontrol,rightistreatmentineachpicture)A：Symptomsat5thdayB：Symptomsat15thday4.3.2室外活体叶片接种无论是离体菌丝块伤口接种还是离体孢子悬浮液伤口接种，ZT-1均能够引起紫藤叶片发病，菌丝块伤口接种发病明显，对照不发病，如图4。取发病叶片病组织进行再分离纯化，培养性状与接种菌一致。被试菌株的无伤口接种（菌丝块接种与孢子悬浮液接种）均未造成叶片发病。A2A1B1B2B1图4.室外叶片接种ZT-1菌株5d和15d后发病症状（A1和A2为对照，B1和B2为处理）Fig.4SymptomsofChinesewisteriaafterinoculationwithseparatedfungusZT-1atoutsideat5thdayand15thday(Athth1andA2：ControlB1andB2：Treatmentat5dayand15dayafterinoculation)14 4.4紫藤叶斑病病原菌的鉴定4.4.1病原菌的形态PCA培养条件下培养5d，分生孢子淡褐色至深褐色，倒棒状、倒梨形、卵形、广椭圆形，有的具有短柱状假喙，有的分生孢子孢身22-51×8-13m。具有1-5个横膈膜和0-3个纵、斜隔膜，分隔处不溢缩或者略溢缩。分生孢子梗单生或数根簇生，分隔，如图（5B）按照3.3.1的方法，显微镜下观察其产孢表型，如图（5A），产孢表型呈矮树状，在分生孢子梗的上部形成特征性的具短分枝的孢子链，在分生孢子侧面和基部也可以产生分生孢子支链，支链一般长1-5个孢子。孢子链上各孢子之间隔分不明显。结合上述4.2部分PDA培养基上菌落形态的观察，可初步判定ZT-1菌株属于链格孢属的小孢子种AlernariaAlternata。AB图5.产孢表型及分生孢子形态的观察（A：产孢表型B：分生孢子）Fig.5Observationofsporulationpatternsandconidium（A：sporulationpatternsB：conidium）4.4.2病原菌的分子生物学鉴定4.4.2.1凝胶电泳检测结果分析将分离纯化的ZT‐1真菌进行分子生物学的鉴定研究，利用EDTA法提取DNA后利用分光光度仪检测，纯度较高，可进行下一步的PCR扩增。采用通用引物ITS4和ITS5对该株菌株进行PCR扩增，570bp左右处有明显的特异性条带，且条带清晰明亮；采用引物GPD的PCR扩增引物在560bp左右出有明显特异性条带，且条带清晰；引物EF1扩增出的PCR条带在230bp处有明显特异性条带，条带清晰。可送样至测序公司测序。15 M1M1232000bp2000bp1000bp1000bp750bp750bp500bp500bp250bp250bp100bp100bp图6.ITS序列PCR扩增凝胶电泳图图7.gdp和TEF序列PCR扩增凝胶电泳图Fig.6ElectrophoresisresultsbasedonITSFig.7ElectrophoresisresultsbasedongpdandTEF4.4.2.2病原菌rDNA-ITS序列测序分析经PCR扩增，确定有特异性条带后，将其产物送至上海英捷维基公司测序，将测序结果用Seqman软件进行序列拼接，得到以下ITS序列。如下：菌株ZT‐1的rDNA‐ITS碱基序列：TTaTTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAAAAGTTGAAAAAAAGGCTTAATGGATGCTAGACCTTTGCTGATAGAGAGTGCGACTTGTGCTGCGCTCCGAAACCAGTAGGCCGGCTGCCAATTACTTTAAGGCGAGTCTCCAGCAAAGCTAGAGACAAGACGCCCAACACCAAGCAAAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCTTTGGAATACCAAAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAATTATTAATTTGTTACTGACGCTGATTGCAATTACAAAAGGTTTATGTTTGTCCTAGTGGTGGGCGAACCCACCAAGGAAACAAGAAGTACGCAAAAGACAAGGGTGAATAATTCAGCAAGGCTGTAACCCCGAGAGGTTCCAGCCCGCCTTCATATTTGTGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGAGACCTTGTTACGATTTTTTACTTCCAAA菌株ZT‐1的GPD基因区碱基序列：CGTCGCATTGGCCGTATCGTCTTCCGCAATGCGTAAGTTTCGCCTAACTCGTCGATACAATCTACCAGaAGCTGACCGCATGCCACAGTATCGAGCACAACGACGTCGACATTGTCGCCGTAAACGACCCCTTCATCGAGCCCCACTACGCTGTAAGCTTCCCCAAGCACCCACACTACAGCCGCGGCCATCCAAGTTGCGAAAACAGTCCTTGCGATGCGCTAGAGCTCCTCTGTGGTCGCAGAATGCAGGCTAACACATTCAGGCCTACATGCTCAAGTATGACAGCACACACGGCCAGTTCAAGGGTGAGATCAAGGTTGACGGCA16 