自体富血小板凝胶—羊膜复合物在治疗眼表疾病的初步临床研究

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分类号：R779.6UDC：密级：重庆医科大学硕士学位论文自体富血小板凝胶-羊膜复合物在治疗眼表疾病的初步论文题目临床研究作者姓名林莉指导教师姓名（职称、单位名称）赵敏教授重庆医科大学附属第一医院申请学位级别硕士学科、专业名称眼科学论文答辩年月2016年5月2016年5月 重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进巧的巧究工作及职得的研究成果。据我所知，除了文中特別加私标速和致谢的地方外，论文中不包含其他人臣经发表或撰写巧的巧究咸累化不包含为获得重庆医科大学或其化教育机构的学位或，证书而便用过的材料，与我同工作的同志对本研究所俄的任巧贡献均己担论文中作了巧确的说巧并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处一，本人承担巧相关责任。＂？－学位论文作者签名，４；巨期：从Ｖ科＾（）｜学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知巧产权的规定，自Ｐ：研兜生在攻读学位期间论文工作的知巧产权单位属重巧屋科大学。本人保证毕业离极看，发轰论文或使用论文工作成果时署名单植为重庆医科大学。学板有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复巧件和磕盘，允许论文被查间和带間。学披可科公布学位论文的全部或部分尚容（保密巧容除外），并编入有关数据库进巧检索，可Ｗ果用影印、缩印或其他手段巧存论文。保密论文在解密后适用本镜权书。论文作者签名；指导教师签名： 目录中文摘要..................................................................................................................................1英文摘要..................................................................................................................................2论文正文：自体富血小板凝胶-羊膜复合物在治疗眼表疾病的初步临床研究..........41.资料与方法..................................................................................................................41.1一般资料.........................................................................................................41.2材料的制备.....................................................................................................51.2.1PRP的制备............................................................................................51.2.2羊膜来源................................................................................................51.2.3APG-AM复合物的制备......................................................................51.3治疗方法.........................................................................................................51.4观察指标.........................................................................................................52.