ACAACCTGACCGTCAACGGCAAGACCATCCGTTTCCACATGGAGAAGGACCCCGCCAACATCCCATGGAGCGAGACCGGCGCTTACTACGTCGTCGAGTCCACCGGTGTCTTCACCACCACCGAGAAGGCCAAGGCTCACTTGAAGGGTGGAGCCAAGAAGGTCGTCATTTCTGCTCCCTCTGCTGACGCCCCCATGTTCGTTATGGGTGTCAACCACGAGACTTACAAGTCTGACATCGAGGTTCTCTCCAACGCCTCTTGCACAACC菌株ZT‐1的TEF1基因区碱基序列：TCATCGAGAAGTtCGAGAAGGTATGGCATCACTTTTCTTTCACGCGGCCTGTTGCGCCCACCCGGTGCTTTCTCTGAGCGCGTAGCCAAAGCCTGGCTTATCGCGATGAGGGGCATTTTTGGGTGGTGGGGATGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCCGCATGCGGCCTTCGCGAACTCCAACGCAATGACGCACATGTAATTTCCCCATTCTGGCCACAGCGAGCTAACAAGCCTCACAGGAAGCCGCCGAACTCGGTAAGGGtTCCCTTCAAGTAA4.4.2.3系统发育树的构建将测序结果在GeneBank数据库中Blast后，下载相似度最高，相似度最低一级相似度最高的三种真菌序列，利用软件DNAMAN做出如下系统发育。下图系统发育树中ZT‐1菌株与以上各菌株的同源性均达到了99%‐100%，很难区分ZT‐1属于哪一种链格孢。基于ITS区构建系统发育树不能够有效区分链格孢属下不同的种。0.05Alternaria_alternata（KU866390）Alternaria_tenuissima（KP324980）Alternaria_tenuissima（KP942908）Alternaria_alternata（KF438091）Alternaria_brassicae（JX290140）Alternaria_alternata（KP278185）Alternaria_alternata（KT192247）Alternaria_citri（DQ339104）Alternaria_citri（KT768146）Alternaria_brassicae（JN108903）Alternaria_alternata（KT819763）ZT-1_ITS.seq图8.ZT-1菌株菌株基于ITS序列构建的系统发育树Fig.8PhylogenetictreebasedonITSgenesequencesofStrainZT-1下图系统发育树基于gpd基因构建，ZT‐1菌株与树中的种的同源性也达到99%‐100%，很难区分ZT‐1属于Alternariaalternata([gbkp851965],[embLN864507])还是Alternariatenuissima([gbKT955743])，或者是Alternariasp.([gbJX960575],[gbJN634823],[gbJN634823])。17 0.05Alternaria_aff._arborescens[gbKP124267]Alternaria_alternata[embLN864507]Alternaria_alternata[gbKP851965]Alternaria_sp._H02-781S-3b[gbJX960575]ZT-1_gpd.seqAlternariatenuissima[gbKT955743]Alternaria_sp._M05-1561-5[gbJN634823]Alternaria_tenuissima[gbJN634819]Alternaria_gaisen[gbAY762954]Alternaria_alternata[gbKP851968]Alternaria_alternata[gbKP851969]Alternaria_tenuissima[gbAY278809]图9ZT-1菌株基于gpd基因序列构建的系统发育树Fig.9PhylogenetictreebasedongpdgenesequencesofStrainZT-1基于EF1基因构建的系统发育树，可以推测出ZT‐1与Alternariaalternata的同源性极高，在该系统发育树中与ZT‐1同源性最高的未出现Alternariatenuissima等在前两个基于ITS以及gpd基因构建的系统发育树中出现的与ZT‐1同源性较高的其他链格孢属小孢子种。系统综合基于ITS基因与GPD基因构建的系统发育树，与ZT‐1同源性最高的种中有且仅有Alternariaalternata在三个系统发育树中出现。0.05Lewiacf.infectoria（FJ214908）Alternaria_alternata[KF889267]Alternaria_alternata_[KF889268]ZT-1_TEF.seqAlternariaalternata[LN864506]Alternaria_sp._97L[KF889269]Stemphylium_lycopersic[AB828257]Alternaria_alternata[KJ830922]Alternaria_alternata[KP125165]Alternariaalternata[KT355704]Alternariagaisen[AY762954]图10.ZT-1菌株基于TEF-1基因序列构建的系统发育树Fig.10PhylogenetictreebasedonTEF-1genesequencesofStrainZT-1综上所述，通过ITS区序列分析可以得出ZT-1属于链格孢属，但是未能够区分到种，综合比较gpd以及TEF基因构建的系统发育树，有且仅有AlternariaAlternata18 在三个系统发育树种中以与ZT-1有着最高同源性出现，结合4.4.1形态鉴定结果，可以明确确定病原菌ZT-1菌株为Alternariaalternata（Fr.:Fr.）Keissler。4.5病原菌的生物学特性4.5.1不同培养基对菌菌丝生长的影响试验表明，菌丝在不同培养基上产生菌落的颜色及菌丝形态均有显著性差异。在OMA培养基上生长最为旺盛，其次是PDA和CA和V8培养基生长良好，其中在CA培养基上生长分菌落墨绿色较其他培养基重，OMA培养基上生长的菌落背面也呈现墨绿色，但是比CA的浅些。PDA、PSA以及V8培养基的颜色较为接近，菌落背面呈灰褐色，PCA的颜色最浅，菌丝生长最为薄弱。abcABCDEFdef图11.不同培养基上的菌落形态(A、a:OMA培养基B、b:CA培养基C、c:PSA培养基D、d：V8培养基E、e:PCA培养基F、f:PDA培养基)Fig.11coloniesmorphologyofA.alternataincubatedondifferentculturemedia(A、a:OMAmediaB、b:CAmediaC、c:PSAmediaD、d：10%V8mediaE、e:PCAmediaF、f:PDAmedia)图12不同培养基对菌丝生长的影响Fig.12Effectofdifferentdifferentculturemediaonmyceliumgrowth19 4.5.2温度对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响（1）温度对病原菌菌丝生长的影响试验结果表明，菌株ZT‐1病原菌菌丝在10‐35℃的温度范围内均能生长。最适生长温度为28℃，菌落的平均直径为33.17mm。温度在15℃以下及35℃以上菌丝将受到明显抑制作用。结果证明该病原菌适宜在高温条件下生存（见图13）图13.不同温度对菌落直径的影响Fig.13Effectofdifferenttemperatureonmyceliumgrowth（2）温度对病原菌孢子萌发的影响试验结果表明，分生孢子在10-35℃的温度范围内均能够萌发。在5-29℃随着温度的升高，孢子萌发率逐渐增加，在29℃分生孢子萌发率达到最高，萌发率超过95%，最适萌发温度为29℃。在20-35℃之间萌发率较高，低于15℃和高于35℃的条件下分生孢子萌发受到抑制。结果证明高温利于该病原菌分生孢子的萌发。（见图14）图14不同温度对孢子萌发的影响Fig.14Effectofdifferenttemperaturesonconidialgermination20 4.5.3病原菌菌丝及孢子致死温度的测定菌株ZT‐1在40℃、45℃和50℃水浴处理10min，在培养箱中均可以生长，在55℃及更高温度处理后不生长，故致死温度为55℃，10min。如下图（15）。菌株ZT‐1的分生孢子在经过45℃和50℃水浴处理10min恒温保湿培养24h后均可以观察到分生孢子萌发较高，而55℃及其以上温度处理没有观察到分生孢子萌发。故分生孢子的致死温度为55℃，10min。图15：各温度处理后培养2天后的菌落生长情况Fig.152days’growthofcoloniesafterthetreatmentwithdifferenttemperatures4.5.4不同pH值对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响（1）pH对病原菌菌丝生长的影响试验结果表明，病原菌ZT‐1在pH4‐10的条件下均可生长，最适宜菌丝生长的pH为6，菌落直径达为49mm。pH在4和11的条件下，菌丝生长受到明显抑制。结果证明该病原菌适于偏酸性环境下生长。（见图16）图16不同pH对菌丝生长的影响Fig.16EffectofdifferentpHvaluesonthegrowthofmycelium21 （2）pH对病原菌孢子萌发率的影响由图15可得，不同条件下的孢子萌发率有显著变化，在pH3‐10范围内均可以萌发，最适pH为6.2。