结果..............................................................................................................................62.1角膜、巩膜溃疡的变化................................................................................62.2眼部上皮修复程度........................................................................................62.3治疗前后视力对比........................................................................................72.4自觉症状改善程度........................................................................................73.讨论..............................................................................................................................7参考文献................................................................................................................................11文献综述...............................................................................................................................13参考文献...............................................................................................................................21致谢........................................................................................................................................24读硕士学位期间发表的论文..............................................................................................25 重庆医科大学硕士研究生学位论文自体富血小板凝胶-羊膜复合物在治疗眼表疾病的初步临床研究摘要目的：观察自体富血小板凝胶-羊膜复合物治疗难治性眼表面疾病疗效，评价其临床应用价值和意义。方法：对我院35例45眼重度眼表疾病患者，采用自体富血小板凝胶联合羊膜移植/敷贴治疗。随访1-6月，观察患者眼表的修复情况及症状改善程度。结果：患者眼表上皮均得到不同程度修复，自觉症状均有不同程度减轻。19例24眼化学及热烧伤患者中18例23眼眼表上皮基本修复，1眼角膜溶解穿孔。5例10眼重度干眼自觉症状均有明显改善，上皮修复或部分修复。9例9眼角膜溃疡5例愈合，3例明显好转，1例无改变。2例2眼巩膜溶解溃疡面完全愈合。结论：自体富血小板凝胶-胶联羊膜是一种新型的羊膜复合物，为难治性眼表面疾病的治疗开辟了一条新的有效途径。关键词：血小板凝胶；羊膜；眼表疾病1 重庆医科大学硕士研究生学位论文THEPRELIMINARYCLINICALSTUDIESOFUSINGAUTOLOGOUSPLATELET-RICHPLASMACOMBINEDWITHAMNIOTICMEMBRANEINOCULARSURFACEDISEASETREATMENTABSTRACTObjective：Toobservehowautologousplatelet-richplasmacombinedwithamnioticmembranemaybeusedintreatmentofrefractoryocularsurfacedisease,andtoevaluateitsclinicalvalueandsignificance.Methods：35patients45eyesinourhospital,havebeentreatedusingautologousplatelet-richplasmacombinedwithamnioticmembranetransplantation.Asfollow-upforonetosixmonths,thepatientshavebeenobservedfortheirocularsurfacesrepairandtheimprovementofsymptoms.Results：Theocularsurfaceepitheliumsofpatientshavebeenrepairedbyvarieddegrees,andpatientsthemselvesfeeltheirsymptomsarerelievedinvariedlevels,18cases23eyesofchemicalburnsandthermalburnsin19cases24eyesofocularsurfaceepithelialbasicrepair,1caseofpatientswithcornealperforation.5patients10eyeswithseveredryeyesymptomswereimprovedconsciously,theocularsurfaceepitheliumshavebeenrepairedpartialorfully.5eyesof9patients9eyeswithcornealulcerhealing,3casesimprovedsignificantly,1caseshowednochange.2eyesof2parientswithscleralmelthealing.2 