在pH小于4，pH大于10的条件下，分生孢子萌发受到明显抑制。结果证明微偏酸性环境有利于分生孢子的萌发。（见图17）图17.不同pH对孢子萌发的影响Fig.17EffectofdifferentpHonconidialgermination4.5.5不同光照条件对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响（1）不同光照条件对病原菌菌丝生长的影响结果表明，菌丝生长在连续光照、光暗交替和连续黑暗条件下均有显著性差异。连续光照条件下菌丝生长最好，平均菌丝的直径达到了35mm，连续黑暗条件下菌丝生长最差，证明在白天更利于菌丝的生长。abc图18.不同光照条件对菌丝生长的影响Fig.18Effectofdifferentlightconditionsonmycelialgrowth22 (2）不同光照条件对病原菌孢子萌发的影响结果表明，在a=0.05水平上进行差异显著性分析，分生孢子在全光照条件、光暗交替及全黑暗条件下差异不显著，证明光照对分生孢子萌发的没有显著影响。aaa图19.不同光照条件对孢子萌发的影响Fig.19Effectofdifferentlightconditionsonconidialgermination4.5.6不同碳源对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响（1）不同碳源对病原菌菌丝生长的影响由图可知，病原菌对葡萄糖和淀粉的碳源利用效果最好，菌丝平均直径分别为55.83和53.00mm，此两者菌落菌丝较为稠密旺盛。与其它碳源对菌丝生长的影响均有显著差异。其中乳糖、果糖、麦芽糖三者的菌落长势相当，病原菌利用效果最差的碳源为甘油，菌落长势稀疏且菌丝直径不长。CK虽然有生长但是极为稀疏。图20不同碳源对菌丝生长的影响Fig.20Effectofdifferentcarbonsourcesonmycelialgrowth(2)不同碳源对病原菌分生孢子萌发的影响由图可知，不同碳源对病原菌分生孢子萌发的有显著性差异，蔗糖、麦芽糖、果糖和葡萄糖最适宜分生孢子的萌发，萌发后的菌丝粗壮。其中淀粉和乳糖的菌落长势23 相当，病原菌孢子萌发利用效果最差的碳源为甘油。aaaaababcbc图21不同碳源对孢子萌发的影响Fig.21.Effectofdifferentcarbonsourcesonconidialgermination4.5.7不同氮源对病原菌菌丝生长的影响图8结果表明，该病原菌在9种不同氮源和CK上均可以生长。其中该病原菌利用效果最好的是牛肉膏和蛋白栋，菌落平均直径分别为39.83mm和39.75mm，菌落长势旺盛且菌落直径长，与其它氮源差异显著。酵母浸出膏虽然与KNO3和NaNO3的菌落直径相当，但是菌丝生长较该两者硝酸盐旺盛。而具有NH+4离子的三种氮源对菌丝生长的抑制作用较大，菌丝的稀疏程度与ck相当却没有ck直径大，笔者分析原因很可能是NH+4水解使得溶液偏酸性而不利于菌丝生长。结果证明该病原菌对有机氮源的利用效果比无机氮源好。aaababababbccc图22不同氮源对菌丝生长的影响Fig.22Effectofdifferentnitrogensourcesonmycelialgrowth24 4.6杀菌剂对病原菌的毒力作用4.6.1不同杀菌剂对菌丝生长的影响由下表可以得出，供试的10种杀菌剂对病原菌菌落的生长都有一定的抑制作用（表2），其中250g/ml吡唑醚菌酯（凯润）乳油的的EC50最小，为0.0777g/mL,对菌丝的抑制作用最强。其次为50%咪鲜胺锰盐（使百功）可湿性粉剂和42.4%唑醚·氟酰胺（健达）悬浮剂，EC50分别为0.3458g/mL和0.4059g/mL；250g/ml丙环唑乳油与10%苯醚甲环唑（世高）水分散粒剂作用效果相当，EC50分别为0.8612g/mL和1.1456g/mL。75%肟菌·戊唑醇（拿敌稳）水分散粒剂（EC50为1.8984g/mL）虽然较前几种药剂稍次，但显著比70%代森锰锌可湿性粉剂（EC50为22.3499g/mL）和75%百菌清可湿性粉剂（EC50为26.4876g/mL）抑菌效果好；对该病原菌的抑制效果最差的是250g/ml嘧菌酯（阿米西达）悬浮剂和80%多菌灵可湿性粉剂，其两者的EC50值均高于1000g/mL。故通过室内毒力测定的结果可以简要概括为（按照效果比较）：凯润＞使百功＞健达＞丙环唑＞世高＞拿敌稳＞代森锰锌＞百菌清＞阿米西达＞多菌灵。4.6.2不同杀菌剂对分生孢子萌发的影响由下表可以得出，供试的10种杀菌剂对病原菌菌落的生长都有一定的抑制作用（表3）。10%苯醚甲环唑（世高）水分散粒剂作用效果，EC50为0.3513g/mL，其次为42.4%唑醚·氟酰胺（健达）悬浮剂，EC50为3.6125g/mL，75%百菌清可湿性粉剂（EC50为7.9092g/mL）较70%代森锰锌可湿性粉剂（EC50为15.3961g/mL）和250g/ml吡唑醚菌酯（凯润）乳油（EC50为28.8043g/mL）效果好，但是以上三者明显比50%咪鲜胺锰盐（使百功）可湿性粉剂（EC50为217.8509g/mL）、250g/ml嘧菌酯（阿米西达）悬浮剂（EC50为313.7709g/mL）、75%肟菌·戊唑醇（拿敌稳）水分散粒剂与250g/ml丙环唑乳油作用效果均较差EC50分别为627.6765g/mL和920.6877g/mL，80%多菌灵可湿性粉剂抑制效果最差，其EC50为16270.5916g/mL。故通过室内毒力测定的结果可以简要概括为（按照效果比较）：世高＞健达＞百菌清＞代森锰锌＞凯润＞使百功＞阿米西达＞拿敌稳＞丙环唑＞多菌灵。25 表2.不同杀菌剂对紫藤叶斑病菌菌丝的抑制作用Tab2EffectsofdifferentfungicidesagainstmyceliumgrowthofAlternariaalternata杀菌剂毒力回归方程相关系数抑制中浓度FungicideToxicregressionequationCorrelationCoefficientEC50（g/mL）80%多菌灵(多菌灵)y=0.3889+1.2874x0.993615811.40242.4%唑醚·氟酰胺（健达）y=5.3507+0.8967x0.96080.4059250g/ml丙环唑（丙环唑）y=5.0716+1.1034x0.94670.861275%肟菌·戊唑醇（拿敌稳）y=4.7203+1.0046x0.97231.898410%苯醚甲环唑（世高）y=4.9223+1.3159x0.97961.145670%代森锰锌（代森锰锌）y=3.8981+0.8167x0.920022.3499250g/ml吡唑醚菌酯（凯润）y=5.6745+0.6078x0.968028.804350%咪鲜胺锰盐（使百功）y=5.5412+1.1736x0.99780.345875%百菌清（百菌清）y=4.4213+0.4067x0.858426.4876250g/ml嘧菌酯（阿米西达）y=4.6338+0.0902x0.874211459.7581表3.不同杀菌剂对紫藤叶斑病菌孢子萌发的抑制作用Tab3EffectsofdifferentfungicidesonconidiagerminationofAlternariaalternata杀菌剂毒力回归方程相关系数抑制中浓度FungicideToxicregressionequationCorrelationCoefficientEC50（g/mL）80%多菌灵(多菌灵)y=1.8445+0.7493x0.839816270.591642.4%唑醚·氟酰胺（健达）y=4.5826+0.7484x0.98563.6125250g/ml丙环唑（丙环唑）y=3.8575+0.3854x0.8683920.687775%肟菌·戊唑醇（拿敌稳）y=3.7900+0.4325x0.9534627.676510%苯醚甲环唑（世高）y=5.2741+0.6033x0.97050.351370%代森锰锌（代森锰锌）y=3.2274+1.4929x0.962315.3961250g/ml吡唑醚菌酯（凯润）y=4.2342+0.5247x0.945828.804350%咪鲜胺锰盐（使百功）y=3.8571+0.4888x0.9748217.850975%百菌清（百菌清）y=4.3293+0.7468x0.90467.9092250g/ml嘧菌酯（阿米西达）y=3.5924+0.5638x0.9872313.770926 5讨论5.1病原菌的分离与鉴定经过病原菌的分离以及柯赫氏法则测定和形态学及分子生物学鉴定，本试验将所研究紫藤的叶斑病害定名为紫藤叶斑病，引起该病的病原物为Alternariaalternata（Fr.:Fr.）Keissler。本病害或许存在复合侵染的可能，但仍需进一步试验去验证。链格孢属易于鉴定到属而难于鉴定到种，对病原菌进行形态学鉴定时，一定要注意保证培养条件的一致性。Simmons认为只有在相同的培养条件下，再进行链格孢菌的研究和比较，分类研究才能有较大准确性和科学性。本文严格按照张天宇(2003)链格孢属种级分类方法，在PCA培养基上，25℃，12h黑暗与12h光照交替条件下培养5d，对产孢表型及分生孢子进行显微观察并记录[17]。结果显示产孢表型呈矮树状，在分生孢子的侧面和基部产生1-5个孢子的孢子链；分生孢子倒棒状、倒梨形、卵形、广椭圆形，孢身22-51×8-13mm，具有1-5个横膈膜和0-3个纵、斜隔膜，与Alternariaalternata小孢子种的产孢表型和孢子形态一致。在分子生物学鉴定时，由于单基因序列分析存在不完整性，多基因序列分析可弥补单基因序列分析的不足，对多基因位点综合分析，可以扬长补短，相辅相成，也益于对相似种间的正确界定[58]。故而本试验对ZT-1菌株的3个基因位点序列ITS与GPD和TEF进行联合分析，3个基因序列全称分别为核糖体DNA（rDNA）的内部转录区间（internaltranscribedspacerregions1and2intervening5.8snrDNA,ITS）、甘油醛-3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,gpd)和翻译延伸因子1-α（translationelongationfactor1-alpha,TEF或EF1-α）。