重庆医科大学硕士研究生学位论文Conclusions：AutologousPlatelet-RichPlasmacombinedwithamnioticmembraneisanewtypeofamnioticmembranecomplex,whichopenupaneweffectivewayoftheocularsurfacediseasetreatment.Keywords：platelet-richplasma;amnioticmembrane;ocularsurfacedisease3 重庆医科大学硕士研究生学位论文自体富血小板凝胶-羊膜复合物在治疗眼表疾病的初步临床研究前言眼表化学烧伤、热烧伤，重度干眼，病毒性角膜炎及静止期角膜溃疡等眼表面疾病，具有经久不愈，反复发作等特点。目前临床上的常规治疗方法，包括局部滴用抗生素眼液，人工泪液，小牛血去蛋白提取物或牛碱性成纤维细胞生长因子等促上皮修复的药物，均难以取得良好的治疗效果。自体血小板凝胶（autologousplatelet-richgel，APG)其主要成分富血小板血浆（platelet-richplasma，PRP）包含高浓度的血小板，在创伤愈合过程中，释放多种生长因子和细胞因子，直接或者间接的参与创伤愈合的级联反应[1]。羊膜也可产生如成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子等多种生长因子，有利于上皮细胞分化移行，作为一种底物，在重建眼表面中可部分代替角膜基质。并通过抑制β1转化生长因子的表达，从而消除炎症及瘢痕化，重建正常上皮表型[2]，所以对眼表创伤治疗有效。我院眼科自2014年1月至2015年6月期间收治的33例患者重度眼表面疾病采用自体富血小板凝胶联合羊膜(AmnioticMembrane，AM)移植治疗，取得较好的疗效，现报道如下。1.资料与方法1.1一般资料本组病例为2014年1月至2015年6月我院眼科收治的重度眼表疾病患者35例45眼，其中重度干眼（包括Stevens-Johnson综合征）5例10眼，重度化学烧伤及热烧伤19例24眼，静止期角膜溃疡9例9眼，翼状胬肉切除术后巩膜溶解2例2眼。男27例36眼，女8例9眼，年龄最大61岁，最小17岁，平均年龄49岁。上述病例均经过1-2周以上的常规治疗，自觉症状没有减轻，眼表溃疡无明显修复。4 重庆医科大学硕士研究生学位论文1.2材料的制备1.2.1PRP的制备制备过程严格无菌操作。抽取患者自身静脉血于加入抗凝剂的无菌管中。进行两次差速离心。第一次离心后，血液从上到下分为三层，依次为贫血小板血浆层、血小板浓缩物、红细胞层。弃去大部分上清液，抽取全部贫血小板血浆、血小板浓缩物及交界面下少量红细胞于空白管中进行二次离心使血小板重悬，即为PRP[3]。通过此种方法收集到的血小板血浆中可能含有少量的红细胞。1.2.2羊膜来源取自健康足月剖腹产产妇，并经乙型肝炎病毒、输血前检查、梅毒、淋球菌及支原体检测阴性。将羊膜通过钝性分离从子宫内剥离出来后，用50μg／ml青霉素、50μg/mL链霉素，100μμg／ml新霉素及2.5μg/ml两性霉素B冲洗后，羊膜基底膜面朝下，平铺于尼龙纸上，分割成数张，分别放置于装有甘油的瓶中低温保存。使用前将保存的羊膜在平衡液+庆大霉素注射液中复水约10分钟[4]。1.2.3APG-AM复合物的制备将配制好的牛凝血酶-钙合剂（10:1）与PRP混合后，凝固形成的凝胶状物质[5]即APG，与羊膜胶联制得APG-AM复合物。1.3治疗方法治疗前给予局部抗生素眼液点眼，常规消毒铺巾，奥布卡因表面麻醉术眼。平衡液反复冲洗，清洗眼表创面，清除坏死组织。将复水羊膜展开，在其基底膜面均匀的平铺PRP后，注射器滴注一定比例的凝血酶-钙剂（10:1）于PRP表面，室温下等待约3分钟，羊膜与血小板凝胶形成的羊膜复合物，紧密不可分离，羊膜上皮面朝上，将其覆盖于眼表，用特制的中空14-15mm穹窿支撑环固定羊膜，少数患者用0/8可吸收缝线缝合固定羊膜于眼表（根据具体病情选用支撑固定或缝合的方式）。根据病情作临时性睑裂缝合，无菌敷料包扎，每日换药1次，1周后拆除睑裂缝线观察眼表修复情况，必要时可再次行APG-AM治疗。5 重庆医科大学硕士研究生学位论文1.4观察指标①裂隙灯下观察，测量角膜、巩膜溃疡的深度与大小的变化②眼表上皮修复程度③术前术后最佳矫正视力的比较④自觉症状的改善程度2.结果2.1角膜、巩膜溃疡的变化治疗7天-1月，9例9眼静止期角膜溃疡5例愈合，3例角膜溃疡明显修复，1例无改变。2例2眼因重度干眼所致的角膜溃疡完全愈合。2例巩膜溃疡完全修复，结膜覆盖巩膜创面。