将不同来源的数据合并起来进行分析的基础上构建系统发育树。本方法提高了利用分子生物学手段鉴定Alternaria属种的精度。总而言之，对Alerinaria孢子种的鉴定，目前仍需要形态学鉴定为主，分子生物学鉴定为辅，两者相结合的方法进行互补分析。目前多基因位点对链格孢属种的分子生物学鉴定技术得到空前提高，以其方便快速准确等优点受到广大科研工作者的青睐，相信未来会有更多的新技术应用于疑难小孢子种的鉴定工作中，人类对链格孢属种的分类也会有更深层的认识及讨论。5.2病原菌生物学特性的研究病原菌菌丝生长及孢子萌发的最适温度为28-29℃，最适宜pH为6-6.2，光照对菌丝生长有促进作用，对孢子萌发无显著影响，其中氨态盐对菌丝生长起到的抑制作用。综合致病性侵染试验的过程，高温高湿利于紫藤叶斑病的发生，尤其是夏天雷阵雨过后，满足了病原菌侵染的伤口、温度、湿度以及pH各种条件。雨后施加叶面氮27 肥对紫藤叶斑病有抑制作用。该菌株对营养条件的要求不高，在无碳或无氮条件下都可以生长，能够吸收利用多种碳氮源。不过各种碳源无论是对菌丝生长还是孢子萌发均具有促进作用。其中菌丝生长时对葡萄糖的利用效果最好，气生菌丝最为旺盛，对甘油的利用效果最差，气生菌丝较少。孢子萌发时对蔗糖的利用效果最好，对甘油的利用率最差。笔者认为糖类较醇类更易被病原菌细胞利用原因应归结于细胞膜的选择通透性以及细胞膜的相似相容性使得葡萄糖更易被细胞吸收进而利用。有机氮源对菌丝生长有极高的促进作用，如牛肉膏与蛋白胨，硝酸盐也对菌丝生长有促进作用，较对照组的气生菌丝浓密。但是氨盐对菌丝生长有抑制作用，原因归结于铵根离子的水解，使得培养基呈弱酸性，超出了适宜菌丝生长的微弱酸性范围，而起到一定抑制作用。故而雨后施加叶面氨态氮肥既有利于紫藤的生长还能够起到抑制紫藤叶斑病病原菌侵染的作用。5.3不同杀菌剂对病原菌的毒力作用作为观赏类藤本植物紫藤，对其发生病害进行化学药剂防治，对于杀菌剂的选择非常重要。由于观赏者近距离与紫藤接触，首先应该保证杀菌剂对人体毒性最低且没有农药气味。经过本试验结果发现，室内毒力测定效果较好的药剂有250g/ml吡唑醚菌酯（凯润）和10%苯醚甲环唑（世高）对病原菌的菌丝生长以及孢子萌发均有较好的抑制作用，其两者分别属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂和甾醇生物合成抑制剂，均具有很高的选择性。本试验仅做了室内杀菌剂的毒力测定，不足之处是未在田间对各杀菌剂进行防治效果的测定。试验结果显示，beta-甲氧基丙烯酸脂类杀菌剂（β-methoxyacrylates）吡唑醚菌酯对AlternariaAlternata的抑制效果最好。甲氧基丙烯酸酯类主要作用于真菌的线粒体呼吸，破坏能量合成[59]。咪唑类杀菌剂咪鲜胺锰盐（由咪鲜胺和氯化锰复合而成）和三唑类脱甲基杀菌剂（如丙环唑、苯醚甲环唑）都表现出很强的毒力。代森锰锌是代森锰和锌离子的配位化合物，抑制菌体内丙酮酸的氧化，属于乙撑二硫代氨基甲酸盐，为有机硫杀菌剂。其与芳烃类杀菌剂百菌清对该病原菌的毒力大小相当，EC50均为25g/mL左右。多菌灵为10种药剂种对病原菌毒力最差的一种杀菌剂，其属于苯并咪唑类杀菌剂，该类杀菌剂普遍对半知菌中的链孢属、长蠕孢属和轮枝孢属等真菌无效[59]。与徐汉虹（2010）植物化学保护关于苯并咪唑类杀菌剂章节的描述一致。由以上分析可知，除了多菌灵对链格孢属的特殊无作用，作为现代选择性杀菌剂的甲氧基丙烯酸脂类杀菌剂、甾醇生物合成抑制剂及其复合物等较传统多作用位点杀菌剂如有机硫类杀菌剂和芳烃类杀菌剂等对本试验病原菌的抑制效果要好几十倍甚至几百倍。有选择性较高的药剂，其不仅对作物和生态安全，对病原菌的进攻专一性也越高，从而会交无选择性的药剂抑菌效果更好且更环保。本试验结果与常规规律一致。不过本药剂毒力测定试验最有趣的部分要数同是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的嘧菌酯，其EC5028 值居然达到了1000g/mL，是同类药剂吡唑醚菌酯的上万倍，几乎对该病原菌无效。徐汉虹（2010）在植物化学保护学关于甲氧基丙烯酸酯类的介绍中提到了旁路氧化酶（alternativeoxidase,AOX），真菌对呼吸链电子传递中断的适应性生物进化是存在旁路呼吸途径的，而AOX便是旁路呼吸途径的一个关键的酶。由于笔者精力有限，对此未做特别深入研究，在此把此问题提出来，期待有对此感兴趣的读者能够对此做深入研究。笔者据有限资料做大致推断，本试验所分离病原菌可能存在着AOX的诱导型表达，以至于嘧菌酯对其没有多大抑制作用。而作为继醚菌酯之后的第二代产品吡唑醚菌酯，其活性相对更高，作用范围更加光谱，其可能对真菌中的AOX诱导机制起干扰破坏作用，抑制AOX的合成，继而对病原菌仍保持着高效抑制作用。经本试验观察，不同类型药剂对分生孢子的毒力，与对菌丝的有一定区别。对病原菌菌丝生长抑制效果最好的甲氧基丙烯酸脂类杀菌剂吡唑醚菌酯退居后位，EC50为28.8043g/mL。