经过1-6月的随访，无一例复发或炎症加重。下图所示为男性患者，45岁，因双眼干伴视力下降5月就诊，诊断：Stevens-Johnson综合征。予以自体富血小板凝胶联合羊膜移植治疗。术前左眼裂隙灯照相情况，眼表明显充血，角膜中央圆形溃疡。术后3周，患者眼部充血减轻，角膜溃疡完全愈合。治疗前治疗后3周图2.1自体富血小板凝胶联合羊膜移植治疗前后角膜溃疡改善情况Figure2.1Theimprovementofconearulcerpreandposttherapyofautologousplatelet-richplasmacombinedwithamnioticmembrane2.2眼部上皮修复程度19例24眼化学烧伤中23眼眼表上皮基本修复，1眼角膜溶解穿孔。随访1-6月，除1例患者出现反复的角膜上皮脱落，其余角膜上皮修复，角膜较前透明，其中8眼角膜基本透明，15眼遗留薄翳或斑翳，仅4眼后期出现轻度的睑球粘连。下图所示为男性患者，45岁，因右眼被膨胀剂烧伤5天就诊，诊断：右眼酸烧伤，予以自体富血小板凝胶联合羊膜移植治疗。术前右眼裂隙灯照相，结膜灰6 重庆医科大学硕士研究生学位论文白色，血管闭塞，角膜上皮完全缺损，灰白色混浊，眼内窥不进。术后两周，角膜明显恢复透明，上皮修复，可窥清虹膜及瞳孔情况。治疗前治疗后2周图2.2自体富血小板凝胶联合羊膜移植治疗化学烧伤前后角膜改善情况Figure2.2Theimprovementofconearpreandposttherapyofautologousplatelet-richplasmacombinedwithamnioticmembrane2.3治疗前后视力对比35例45眼，6眼（13.3%）由治疗前的光感或手动视力提高到数指，21眼（46.7%）最佳矫正视力提高1-2行，1眼（2.2%）提高5行，17眼（37.8%）视力无改变。无一例视力下降。2.4自觉症状改善程度经过1-2周的治疗，患者眼部疼痛、眼干的症状均不同程度的减轻或消失，81%角膜荧光染色完全消失。3.讨论血小板通过粘附、聚集，形成一个促凝血的表面，导致凝血酶生成和纤维蛋白的形成，参与我们所熟知的凝血功能，此外还可以释放多种促进组织修复的生长因子和细胞因子。与自体血清相比，血小板中包含更多的维生素和生长因子。血小板中释放的α颗粒含有30种以上的生物活性蛋白，如表皮生长因子（EGP），血小板衍生生长因子抗体（PDGF-AB）、血管内皮生长因子（VEGF），胰岛素样生长因子（IGF-1）、转化生长因子β（TGF-β），细胞因子中包括PF4和CD407 重庆医科大学硕士研究生学位论文L蛋白质[6]，[7]，有促进组织修复和影响血管和其他血细胞在血管生成与炎症中的反应。表皮生长因子目前已经被研究的很透彻了。在凝血酶刺激下使血小板浓缩物释放生长因子制剂最近也有所报道。在这些生长因子存在的情况下，对人类角膜上皮细胞进行体外测试其生长、移行、分化的能力，均显示出来戏剧性的影响作用。APG的主要成分PRP包含高浓度的血小板，与全血相比，极大的促进和推动了创伤修复和组织再生的级联反应，目前已广泛应用于口腔颌面外科[8]、骨科[9]、烧伤整形科及创伤和慢性溃疡如糖尿病足溃疡的愈合[10-12]。在临床上，可以直接将PRP应用于创口或术区，利用机体自身的凝血过程或者创伤刺激，使PRP所含的高浓度血小板被激活而发挥作用。也可以在体外将PRP与凝血酶一钙合剂混合而形成APG，再应用到临床的手术、创伤修护等，这两种方式的基本作用机制实际是相同的。制成血小板凝胶可以使生长因子局限在需要修复的病灶范围内释放，以利于其更好的发挥作用。将APG应用于眼表疾病的治疗，是近年在眼科疾治疗的一种新手段，如眼部的热烧伤、化学烧伤，可缩短眼表修复时间，降低感染率和角膜新生血管发生率，不影响视力恢复，甚至一定程度上提高视力[13]。对于干眼患者改善自觉症状以及主要的临床指标都有很大的作用[14]。羊膜取自于胎盘，是胎盘的最内层，而它又包含了三个层次：最内层的基底膜面，中间的基质层和最外层的上皮层。它能够促进结膜上皮向角膜上皮转化、促进结膜干细胞分化为结膜上皮细胞，促进角膜缘干细胞增殖，提供一个有助于角膜干细胞生长的微环境。抑制结膜下纤维组织增生、抑制新生血管增生，同时具有抗炎、抗菌等功能。相较于角膜供体材料的来源有限，羊膜来源丰富，成本低，操作简单，羊膜中因缺乏人类主要组织相容性抗原HLA-A，B，几乎不存在排斥反应，在基层医院也可以开展手术。同时羊膜具有的抗纤维化、抗新生血管的作用，可减轻眼部化学烧伤或热烧伤患者的局部新生血管生成和睑球粘连。因此，羊膜被广泛用于眼部烧伤、角膜溃疡等疾病的治疗[15]。关于羊膜与其他眼表修复剂的联合应用的报道较少，但根据本组的实验研究，发现其也有很好的应用前景。国外学者JorgeL.Alio报道，将制备的APG直接滴注于角膜溃疡面，再联合羊膜或自体纤维膜移植治疗静止期角膜溃疡，收到很好的疗效[16]，[17]。本组将血小板凝胶与羊膜胶联在一起，形成一种新型的羊膜复合物，旨在发挥二者的优势及8 重庆医科大学硕士研究生学位论文协同作用，促进角膜溃疡愈合，促进组织修复及减轻炎症与疼痛。单用凝胶不能固定于眼表，容易脱落。APG-AM复合物使APG在眼表停留的时间更长，同时又发挥了羊膜的作用。