在上述关于甲氧基丙烯酸脂类杀菌剂对病原菌菌丝生长的毒力分析时候，提到真菌遇到呼吸链电子传递中断会本能走通过生物进化而来的旁路呼吸途径。按照上述对菌丝生长抑制作用的推论，本试验所分离病原菌存在着AOX的诱导型表达，而孢子内的表达机制较菌丝生长更加完善而不会被化学药剂轻易干扰，致使活性较强的吡唑醚菌酯对孢子萌发的毒力减弱。但是毒力仍然明显强于同类型杀菌剂嘧菌酯，是其10倍左右，嘧菌酯的EC50为313.7709g/mL。而作为三唑类杀菌剂苯醚甲环唑，甾醇类生物合成抑制剂，破坏真菌细胞膜的结构和功能，对菌丝生长以及孢子萌发两者的作用效果相当，没有因孢子及菌丝的生物学特性而造成过多抑制效果的差别。而位于供试十种菌株的对病原菌的抑制效果的前列。然而同样作为甾醇生物抑制剂的咪唑类杀菌剂咪鲜胺锰盐（由咪鲜胺和氯化锰复合而成），对菌丝生长的抑制效果很好，对孢子萌发的抑制效果却并不理想，EC50为217.8509g/mL，毒力在十种供试药剂的后五位介于吡唑醚菌酯与嘧菌酯之间，与嘧菌酯（EC50为313.7709g/mL）相当。唑醚·氟酰胺是吡唑醚菌酯与氟唑菌酰胺的复配，其对病原菌的毒力仅次于苯醚甲环唑，EC50为3.6125g/mL。氟唑菌酰胺属于羧酰胺类化学品,其作用方式是对线粒体呼吸链的复合物II中的琥珀酸脱氢酶起抑制作用,从而抑制靶标真菌的种孢子萌发,芽管和菌丝体生长[59]。本试验种该药剂对病原菌的毒力影响主要是氟唑菌酰胺起了较大的作用。百菌清和代森锰锌作为传统多作用位点杀菌剂，对孢子萌发的抑制效果相当，由于作用位点不具有选择性，对孢子萌发抑制作用反而有较好的效果。它们的EC50分别为7.9092g/mL和15.3961g/mL，在吡唑嘧菌酯之上。肟菌·戊唑醇作为三唑类杀菌剂与甲氨基丙烯酸酯类杀菌剂的复配，其对分生孢子萌发的抑制效果并不理想，病原菌特异性地对此复配不敏感。对于选择性杀菌剂，尤其是EBIs麦角甾醇生物合成抑制剂而言，不同的EBIs有着不同的抗菌谱，并存在这很大的活性差异，不同杀菌剂的脂水平衡系数和不同真菌的细胞壁及细胞膜结构存在的29 差异，对药剂进入菌体细胞的速度和数量起决定性的作用。菌体细胞内的生物化学反应及代谢的不同也对EBI的抗菌活性有着极大的影响[59]。其中丙环唑对孢子萌发的抑制效果远远不及同属于三唑类杀菌剂的苯醚甲环唑，且远不及其自身对病原菌菌丝生长的抑制效果，或许跟病原菌孢子的内在细胞膜结构和杀菌剂的特有化学特性有关系。丙环唑对病原菌孢子的毒力位于十种杀菌的倒数第二位，EC50接近1000g/mL。多菌灵为10种药剂种对病原菌分生孢子毒力最差的一种杀菌剂，其属于苯并咪唑类杀菌剂，对半知菌的链格孢属无效是该类杀菌剂被公认的短板。30 6结论6.1病原菌的分离与致病性紫藤叶斑病症状：在6-9月均可看到病叶，发病初期，叶片上会出现零星浅黄色小点，随后黄色部位颜色加深，并沿直径向周边延伸，其间黄点中央位置开始变为黄褐色，接着转变为黑褐色并枯死，黄色部位渐渐消失，枯死部位变大。最后病斑直径保持稳定，大致在10mm-15mm范围内不再继续扩大，直至该点枯死。该病害可致叶片遍布黄点，最后叶片呈密点状枯死病斑，严重影响紫藤的美观。于2014年8月采集安徽省霍邱县和池州市典型叶斑病叶，按常规的组织分离法进行分离。得到2株菌落形态及孢子形态一致的真菌，取其中一株长势旺盛的菌株ZT-1利用柯赫氏法则回接健康叶片，进行致病性侵染试验，并进行在分离。柯赫氏法则验证结果表明，ZT-1无论是室内还是室外的菌丝块接种（对叶片造成伤口前提下）均可以对叶片完成侵染并可以再分离得到，由此可知ZT-1菌株为该病的病原菌。6.2病原菌的鉴定以对病原菌产孢表型与孢子及菌落形态的观察为基础，对ZT-1菌株的3个基因位点序列ITS与GPD和TEF进行分析，经PCR扩增并测序并在Genbank中Blast后，利用DNAMAN软件构建系统发育树。结果显示与ZT-1同源性最高的种中有且仅有Alternariaalternata在三个系统发育树中同时出现。结合形态学的观察结果：在PCA滤纸上，25℃，12h/12h黑暗与光照下培养5d，产孢表型呈矮树状，在分生孢子的侧面和基部产生1-5个孢子的孢子链；分生孢子倒棒状、倒梨形、卵形、广椭圆形，孢身22-51×8-13m，具有1-5个横膈膜和0-3个纵、斜隔膜。与Alternariaalternata小孢子种形态一致。由此可以确定ZT-1即为Alternariaalternata。经过病原菌的分离以及柯赫氏法则验证和形态学及分子生物学鉴定，本试验所研究紫藤的叶斑病害定名为紫藤叶斑病，引起该病的病原物为Alternariaalternata（Fr.:Fr.）Keissler。6.3病原菌生物学特性病原菌ZT-1菌丝在10-35℃的温度范围内均能生长，最适生长温度为28℃，致死温度为55℃，10min。菌丝在pH4-10的条件下均可生长，菌丝生长的最适pH为6。光照利于菌丝生长，在无碳或氮源条件下均可以生长，但是在以葡萄糖和淀粉为碳源，以蛋白栋和牛肉膏为氮源时生长最好。其中氨态盐对菌丝生长起到很好的抑制作用。分生孢子在10-35℃的温度范围内均能够萌发。在5-29℃随着温度的升高，孢子萌发率逐渐增加，最适萌发温度为29℃，致死温度为55℃，10min。在pH3-10范围内均可以萌发，最适pH为6.2。光照条件对孢子萌发无显著性影响，最适碳源为蔗31 糖、麦芽糖、果糖和葡萄糖。6.4杀菌剂对病原菌的毒力供试的10种杀菌剂对病原菌菌落的生长都有一定的抑制作用，250mg/ml吡唑醚菌酯（凯润）乳油的的EC50最小，为0.0777g/mL,对菌丝的抑制作用最强。其次为50%咪鲜胺锰盐（使百功）可湿性粉剂和42.4%唑醚·氟酰胺（健达）悬浮剂，EC50分别为0.3458g/mL和0.4059g/mL。对该病原菌的抑制效果最差的是250g/ml嘧菌酯（阿米西达）悬浮剂和80%多菌灵可湿性粉剂，其两者的EC50值均高于1000g/mL。供试的10种杀菌剂对病原菌的分生孢子萌发都有一定的抑制作用。10%苯醚甲环唑（世高）水分散粒剂作用效果，EC50为0.3513g/mL，其次为42.4%唑醚·氟酰胺（健达）悬浮剂和75%百菌清可湿性粉剂，EC50分别为3.6125g/mL和EC50为7.9092g/mL。80%多菌灵可湿性粉剂抑制效果最差，其EC50为16270.5916g/mL。32 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附录供试配培养基PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mLPD培养基（液体）：马铃薯200g，葡萄糖15g，水1000mLPCA培养基：马铃薯20g，胡萝卜20g，琼脂粉17g，水1000mLPSA培养基：马铃薯20g，蔗糖20g，琼脂粉17g，水1000mLCA培养基：胡萝卜100g、琼脂17g、水1000mLOMA培养基：燕麦片100g、琼脂17g、水1000mL10%V8培养基：V8汁100mL、琼脂20g、水1000mL查彼（Czapik）培养基（液）：硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、水1000mL供试实验器材超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、冰箱、恒温培养箱、RGL‐P280C型智能人工气候箱、漩涡震荡仪、摇床、离心机、光学显微镜（CH20，OLYMPUS）、研钵、水浴锅、Eppendorf移液器、PCR仪、电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪、Milli‐Q超纯水仪、分光光度计、干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅、金属打孔器、超净工作台、研钵、PH试纸、酒精灯、移液枪、接种针、酒精灯、载玻片、凹玻片、保鲜袋、培养皿（直径9cm和6cm）、米尺、移液枪、50mL离心管、100mL塑料锥形瓶、1.5mL离心管、2mL离心管、镊子、酒精灯、大头针、移液枪、酒精灯、试管、培养皿（直径9cm和6cm）、保鲜袋、喷雾瓶、PE手套37 致谢光阴荏苒，日月如梭，研究生三年转眼间就过去了，在论文即将完成之际，感谢我的老师、同学及朋友在研究生三年里给予我无私的帮助，在此向所有关心我的老师和同学、朋友们致以最诚挚的谢意。在毕业之际，许多莫名的微妙感觉难以言说，三年来在实验室做实验验的每幅画面总是历历在目，不乏失败，更不乏导师的信任及鼓励，在实验失败迷茫之际，檀根甲导师敦敦教诲总能够使我醍醐灌顶，重新增加继续实验的信心和勇气。感谢檀老师三年来的耐心教导与鼓励。在论文的选题、实验设计、试验的实施及论文撰写各方面都有您无私的教诲和无尽的关怀。您的诚诚恳恳、脚踏实地的科研作风更值得我终身学习。本论文的完成也得到植物保护学院领导和老师的大力支持与帮助，感谢张立新老师、李淼老师、汪章勋老师、江彤老师、伍万荣老师在我实验的艰难时刻所提出的宝贵意见和关怀鼓励。感谢周雪平研究员、刘万学副研究员、高同春研究员、高智谋老师和丁克坚老师在论文答辩期间所提供的宝贵建议。实验室的师兄弟们总能够结下深厚的友谊，感谢范洪亮师兄、宋炜师兄、于建红师姐和费丹师姐的出现，感谢我的同窗彭衍彪、我的老同学徐玉平、冯明峰和江寒师弟、王文凤师妹、李帅师弟在实验过程中所提供的无私帮助，感谢本科毕业生周磊、庄中岳、苗昱同学在实验中所作出的努力。最后我要特别感谢我的家人，感谢父母和妹妹对我的无限期待与鼓励，对屡次遭遇挫折的我的永不放弃。最后的最后，感谢在我生命中出现的所有人，是你们的出现，让我拥有一颗感恩的心，感谢大家，感谢有你！李凯旋二〇一六年六月38 作者简介李凯旋，男，汉族，中共党员，1992年11月出生于安徽亳州。2013年毕业于安徽农业大学植物保护学院，获农学学士学位。同年9月推荐免试进入安徽农业大学研究生学院，攻读植物病理学专业，师从檀根甲教授，主要从事植物病害生态与绿色防控的研究。2014年6月在安徽省万方数据杯文献检索竞赛中获第一名，2014年11月获“三好研究生”暨“安科生物奖学金”，2015年10月暑期赴美社会实践被评为“优秀实习生”，2016年获安徽农业大学品学兼优毕业研究生。读研期间，主要参与并完成课题“紫藤叶斑病的病原鉴定及生物学特性研究”。39