本组所用APG-AM复合物，采用了特制的压迫环，不需缝合，对患者眼表不造成创伤，且可多次敷贴治疗，对阻止睑球粘连的形成也有一定疗效。因其来源于自体、属于新鲜的纯天然制剂，不含防腐剂，只要严格无菌操作，不存在疾病传播、过敏反应等问题，同时也未触及相关伦理问题。目前关于联合应用的报道较少，我们尝试采用这种方法，对难治性眼表面疾病的治疗取得了较好的成效，在随访的1-6月里无1例患者出现并发症或不良反应，值得临床上进一步研究与探讨。因为疾病的严重程度和炎症程度不尽相同，我们现有的研究并不能确定联合应用血小板凝胶-胶联羊膜是否一定优于单独使用羊膜移植治疗。目前我们所选的均为临床上治疗棘手的病例，既往常规羊膜移植或睑裂缝合治疗，不能收到较好的疗效。在临床应用中，我们正尝试将APG-AM复合物替代口腔黏膜，应用于眼球摘除术后结膜囊缩窄病例的治疗，将羊膜作为一种基板，在血小板凝胶的促生长因子的作用下，促进结膜上皮的移植，填补结膜缺损区域，现已有两例患者病情改善，成功安装义眼。APG-AM复合物在眼部疾病的其他适应症还需进一步探讨。对于有明显感染的病例，建议不要联合使用APG，需待眼部感染控制以后。需要进一步考察的是单纯使用羊膜或血小板凝胶治疗眼表面疾病与联合应用的的疗效差异，作此类患者治疗的对照性的研究。探讨制备APG-AM复合物的规范化流程以及能否使其长期保存，以备同一患者再次使用。总之，从本组病例治疗效果看来，该方法确切有效，具有应用前景，为临床医生提供了新的治疗手段，值得临床上的进一步探讨和研究。9 重庆医科大学硕士研究生学位论文全文小结1.APG应用于眼表疾病的治疗，是近年在眼科疾治疗的一种新手段，如眼部的热烧伤、化学烧伤，可缩短眼表修复时间，降低感染率和角膜新生血管发生率，对于干眼患者改善自觉症状以及主要的临床指标都有很大的作用。2.羊膜被广泛用于眼部烧伤、角膜溃疡等疾病的治疗。关于羊膜与其他眼表修复剂的联合应用的报道较少，但根据本组的实验研究，发现其也有很好的应用前景。3.APG-AM复合物的方法确切有效，具有应用前景，为临床医生提供了新的治疗手段，值得临床上的进一步探讨和研究。10 重庆医科大学硕士研究生学位论文参考文献[1]吴静,赵敏.自体富血小板凝胶在眼表疾病中的应用[J].中国实用眼科杂志,2012,30(8).:885-888.[2]杜志山.羊膜移植在眼科的应用[J].眼外伤职业眼病杂志：附眼科手术,2003,(4):285-287.[3]LiM．ZhangC，YuanT，eta1．Assessmentstudyonasetofplatelet—richplasmapreparation．ZhongguoXiuFuChongJianWaiKeZaZhi，2011，25(1)：112—116．[4]魏小琴,韩英.羊膜的制备与保存[J].眼科新进展,2002:117-117.[5]康健,袁文.富血小板凝胶制备方法的比较与优选[J].中国组织工程研究,2014,18(3).:479-481.[6]FrechetteJP,MartineauI,GagnonG.Platelet-richplasmas:growthfactorcontentandrolesinwoundhealing.JDentRes2005;84:434–9[7]EppleyBL,WoodellJE,HigginsJ.Plateletquantificationandgrowthfactoranalysisfromplatelet-richplasma:implicationsforwoundhealing.PlastReconstrSurg2004;114:1502–8.[8]SammartinoG,TiaM,MarenziG,etal.Useofautologousplatelet-richplasma(platelet-richplasma)inperiodontaldefecttreatmentafterextractionofimpactedmandibularthirdmolars.JOralMaxillofacSurg2005;63:766–70.[9]冯扬,唐休发.富血小板血浆在颌面部非血管化骨移植中的应用[J].中国修复重建外科杂志,2006,(9):944-946.[10]KazakosK,LyrasN,TryfonidisM,etal.Theuseofautologousplatelet-richplasmagelasanaidinthemanagementofacutetraumawounds[J].InjuryExtra,2008,39:185–186.[11]陈海燕,陈晓荣,梁燕等.自体富血小板凝胶治疗难治性糖尿病足的疗效观察[J].中国临床新医学,2008,23(9).[12]饶忠,周红菊.自体富血小板凝胶治疗烧伤残余创面的临床研究[J].医学临床研究,2007,(11):1875-1877.[13]吴建斌,黄任强,贾丽.自体富血小板凝胶在眼表烧伤治疗中的应用[J].安徽医药,2014,(11).DOI:10.3969/j.issn.1009-6469.2014.11.029.11 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重庆医科大学硕士研究生学位论文文献综述自体富血小板血浆/凝胶与羊膜在治疗眼表面疾病中的应用摘要自体富血小板凝胶(autologousplatelet—richgel，APG）因其所提供的高浓度生长因子和粘附分子，在促进伤口愈合和组织修复方面，已充分展示了它的作用。羊膜作为一种生物材料，具有抗炎、抗菌、抗纤维化和血管化的作用，两者都已广泛的应用于临床及治疗眼科疾病。本文就两者的作用机制、制备方法、在治疗眼表面疾病的不同应用方式等方面进行综述，探讨两者联合应用的可能性。关键词：富血小板凝胶自体羊膜眼表面疾病THEAPPLICATIONOFAUTOLOGOUSPLATELETRICHPLASMA/GELANDAMNIOTICMEMBRANETRANSPLANTATIONINTHETREATMENTOFOCULARSURFACEDISEASESABSTRACTAutologousplateletrichgel（APG），providedforitshighconcentrationofgrowthfactorsandadhesionmolecules,ithasfullydemonstrateditsroleofpromotingwoundhealingandtissuerepair.Amnioticmembraneisabiologicalmaterials,have13 重庆医科大学硕士研究生学位论文anti-inflammatory,antibacterial,antifibrosisandtheeffectofvascularization,bothofwhichhavebeenwidelyappliedinclinicalandtreatmentofoculardisease.Inthisarticle,wewillreviewedtheirmechanism,preparationmethods,thetreatmentofocularsurfacediseaseofdifferentapplicationmode,discussedthepossibilityofcombiningbothapplication.Keywords:platelet-richgel;autologous;amnioticmembrane;ocularsurfacedisease自体富血小板血浆（Platelet-richplasma）是从少量的患者自身血液中提取出的高浓度的血小板。而血小板凝胶是在血小板血浆中加入激活剂以后形成的胶冻状凝块。与自体血清不同，血小板凝胶里富含血小板，其产生的生长因子是增强细胞增殖和伤口愈合的重要因素。羊膜是人体内最厚的基底膜，因其不具有血管和抗原组织，在移植治疗的过程中，不存在免疫排斥反应，被应用于临床治疗已长达100年[1]，在眼科的应用也有20多年的历史[2]。本文的目的是分别回顾文献中血小板凝胶和羊膜在治疗不同眼表面疾病中的应用价值，对其作用机制、制备方法进行综述。自体血小板凝胶的制备抽取患者自体的静脉血80-100ml，收集在10ml一支的无菌试管内，试管中加入枸盐酸纳防止血液混凝。在层流室内严格无菌的条件下进行制作。富血小板血浆的制备目前主要分为手工制备法和全自动制备法两种。手工制备方法只需简单的离心机，通过离心分离得到，制作成本低廉。但其过程繁琐、样本被污染的机率较高，且不容易获取到纯粹的血小板血浆。全自动制备方法通过使用专业的血细胞分离仪器，获取富血小板血浆，操作较为简单，但仪器价格高昂，基层医院难以有条件配备。国外多个学者如Landesherg、Aghalo等分别以不同离心力和速14 重庆医科大学硕士研究生学位论文度制备自体富血小板血浆，其离心次数和时间都有较大差异。速度和时间主要取决于每一个离心机的特性及所用管材的尺寸。但普遍认为二次差速离心收集的血小板效率最高。最后所收集的到的血小板血浆的浓度是至少1000000血小板/ml。血小板血浆（PRP）可保存于眼药水瓶中，直接作为滴眼液使用，治疗眼部疾病。因其不含防腐剂，使用中的眼药水储存于-4°C冰箱中，使用时间一般不超过7天。未使用的PRP在-20°C的冰箱内冷冻保存。在制备好的血小板血浆中以一定比例加入10%氯化钙和牛凝血酶混合，室温下放置约30分钟，形成的凝块即为血小板凝胶。Alio在后来的制备中去除了牛凝血酶作为凝血引发剂，凝胶也可以形成。因其完全取自于自身，由牛凝血酶引发的抗体产生也将不再是一个问题[3]。还有一种方法是将未加入抗凝剂的全血放入离心机中进行离心，利用不同的离心次数和离心力改变血小板血浆的体外凝固时间和凝缩率，以此获得富血小板血浆凝胶。以前一种方法使用较多和普遍。羊膜的制备羊膜的获取是通过严格的无菌筛查。排除人类免疫缺陷病毒，乙型和丙型肝炎病毒和梅毒，避免交叉感染。通过产道分娩的胎盘因不能排除被阴道内细菌污染的潜在风险，也不能使用。羊膜通过钝性分离从子宫内剥离出来后，用50μg／ml青霉素、50μg/mL链霉素，100μμg／ml新霉素及2.5μg/ml两性霉素B冲洗，将羊膜上皮面朝上平铺于尼龙纸上，分割成数张。使用50%甘油在-80°C冰箱内低温冷冻保存。使用前拿出来，在室温下复温约10分钟左右，加用含有庆大霉素的平衡液反复冲洗后使用。在临床应用中，当羊膜被移植于眼表面时，无论是新鲜的还是保持的羊膜，都被认为是同样有效的[4]。一般在羊膜保存6个月后，需要再进行供体的血清学检查，排除一些处于窗口期的传染性性疾病，令羊膜的使用更为安全。而新鲜的羊膜因为不能排除这种风险，故保存羊膜更为安全，且避免了因为不能一次性完全使用而造成的浪费[5]。PRP/APG作用机制血液制品中的自体血清，是血液中去除了细胞成分和凝血蛋白的全液体部分，很早以前就被用于治疗干眼、持续性角膜上皮缺损、移植物抗宿主病等眼表疾病，并取得了满意的疗效。与血清不同，血小板中包含了凝血蛋白。血小板中释放的α15 重庆医科大学硕士研究生学位论文颗粒含有30种以上的生物活性蛋白，如表皮生长因子（EGP），血小板衍生生长因子抗体（PDGF-AB）、血管内皮生长因子（VEGF），胰岛素样生长因子（IGF-1）、转化生长因子β（TGF-β），以及细胞因子包括PF4和CD40L，促进组织修复和影响血管和其他血细胞在血管生成与炎症中的反应。在血小板存活的数天内，包括PF4和CD40L之类的趋化因子和一些新合成的代谢物也被释放出来，从而放大了促进伤口愈合的效果。血小板中还包含一些高浓度的促进细胞粘附作用的分子，如纤维蛋白、纤维粘连蛋白、玻连蛋白等。血小板凝胶作为一种纤维蛋白凝块或纤维蛋白胶，提供了一种粘合剂的作用，使生长因子和活性蛋白分泌到使用者选定的地点。羊膜的作用机制羊膜取自于胎盘，是胎盘的最内层，而它又包含了三个层次：最内层的基底膜面，中间的基质层和最外层的上皮层。羊膜的促进眼表修复与愈合作用主要有几个作用机理：1）、羊膜的机械保护性作用。羊膜使用时，基底膜面紧贴眼表，有类似于绷带镜的作用，在上皮损伤的眼表面，羊膜可以避免上皮缺损区域持续性的受到外界刺激，和眨眼时眼睑对伤口区域的机械性作用，这样也可以很快的缓解患者眼部疼痛、异物感等刺激症状。2）、抗微生物的作用。有学者认为，羊膜中存在数种抗微生物因子，如：β-细胞溶解酶，溶菌酶，转铁蛋白，7S免疫球蛋白[6]。但也有一些学者认为，羊膜中并不存在任何化学性的可以抗细菌的成分，它能够减少感染，仅仅是因为羊膜能与眼表紧密贴合的所起到的物理屏障的缘故[7]。3）、促进上皮再生。羊膜基底膜中所含有的胶原成分，作为一个基板，便利上皮细胞移行，加强上皮细胞粘附，促进细胞分化和阻止细胞凋亡，使上皮细胞更易于生长[8]。4）、抗纤维化和抗炎作用。羊膜中的胎儿透明质酸，通过抑制TGF-β的表达，从而阻止角膜缘干细胞与结膜成纤维细胞的增生。同时羊膜可以通过抑制促炎性因子的表达而减轻伤口的炎性反应。4）、抗血管生成。主要归因于羊膜中所产生的几种有效的抗血管生成物质，包括血小板反应蛋白-1，内皮抑素和组织金属蛋白酶抑制剂[9]。5）、羊膜中因缺乏人类主要组织相容性抗原HLA-A,B，避免了移植术后的免疫排斥反应。16 重庆医科大学硕士研究生学位论文PRP/APG在治疗眼表面疾病中的应用在近十年里，许多文献内都提到，成功的使用自体血小板血浆治疗，促进伤口愈合和组织修复，例如口腔、颌面外科手术，骨科重建手术，心血管手术和整形外科手术等[10-12]。回顾文献，虽然血小板血浆已经在其他很多学科使用，却还未在眼科广泛的应用。国外学者Alio曾对使用PRP/APG治疗眼表面疾病进行了一系列的报道。但在国内的报道里却很罕见。王海林等使用自体浓缩血小板治疗特发性黄斑裂孔，收到了很好的疗效[13]。有研究表明，发生时间在3年内的黄斑裂孔，使用血小板血浆治疗，手术解剖复位的成功率很高，但与对照组相比，对视力的改善并没有显著差异。对于使用PRP/APG治疗眼表面疾病，分述如下：1、干眼。干眼是眼科一类常见的疾病。主要是因为泪液的成分与（或）数量的异常导致的泪膜不稳定。患者出现眼干、烧灼感、异物感等主观症状，多伴随点状角膜炎的体征。严重的干眼可导致视力减退。此类患者的治疗主要是使用人工泪液行替代治疗。但人工泪液因为成分有限，部分人工泪液含有防腐剂，不能完全得缓解患者的症状与体征。ValentiniCG等将血小板血浆制成的滴眼液用于6例移植物抗宿主病所致的干眼的治疗，收到了较好的反应[14]。Alio等对36例中-重度干眼的患者，其中包括Sjögren’s综合征和Stevens-Johnson综合征，使用血小板血浆治疗，进行了一次前瞻性的、非随机性的观察。使用1个月以后，89%的患者症状得到了显著的改善，无1例症状加重[15]。2、角膜、巩膜溃疡。Alio等对26例常规治疗无效的静止期角膜溃疡患者滴用PRP治疗。他选择的病例是角膜上皮缺损，常规药物治疗2周以上无效的患者。这类病损多由神经营养角膜病,干眼,或免疫疾病如风湿性关节炎或眼部瘢痕性类天疱疮引起。PRP治疗后，92%的患者收到了显著的疗效，50%的患者溃疡完全愈合。只有2例治疗后溃疡无改变，无1例加重[16]。赵敏等对19例24眼化学烧伤、热烧伤患者，9例9眼静止期角膜溃疡，2例2眼翼状胬肉术后巩膜溶解患者使用了PRP/APG治疗，9例9眼静止期角膜溃疡5例愈合，3例角膜溃疡明显修复。2例巩膜溃疡完全愈合。24眼化学烧伤中23眼眼表上皮基本修复，仅1眼碱烧伤严重的患者角膜溶解穿孔，施行了角膜移植手术。说明PRP/APG对化学烧伤后的眼表修复也有效。3、LASIK术后的眼表面综合征。随着屈光手术LASIK技术的发展，眼表面综合征作为其一大术后并发症逐渐受到重视。主要表现为干眼、点状角膜炎、泪17 重庆医科大学硕士研究生学位论文膜减少与不稳定以及最好矫正视力降低。Alio对此类患者使用PRP滴眼（每天6次）治疗后，84%的患者主观症状得到明显改善，69%的患者角膜荧光染色为转阴，69%的患者视力提高了1-4行[17-19]。4、LuengoGimenoF等实验性的将PRP作为一种生物粘附剂成功的用于兔的板层角膜移植[20]，作者想要通过进一步的研究证实PRP的粘附作用对于角膜伤口的愈合有效。PRP/APG在治疗眼表面疾病中的应用DeRoth是第一个将胎儿膜用于眼科手术的人，用其治疗睑球粘连，试图进行眼表面重建。目前羊膜在眼科的应用范围正逐年扩大，大体上主要被归纳为以下几类：1）、角膜上皮功能障碍，不伴有角膜缘干细胞缺乏（LSCD）；2）、角膜上皮功能障碍，伴角膜缘干细胞缺乏；3）、结膜眼表重建，如：翼状胬肉切除；4）、作为角膜上皮细胞体外扩增的载体；5）、青光眼手术；6）、巩膜融解和穿孔的治疗；7）、其他适应症[21]。在眼表面疾病的治疗分述如下：1、大泡性角膜病变。各种原因严重损毁角膜内皮细胞，导致角膜内皮失代偿，使其失去液体屏障和主动液泵功能，引起角膜基质和上皮下持续性水肿。对症状明显、病情顽固、潜在视功能极差，估计难以恢复有效视力或不愿接受穿透性角膜移植及内皮移植手术的大泡性角膜病变患者，施行层间羊膜移植控制疼痛症状。沈志兵等对10例大泡性角膜病变患者进行层间羊膜移植，证实了此手术不仅可缓解疼痛，还可以部分恢复视力[22]。2、持续性的上皮缺损和角膜溃疡。细菌、真菌、病毒感染所致的经久不愈的角膜溃疡，虽使用了足量的抗生素与抗真菌药物，由于促炎因子和微生物产生的蛋白水解酶，溃疡面仍一直难以愈合。此时使用羊膜移植于眼表面，可抑制蛋白水解酶的作用，还为上皮生长提供了一个健康的基底膜，促使眼表面的快速愈合。3、带状角膜变性。主要是因为异常沉积的钙对眼表面的刺激与上皮损害的缘故。手术中使用螯合剂清除钙的沉积和角膜表层后，使用羊膜敷贴于眼表，有利于促进上皮修复和减轻因上皮缺损，神经暴露所致的眼表刺激症状。4、眼表面重建。羊膜被用于翼状胬肉手术和治疗严重的睑球粘连。虽然有研究表明，使用羊膜移植的翼状胬肉并不能比使用自体结膜移植的患者术后复发率低，但对于较大的翼状胬肉或复发性胬肉术后，因结膜缺损过多，自体结膜不能18 重庆医科大学硕士研究生学位论文填补缺损处时，使用羊膜移植，为结膜上皮细胞和杯状细胞的生长提供了一个正常的基底膜[23]。但羊膜只是一个临时性的替代品，结膜上皮要正常的生长，仍然需要其周围有一个完整的血管床。5、巩膜溶解和角膜穿孔。对于小的巩膜溶剂或角膜穿孔，使用羊膜移植可以覆盖穿孔处。较大的巩膜溶剂，羊膜可以作为一种载体，促进巩膜植片的上皮化和减轻炎症。Tay等曾报道过使用双层干燥冷冻的羊膜治愈1例人工角膜溶解的患者[24]。赵敏等使用血小板凝胶-胶联羊膜敷贴移植治疗，2例翼状胬肉术后巩膜溶解的患者，溃疡面完全愈合。6、睑球粘连。羊膜通过覆盖在受损的眼表面，可以减轻眼部的炎症，作为上皮移行的基底膜，进一步治疗和阻止睑球粘连的形成。7、结膜肿瘤和角结膜鳞状上皮瘤。手术切除结膜肿瘤或角结膜鳞状上皮瘤后，羊膜可作为一个结膜上皮移行的基板，促进结膜和角膜上皮的修复过程。自体富血小板凝胶与羊膜联合应用治疗眼表面疾病自体富血小板凝胶释放的生长因子与羊膜的抗微生物、抗纤维化、抗新生血管化、消炎的机制在治疗眼表面疾病方面都发挥了很大的作用，为了起到二者的协同作用，Alio等使用APG联合羊膜移植(AMT)手术治疗角膜溃疡穿孔或濒临穿孔的患者14例[25]。术中将APG填补于角膜溃疡或溃疡穿孔处，使用10-0尼龙线缝合固定羊膜于角膜面，并行临时性睑裂缝合。结果表明，71%患者角膜溃疡完全愈合，29%患者改善明显，在随访的11.1±3.2月中，无1例复发。最好的1例患者，视力提高了11行。国内学者赵敏等通过制备APG-AM复合物治疗眼表化学烧伤、热烧伤，重度干眼，病毒性角膜炎及静止期角膜溃疡等难治性眼表面疾病，随访1-6月中，患者眼表上皮均得到不同程度修复，自觉症状均有不同程度减轻。患者视力有不同程度的提高，无一例视力下降，无炎症加重或复发。他将血小板凝胶与羊膜胶联在一起，形成一种新型的羊膜复合物，旨在发挥二者的优势及协同作用，促进角膜溃疡愈合，促进组织修复及减轻炎症与疼痛。面临的问题与展望血小板血浆/凝胶以及羊膜在促进眼表上皮愈合方面是可靠和有效的治疗工具，在与常规的局部治疗比较下，充分显示了它们的优越性。但是，羊膜虽然罕19 重庆医科大学硕士研究生学位论文见有并发症发生，在临床上也不能不分青红皂白的滥用，因其依然存在着传播细菌、真菌、病毒感染的风险。进一步需要探讨的是制备APG-AM复合物的规范化流程以及能否使其长期保存，以备同一患者再次使用的问题。未来的研究将指向富血小板凝胶能够促进角膜伤口愈合的分子机制方面，以便我们更好的对这种生物物质影响的认识，并挖掘其在眼表面疾病治疗方面的潜在作用。目前缺乏的是单独使用羊膜或血小板血浆/凝胶与联合使用二者的对照性研究，比较是否存在联合应用比单独使用一种更有效的证据，以对临床治疗方案的选择提供依据。20 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